Name: Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 항암 쿠마린의 전임상 평가를 위한 3D 배양 및 제브라피시 이종이식 모델을 활용한 약물 발견 기법을 탐색하세요. 이 방법은 생리학적으로 관련성 높은 환경에서 약물 효능을 검증하는 데 도움이 됩니다.

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서울대에서 연구는 종양 Microenvironment 글로벌 핵심 연구 센터 (GCRC) 그랜트, [허가 번호 2011-0030001];에 대 한 한국 개 국립 연구 재단 (NRF)에 의해 지원 됩니다. 서울 국가 대학 연구 보조금 및 두뇌 한국 (BK21) 프로그램 플러스.

1. 식민지 대형 분석 실험
<ol><li>20000 셀/cm2 RPMI1640의 15 ml에서의 농도에서 문화 A549 세포 세포 배양 10 보충 %FBS (태아 둔감 한 혈 청)과 37 ° C, 5% CO2CO2 배양 기에서 75 c m2 플라스 크에 1% 항생제.</li>
	<li>실험의 날에는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 7 분 400 x g 에서 원심 분리 하 여 50, 000 셀을 수집 하 고 다시 1 x 살 균 PBS (인산 염 버퍼) 1.5 mL 튜브에의 100 µ L에서 세포를 일시 중단.</li>
	<li>multipipette와 함께 15 mL 튜브에서 반 고체 스 기반 매체 (MCBM)의 1.1 mL을 분배. 각 조건에 대 한 튜브를 준비 합니다.</li>
	<li>P200 micropipette를 사용 하 여 MCBM의 1.1 ml FBS의 110 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1, 000 셀/mL에서 씨앗 셀입니다. 재고 솔루션 (50000 셀 1 x PBS의 100 µ L)에서 2.4 µ L 세포 현 탁 액의 수집 P2 micropipette 사용 하 고 10% 보충 하는 MCBM의 1.1 mL에 추가 FBS.</li>
	<li>셀, 추가한 후 소용돌이 MCBM와 셀을 잘 혼합 하 최고 속도로 그들을 수직으로 잡고 1 분에 대 한 관.</li>
	<li>테스트 화합물 (OT48 혼자 또는 조합에서 A1210477으로)을 추가 합니다. 제어로 별도 튜브 준비 용 매 사용에 대 한 (여기 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)). 각 조건에 대 한 추가 볼륨과 화합물의 농도 따라 용 컨트롤 용 매 화합물, 테스트의 희석에 대 한 사용 하는 용 매로 인 한 부작용에 대 한 평가의 가장 높은 농도 포함 됩니다.</li>
	<li>1 분 동안 소용돌이 튜브.</li>
	<li>각 분석 결과 대 한 12 음 셀 문화 접시의 센터 P1000 micropipette와 혼합물의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>살 균 물의 1 mL와 함께 빈 우물 또는 습도 안정 시키기 위해 1 x PBS를 채우십시오.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2배양 기에서 10 일 동안 배양 배지를 품 어.</li>
	<li>10 일 후 부 화, 각 잘 1 mg/mL의 최종 농도 도달 하는 MTT (methylthiazolyldiphenyl tetrazolium 브 로마 이드) 재고 솔루션 (5 mg/mL)의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2배양 기에서 10 분을 품 어. 실행 가능한 식민지 바뀝니다 바이올렛.</li>
	<li>흰색 배경 플레이트 (라스 화이트 디 아 트레이)를 사용 하 여 디지털 카메라를 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오. 다음 설정을 사용 합니다: 방법, 디지털화; 노출 유형, 정밀; 노출 시간, 수동, 1 초; 감도/해상도, 높은 해상도입니다. Tiff 형식에 이미지를 저장 합니다.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 가능한 식민지를 계량. 선택 메뉴 "이미지 | 유형 | 8 비트 "입니다. 선택 메뉴 "조정 | 임계값 "입니다. 제어 임계값을 설정 하 고 모든 조건;에 대 한 일정 하 게 유지 선택 메뉴 "분석 | 입자 분석 ". 데이터를 저장 하 고 그래픽 표현에 대 한 통계 소프트웨어와 분석.</li>
</ol>2. 회전 타원 체 형성 분석 결과
<ol><li>10 %FBS 1% 항생제로 보충 RPMI 1640 매체의 15 mL와 75 c m2 플라스 크에 20000 셀/c m2 의 농도에 문화 A549 세포.</li>
	<li>실험 당일 준비는 96 U-바닥판 잘.</li>
	<li>이미 관심 (여기 50 µ M OT48) 및 A1210477의 20 µ M의 화합물을 포함 하는 우물으로 접시 10, 000 셀입니다. 세포 배양의 100 µ L 최종 볼륨을 조정 합니다. 그대로 외부 경계와 균일 한 spheroids를 형성 하는 세포의 수는 양식 spheroids에 적절 한 간주 됩니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에 인큐베이터에서 3 일 동안 품 어.</li>
	<li>3 일 후 부 화, 4 x 확대와 함께 가벼운 현미경을 사용 하 여 spheroids의 이미지를 캡처하십시오.</li>
</ol>3. 제 브라가 종이 식 분석 결과
참고:이 기술 접근 회로도 (그림 1)으로 시각 이다.
<ol><li>
재고 시 약의 준비
	<ol>
<li>Danieau의 솔루션 x 30의 1 리터를 준비: 1740 mM NaCl, 21 m KCl m, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 m m Ca (3)2및 150 mM HEPES. 7.6 pH 미터를 사용 하 여 버퍼의 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>1% (50 x) tricaine 솔루션 준비: 20mg 에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) 2 mL의 증류수에 녹.</li>
		<li>1% 페 놀 레드-PBS 솔루션 준비: 198 µ L의 1.5 µ L 튜브의 소독된 PBS 솔루션 들을 페 놀 레드 나트륨 소금 솔루션의 추가 2 µ L.</li>
		<li>3% 스 준비: Danieau의 솔루션 x 1의 100 mL에 스의 3 세대를 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zebrafish 계란 생산 및 부 화
	<ol>
<li>별도 한 여성 및 파티션 탱크에 한 남성 zebrafish 어둠 속에서 28.5 ° C에서 UV 살 균 및 필터링 된 수돗물으로 가득합니다. 분리의 24 h 후 물고기 짝짓기를 시작 하는 두 남녀의 혼합. 짝짓기 탱크의 수정 된 난 자 신선한 Danieau 솔루션의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 전송.</li>
		<li>세 번 Danieau의 솔루션의 5 mL와 함께 계란을 세척. 세척, 피 펫 및 신선한 솔루션의 5 mL에 계란을 발음 신중 하 게. 8 h 28.5 ° c.에 대 한 품 어<ol>
<li>Danieau의 솔루션에 외피의 8 h 후 0.03 %1-페 닐-2-thiourea 착 색을 억제 (PTU)를 포함 하는 Danieau의 솔루션을 변경 합니다. 오염을 방지 하기 위해 불투명 계란 (unfertilized 또는 포함 미 개발된 태아) 밖으로 정렬.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
태아 dechorionation
	<ol>
<li>24 시간 수정 (hpf), dechorionate zebrafish 태아 날카로운 집게를 사용 하 여 게시할 수 있습니다. 0.03 %Danieau 솔루션에서 해칭 태아를 품 어 48까지 28.5 ° C에서 통해 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
복합 치료 세포 준비
	<ol>
<li>20000 셀/cm2 25 cm2 문화 플라스 크 씨 A549 세포. 뿌리기의 24 h 후 추가 화합물 (50 µ M에서 여기 OT48 및 또는 20 µ M에서 A1210477) 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 24 h에 대 한. 하지만 세포 죽음으로 그들을 저지 하는 세포의 생존 능력을 유지 하기 위해 각 화합물에 대 한 치료 시간을 설정 합니다. 이 시간은 개별적으로 설정 해야 포인트 기준 세포 생존 능력, 형태학 및 분자 마커.</li>
		<li>치료의 끝 전에 2 h, 얼룩 세포 형광 셀 추적기의 4 µ M로 37 ° C, 5% CO2CM Dil 염료. 외피의 2 시간 후 0.05% 트립 신-EDTA, 셀 trypsinize 그리고 106 세포 주입 전에 페 놀 레드-PBS 솔루션의 50 µ L 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이 종이 식 형성에 대 한 암 세포의 마이크로 주입
	<ol>
<li>그들은 한 접시에 정착 될 때까지 5 분 0.02 %tricaine 솔루션에서 zebrafish를 anesthetize.</li>
		<li>(외부 직경 (OD) 유리 모 세관) 1.0 m m는 micropipette 끌어당기는 당겨 (설정 프로그램: p: 300, 열: 260, 당겨: 60, 벨: 50, 및 시간: 200). 주사기는 날카로운 가장자리를 생산 하는 microcapillary를 잘라. 로드 셀/페 놀 레드의 20 µ L 함께 microcapillaries-PBS 솔루션. 사출 압력을 설정 하 고 하는 걸 2 시간 주입 당 nL.</li>
		<li>주사 6 ~ 10 여 른 골목에 100-200 셀 주사 3 ~ 5 주사 통해 nL. 주입 후 물고기를 통해 솔루션을 포함 하는 신선한 Danieau 솔루션의 5 mL에 10 ~ 30 분에 대 한 복구할 수 있습니다. 디스패치 통해 솔루션을 포함 하는 Danieau의 솔루션의 1 mL 24-잘 접시에는 생선과 28.5 ° c.에서 72 h에 대 한 품 어</li>
		<li>외피의 72 h 후 물고기 0.02 %tricaine 솔루션에서 anesthetize 고 스 3%의 하락을 가진 유리 슬라이드에 고정. 620 750의 파장에서 형광 현미경 검사 법에 의해 5 x 사진을 찍어 nm.</li>
		<li>ImageJ 소프트웨어에 의해 형광 종양의 크기를 계량. 선택 메뉴 "분석 | 측정 "입니다. 형광 신호에 해당 하는 값을 저장 하 고 그래픽 표현에 대 한 통계 소프트웨어와 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
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<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

MCBM으로 얻은 식민지 형성의 속도 셀 형식에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 비 부착 한 세포에 대 한 식민지의 수는 부착 세포에 비해 훨씬 높은. 우리가 관찰 A549 세포 10 일 후 30 ~ 40 식민지를 형성 했다. 이전 우리 보고 다른 백혈병 세포에 대 한 식민지의 수 200 ~ 2509사이입니다. 우리의 결과 OT48 혼자 혼자 식민지의 수의 상당한 감소를 생성 하지 않았다 보여주었다. 그러나, BH3 함께에서 A549 세포의 모방 A1210477 식민지 형성 능력 synergistically 감소 되었다. 이전 우리는 다른 hydroxycoumarin 파생 A549 세포의 식민지 형성 능력을 억제 하기 위해 또한 BH3 mimetics와 synergized OT52 보고. 제안 된 시드 농도 1.5 x 10을 1 x 103 에서 다를 수 있습니다3. CFA MethoCult를 사용 하 여 정기적으로 측정 하는 tumorigenesi...

암은 세포 돌연변이 의해 발생 하 고 결과적으로 생 화 확 적인 신호 경로 통제 세포 분열 및 세포 죽음에 저항을 트리거링 혼란 된다. 종양 소화, 신경, 순환 시스템 및 이후에 이웃 조직1의 생리 기능을 방해합니다. 광범위 한 연구 노력에도 불구 하 고 암2세계 가장 널리 퍼진 생명이 질병에 남아 있다. 정밀 의학 미래 암 치료의 기초로 인식 하고있다. 임상 결과 개선 하기 위해 기존 약물과 함께에서 새로운 분자 엔티티를 정기적으로 테스트 합니다.
그러나, 새로운 효율적인 표적으로 한 치료의 개발과 관련 된 중요 한 제한 중 약물 노출3의 정확한 생물 학적 결과 시뮬레이션 하기 위해 일반적으로 사용 되는 분석의 실패 이다. 암 약물 발견 여전히 대부분 암 세포 선에서4임상 시험 확인 하기 어려운 차원 단층 문화에서 교양 치료제의 효능을 테스트에 의존 합니다. 따라서, 더 나은 종양 vivo에서5의 기본 기능을 모방 하는 더 나은 암 모델을 개발 하는 관심이 있다. 최근 몇 년 동안, 3D 문화 모델에 증가 관심 3D 종양 모델5생산 향상된 방법론의 개발에 결과.
여기, 우리는 깊이 비보에 분석 실험에 함께 더 전에 BH3 mimetics hydroxycoumarin OT486 의 힘의 이해를 향상 시킬 수 있도록 세 개의 다른 3D 셀 문화 기술로 접근을 제시. 우리의 방법은 식민지 및 SFAs는 vivo에서 종양 형성에 따라 검사 추가 폐 암 세포에서 OT48 및 BH3 mimetics의 조합의 효능을 확인 하 고 생활에서 암 진행 모니터링 zebrafish 모델에 결합의 구성 유기 체입니다.
식민지 대형 분석 실험 정기적으로 모두 고체 뿐만 아니라 조 혈 암에 대 한 항 암 제의 효능을 평가 하는 데 사용 됩니다. 분석 결과 무한정 증식 하 고 식민지7을 형성 하는 세포의 능력을 결정 합니다. 셀의 능력을 형성 하는 식민지에는 항 암 제의 효과 수의 감소 및 식민지의 크기에 의해 결정 됩니다.
Spheroids 종양 모델 생체 외에서 나타내고 제 에이전트는 저가 심사 플랫폼 역할. Spheroids는에 성장 하는 셀의 집계 또는 3D 매트릭스에 포함 된. 이 접근은 마약 검사 및 종양 성장, 확산 및 면역 상호 작용8의 연구에 널리 사용 됩니다.
완전히 새로운 약물의 속성 이해, vivo에서 실험 설치류에 필수적 이다. 그러나,이 전통적인 메서드는 비용과 시간이 소요 됩니다. 최근 몇 년 동안, zebrafish (Danio rerio) 널리 공부 실험실 유기 체를 저렴 하 고 빠르게 인상 되었다. 종양은 zebrafish 대표 3D 셀 문화 접근에서 하지만 척추9의 vivo에서 설정 내에서 개발.
전부, 사용 여기 CFAs, SFAs zebrafish vivo에서 종양 형성 등 3 가지 3D 문화 접근 BH3 mimetics 함께에서 폐 암 A549 세포 모델에서 hydroxycoumarin OT48의 항 암 제 용량을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td><강>집락 형성 분석에 필요한 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>론자</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS 용액</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml 튜브</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 웰 플레이트</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell 기술</td><td>4230-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT 분말)</td> <td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C &deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>스페로이드 형성 분석에 필요한 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>론자</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS 용액</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Corning costar 초저 부착물 96 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>현미경 Nikon</td><td></td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>제브라피쉬 이종이식에 필요한 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>론자</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5ml 튜브</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS 솔루션</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>황산 마그네슘 헵타 하이드레이트 (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>질산 칼슘 사수화물 (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr>, <tr><td>HEPES 용액</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 (트리카인)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>페놀 레드 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>시그마-알드리치</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-페닐-2-티오우레아 (PTU)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-딜 염료</td><td>인비트로젠</td><td>C7001-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>셔터 기기, 미국</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro</td><td>injector World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>주사기</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 zebrafish xenografts 제 coumarin ot48의 bioactivity의 전 임상 평가

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

생체 외에서 그리고 vivo에서 새로운 치료제의 전 임상 심사 암 약물 발견에 필수적인 도구입니다. 비록 인간의 암 세포 선 2 차원 (차원) 단층 세포 배양에서 치료 화합물에 대응, 더 순수 관련 모델에서 약물의 효능을 이해 하 3 차원 배양 시스템 개발 되었다. 최근 몇 년 동안, 패러다임의 변화는 3D 문화 시스템, 더 정확 하 게 종양 microenvironment를 흉내 낸 새로운 분자의 힘을 확인 하기 위해 전 임상 연구에서 관찰 되었다. 이러한 시스템 보다 생리 적으로 관련 된 방식으로 질병 상태를 특성화 하 고 더 나은 기계적 통찰력 및 주어진된 분자의 약리 효능을 이해 하는 데 도움이. 또한, 암 모델 vivo에서 개선 추세와 함께 zebrafish vivo에서 종양의 형성을 평가 하 고 치료제의 효과 연구 하는 중요 한 척추 모델로 떠오르고 있다. 여기, 우리 조사 hydroxycoumarin OT48의 치료 효능 하거나 폐 암 세포 라인 A549 BH3 mimetics와 함께 식민지 대형 분석 실험 (CFA), 회전 타원 체 형성 분석 결과 (SFA) 등 세 가지 다른 3D 문화 시스템을 사용 하 여 및 zebrafish xenografts vivo에서 .

그림 2, 폐암 A549 했다 시드 MCBM에서 식민지를 형성 하 OT48와 치료 후 또는 표시 농도에서 BH3 모방 A1210477와 선 세포. 결과 조합 크게 감소 번호, 크기 및 식민지의 총 면적 외피의 10 일 후에 나타났다.
그림 3에서는 A549 세포 BH3 모방 A1210477와 혼자 또는 조합에서 OT48로 치료 했다 고 양식 spheroids U-하단 플레이트 기술에 의해 허용 되었다. 3 일 후 부 화, spheroids의 이미지 촬영 했다. spheroids의 정량화 이루어졌다 이미지 J 및 3D를 사용 하 여 이미지 생성 된.
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여기, 선물이 3D 문화와 제 브라를 사용 하 여 항 암 제 coumarins의 전 임상 심사.

Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

이 방법은 in vitro 및 in vivo 3D 배양 시스템을 사용하여 항암 효과를 식별하고 새로운 분자에 대한 더 나은 기계론적 통찰력을 얻기 위해 약물 개발 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생리학적으로 더 관련성이 높은 생체 내 모델에서 화합물의 약리학적 효과의 다양성입니다. 시작하기 위하여는, 75 평방 센티미터 플라스크에 있는 10%FBS와 1%%antibiotics로 보충된 RPMI 1640 세포 배양 매체의 15 밀리리터에 있는 평방 센티미터 당 20, 000의 A549 세포를, 도금하십시오.섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양합니다. 실험 당일에는 혈구계를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. 50의 7 분 동안 400g에 원심분리에 의하여 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관에 있는 000의 세포를 모으고 메마른 1x PBS의 100개 마이크로리터에 있는 세포를 resuspend.멀티 피펫을 사용하여 1.1ml의 반고체 메틸셀룰로오스 기반 매체(MCBM)를 튜브에 분배하여 각 조건에 대해 하나의 튜브를 준비합니다. 그런 다음 각 튜브에 110마이크로리터의 FBS를 추가합니다. 다음으로, 밀리리터당 1000개의 셀을 저장합니다.그런 다음 2.4마이크로리터의 스톡 셀 용액을 MCBM 및 FBS의 튜브에 피펫으로 넣습니다. 세포를 추가한 후 튜브를 수직으로 잡고 1분 동안 최고 속도로 와류로 회전시켜 MCBM과 세포를 완전히 혼합합니다. 이제 테스트 컴파운드 OT48을 단독으로 또는 A1210477와 함께 샘플에 첨가합니다.DMSO와 같이 사용되는 용매에 대한 대조군으로 별도의 튜브를 준비합니다. 그런 다음 1분 동안 샘플을 소용돌이치십시오. 각 분석에 대해 혼합물 1ml를 12웰 세포 배양 플레이트의 중앙 웰에 피펫으로 주입합니다.그런 다음 1ml의 멸균수 또는 PBS를 사용하여 빈 우물을 채웁니다. 플레이트를 섭씨 37도, 5%CO2에서 10일 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 밀리리터당 5밀리그램 MTT 원액을 추가합니다.플레이트를 10분 동안 배양한 후 보라색으로 변하는 생존 가능한 군체가 있는지 확인하십시오. 흰색 배경 플레이트를 사용하여 다음 설정을 사용하여 이미지를 캡처합니다.방법으로 digitize를 선택합니다. 노출 유형에서 정밀도를 선택합니다.노출 시간의 경우 수동 및 1초를 선택합니다. 감도와 해상도의 경우 High Resolution(고해상도)을 선택합니다. 그런 다음 캡처한 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다.ImageJ 소프트웨어를 사용하면 image, type, 8-bit 메뉴를 선택하여 생존 가능한 콜로니를 정량화할 수 있습니다. 메뉴 조정 및 임계값을 선택합니다. 제어할 임계값을 설정하고 모든 조건에 대해 일정하게 유지합니다.그런 다음 메뉴 분석, 입자 분석을 선택합니다. 데이터를 저장하고 그래픽 표현을 위한 통계 소프트웨어로 분석합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 스톡 시약을 준비한 후, 섭씨 28.5도의 UV 살균 및 여과된 수돗물로 채워진 칸막이 탱크에 암컷 제브라피시 1마리와 수컷 제브라피시 1마리를 분리하여 어두운 곳에 둡니다.24시간 동안 분리한 후 파티션을 제거하여 짝짓기를 시작합니다. 짝짓기 탱크에서 수정란을 5ml의 신선한 Danios 용액이 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 5ml의 Danios 용액을 사용하여 피펫을 사용하여 계란을 조심스럽게 흡인하고 5ml의 신선한 용액으로 옮겨 달걀을 세 번 씻습니다.그런 다음 섭씨 28.5도에서 8시간 동안 알을 부화시킵니다. 0.03%PTU를 함유한 Danios 용액으로 변경하여 색소 침착을 억제하고 불투명한 수정되지 않은 난자를 분류하여 오염을 방지합니다. 수정 후 24 시간, 날카로운 집게를 사용하여 배아를 제거하십시오.그런 다음 수정 후 최대 48시간까지 PTU를 사용하여 Danios 용액에서 배아를 배양합니다. A549 세포를 파종하고 텍스트 프로토콜에 따라 화합물로 배양한 후 치료 종료 24시간 전에 형광 세포 추적기 염료인 CM-Dil의 4마이크로몰을 첨가하여 세포를 염색하고 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 0.05%Trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 트립신화합니다.그런 다음, 주입하기 전에 50 마이크로 리터의 페놀 레드 PBS 용액에 10 개에서 6 번째 세포를 희석한다. 암세포의 미세주입을 수행하려면 다음 프로그램 설정을 사용하여 1.0mm 유리 모세관을 당깁니다. 주사기를 사용하여 모세관을 잘라 날카로운 모서리를 만듭니다. 그런 다음 미세 모세관에 20 마이크로 리터의 세포 페놀 레드 용액을 로드합니다.텍스트 프로토콜에 따라 제브라피쉬를 마취한 후, 3-5회 주사를 통해 6-10나노리터를 주입하여 100-200개의 세포를 노른자 자루에 주입합니다. 미세주입은 정확한 양의 세포가 주입되고 주입 부상이 최소화되며 이산화탄소 압력이 측면의 균열을 피하기 위해 최적이어야 합니다. 주입 후 PTU가 함유된 5ml의 신선한 Danios 용액에서 물고기가 10-30분 동안 회복되도록 합니다.생선을 1ml의 Danios PTU 용액이 담긴 24개의 웰 플레이트에 옮기고 섭씨 28.5도에서 72시간 동안 배양합니다. 부화 후 텍스트 프로토콜에 따라 물고기를 마취한 후 3%메틸 셀룰로오스 한 방울로 유리 슬라이드에 고정시킵니다. 620 - 750나노미터의 파장에서 5배 형광 이미지를 촬영합니다.ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석 및 측정을 선택하여 형광 종양의 크기를 정량화할 수 있습니다. 그런 다음 형광 값을 저장하고 그래픽 표현을 위해 통계 소프트웨어로 분석합니다. 이 실험에서 폐암 세포주 A549를 MCBM에 파종하여 OT48 단독 또는 BH3 모방, A1210477와 조합하여 여기에서 볼 수 있는 농도로 처리한 후 콜로니를 형성했습니다.그 결과, 이 조합은 배양 10일 후 군체의 수, 크기 및 총 표면적을 현저히 감소시켰다는 것을 보여주었습니다. 여기서, OT48을 단독으로 또는 BH3 모방제와 병용하여 처리한 후, A1210477, 세포는 U-바닥 플레이트 기술을 사용하여 스페로이드를 형성하도록 허용했습니다. 3일간의 배양 후 스페로이드를 이미지화하고 정량화하고 3D 이미지를 생성했습니다.이 그림은 처리된 세포를 제브라피시 난황 자루에 주입할 때 생성된 형광 종양의 정량화로부터 종양 형성에 대한 OT48 및/또는 A1210477의 억제 가능성을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 데이터의 통계적 평가에 영향을 미치는 중요한 변동을 피하기 위해 각 조건에 대한 물고기 수를 약 10개 이상으로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 제브라피시 이종 이식편에서 표적 단백질 발현을 평가하기 위해 조직학적 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 기술은 신약 개발 분야의 연구자들이 제브라피시 이종 이식편의 생체 내 마이크로 환경에서 화합물의 효능을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 3D 배양 환경에서 약물 효능을 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

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이 비디오는 폐암 세포가 무한정 증식하고 개별 군체를 형성하는 능력을 결정하는 데 도움이 되는 군집 형성 분석에 대해 설명합니다. 항암제가 군집 형성 세포에 미치는 영향은 결과 군체의 수 및/또는 크기의 변화를 분석하여 분석할 수 있습니다.

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Zebrafish의에서 암 세포의 혈관 침습 능력을 (테스트<em&gt; 다니오 레 리오</em&gt;)

Zebrafish 이종이식 모델은 생체 내 미세 환경에서 인간 암 세포의 고처리량 약물 스크리닝 및 형광 이미징을 허용합니다. 당사는 자동 형광 현미경 장착 이미징 유닛을 사용하여 제브라피시의 환자 유래 백혈병 시료에 대한 대규모 자동 약물 스크리닝을 위한 워크플로우를 개발했습니다.

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Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

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