Name: 개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 배우세요 인간 비강 상피 세포로 구형체를 생성하여 CFTR 기능을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 낭성 섬유증 치료제 반응을 평가하는 개인 맞춤형 분석 도구로 활용됩니다.

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이 작품은 낭 성 섬유 증 재단 치료제에 의해 지원 되었다, CLANCY14XX0, 번호를 부여 하 고 낭 성 섬유 증 재단을 통해 CLANCY15R0 번호를 부여. 저자는 크리스티나 레이 환자 모집 및 규제 감독 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 저자 또한 HNE 문화 능력의 세대에 지원 낭 성 섬유 증 재단에서 지 원하는 HNE 작업 그룹을 감사 하 고 싶다: 프레스 톤 Bratcher, 캘빈 면, 마르티나 Gentzsch, 엘리자베스 Joseloff, 마이클 Myerburg, 데이브 니콜스, 스콧 Randell, 스티브 로우, G. 마티 솔로몬, 그리고 캐서린 Tuggle

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜 환자 파생 코 셀 회전 타원 체 문화 CFTR 함수의 개별, 구체적인 모델을 생산할 수의 생성을 설명 합니다. 밀접 하 게 어려움을 피하기 위해 참석 해야 하는 과정에서 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 먼저 환자의 코에서 좋은 샘플 인수가입니다. 좋은 샘플 있어야 > 50000 세포, 점액/파편, 제한 하 고 (비록 성공 또한 쉽게 달성로 얼음에 배송) 4 h 이내 처리에 대 한 준비. 연습 연구 직원을 퀴 렛 또는 브러시 샘플 획득은 필요는 그들의 편안 함을 극대화 하기 위해 하나 또는 두 개의 공급자의 손에 초기 샘플 수집을 초점에 의해 촉진 된다. 둘째, 좋은 청소/살 균 기술 모든 조직 문화 단계에 필수적 이다. 모든 HNE 문화에 대 한 우리의 경험, 실패의 기본 모드는 기본 예제와 다른 성장 문화 인큐베이터에서 복잡 하 게 수 세균 이나 곰 팡이 오염. 문화 만성 감염 (예를 들어, CF) 과목의 증가이 위험, 따라서 성공 깨끗 하 고 별도 문화를 유지 하는 기능에 경첩. 우리의 연습 유지...

낭 성 섬유 증 (CF) 이상 7 만명 세계적으로1에 영향을 미치는 치명적인, 상 염색체 열성 질병 이다. 이 수명 단축의 유전 질환 돌연변이 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 단백질 (CFTR)2에 의해 발생 합니다. CFTR의 멤버인 아데노신 3 인산 염 바인딩 카세트 가족과 기능으로 위장, 땀 샘을 포함 하 여 여러 편광된 epithelia의 꼭대기 막 걸쳐 염화 중 탄산염의 움직임을 허용 하는 이온 채널 그리고 호흡 나무, 다른 사람의 사이에서,34. 따라서, 역 기능적인 CFTR multisystem 상피 부전, 호흡기 질환1에서 형태소 분석 대부분 사망률과 리드. CF 폐, CFTR 구동 기도 표면 액체 (ASL) 규정과 점액 릴리스 리드의 굵은 점액, 기도 방해, 만성 감염, 및 진보적인 기도 개장 손실 및 폐 기능1,5.
질병의 원인으로 CFTR 부전의 식별에 불구 하 고 CF에 치료 증상 (예, 췌 장 효소 대체 요법, 기도 클리어런스 치료)1의 완화에 전통적으로 집중 했다. 이 접근은 최근 "CFTR 변조기," 직접 역 기능적인 CFTR 대상 되 나 새로운 치료제의 출현에 의해 혁명을 일으켰다. 이 방법은 이동 했다 임상 가로 증상 관리에서 질병을 수정 상관 하지만 몇 가지 제한6,7,8,,910. 변조기 활동은 각 CFTR 돌연변이 동반 하는 단백질 결함을 구체적이 고 유전 인구11선택 제한. 이 제한은 단백질 결함의 이질적인 본질 뿐만 아니라 희귀 돌연변이 그룹에서 임상 시험의 비에 의해 구동 됩니다. 또한, 잘 공부 genotypes (예를 들어, F508del/F508del CFTR 가장 일반적인 CFTR 돌연변이), 과목 중 거기에 넓은 가변성 질병 부담 및 변조기 응답6,7,8 ,,911.
모두 이러한 문제를 극복 하기 위해 수 사관 전 임상 테스트12맞춤된 모델의 사용을 제안 했다. 이 개념 맞춤된 패션에서 치료 주제 응답 vivo에서 예측는 개별 비보 전 모델 시스템 복합 테스트 생성 하 환자 관련 조직을 활용 합니다. 일단 확인, 이러한 모델 임상 드라이브 정밀 치료 환자의 기본 CFTR 유전자 형에 의해 사용 될 수 있습니다.
폐 이식 시 explant 조직에서 얻은 인간 기관지 상피 (HBE) 셀 CF13,14에 대 한 이러한 모델의 가능성을 설립. 공기 액체 인터페이스 (알리)에서 성장 하는 HBEs 기능 CFTR 정량화 electrophysiologic 테스트를 통해 직접 또는 간접적으로 ASL 항상성13,15의 조치를 통해 하실 수 있습니다. 이 모델은 CFTR 생물학을 이해 하는 중요 한 되었고 CFTR 변조기16의 개발의 핵심 드라이버 했다. 불행히도, HBE 모델 희귀 돌연변이 또는 가벼운 질병에 대 한 맞춤된 모델 수집 (폐 이식 또는 기관지 솔 질)의 침략 적인 본질과 샘플의 부족으로 유지할 수 없습니다. 반대로, 장 조직, 직장 또는 십이지 장 생 검 표본에서 얻은를 사용할 수 있는 장 전류 측정 (ICM) 또는 붓기 기반 organoid 분석 결과 대 한 개별적인된 CFTR 함수17,18, 연구 19. Organoid 분석 실험, 특히 CFTR 활동20,,2122의 매우 중요 한 모델 이다. 두 모델은 조직 소스 (장 조직, 대부분 질병 병 리는 호흡) 및 수집의 반 침략 적 방법에 의해 제한 됩니다. 또는, 여러 조사 모델 CFTR 복원23,,2425인간의 비 강 상피 (HNE) 세포를 공부 했다. HNEs는 브러쉬 또는 소파 어떤 나이의 주제에 의해 안전 하 게 수확 하실 수 있습니다 그리고, 알리, 경작 하는 때 HBEs25,26,,2728의 많은 특성을 정리. HNE 단층 문화는 전통적으로 편평 변화와 성숙29에 오랜 시간에 의해 제한 되었습니다. 또한, 보고 단락 회로 전류 측정 HNEs에는 HBEs, 치료 효능25를 감지 하는 작은 창을 제안에 그 보다 작은.
CFTR 기능의 개인, 비-침략 적, 호흡기 조직 문화 모델에 대 한 필요성을 감안할 때, 우리 HNEs의 비-침략 적 및 호흡기 자연과 붓기-기반, organoid 분석 결과의 감도 병합 하고자 했다. 여기, 붓기 기반 분석 결과30에 개별된 CFTR 연구에 대 한 HNEs의 3 차원 "회전 타원 체" 문화를 생성 하는 우리의 방법을 설명 합니다. HNE spheroids 구 중심, 또는 루멘으로 상피 정점으로 안정적으로 분극. 이 모델은 낮은 호흡기 상피의 수많은 특성이 고 알리 문화 보다 더 빨리 성숙. 기능 시험으로 HNE spheroids 안정적으로 CFTR 범위 기능 뿐만 아니라, 잘 공부 돌연변이 그룹 (예를 들어, F508del CFTR)에 변조를 계량. 이 붓기 기반 분석 결과 직접 측정 하지 유체 유입은 회전 타원 체로 물 꼭대기 소금 경과 다음과 같이 CFTR의 이온/소금 전송 속성에 대문자로 바꿉니다. 이 패션에 완벽 하 게 기능적인 CFTR와 자극된 spheroids 팽창 견고 하 게, 그 역 기능 CFTR 덜 팽창 또는 수축 하는 동안. 이 사전 이미지 분석을 통해 정량은 고 1 시간 후 자극 spheroids, luminal 영역을 측정 하 고 결정 하는 백분율 변경 합니다. 이 측정 후 실험 그룹 환자 전용 패션에 약 bioactivity에 대 한 화면을 통해 비교할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf Tube</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>150 mL 필터 플라스크</td><td>Midsci&nbsp;</td><td>TP99150</td><td>여과 매체</td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Midsci&nbsp;</td><td></td><td></td>TP91015</tr><tr><td>1 L 필터 플라스크</td><td>Midsci&nbsp;</td><td>TP99950</td><td>미디어 필터링</td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td>선택적</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AC228420010&nbsp;</td><td>1mL의 DMSO에 22.0mg의 100mM 원액을 준비합니다</td></tr>.<tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Midsci&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>TP91050</tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AT-104</td><td>세포 분리 용액</td></tr><tr><td>아데닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2786-25G</td><td>표 1 참조</td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9528-100MG</td><td>표 1 참조</td></tr><tr><td>소 뇌 추출물 (9mg/mL)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4098</td><td>표 2 참조</td></tr><tr><td>Ceftazidime 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3809-1G</td><td>표 1 참조</td></tr><tr><td>셀 스크래퍼 20 cm&nbsp;</td><td>미시과학&nbsp;</td><td></td><td></td>TP99010</tr><tr><td>CFTR Inh172</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3430</td> DMSO 콜레라 독소 B (Vibrio cholerae에서) <td>1mL에 4.0mg의 10mM 원액을 준비하십시오</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>표 1 참조</td></tr><tr><td>CYB-1</td><td>Medical Packaging Corporation</td><td>CYB-1</td><td>세포학 브러시</td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드 (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형된 독수리 매체 (DMEM)/F12 Hepes&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td>11330-057</td><td>기본 매체; 표 1 및 2 참조</td></tr><tr><td>표피 성장 인자 (재조합 인간 단백질, 동물 유래 없음)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>PHG6045 표 1 참조</td></tr><tr><td>Epinephrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4250-1G</td><td>표 2</td></tr><tr><td>참조 Ethanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 아민</td><td>시그마-알드리치</td><td>E0135-500ML</td><td>16.6 mM 용액; 표 2 참조</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>TCI America&nbsp;</td><td>E0084</td><td></td></tr><tr><td>소태아 혈청 (고성능 FBS)</td><td>인비트로겐&nbsp;</td><td>10082147</td><td>표 1 참조</td></tr>: <tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886-50</td> DMSO Growth Factor-Reduced Matrigel Corning, Inc.<td>의 1mL에 4.1mg의 10mM 원액을 준비합니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>356231</td><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) 기저막 매트릭스, 페놀 레드-프리, LDEV-프리, 10 mL.</td></tr><tr><td>Hemacyometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>인간 콜라겐 솔루션, 유형 I (VitroCol; 3 mg/mL)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5007-A</td><td>콜라겐 솔루션</td></tr><tr><td>HyClone (aka FetalClone II)&nbsp;</td><td>GE 헬스케어&nbsp;</td><td>SH30066.03HI</td><td>표 2 참조</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>StemCell Technologies</td><td>07904</td><td>표 1 및 2 참조</td></tr><tr><td>인슐린, 인간 재조합, 아연 용액</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12585014</td><td>4 mg/mL 용액; 표 2 참조</td></tr><tr><td>: IVF 4-Well Dish, Non-treated</td><td>NUNC (via Fisher Scientific)</td><td>12566350</td><td>스페로이드용 4-웰 플레이트; 24-웰 플레이트와 유사한 웰 크기</td></tr><tr><td>MEF-CF1-IRR</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6001G</td><td>방사선 처리된 쥐 배아 섬유아세포</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7</td><td>분자 장치</td><td></td><td>분석 소프트웨어; 견적 https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software</td></tr><tr><td>Olympus IX51 도립 현미경</td><td>Olympus Corporation</td>은 이미징 현미경을 <td>단종했습니다</td><td>. 교체: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&nbsp; 견적</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15140122</td><td>표 2 참조</td></tr><tr><td>Phsophoryletheanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503-5G</td><td>표 2 참조</td></tr><tr><td>레티노산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>표 2 참조</td></tr><tr><td></td><td>Rhinoprobe Arlington Scientific, Inc.</td><td>96-0905</td><td>비강 큐렛</td></tr><tr><td>슬라이드북 5.5</td><td>3i, Intelligent Imaging Innovations</td><td>단종</td><td>이미징 소프트웨어. 교체: 슬라이드 북 6, 견적 https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td></tr><tr><td>Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 100</td><td>Techno Plastic Products</td><td>93100</td><td>팽창 용 조직 배양 접시</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>표 1 참조</td></tr><tr><td>트랜스페린 (인간 트랜스페린 0.5 mL)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4205</td><td>표 2 참조</td></tr><tr><td>트리요오도트리오닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>T6397-1G</td><td>3,3&프라임;,5-트리요도-L-티로닌 나트륨 염&nbsp; [T3]; 표 2 참조</td></tr>: <tr><td>돼지 췌장에서 추출한 트립신</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>T4799-10G</td><td></td></tr>, <tr><td>Ultroser-G</td><td>, Crescent Chemical(Fisher Scientific 경유)</td><td>NC0393024</td><td>20mL 리포필화 분말; 표 2 참조</td></tr><tr><td>Streptomyces orientalis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2002-5G</td>의 반코마이신 염산염 <td>표 1</td></tr><tr><td>VX770</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td> 참조 DMSO <td></td></tr><tr><td>VX809</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1565</td> 1mL에 <td>4.5mg의 10mM 염원 용액 준비 DMSO Y-27632 Dihydrochloride 1mL에 4.5mg의 10mM 염원 용액을 구입하거나 준비</td></tr>하십시오<tr><td>. ROCK 억제제&nbsp;</td><td>엔조 라이프사이언스&nbsp;</td><td>ALX-270-333-M025&nbsp;</td><td>표 1 참조</td></tr></tbody></table>

개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 spheroids의 생성

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 변조기 약물의 도입 치료 낭 성 섬유 증 (CF)에 혁명 하고있다, 그러나 현재 사용 되 고 있는 유전자 이동 치료 모델은 몇 가지 제한이 있습니다. 첫 번째, 희귀 또는 understudied 돌연변이 그룹 확실 한 임상 시험에서 제외 됩니다. 또한, 추가 변조기 마약 시장에 진입, 그것은 변조기 선택 개별 주제에 대 한 최적화 하기가 될 것입니다. CFTR 기능 및 변조, 개별 환자 파생 전 임상 모델 시스템의 사용으로 이러한 문제를 모두 해결 합니다. 인간의 비 강 상피 세포 (HNEs)는 이러한 모델에 대 한 호흡기 조직의 쉽게 접근할 수 있는 소스입니다. 여기는 CFTR 기능과 기본 HNEs를 사용 하 여 변조의 3 차원 회전 타원 체 모델의 생성에 설명 합니다. HNEs 과목 조건부 재활 조건에서 확장 및 회전 타원 체 문화에 시드, 최소 침 습 방식 으로부터 격리 됩니다. 뿌리기의 2 주 안에 회전 타원 체 문화 HNE spheroids와 3', 5'-주기적인 아데노신 monophosphate (캠프) 자극 될 수 있는 생성-생성 촉진제 CFTR 기능을 활성화. 회전 타원 체 붓기는 CFTR 활동의 프록시 다음 정량 된다. HNE spheroids 질병 사망률 및 사망을 반영 하는 상피에 관련 된 접근, 맞춤 모델을 생성 하 비 강 세포의 침 습, 아직 호흡기 근원에 대문자로 표기 합니다. 공기 액체 인터페이스 HNE 문화에 비해, spheroids는 상대적으로 빨리 성숙, 전체 오염 속도 감소 시키는 있습니다. 그것의 현재 모양에서 모델이 조직 취득 상대적으로 완화에 의해 상쇄 됩니다 비록 낮은 처리량에 의해 제한 됩니다. Spheroids HNE 안정적으로 계량 CFTR 활동 개별 수준에서 특성을 사용할 수 있습니다. Vivo에서 마약 응답을이 정량화를 넥타이 하는 지속적인 연구 HNE spheroids CFTR 변조에 환자의 응답의 진정한 전 임상 예언자 인지 결정 됩니다.

HNEs 문화 접시를 연결 하 고 시드;의 72 h 내의 셀의 작은 섬 형성 한다 1 주일에 좋은 고 가난한 섬 형성의 예는 각각 그림 1A 및 1B에 표시 됩니다. 이 섬 15-30 일의 과정을 통해 요리를 확장 해야 합니다. 작은 또는 차선 샘플 더 오래 걸릴 수 있습니다 및 종종 유용한 spheroids를 생성 하지 것입니다. 전염 성 요원으로 오염 깊은 노란색/흐린 미디어, 문화 접시를 연결할 셀의 실패 및 곰 팡 이/세균의 직접 시각화로 입증 됩니다. 모든 오염 된 문화 교차 오염을 피하기 위해 즉시 폐기 해야한다.
지하실 막 매트릭스에 문화의 첫 번째 3-4 일 이내 작은 낭 성 구조 행렬에서 양식 하기 시작 한다. 이 얇은 벽과 luminal 표면 보여주는 그대로 sp...

여기 우리 인간의 비 강 상피 세포의 3 차원 회전 타원 체 문화를 생성 하는 방법을 설명 합니다. Spheroids는 다음 드라이브 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 자극-종속 이온 및 액체 분 비, CFTR 함수에 대 한 프록시로 회전 타원 체 luminal 크기의 변화를 측정.

개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

이 절차의 전반은 궁극적으로 기능적 CFTR 연구를 위한 분석법으로 사용할 수 있는 인간 비강 세포 스페로이드를 생성하는 것입니다. 이 방법은 체외 모델 시스템에서 CFTR 변경 약물에 대한 개별 피험자의 반응을 평가하는 것과 같은 낭포성 섬유증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 작은 비강 세포 샘플에서 비교적 빠른 시간 내에 많은 수의 스페로이드가 생성되어 광범위한 테스트가 가능하다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Lauren Strecker와 Jessica Moncivaiz입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 공급섬유아세포에서 인간 비강 상피 또는 HNE 세포를 처리하고 확장한 후 미리 준비한 확장 배지, 분화 배지, 0.1% 트립신 EDTA 용액 및 멸균 PBS를 30분 이상 실온에서 가져옵니다. 그런 다음 70% 에탄올을 사용하여 용기를 청소하고 깨끗한 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.생물 안전성 캐비닛에서 진공 라인에 부착된 파스퇴르 피펫을 사용하여 HNE 배양에서 배지를 흡인하고 폐기합니다. 그런 다음 깨끗한 혈청학적 피펫으로 5ml의 PBS를 사용하여 완충액을 추가하고, 휘젓고, 흡인하여 접시를 세척합니다. 배양액에 0.1% 트립신 EDTA 용액 5ml를 첨가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 5분 동안 배양기에 다시 넣습니다.그런 다음 4-10X의 도립 현미경으로 세포가 접시에서 분리되어 둥글고 떠 다니는지 확인합니다. 배양 접시의 측면을 부드럽게 두드려 세포를 제거하고 필요한 경우 대부분의 세포가 분리될 때까지 접시를 5분 더 다시 배양합니다. 다음으로, 10 밀리리터 혈청학 피펫을 사용하여 5 밀리리터의 팽창 배지를 접시에 넣고 모든 액체를 라벨이 붙은 멸균 50 밀리리터 원추형 튜브에 모읍니다.3차례의 트립신화 후에도 세포가 배양 접시에 부착되어 있으면 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 남은 세포를 부드럽게 분리하고 5ml의 팽창 배지로 스크레이퍼와 접시를 세척하고 내용물을 동일한 라벨이 붙은 원뿔형 튜브에 모읍니다. 튜브를 섭씨 4도에서 360회 g으로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 1ml의 팽창 배지를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 제조업체의 지침에 따라 얼음 위에서 기저막 매트릭스를 해동합니다. 매트릭스 밀리리터당 500, 000 세포의 최종 농도를 위해 적절한 수의 차등적으로 트립신화된 계대 세포를 분리합니다.4 웰 플레이트의 경우 200, 000 세포를 사용하여 1.5 밀리리터 튜브에 모으십시오. 다음으로, 세포 혼합물을 360배 g 이하에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 1 밀리리터 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의하면서 배지를 완전하고 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오.세포 튜브를 적극적으로 다루지 않을 때는 얼음 위에 보관하십시오. 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 계획된 웰당 100마이크로리터의 기저 멤브레인 매트릭스를 세포에 추가합니다. 기포가 유입되지 않도록 피펫 팁을 완전히 비우지 않고 피펫을 위아래로 움직여 세포를 신중하고 철저하게 재현탁시킵니다.매트릭스가 응고되지 않도록 빠르게 이동합니다. 4웰 IVF 배양 플레이트의 각 웰에 100ml 매트릭스 분취액을 시딩하려면 깨끗한 가위를 사용하여 200마이크로리터 피펫 팁에서 원위 3-4mm를 잘라냅니다. 100마이크로리터의 세포 매트릭스 혼합물을 각 웰의 중앙에 조심스럽게 천천히 피펫으로 주입하여 방울이 구형으로 유지되고 웰의 측면에 닿지 않도록 합니다.플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 굳을 때까지 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 분화 배지를 각 웰에 조심스럽게 피펫으로 넣고 매트릭스 드롭을 방해하지 않도록주의하십시오. 매체가 드롭을 덮고 있는지 확인하고 필요한 경우 더 추가합니다.HNE 스페로이드를 배양하려면 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 스페로이드를 파괴하는 매트릭스를 피하면서 웰의 모든 배지를 부드럽게 흡인합니다. 그런 다음 새 1ml 피펫 팁을 사용하여 매트릭스를 만지거나 방해하지 않도록 하면서 매트릭스 주위의 웰에 500마이크로리터의 분화 배지를 부드럽게 추가합니다. 스페로이드를 계속 배양하고, 방금 시연한 것처럼 분화 배지를 매주 3회 교체합니다.20X 배율의 도립 현미경으로 매일 스페로이드 형태를 평가합니다. 스페로이드는 도금 후 3일에서 5일 이내에 형성되어야 하며 약 10일 이내에 성숙해야 합니다. HNE는 배양 접시에 부착되어 파종 후 72시간 이내에 작은 섬을 형성해야 합니다.1주일에 좋은 섬과 나쁜 섬 형성의 예가 여기에 나와 있습니다. 섬은 15일에서 30일 동안 접시를 덮을 수 있도록 확장되어야 합니다. 배양 후 첫 3-4일 이내에 작은 낭성 구조가 기질에 형성되기 시작하고 약 10일에 걸쳐 성숙해야 합니다.설명된 밀도로 도금된 경우, 성공적인 배양에는 매트릭스 드롭당 50-100개의 스페로이드가 포함됩니다. 내강은 야생형 CFTR과 같이 비교적 맑거나 CF 스페로이드에서와 같이 세포 파편과 점액으로 채워질 수 있습니다. 스페로이드의 광강 영역을 묘사하기 위한 마스킹은 이 두 패널에서 시연됩니다.여기에 표시된 것은 잘못 형성된 실패한 스페로이드 배양의 예입니다. 기능 분석에서 이러한 그래프에 설명 된 바와 같이, 야생형 CFTR을 가진 피험자로부터의 스페로이드는 자극을 받으면 한 시간 이상 팽창해야하며 CFTR 억제제 inh-172의 존재 하에서 자극되면 덜 팽창하거나 수축해야합니다. F508del-CFTR에 대한 동형접합체의 피험자로부터의 스페로이드는 CFTR 조절제 VX809 및 VX770으로 약리학적으로 교정될 때 팽창이 증가하거나 수축이 감소하면서 매우 약간 수축하거나 팽창해야 합니다.일단 마스터하면 비강 세포 스페로이드 파종은 제대로 수행되면 15-20분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 오염 위험을 최소화하고 자신의 건강에 대한 위험을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛 내에서 깨끗한 작동 절차를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 세포 형태 및 구성에 대한 추가 질문에 답하기 위해 고정, 염색 및 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후, CFTR 기능의 개인화 된 분석법으로 활용 될 수있는 1 차 인간 비강 세포 스페로이드를 생성하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다. 일차 인체 조직으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행할 때 항상 적절한 개인 보호 장비 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

이 간행물은 어린이의 코 상피 점막을 성공적으로 샘플링 및 배양하고 이러한 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다.

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

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포스 콜린 유발 장내 Organoids에 붓기 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 분석 낭포 성 섬유증 환자의 약물 반응을 평가하기위한

우리는 제노푸스 laevis 배아로부터 분리된 깊은 자궁 근세포세포로부터 점도 상피 오르가노이드를 개발하는 간단한 프로토콜을 기술합니다. 다능성 선조는 상피 잔잔 세포 전구체를 재생하고 오르가노이드 표면의 세포 전이의 개시 및 진행을 실시간으로 추적할 수 있도록 합니다.

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상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

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