개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성

이 절차의 전반은 궁극적으로 기능적 CFTR 연구를 위한 분석법으로 사용할 수 있는 인간 비강 세포 스페로이드를 생성하는 것입니다. 이 방법은 체외 모델 시스템에서 CFTR 변경 약물에 대한 개별 피험자의 반응을 평가하는 것과 같은 낭포성 섬유증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 작은 비강 세포 샘플에서 비교적 빠른 시간 내에 많은 수의 스페로이드가 생성되어 광범위한 테스트가 가능하다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Lauren Strecker와 Jessica Moncivaiz입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 공급섬유아세포에서 인간 비강 상피 또는 HNE 세포를 처리하고 확장한 후 미리 준비한 확장 배지, 분화 배지, 0.1% 트립신 EDTA 용액 및 멸균 PBS를 30분 이상 실온에서 가져옵니다. 그런 다음 70% 에탄올을 사용하여 용기를 청소하고 깨끗한 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.

생물 안전성 캐비닛에서 진공 라인에 부착된 파스퇴르 피펫을 사용하여 HNE 배양에서 배지를 흡인하고 폐기합니다. 그런 다음 깨끗한 혈청학적 피펫으로 5ml의 PBS를 사용하여 완충액을 추가하고, 휘젓고, 흡인하여 접시를 세척합니다. 배양액에 0.1% 트립신 EDTA 용액 5ml를 첨가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 5분 동안 배양기에 다시 넣습니다.

그런 다음 4-10X의 도립 현미경으로 세포가 접시에서 분리되어 둥글고 떠 다니는지 확인합니다. 배양 접시의 측면을 부드럽게 두드려 세포를 제거하고 필요한 경우 대부분의 세포가 분리될 때까지 접시를 5분 더 다시 배양합니다. 다음으로, 10 밀리리터 혈청학 피펫을 사용하여 5 밀리리터의 팽창 배지를 접시에 넣고 모든 액체를 라벨이 붙은 멸균 50 밀리리터 원추형 튜브에 모읍니다.

3차례의 트립신화 후에도 세포가 배양 접시에 부착되어 있으면 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 남은 세포를 부드럽게 분리하고 5ml의 팽창 배지로 스크레이퍼와 접시를 세척하고 내용물을 동일한 라벨이 붙은 원뿔형 튜브에 모읍니다. 튜브를 섭씨 4도에서 360회 g으로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 1ml의 팽창 배지를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 제조업체의 지침에 따라 얼음 위에서 기저막 매트릭스를 해동합니다. 매트릭스 밀리리터당 500, 000 세포의 최종 농도를 위해 적절한 수의 차등적으로 트립신화된 계대 세포를 분리합니다.

4 웰 플레이트의 경우 200, 000 세포를 사용하여 1.5 밀리리터 튜브에 모으십시오. 다음으로, 세포 혼합물을 360배 g 이하에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 1 밀리리터 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의하면서 배지를 완전하고 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오.

세포 튜브를 적극적으로 다루지 않을 때는 얼음 위에 보관하십시오. 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 계획된 웰당 100마이크로리터의 기저 멤브레인 매트릭스를 세포에 추가합니다. 기포가 유입되지 않도록 피펫 팁을 완전히 비우지 않고 피펫을 위아래로 움직여 세포를 신중하고 철저하게 재현탁시킵니다.

매트릭스가 응고되지 않도록 빠르게 이동합니다. 4웰 IVF 배양 플레이트의 각 웰에 100ml 매트릭스 분취액을 시딩하려면 깨끗한 가위를 사용하여 200마이크로리터 피펫 팁에서 원위 3-4mm를 잘라냅니다. 100마이크로리터의 세포 매트릭스 혼합물을 각 웰의 중앙에 조심스럽게 천천히 피펫으로 주입하여 방울이 구형으로 유지되고 웰의 측면에 닿지 않도록 합니다.

플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 굳을 때까지 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 분화 배지를 각 웰에 조심스럽게 피펫으로 넣고 매트릭스 드롭을 방해하지 않도록주의하십시오. 매체가 드롭을 덮고 있는지 확인하고 필요한 경우 더 추가합니다.

HNE 스페로이드를 배양하려면 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 스페로이드를 파괴하는 매트릭스를 피하면서 웰의 모든 배지를 부드럽게 흡인합니다. 그런 다음 새 1ml 피펫 팁을 사용하여 매트릭스를 만지거나 방해하지 않도록 하면서 매트릭스 주위의 웰에 500마이크로리터의 분화 배지를 부드럽게 추가합니다. 스페로이드를 계속 배양하고, 방금 시연한 것처럼 분화 배지를 매주 3회 교체합니다.

20X 배율의 도립 현미경으로 매일 스페로이드 형태를 평가합니다. 스페로이드는 도금 후 3일에서 5일 이내에 형성되어야 하며 약 10일 이내에 성숙해야 합니다. HNE는 배양 접시에 부착되어 파종 후 72시간 이내에 작은 섬을 형성해야 합니다.

1주일에 좋은 섬과 나쁜 섬 형성의 예가 여기에 나와 있습니다. 섬은 15일에서 30일 동안 접시를 덮을 수 있도록 확장되어야 합니다. 배양 후 첫 3-4일 이내에 작은 낭성 구조가 기질에 형성되기 시작하고 약 10일에 걸쳐 성숙해야 합니다.

설명된 밀도로 도금된 경우, 성공적인 배양에는 매트릭스 드롭당 50-100개의 스페로이드가 포함됩니다. 내강은 야생형 CFTR과 같이 비교적 맑거나 CF 스페로이드에서와 같이 세포 파편과 점액으로 채워질 수 있습니다. 스페로이드의 광강 영역을 묘사하기 위한 마스킹은 이 두 패널에서 시연됩니다.

여기에 표시된 것은 잘못 형성된 실패한 스페로이드 배양의 예입니다. 기능 분석에서 이러한 그래프에 설명 된 바와 같이, 야생형 CFTR을 가진 피험자로부터의 스페로이드는 자극을 받으면 한 시간 이상 팽창해야하며 CFTR 억제제 inh-172의 존재 하에서 자극되면 덜 팽창하거나 수축해야합니다. F508del-CFTR에 대한 동형접합체의 피험자로부터의 스페로이드는 CFTR 조절제 VX809 및 VX770으로 약리학적으로 교정될 때 팽창이 증가하거나 수축이 감소하면서 매우 약간 수축하거나 팽창해야 합니다.

일단 마스터하면 비강 세포 스페로이드 파종은 제대로 수행되면 15-20분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 오염 위험을 최소화하고 자신의 건강에 대한 위험을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛 내에서 깨끗한 작동 절차를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 세포 형태 및 구성에 대한 추가 질문에 답하기 위해 고정, 염색 및 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후, CFTR 기능의 개인화 된 분석법으로 활용 될 수있는 1 차 인간 비강 세포 스페로이드를 생성하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다. 일차 인체 조직으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행할 때 항상 적절한 개인 보호 장비 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.