두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

이 실험의 전반적인 목표는 특정 뉴런의 레이저 절제가 회로 활동 및 동작에 미치는 영향을 테스트하는 것입니다. 이 실험 기법을 통해 우리는 행동의 기저에 있는 회로에서 뉴런의 필요성을 조사할 수 있습니다. 이 방법은 먹이가 어떻게 인식되는지, 먹이 포획 행동이 신경 활동에 의해 어떻게 생성되는지와 같은 행동 및 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 이러한 뉴런의 유전적 라벨링과 레이저의 높은 공간 해상도로 인해 뉴런을 특이적으로 절제할 수 있다는 것입니다. 유충을 사육하고 2% 저융점 아가로스에 장착한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 아가로스 내장 유충을 2광자 레이저 스캐닝 현미경 아래에 놓고 현미경 시스템을 시작합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 열고 레이저 탭에서 켜기 버튼을 클릭하여 레이저를 켭니다.

레이저 상태가 사용 중에서 잠금 모드로 변경될 때까지 기다립니다. 채널 탭에서 레이저의 파장을 EGFP 절제의 경우 880나노미터, GCaMP 절제의 경우 800나노미터로 설정합니다. 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 20X 주관식 렌즈를 선택합니다.

그런 다음 위치 탭을 클릭하고 GFP를 클릭하여 광학 경로를 변경하고 눈으로 형광을 직접 볼 수 있습니다. 얼룩말 물고기 유충 뇌를 시야의 중앙에 배치한 다음 획득 탭을 클릭하여 두 개의 광자 현미경으로 돌아가 레이저 출력과 게인을 설정합니다. 절제 전 조건에 대한 기록으로 Z 스택을 클릭하여 Z 스택 옵션을 선택합니다.

그런 다음 유충 뇌의 복부 말단에 초점을 맞춘 후 먼저 설정 버튼을 클릭하여 하한을 설정하고, 뇌의 가장 등쪽 표면에 초점을 맞춘 후 마지막으로 설정 버튼을 클릭하여 상한을 설정합니다. 마지막으로 실험 시작 버튼을 클릭하여 Z 스택 이미지 획득을 실행합니다. 그런 다음 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 63X 주관식 렌즈를 선택합니다.

그런 다음 위치 탭을 클릭하여 epifluorescence microscopy로 전환합니다. 눈으로 절제할 세포를 중앙에 배치한 다음 획득 탭을 클릭하여 레이저 스캐닝 현미경으로 돌아갑니다. 획득 모드 탭에서 프레임 크기를 256 x 256으로 설정합니다.

라이브를 클릭하고 관심 있는 뉴런을 관찰합니다. 그런 다음 등쪽에서 시작하여 절제할 세포가 초점이 맞춰진 초점면을 찾습니다. regions 함수를 사용하여 각 뉴런에 세포 지름의 약 1/3 크기의 작은 원형 영역을 ROI로 표시합니다.

스캔 속도를 256 x 256 픽셀당 13.9초로 설정하며, 이는 픽셀당 약 200마이크로초 또는 1/2미크론당 200마이크로초의 레이저 체류 시간에 해당합니다. 또한 반복 주기를 4회 반복으로 설정합니다. 실험 시작을 클릭하여 시계열 및 표백 기능을 실행합니다.

시계열 주기에서 절제 전 이미지를 절제 후 이미지와 비교하여 대상 세포의 형광이 사라졌는지 확인합니다. 다음으로, 초점면을 약간 더 깊게 이동하고 절제되지 않은 세포가 나타나는 다음 초점면을 선택합니다. 방금 설명한 대로 표백 기능을 수행하고 관심 신경 구조의 모든 세포가 절제될 때까지 이 과정을 반복합니다.

절제 후 세포에 형광이 제거되었는지 확인하고 필요한 경우 레이저 조사를 반복합니다. 방사선 조사 후에는 유충을 회복해야 합니다. 유충 주위의 아가로스에 조심스럽게 작은 수직 절단을 만듭니다.

그런 다음 마취제가 사라지면 물고기가 아가로스에서 스스로 헤엄쳐 나올 때까지 기다립니다. 파라메시아를 배양하고 얼룩말 물고기 유충을 마취한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 유충을 2%의 낮은 융점 아가로스에 놓고 여분의 아가로스를 즉시 제거하여 아가로스의 표면이 약간 볼록하게 보이도록 합니다. 해부 바늘을 사용하여 유충을 똑바로 세운 자세로 빠르게 방향을 잡습니다.

그런 다음 수술용 칼을 사용하여 아가로스를 몇 개 작게 잘라 얼룩말 물고기 머리 주위의 아가로스를 제거하여 파라메시움이 수영할 수 있는 공간을 만듭니다. 챔버에 시스템 물을 부드럽게 부어 잔류 아가로스를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 시각적 자극 역할을 하기 위해 기록 챔버에 하나의 파라메시움을 놓습니다.

그런 다음 과학용 CMOS 카메라가 장착된 형광 현미경 아래에 기록 챔버를 놓고 2.5X 대물 렌즈를 선택합니다. 장착된 카메라에 대한 이미지 획득 애플리케이션을 시작합니다. 시퀀스 창을 클릭하고 창에서 하드 디스크 레코드를 선택합니다.

스캔 설정 섹션에서 프레임 수를 900 또는 원하는 다른 총 프레임 수로 설정합니다. 캡처 창에서 노출 시간을 30밀리초로 설정하고 binning을 2x2로 설정합니다. 캡처 창에서 live를 클릭하여 카메라 보기에서 유충을 찾고 초점을 맞춘 다음 stop live를 클릭하고 시작 버튼을 클릭합니다.

동영상을 cxd 형식으로 저장하고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다. 행동 기록 시스템을 설정하고 텍스트 프로토콜에 따라 유충을 기록 챔버에 배치한 후 마이크로 피펫을 사용하여 50개의 파라메시아를 수집하고 기록 챔버에 배치합니다. 커버 슬립을 레코딩 챔버 위에 놓으려면 커버 슬립에 작은 물 방울을 떨어뜨린 후 레코딩 챔버의 물 표면에 놓아 챔버에 공기가 유입되지 않도록 합니다.

조명 시스템에 레코딩 챔버를 배치합니다. 그런 다음 10분 동안 초당 11프레임으로 타임랩스 녹화를 시작합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따른 수행 분석입니다.

이 실험에서는 전(pretectal) 영역의 핵을 라벨링하는 Gal4 라인과 후각구 뉴런의 하위 개체군을 사용합니다. 전신경세포(pretectal neuron)는 양측으로 레이저로 절제하였다. 후각 뉴런은 대조군으로 절제되었습니다.

결과는 두 개의 광자 레이저가 인접한 신경돌기는 영향을 받지 않도록 유지하면서 표적 세포를 제거할 수 있음을 보여줍니다. 이 실험에서는 축삭돌기를 ILH 동측으로 돌출하는 전(前) 뉴런의 기능적 연결성을 조사했습니다. pretectum과 ILH 모두 먹이의 근위부 존재에서 뉴런 활동을 보였으며, 이는 두 뉴런 활동이 모두 시각적으로 주도된다는 것을 시사합니다.

칼슘 이미징은 또한 pretectum의 신경 세포 활동과 pretectal neuron 절제 유충의 ILH를 관찰하는 데 사용되었습니다. 레이저로 절제된 좌측 전두엽은 신경 세포 활동이 전혀 없거나 잔류하는 것으로 나타났습니다. 또한, 동측 ILH는 극적으로 변위된 신경 활동을 보였는데, 이는 ILH에 대한 주요 입력이 동측 전립선(ipsilateral pretectum)에서 비롯됨을 시사합니다.

대조적으로, 레이저가 절제된 전립선의 반대편에 있는 ILH는 동측 전립선의 신경 활동과 유사한 신경 활동을 보였는데, 이는 오른쪽 ILH가 우측 전립선에서 입력을 받고 있음을 시사합니다. 일단 마스터되면 각 얼룩말 물고기 유충에 대해 약 1시간 안에 레이저 절제를 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 레이저 조사로 표적 뉴런만 절제하여 레이저에 의한 열 손상을 피하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 전뇌 또는 후뇌와 같은 다른 뇌 영역의 뉴런을 절제하여 이러한 뉴런이 인지 기능이나 운동 기능에 어떻게 관여하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 행동 신경과학 분야의 연구자들이 제브라 피쉬 모델에서 기능적 신경 회로를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라 피쉬 유충 뇌의 뉴런을 구체적으로 레이저로 제거하고 기능적 및 행동적 결과를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 제조업체의 지침을 준수한다는 것을 잊지 마십시오.