Name: 두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 배우세요 양광자 레이저를 사용하여 제브라피시 애벌레의 특정 신경 세포를 제거하고 회로 활성 및 먹이 포착 행동 변화를 분석하는 방법을. 이 기술은 신경 과학 연구에 필수적인 기능적 역할 규명에 활용됩니다.

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이러한 연구는 문 부 과학성, JSP KAKENHI 보조금 번호 JP25290009, JP25650120, JP17K07494, 및 JP17H05984에서 받은 교부 금에 의해 투자 되었다.

1. 절제 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여 신경 세포의 부분 모집단의
참고: 사용자가 Ca 이미징 다음 제거 수행 계획, UAShspzGCaMP6s 선21을 사용 합니다. 사용자 행동 기록 제거 다음 수행 계획, EGFP 긍정적인 세포의 제거는 GCaMP6s 표현 세포의 보다 수행 하기가 UAS:EGFP 라인을 사용 합니다.
<ol><li>특정 뉴런 공부 하 고 UAS:EGFP 또는 UAShspzGCaMP6s 레이블 Gal4 라인의 짝짓기를 설정 하 여 시작 합니다. 부모에 대 한 nacre 배경을 사용할 수 nacre homozygotes를 얻을 수 있도록 해야 합니다. 참고: Nacre 의 homozygotes 아니 melanophores 몸 표면 (그림 1B)에 포함 되어 있습니다. 현재에서 연구, (이 pretectum 라벨) Gal4 선 gSAIzGFFM119B와 다른 Gal4 라인 hspGFFDMC76A (이 ILH 레이블) 사용된21입니다.</li>
	<li>짝짓기 설치의 다음 날, zebrafish 계란을 수집 하 고 어느 시점에서 관심의 뉴런 형광 기자 익스프레스는 애벌레 단계에 그들을 제기.</li>
	<li>2% 낮은 융 점 agarose (그림 1B)에서 zebrafish 애벌레를 탑재 합니다.<ol>
<li>2 %agarose 재고 솔루션을 준비 하 여 시작: 2 세대 분해 (즉, 성인 zebrafish 물 순환 시스템에서을 유지 하는 데 사용 하는 물) 100 mL 시스템 물에 낮은 녹는점 agarose 분말의22 또는 E3 물23, 물 여 포인트는 전자 레인지에 끓는과 적극적으로 혼합.</li>
		<li>그것은 종 기까지 2% 낮은 녹는점 agarose 주식을 전자 레인지. 6 cm 배양 접시의 뚜껑에 agarose의 3.5-4.0 mL를 붓으십시오. agarose 냉각을 계속 하기 전에 터치에 따뜻한 때까지 기다립니다.</li>
		<li>다음으로 agarose에 하나의 유 충 (이 단계에서 하지 마 취)를 배치 합니다. 그것은 직 립 해 바늘 (그림 1의C)를 사용 하 여 위치와 유 충의 방향을 조절 유지는 agarose는 유 충의 적절 한 위치를 보장 하기 위해 굳은 때까지. 참고: 유 충은 agarose 굳은 동안 주위 수영 계속 것입니다.</li>
		<li>일단 유 충, 위치를 완전히 응고 agarose 위한 5 분 수 있습니다.</li>
		<li>Tricaine 솔루션 (작업 농도 x 1 0.4%)의 5 mL는 agarose 붓는 다. 참고: 동안을 피하기 위해 움직임 애벌레에 의해 레이저 절제, 애벌레 유지 해야 제거 절차를 통해 마 취.</li>
	</ol></li>
	<li>두 광자 레이저 현미경 시스템에 표백 기능을 사용 하 여 유 충 ablate<ol>
<li>Agarose 내장 유 충 2 광자 레이저 스캔 현미경 아래 놓고 현미경 시스템을 시작 합니다.</li>
		<li>이미지 수집 소프트웨어 및 레이저 (그림 1D) 설정 하려면 "레이저" 탭에서 "On" 버튼을 클릭 하십시오. "다른 용무 중"에서 "모드-잠겨 있습니다."로 변경 하는 레이저의 "상태"에 대 한 대기</li>
		<li>"채널" 탭에서 880에서 레이저의 파장을 설정 nm (최대 전력: 약 2300 mW) EGFP 절제, 또는 800 nm (최대 전력: 약 2600 mW) GCaMP 절제술에 대 한.</li>
		<li>20 X 객관적 렌즈 렌즈 리볼버를 수동으로 이동 하 여 선택 합니다. "찾기" 탭을 클릭, 클릭 "GFP" 광학 경로 변경 하 여 직접 눈으로 형광을 볼.</li>
		<li>보기;의 센터에서 zebrafish 애벌레 뇌를 찾습니다 다음 두 광자 현미경으로 돌아가기 위해 "수집" 탭을 클릭 합니다.</li>
		<li>'절제' 전에 상태 기록, 빠른 검색 속도 ()을 피하기 위해 열 손상에서 렌즈는 20 X와 z-스택 이미지를 가져가 라. 나중에 이미지가 제거 실험 (그림 2A) 전후 비교. 스택-z를, 후에 초점을 맞추고 "Z-스택" z-스택 옵션을 선택 하 고 애벌레 두뇌의 복 부 끝에 초점을 맞추고 후 낮은 제한 (클릭 "설정 처음" 버튼")를 설정 하 고 상한 (" 마지막 설정 "버튼을 클릭 하십시오.) 설정 탭 확장을 클릭 합니다 뇌의 등 쪽 대부분-표면입니다. Z-스택 이미지 수집을 실행 하려면 "실험 시작" 버튼 클릭.</li>
		<li>63 X 객관적 렌즈 렌즈 리볼버를 수동으로 이동 하 여 선택 합니다.</li>
		<li>피-형광 현미경 검사 법으로 전환, 수 녹지 보기의 중심에 눈에 의해 세포를 찾아 다음 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 다시가 서 "인수" 탭을 클릭 "찾기" 탭을 클릭 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>"수집 모드" 탭에서 256 x 256에 "" 프레임 크기를 설정 합니다. "라이브"를 클릭 하 고 관심의 뉴런을 관찰.</li>
	<li>등 대부분 측면에서 starting 있는 녹지 수를 셀에 있는 초점 초점 비행기를 찾아.</li>
	<li>작은, 원형 지역 "영역" 기능을 사용 하 여 관심 (ROI)의 영역으로 각 뉴런에 직경에서 1/3 정도 셀의 크기를 표시 합니다.</li>
	<li>약 200 μ s/픽셀, 또는 200 µs/0.5 µ m의 레이저 면만 시간에 해당 하는 256 픽셀 (134.42 µ m x 134.42 µ m), x 13.93 s/256를 스캔 속도 설정 합니다. 또한, 4 반복을 설정 (' 반복 주기: 4'). 또는 충분 한 절제 달성 된다 그래야 수 반복 및 스캔 속도 최적화 합니다.</li>
	<li>샘플 (전과 제거 후)와 '지역' (설정에 ROIs) 또는 해당 함수 (그림 1D) 사용 되는 소프트웨어에 이미지를 '시계열 (2 주기)'와 함께에서 박 리에 대 한 '표백' 기능을 수행 합니다.</li>
	<li>(절제) 전에 첫 번째 이미지와 시계열에서 (제거) 후 두 번째 이미지를 비교 하 여 주기, 그 배경 수준 (그림 2B)에서 관찰 대상된 세포 감소에 형광 표백 후 확인.</li>
	<li>있으면 형광 여전히 절제 후, 반복의 수를 늘립니다.</li>
	<li>다음, 초점면 약간 깊은 (즉, 복 부 쪽을 향해), 이동한 다음 초점 비행기 취소 연기나 셀 표시를 선택 합니다.</li>
	<li>(단계 1.9) 위에서 설명한 대로 표백 기능을 수행 합니다. 관심의 신경 구조에 있는 모든 세포는 되어 녹지까지이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>연기나 수에 신경 구조를 다루는 모든 초점 비행기를 거쳐, 폐지 된 형광에 대 한 셀을 확인 합니다. 만약 일부 셀은 여전히 부족 한 절제로 인해 형광, 레이저-비추는 그들 다시 위에서 설명한 대로.</li>
	<li>유 충 레이저 방사선 조사 후 agarose에서 복구 해야 하는 경우, 그것을 강제로 agarose 중이 유 충을 손상 할 수 있기 때문에 시도 하지 마십시오. 대신, 신중 하 게 할 작은 상처 유 충 주위 agarose에서 수직으로 신체의 표면에. 그런 다음 마 취 기운이 떨어지기 때 자체 agarose에서 수영 유 충을 기다립니다.</li>
	<li>제거에 대 한 다음 유 충 이동 합니다 또는 조사 행동에 관여 하지 않은 뉴런의 다른 인구를 사용 하 여 제어 실험을 수행. 참고: 여기, 컨트롤, UAS:EGFP;에서 嗅 뉴런 gSAIzGFFM119B 유 충 레이저-녹지 (그림 2A, 오른쪽) 위에서 설명한 동일한 프로토콜을 사용 하 여 했다.</li>
	<li>몇 시간 또는 1 일 Ca 이미징 (제 2) 또는 행동 기록 (제 3)를 진행 하기 전에 복구에 대 한 허용. 이 복구 기간 동안, 애벌레 상태 (즉, 일반 자연 수영, 녹지 지역, 등명백한 열-손상)을 확인 하 고 가난한 건강의 흔적을 보여주는 하는 애벌레를 제거 합니다.</li>
</ol>2. 칼슘 이미징 Pretectum 연기나 Zebrafish 애벌레에 먹이 갖는 신경 활동을 기록 하
<ol><li>준비는 녹음 실, 보안 씰 교 잡 챔버 가스 켓 유리 슬라이드에 접착 면이 유리에 놓고 최고 봉인 제거. 참고: 이것은 9 mm 직경에서 및 깊이 (그림 3A)에 0.8 m m는 작은 녹음 실을 만듭니다.</li>
	<li>다음, 나일론 메쉬를 배치 (개방의 크기: 32 µ m)을 자르면 아래 50 mL 튜브에. 모자를 사용 하 여 메쉬 튜브 (그림 3B)에 연결.</li>
	<li>Paramecia (이 데 사용할 시각적 자극으로 유 충 먹이)를 준비 합니다. 참고: Paramecium 문화 (2.3.1, 2.3.2 단계) 준비 미리.<ol>
<li>상용 소스 또는 학술 바이오 리소스 센터24 에서 paramecia 씨 문화를 사전에 얻을.</li>
		<li>문화 압력가 쌀 밀 짚 및 건조 맥주 효 모22 (그림 3C)의 펠 릿을 포함 하는 물에 몇 일 동안 paramecium .</li>
		<li>연속적으로 paramecium 문화 2 체를 통해 부 어 (150 µ m 조리개와 한 뒤 75 µ m 조리개와 다른) 문화에서 파편을 제거 하.</li>
		<li>나일론 메쉬 (13 µ m 조리개)에 이전 단계에서 흐름 통해 paramecia 를 수집 합니다.</li>
		<li>다시 시스템 물 (그림 3D)의 쥐 어 짜기 병을 사용 하 여 유리 비 커에 나일론 메쉬에 paramecia 를 일시 중단 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>(그림 3E) x 시스템 물 2에서에서 메쉬 (그림 3B) 린스. 참고: 이 단계의 목적은 현재 연구의 목표는 시각적으로 신경 활동을 구동 관찰로 모든 가능한 odorants 및 paramecium 문화 매체에 포함 된 tastants를 제거 하는 것입니다.</li>
	<li>Anesthetize을 tricaine 솔루션에서 zebrafish 애벌레를 놓습니다.</li>
	<li>2% 낮은 녹는점 agarose에 하나의 유 충을 탑재 합니다.<ol>
<li>첫째, 전자 레인지 2% 낮은 녹는점 agarose 고는 agarose를 집중된 tricaine x 10의 1/10 볼륨을 추가 합니다.</li>
		<li>녹음 실 (그림 3A)에 포함 하는 tricaine agarose의 한 방울을 배치 합니다.</li>
		<li>확인 한 후는 agarose는 너무 뜨겁다, 즉시 제거 하는 어떤 과잉 agarose는 agarose의 표면 보이도록 약간 볼록 agarose (2.5 단계)에서 마 취 유 충을 넣습니다.</li>
		<li>신속 하 게 방향을 지정 유 충으로 수직 위치 해 바늘 (그림 1C). 참고: 이 절차는 agarose 고형화 하기 전에 몇 초 이내에 완료 되어야 합니다.</li>
		<li>유 충은 제대로 위치 하 고, 일단 완전히 응고 agarose 위한 5 분 수 있습니다. 그런 다음는 agarose에 1 x tricaine 솔루션의 한 방울을 붓는 다.</li>
	</ol></li>
	<li>Zebrafish 유 충의 머리 주위 agarose를 제거 하 고 수술 칼을 사용 하 여 수영 paramecium 에 대 한 공간. 이렇게 하려면 먼저 확인 합니다 (그림 3F) agarose에서 몇 가지 작은 상처. 다음, 조심 스럽게 부드럽게 챔버에 시스템 물을 붓는 의해 초과 agarose를 제거. 참고: 이 단계에서는 tricaine 밖으로 세척 될 것 이다.</li>
	<li>다음으로, 시각적 자극으로 녹음 실에서 한 paramecium 를 넣어. 참고: Paramecium zebrafish 유 충의 머리 근처 수영 때 신경 응답을 (그림 3G)을 일 깨우 다 것 이다 그것.</li>
	<li>장소는 피 형광 현미경 녹음 실 과학 CMOS 카메라 (그림 3H)를 갖춘 고 2.5 X 목표 렌즈 (그림 3나)를 선택 합니다.</li>
	<li>시간 경과 기록의 GCaMP 형광 신호를 수집 합니다.<ol>
<li>갖춘 카메라용 이미지 수집 응용 프로그램을 시작 합니다.</li>
		<li>"시퀀스 창"을 클릭 하 고 창에서 "하드 디스크 기록"을 선택 합니다. 검색 설정 섹션에서 "프레임 카운트" 900 또는 어떤 다른 총 프레임 수를 원하는 설정 합니다. 참고: 가능한 경우, 시간 경과 기록 소프트웨어를 사용 하 여 모듈 함께 (여기, "하드 디스크 기록") 하드 드라이브에 데이터의 효율적인 저장을 가능 하 게.</li>
		<li>"캡처" 창에서 x 2 사용 (즉, 33.3 fps), 30-ms와 Binning 2 노출 시간을 설정 합니다.</li>
		<li>터치 패널을 제어 하는 현미경에는 GCaMP는 GFP 비슷한 여기/방출 스펙트럼 GFP, 설정 하는 필터를 선택 합니다.</li>
		<li>카메라 보기 및 초점그림 4(A), 유 충을 찾은 다음 "라이브 중지"를 클릭 하 고 "시작" 버튼을 클릭 하 고 캡처 창에 "라이브"를 클릭 합니다. .Cxd 또는 인수 조건에 대 한 정보를 보유 하는 다른 형식의 동영상을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>녹음 후 피지25무료 소프트웨어를 사용 하 여 시간 경과 영화에 두뇌 구조에 투자 수익에 대 한 평균 픽셀 값을 얻어서 GCaMP6s 형광 신호 (Ca 신호)를 분석 합니다. 참고: 피지는 많은 유용한 플러그에 ImageJ의 버전의 미리 설치 되어 있으며 바이오 형식과.cxd 형식 이미지 파일을 읽을 수 있는 플러그인.</li>
	<li>유 충 약간 녹음 하는 동안, 이동 하는 경우 피지에서26 TurboReg 플러그인 실행 하 여 이미지 등록을 수행 합니다. 메뉴에서 '플러그인', '등록' 및 'TurboReg'를 선택 합니다.</li>
	<li>연구의 목적에 따라 데이터를 분석 하는 방법을 고려 하십시오. 다음 예입니다.<ol>
<li>다음과 같이 F/F0 (형광 강도 각 시간에 나눈 나머지에 또는 어떤 Ca 과도 발생 전에 형광 강도)을 계산.</li>
		<li>pretectum 또는 투자 수익 관리자를 사용 하 여 ILH ROIs를 설정: 메뉴에서 "분석" "도구" "ROI 관리자" 선택 및 ROIs(그림 4)의 목록에 "추가".</li>
		<li>ROIs에 대 한 평균 픽셀 값을 계산 (즉,., GCaMP6s의 형광 강도) ROI 관리자 패널에서 선택 하 여: "더," "멀티 측정", 그리고 "확인." 스프레드시트 파일로 결과 저장 합니다.</li>
		<li>신호는 시끄러운, 평균 11 시간-포인트 (이동 평균) 스프레드시트 데이터를 처리할 수 있는 응용 프로그램을 사용 하 여 신호.</li>
		<li>F0 F (시간이 지남에 형광 강도) 나누어 (기초 수준에서 형광 강도) 정규화 된 형광 강도 계산 하. 데이터 시각화의 예에서 변경 정규화 GCaMP6s 형광 강도 pretectum에는 ILH 색 이며 paramecium 궤도 (그림 4B-D)에 매핑됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 레이저 절제 다음 행동 결과의 평가
<ol><li>비디오 카메라를 갖춘 stereoscope 구성 된 행동 녹화 시스템을 설정 합니다. 카메라를 사용 하 여 한 적절 한 이미지 수집 소프트웨어, 상업적 또는 주문 품(그림 5).</li>
	<li>Paramecium 는 이미지 처리에 의해 검출 될 수 있다 조명 상태를 최적화. 예를 들어 공백 (그림 5B)와 링 백색 LED 빛을 사용 합니다. 참고: , 거리와 각도, LED의 샘플 (즉, 어두운 배경에서 밝은 또는 밝은 배경에서 어두운), 따라서, 성공적인 이미지 처리에 대 한 중요 한 모양에 영향을 줍니다. 스페이서 (그림 5C)의 최고 높이 결정 합니다.</li>
	<li>원래 최고 봉인 제거 (그림 5D)와 (는 유리 슬라이드에 연결 된) 행동 녹음 실에서 zebrafish 유 충 (섹션 1에 설명 된 레이저 제거 실험에서 발견)를 배치 합니다.</li>
	<li>50 paramecia 문화 (단계 2.3.5)에서 수집는 micropipette 사용 하 고 녹음 실에서 그들을 배치.</li>
	<li>녹음 실 위에 커버 슬립을 놓습니다. 물 작은 방울을 챔버에 공기를 도입 하지 않으려면 녹음 실의 물 표면에 배치 하기 전에 커버 슬립에 입었다. 참고: 이 단계에서 paramecia 와 물 녹음 실에서 오버플로될 것입니다. 녹음 실에서 paramecia 의 나머지 수는 약 30-40를 있을 것입니다.</li>
	<li>(유 충 및 paramecia를 포함 하는) 녹음 실을 조명 시스템 (그림 5D)에 놓습니다.</li>
	<li>11 분 (6, 600 프레임) 10 프레임에서 시간 경과 녹음을 시작 합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 동작에 대 한 테스트는 유 충의 각에 대 한 형광 현미경 레이저-절제 (즉, 부재, 또는에서 크게 감소의 번호, 형광 세포의 효과 확인 하 여 레이저 연기나 영역의 형광을 관찰 레이저 방사선 영역)입니다. 참고: 방사선, 후에 일부 형광 세포 절제27후 분화 하는 셀에 Gal4 유전자 발현의 이상 증상으로 인하여 여전히 관찰할 수 있습니다.</li>
	<li>백그라운드에 균일의 부족에 대 한 보상을 유 충의 행동을 기록한 후 피지에서 평균 이미지에 의해 각 프레임의 픽셀에 의해 나눗셈을 수행: '과정', ' 이미지 계산기 ' 클릭 ' 작업: 나누기 ', ' 32 비트 (부동 소수점) 결과 ', 그리고 ' 확인 '. 평균 이미지 하려면, '이미지', '스택', ' Z', '평균 강도', 및 '확인' (그림 5E, F)을 클릭 합니다.</li>
	<li>수 paramecia 의 수는 '분석', ' 분석 입자 '를 클릭 하 여 챔버에 남아 모든 paramecia를 포함 하는 지역 범위 설정 ' 쇼: 마스크 ' 확인란을 선택 하 고 '확인'을 클릭 하면. ' 쇼: 마스크 ' 옵션 추출 된 paramecia 이미지 (그림 5G), 각 프레임에서 입자 (paramecia)의 수의 목록을 제공할 것입니다.</li>
	<li>시간이 지남에 따라 녹음 실에서 paramecia 왼쪽의 숫자를 플롯 합니다. Paramecia 의 수의 견적은 시끄러운 이기 때문에, 스프레드시트에 600 프레임 (1 분)의 범위에 있는 각 지점에 이동 평균을 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

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저자 보고 관심의 없습니다 충돌 있다.

두 광자 레이저는 구체적으로 개별 뉴런을 ablate을 우수한 공간 해상도, 위대한 주의 뇌 조직의 열 때문에 원치 않는 어떤 손상을 피하기 위하여 취해야 한다. 제거 실험에서 가장 중요 한 단계는 최적의 레이저 방사선 양을 결정 하는. 부족 한 방사선을 신경 세포를 죽 일 실패 합니다. 너무 많은 방사선 열 손상 주변 조직, 바람직하지 않은 효과가 발생할 것입니다 것입니다. 레이저 조사 (ROIs, 반복, 그리고 스캔 속도의 수의 분야)의 최적 범위는 좁은 것 처럼 보인다. 몇 가지 요소는 절제의 효율성을 영향을 줍니다.
첫째, 다른 형광 기자 단백질을 사용 하 여 제거 조건 각 기자에 대 한 최적화가 필요 합니다. GCaMP 식 핵 없는 세포질에서 관찰 됩니다. 반면, EGFP 형광 GCaMP에 비해 대상된 셀의 효율적이 고 특정 절제에 대 한 유리한 수 있습니다 셀의 내부에 걸쳐 나타납니다. GCaMP 사용 하 여도 레이저 녹지 GCaMP 표현 셀 줄된 형광 강도 EGFP ...

동작 뇌의 신경 활동에서 발생 하는 방법을 이해 하는 그 행동의 생성에 관여 하는 신경 회로 식별할 필요가 있다. 애벌레 단계에서 zebrafish는 그들의 작은, 투명 한 두뇌는 신경 활동의 광범위 한 영역에서 셀룰러 해상도에서 조사를 가능 하 게 하기 때문에 동작와 관련 된 두뇌 기능을 공부에 대 한 이상적인 동물 모델을 제공 합니다 1동작 관찰 하는 동안 두뇌입니다. 특정 뉴런에 신경 활동의 이미징 유전자 인코딩된 칼슘 (Ca) 지표 (GECIs) GCaMP2등의 발명을 통해 가능한 되고있다. 제 브라 GCaMP 유전자 변형 동물3행동에서 Ca 이미징 실시 하 여 동작 기능 신경 회로 연결 하는 데 유용 하 게 입증 했습니다.
Ca 이미징 신경 활동과 행동 사이의 상관 관계를 설명할 수 있다, 그러나 인과 관계, 보여 신경 활동과 행동에 그것의 consequence(s)를 테스트의 중요 한 단계가 있습니다. 이를 위해 다양 한 방법이 있다: 특정 신경 회로4, 특정 뉴런5,6, halorhodopsin7, optogenetic 도구를 사용 하 여 신경의 표현 변경 유전자 변이의 사용 및 레이저 타겟된 신경8,9의 제거. 레이저 절제술은 상대적으로 적은 수의 특정 뉴런에 활동을 제거에 대 한 특히 적합 합니다. 신경 세포를 죽 여 신경 활동의 돌이킬 수 없는 제거 행동 결과 평가 촉진 한다.
Zebrafish의 애벌레 단계에서 관찰 될 수 있는 하나의 재미 있는 행동은 먹이 캡처 (그림 1A). 시력10, visuomotor 변환11,,1213, 시각 지 각의 인식의 연구에 대 한 유리한 실험 시스템을 제공 하는이 시각 가이드, 목표 지시 동작 개체14,15,,1617,18, 그리고 의사 결정19. 어떻게 먹이 neuroethology20에서 중앙 질문 되었습니다 잡는 행동 포식 자와 먹이 탐지 먹이를 리드 하는 방법에 의해 인식 된다. 이 문서에서 우리는 pretectum에서 핵의 계획에 의해 형성 된 pretecto hypothalamic 회로의 역할에 초점 (핵 pretectalis superficialis 갈 거 예요 magnocellularis,이 하, 간단 하 게는 pretectum으로 표시)에 ILH 하. pretectum의 레이저 절제 먹이 캡처 활동을 줄이고 ILH 시각적 먹이 지 각21와 관련 된 신경 활동 폐지를 표시 했다. 여기, 수행을 위한 프로토콜 레이저 절제 및 애벌레 설명 zebrafish의 캘리포니아2 + 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 그것의 효과 테스트.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG 아가로스</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>저융점 아가로스</td></tr><tr><td>6cm 페트리 접시</td><td>FALCON</td><td>제품#:351007</td><td></td></tr><tr><td>해부 바늘</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. 번호 2-013-01</td><td></td></tr><tr><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 LSM7MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>이광자 레이저 스캐닝 현미경</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X 대물 렌즈</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>에피 형광 현미경</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>컨포칼 현미경용 이미지 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>Secure-Seal 혼성화 챔버 개스킷, 챔버 8개, 직경 9mm x 깊이 0.8mm</td><td>분자 프로브</td><td>카탈로그 # S-24732</td><td>Ca 이미징</td></tr><tr><td>이미징 챔버</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell 이미징 챔버 PCI-A-2.5</td><td>행동 기록 챔버로 사용</td></tr><tr><td>수술용 칼</td><td>MANI</td><td>안과 칼 MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>모델 : C11440-22CU</td><td>과학적인 CMOS 카메라</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>이미지 정확도 소프트웨어</td></tr><tr><td>하드 디스크 레코딩 모듈</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>짧은 시간에 하드 디스크 드라이브에 동영상 파일을 저장할 수있는 소프트웨어 모듈</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>올림푸스 스테레오</td><td></td><td>스코프</td></tr><tr><td>DF PL 0.5X</td><td>올림푸스</td><td></td><td>SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1MP 모노 USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td>용 대물 렌즈<td>제품 번호. GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS 카메라</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ 카메라</td><td>XIMEA</td><td>제품 번호 MQ042RG-CM</td><td>CMOS 카메라</td></tr><tr><td>링 LED 라이트</td><td>CCS</td><td>모델: LDR2-100SW2-LA</td><td>백색 LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬 32&마이크로; m</td><td>도쿄 스크린</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>나일론 메쉬 13&마이크로; m</td><td>도쿄 스크린</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>메탈 시브 150 미크론 조리개</td><td>도쿄 스크린</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>메탈 시브 75 미크론 조리개</td><td>도쿄 스크린</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami EBIOS</td><td>아사히 식품 & 헬스케어, Co. Ltd.</td><td></td><td>건조 맥주 효모</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td>, Mai-Tai HP Spectra Physics <td>프로그래밍을 위한 통합 개발 환경</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td></td><td>이광자 레이저&nbsp;</td></tr></tbody></table>

두 광자 레이저와 zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

동작에서 뉴런의 부분 모집단의 역할을 확인 하려면 차단 하는 살아있는 동물에 그것의 활동의 결과 테스트 필수적 이다. 레이저 절제 뉴런의 신경 세포는 선택적으로 형광 프로브로 표시 된 경우이 목적을 위해 효과적인 방법입니다. 현재 연구에서 레이저 ablating 신경 2 광자 현미경을 사용 하 고 그 기능 및 행동 결과의 테스트의 부분 모집단에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 연구에서 zebrafish 애벌레에 먹이 캡처 동작 연구 모델로 사용 됩니다. 이 시각 기반 먹이 잡는 동작을 기초 pretecto hypothalamic 회로 알려져 있다. 제 브라 pretectum 레이저 녹지, 그리고 열 등 한 엽 (ILH; pretectal 투영의 대상) 시상 하 부의 신경 활동 조사 되었다. Pretectal 제거 후 먹이 캡처 동작 또한 시험 되었다.

특정 뉴런 유전자 EGFP 또는 GCaMP6s, 누구의 식 Gal4 라인에서 주도 했다으로 표시 했다. Gal4 라인 gSAIzGFFM119B pretectal 지역 (magnocellular 표면 pretectal 핵), 및 후 각 전구 뉴런의 부분 모집단에 핵을 사용 되었다. 또 다른 Gal4 라인, hspGFFDMC76A에 ILH 레이블을 사용 되었다. 우리가 레이저-녹지 pretectal 신경 양측 (그림 2A 왼쪽된 패널)와 또한 연기나 신경 후 각 전구에 양측 Gal4 라인 gSAIzGFFM119B의 zebrafish 애벌레에는 컨트롤 (그림 2A 오른쪽 패널)로 UAS:EGFP 기자 물고기와 성관계를 했다. 결과 2 광자 레이저 하면서 인접 한 셀 또는 neurites 영향을 받지 않습니다 (...

여기, 우리는 프로토콜 Zebrafish 애벌레에서 2 광자 레이저로 뉴런의 유전자 표시 부분 모집단을 ablate을 제시.

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

이 실험의 전반적인 목표는 특정 뉴런의 레이저 절제가 회로 활동 및 동작에 미치는 영향을 테스트하는 것입니다. 이 실험 기법을 통해 우리는 행동의 기저에 있는 회로에서 뉴런의 필요성을 조사할 수 있습니다. 이 방법은 먹이가 어떻게 인식되는지, 먹이 포획 행동이 신경 활동에 의해 어떻게 생성되는지와 같은 행동 및 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 이러한 뉴런의 유전적 라벨링과 레이저의 높은 공간 해상도로 인해 뉴런을 특이적으로 절제할 수 있다는 것입니다. 유충을 사육하고 2% 저융점 아가로스에 장착한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 아가로스 내장 유충을 2광자 레이저 스캐닝 현미경 아래에 놓고 현미경 시스템을 시작합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 열고 레이저 탭에서 켜기 버튼을 클릭하여 레이저를 켭니다.레이저 상태가 사용 중에서 잠금 모드로 변경될 때까지 기다립니다. 채널 탭에서 레이저의 파장을 EGFP 절제의 경우 880나노미터, GCaMP 절제의 경우 800나노미터로 설정합니다. 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 20X 주관식 렌즈를 선택합니다.그런 다음 위치 탭을 클릭하고 GFP를 클릭하여 광학 경로를 변경하고 눈으로 형광을 직접 볼 수 있습니다. 얼룩말 물고기 유충 뇌를 시야의 중앙에 배치한 다음 획득 탭을 클릭하여 두 개의 광자 현미경으로 돌아가 레이저 출력과 게인을 설정합니다. 절제 전 조건에 대한 기록으로 Z 스택을 클릭하여 Z 스택 옵션을 선택합니다.그런 다음 유충 뇌의 복부 말단에 초점을 맞춘 후 먼저 설정 버튼을 클릭하여 하한을 설정하고, 뇌의 가장 등쪽 표면에 초점을 맞춘 후 마지막으로 설정 버튼을 클릭하여 상한을 설정합니다. 마지막으로 실험 시작 버튼을 클릭하여 Z 스택 이미지 획득을 실행합니다. 그런 다음 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 63X 주관식 렌즈를 선택합니다.그런 다음 위치 탭을 클릭하여 epifluorescence microscopy로 전환합니다. 눈으로 절제할 세포를 중앙에 배치한 다음 획득 탭을 클릭하여 레이저 스캐닝 현미경으로 돌아갑니다. 획득 모드 탭에서 프레임 크기를 256 x 256으로 설정합니다.라이브를 클릭하고 관심 있는 뉴런을 관찰합니다. 그런 다음 등쪽에서 시작하여 절제할 세포가 초점이 맞춰진 초점면을 찾습니다. regions 함수를 사용하여 각 뉴런에 세포 지름의 약 1/3 크기의 작은 원형 영역을 ROI로 표시합니다.스캔 속도를 256 x 256 픽셀당 13.9초로 설정하며, 이는 픽셀당 약 200마이크로초 또는 1/2미크론당 200마이크로초의 레이저 체류 시간에 해당합니다. 또한 반복 주기를 4회 반복으로 설정합니다. 실험 시작을 클릭하여 시계열 및 표백 기능을 실행합니다.시계열 주기에서 절제 전 이미지를 절제 후 이미지와 비교하여 대상 세포의 형광이 사라졌는지 확인합니다. 다음으로, 초점면을 약간 더 깊게 이동하고 절제되지 않은 세포가 나타나는 다음 초점면을 선택합니다. 방금 설명한 대로 표백 기능을 수행하고 관심 신경 구조의 모든 세포가 절제될 때까지 이 과정을 반복합니다.절제 후 세포에 형광이 제거되었는지 확인하고 필요한 경우 레이저 조사를 반복합니다. 방사선 조사 후에는 유충을 회복해야 합니다. 유충 주위의 아가로스에 조심스럽게 작은 수직 절단을 만듭니다.그런 다음 마취제가 사라지면 물고기가 아가로스에서 스스로 헤엄쳐 나올 때까지 기다립니다. 파라메시아를 배양하고 얼룩말 물고기 유충을 마취한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 유충을 2%의 낮은 융점 아가로스에 놓고 여분의 아가로스를 즉시 제거하여 아가로스의 표면이 약간 볼록하게 보이도록 합니다. 해부 바늘을 사용하여 유충을 똑바로 세운 자세로 빠르게 방향을 잡습니다.그런 다음 수술용 칼을 사용하여 아가로스를 몇 개 작게 잘라 얼룩말 물고기 머리 주위의 아가로스를 제거하여 파라메시움이 수영할 수 있는 공간을 만듭니다. 챔버에 시스템 물을 부드럽게 부어 잔류 아가로스를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 시각적 자극 역할을 하기 위해 기록 챔버에 하나의 파라메시움을 놓습니다.그런 다음 과학용 CMOS 카메라가 장착된 형광 현미경 아래에 기록 챔버를 놓고 2.5X 대물 렌즈를 선택합니다. 장착된 카메라에 대한 이미지 획득 애플리케이션을 시작합니다. 시퀀스 창을 클릭하고 창에서 하드 디스크 레코드를 선택합니다.스캔 설정 섹션에서 프레임 수를 900 또는 원하는 다른 총 프레임 수로 설정합니다. 캡처 창에서 노출 시간을 30밀리초로 설정하고 binning을 2x2로 설정합니다. 캡처 창에서 live를 클릭하여 카메라 보기에서 유충을 찾고 초점을 맞춘 다음 stop live를 클릭하고 시작 버튼을 클릭합니다.동영상을 cxd 형식으로 저장하고 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석합니다. 행동 기록 시스템을 설정하고 텍스트 프로토콜에 따라 유충을 기록 챔버에 배치한 후 마이크로 피펫을 사용하여 50개의 파라메시아를 수집하고 기록 챔버에 배치합니다. 커버 슬립을 레코딩 챔버 위에 놓으려면 커버 슬립에 작은 물 방울을 떨어뜨린 후 레코딩 챔버의 물 표면에 놓아 챔버에 공기가 유입되지 않도록 합니다.조명 시스템에 레코딩 챔버를 배치합니다. 그런 다음 10분 동안 초당 11프레임으로 타임랩스 녹화를 시작합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따른 수행 분석입니다.이 실험에서는 전(pretectal) 영역의 핵을 라벨링하는 Gal4 라인과 후각구 뉴런의 하위 개체군을 사용합니다. 전신경세포(pretectal neuron)는 양측으로 레이저로 절제하였다. 후각 뉴런은 대조군으로 절제되었습니다.결과는 두 개의 광자 레이저가 인접한 신경돌기는 영향을 받지 않도록 유지하면서 표적 세포를 제거할 수 있음을 보여줍니다. 이 실험에서는 축삭돌기를 ILH 동측으로 돌출하는 전(前) 뉴런의 기능적 연결성을 조사했습니다. pretectum과 ILH 모두 먹이의 근위부 존재에서 뉴런 활동을 보였으며, 이는 두 뉴런 활동이 모두 시각적으로 주도된다는 것을 시사합니다.칼슘 이미징은 또한 pretectum의 신경 세포 활동과 pretectal neuron 절제 유충의 ILH를 관찰하는 데 사용되었습니다. 레이저로 절제된 좌측 전두엽은 신경 세포 활동이 전혀 없거나 잔류하는 것으로 나타났습니다. 또한, 동측 ILH는 극적으로 변위된 신경 활동을 보였는데, 이는 ILH에 대한 주요 입력이 동측 전립선(ipsilateral pretectum)에서 비롯됨을 시사합니다.대조적으로, 레이저가 절제된 전립선의 반대편에 있는 ILH는 동측 전립선의 신경 활동과 유사한 신경 활동을 보였는데, 이는 오른쪽 ILH가 우측 전립선에서 입력을 받고 있음을 시사합니다. 일단 마스터되면 각 얼룩말 물고기 유충에 대해 약 1시간 안에 레이저 절제를 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 레이저 조사로 표적 뉴런만 절제하여 레이저에 의한 열 손상을 피하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 전뇌 또는 후뇌와 같은 다른 뇌 영역의 뉴런을 절제하여 이러한 뉴런이 인지 기능이나 운동 기능에 어떻게 관여하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 행동 신경과학 분야의 연구자들이 제브라 피쉬 모델에서 기능적 신경 회로를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라 피쉬 유충 뇌의 뉴런을 구체적으로 레이저로 제거하고 기능적 및 행동적 결과를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.레이저로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 제조업체의 지침을 준수한다는 것을 잊지 마십시오.

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

이 비디오는 먹이 포획 분석에 대해 설명합니다. 이 비디오는 특정 뉴런의 레이저 절제 후 제브라피시 유충의 먹이 포획 행동을 연구하는 방법에 대해 설명합니다.

먹이 포획 분석: 제브라피시 유충의 피식자 포획 행동을 연구하는 방법

이 비디오는 두 개의 광자 레이저 축삭 절개술을 사용하여 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 손상으로부터 축삭 회복을 관찰하는 방법을 설명합니다.

이광자 레이저 축삭 절개술: 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 축삭 회복을 관찰하는 방법

이 비디오는 형광 칼슘 지시약 복합체를 발현하는 뉴런을 이용한 칼슘 지표 기반 형광 이미징을 사용하여 형질전환 제브라피시 유충의 시각적 먹이 감지를 연구하는 방법을 보여줍니다.

형질전환 제브라피시 유충에서 먹이가 유발하는 뉴런 활동 분석

출처: Morsch, M.,   et. al., Triggering cell stress and death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오에서는 형질전환 제브라피시의 개별 뉴런을 정확하게 표적화하고 연구하기 위한 고강도 UV 레이저 절제 기술을 살펴봅니다. 우리는 신경 반응을 준비하고, 고정하고, 시각화하는 방법을 보여주며, 부상과 회복의 세포 역학을 강조합니다.

컨포칼 현미경을 사용한 제브라피시 유충의 선택적 단일 뉴런 레이저 절제

출처: Muto, A., et al. 이광자 레이저를 사용한 신경 세포 집단의 절제 및 제브라피시 유충의 칼슘 이미징 및 행동 기록을 사용한 평가.J. Vis. Exp. (2018) 이 비디오에서,  이광자 레이저 절제 절차가 시연되어 아가로스에 고정된 제브라피시 유충에서 형광 뉴런을 선택적으로 파괴할 수 있습니다. 시술 전후의 고해상도 이미징은 형광의 부재로 관찰되는 바와 같이 효율적인 신경 손상을 확인합니다.

제브라피시 라라바(Larava)에서 이광자 현미경을 사용한 표적 신경 세포 절제

말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

레이저 절제는 생물학적 시스템의 재생을 연구하는 데 널리 적용되는 기술입니다. 제시된 프로토콜은 제브라피시 측면에서 신경마비 세포를 재생시키는 레이저 절제 및 후속 시간 경과 화상 진찰을 위한 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 사용을 설명합니다.

제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

여기에서는 성인 제브라피쉬의 등쪽 전뇌에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

이 프로토콜은 제브라피시 유충에서 수행된 이광자 레이저 절제 접근법을 설명하며, 이는 뼈 재생과 절제에 대한 면역 반응의 효과를 연구하기 위한 모델 역할을 합니다.

발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 Two-photon 레이저 매개 절제

여기에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 GCaMP 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 뇌 영역에서 신경 활동을 조사하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점 형광 이미징

배우세요 양광자 레이저를 사용하여 제브라피시 애벌레의 특정 신경 세포를 제거하고 회로 활성 및 먹이 포착 행동 변화를 분석하는 방법을. 이 기술은 신경 과학 연구에 필수적인 기능적 역할 규명에 활용됩니다.

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

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