Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

이 방법은 in vitro 및 in vivo 3D 배양 시스템을 사용하여 항암 효과를 식별하고 새로운 분자에 대한 더 나은 기계론적 통찰력을 얻기 위해 약물 개발 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생리학적으로 더 관련성이 높은 생체 내 모델에서 화합물의 약리학적 효과의 다양성입니다. 시작하기 위하여는, 75 평방 센티미터 플라스크에 있는 10%FBS와 1%%antibiotics로 보충된 RPMI 1640 세포 배양 매체의 15 밀리리터에 있는 평방 센티미터 당 20, 000의 A549 세포를, 도금하십시오.

섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양합니다. 실험 당일에는 혈구계를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. 50의 7 분 동안 400g에 원심분리에 의하여 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관에 있는 000의 세포를 모으고 메마른 1x PBS의 100개 마이크로리터에 있는 세포를 resuspend.

멀티 피펫을 사용하여 1.1ml의 반고체 메틸셀룰로오스 기반 매체(MCBM)를 튜브에 분배하여 각 조건에 대해 하나의 튜브를 준비합니다. 그런 다음 각 튜브에 110마이크로리터의 FBS를 추가합니다. 다음으로, 밀리리터당 1000개의 셀을 저장합니다.

그런 다음 2.4마이크로리터의 스톡 셀 용액을 MCBM 및 FBS의 튜브에 피펫으로 넣습니다. 세포를 추가한 후 튜브를 수직으로 잡고 1분 동안 최고 속도로 와류로 회전시켜 MCBM과 세포를 완전히 혼합합니다. 이제 테스트 컴파운드 OT48을 단독으로 또는 A1210477와 함께 샘플에 첨가합니다.

DMSO와 같이 사용되는 용매에 대한 대조군으로 별도의 튜브를 준비합니다. 그런 다음 1분 동안 샘플을 소용돌이치십시오. 각 분석에 대해 혼합물 1ml를 12웰 세포 배양 플레이트의 중앙 웰에 피펫으로 주입합니다.

그런 다음 1ml의 멸균수 또는 PBS를 사용하여 빈 우물을 채웁니다. 플레이트를 섭씨 37도, 5%CO2에서 10일 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 밀리리터당 5밀리그램 MTT 원액을 추가합니다.

플레이트를 10분 동안 배양한 후 보라색으로 변하는 생존 가능한 군체가 있는지 확인하십시오. 흰색 배경 플레이트를 사용하여 다음 설정을 사용하여 이미지를 캡처합니다.방법으로 digitize를 선택합니다. 노출 유형에서 정밀도를 선택합니다.

노출 시간의 경우 수동 및 1초를 선택합니다. 감도와 해상도의 경우 High Resolution(고해상도)을 선택합니다. 그런 다음 캡처한 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다.

ImageJ 소프트웨어를 사용하면 image, type, 8-bit 메뉴를 선택하여 생존 가능한 콜로니를 정량화할 수 있습니다. 메뉴 조정 및 임계값을 선택합니다. 제어할 임계값을 설정하고 모든 조건에 대해 일정하게 유지합니다.

그런 다음 메뉴 분석, 입자 분석을 선택합니다. 데이터를 저장하고 그래픽 표현을 위한 통계 소프트웨어로 분석합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 스톡 시약을 준비한 후, 섭씨 28.5도의 UV 살균 및 여과된 수돗물로 채워진 칸막이 탱크에 암컷 제브라피시 1마리와 수컷 제브라피시 1마리를 분리하여 어두운 곳에 둡니다.

24시간 동안 분리한 후 파티션을 제거하여 짝짓기를 시작합니다. 짝짓기 탱크에서 수정란을 5ml의 신선한 Danios 용액이 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 5ml의 Danios 용액을 사용하여 피펫을 사용하여 계란을 조심스럽게 흡인하고 5ml의 신선한 용액으로 옮겨 달걀을 세 번 씻습니다.

그런 다음 섭씨 28.5도에서 8시간 동안 알을 부화시킵니다. 0.03%PTU를 함유한 Danios 용액으로 변경하여 색소 침착을 억제하고 불투명한 수정되지 않은 난자를 분류하여 오염을 방지합니다. 수정 후 24 시간, 날카로운 집게를 사용하여 배아를 제거하십시오.

그런 다음 수정 후 최대 48시간까지 PTU를 사용하여 Danios 용액에서 배아를 배양합니다. A549 세포를 파종하고 텍스트 프로토콜에 따라 화합물로 배양한 후 치료 종료 24시간 전에 형광 세포 추적기 염료인 CM-Dil의 4마이크로몰을 첨가하여 세포를 염색하고 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 0.05%Trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 트립신화합니다.

그런 다음, 주입하기 전에 50 마이크로 리터의 페놀 레드 PBS 용액에 10 개에서 6 번째 세포를 희석한다. 암세포의 미세주입을 수행하려면 다음 프로그램 설정을 사용하여 1.0mm 유리 모세관을 당깁니다. 주사기를 사용하여 모세관을 잘라 날카로운 모서리를 만듭니다. 그런 다음 미세 모세관에 20 마이크로 리터의 세포 페놀 레드 용액을 로드합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 제브라피쉬를 마취한 후, 3-5회 주사를 통해 6-10나노리터를 주입하여 100-200개의 세포를 노른자 자루에 주입합니다. 미세주입은 정확한 양의 세포가 주입되고 주입 부상이 최소화되며 이산화탄소 압력이 측면의 균열을 피하기 위해 최적이어야 합니다. 주입 후 PTU가 함유된 5ml의 신선한 Danios 용액에서 물고기가 10-30분 동안 회복되도록 합니다.

생선을 1ml의 Danios PTU 용액이 담긴 24개의 웰 플레이트에 옮기고 섭씨 28.5도에서 72시간 동안 배양합니다. 부화 후 텍스트 프로토콜에 따라 물고기를 마취한 후 3%메틸 셀룰로오스 한 방울로 유리 슬라이드에 고정시킵니다. 620 - 750나노미터의 파장에서 5배 형광 이미지를 촬영합니다.

ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석 및 측정을 선택하여 형광 종양의 크기를 정량화할 수 있습니다. 그런 다음 형광 값을 저장하고 그래픽 표현을 위해 통계 소프트웨어로 분석합니다. 이 실험에서 폐암 세포주 A549를 MCBM에 파종하여 OT48 단독 또는 BH3 모방, A1210477와 조합하여 여기에서 볼 수 있는 농도로 처리한 후 콜로니를 형성했습니다.

그 결과, 이 조합은 배양 10일 후 군체의 수, 크기 및 총 표면적을 현저히 감소시켰다는 것을 보여주었습니다. 여기서, OT48을 단독으로 또는 BH3 모방제와 병용하여 처리한 후, A1210477, 세포는 U-바닥 플레이트 기술을 사용하여 스페로이드를 형성하도록 허용했습니다. 3일간의 배양 후 스페로이드를 이미지화하고 정량화하고 3D 이미지를 생성했습니다.

이 그림은 처리된 세포를 제브라피시 난황 자루에 주입할 때 생성된 형광 종양의 정량화로부터 종양 형성에 대한 OT48 및/또는 A1210477의 억제 가능성을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 데이터의 통계적 평가에 영향을 미치는 중요한 변동을 피하기 위해 각 조건에 대한 물고기 수를 약 10개 이상으로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 제브라피시 이종 이식편에서 표적 단백질 발현을 평가하기 위해 조직학적 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 신약 개발 분야의 연구자들이 제브라피시 이종 이식편의 생체 내 마이크로 환경에서 화합물의 효능을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 3D 배양 환경에서 약물 효능을 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.