Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

이 실험의 전반적인 목표는 화학적 유도제인 테부페노자이드(tebufenozide)를 투여하여 전이유전자 발현을 조절하는 것입니다. 이 방법은 세포 및 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 원하는 시간에 원하는 강도로 관심 유전자의 발현을 자극해야 하는 경우와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 벡터 내에서 전이유전자 발현에 필요한 모든 요소를 결합함으로써 화학적 유도제인 테부페노자이드의 투여에 의해 전이유전자 발현을 자극할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 EGFP 또는 ANKRD13A 전이유전자를 서브클로닝한 후, 5-10% FBS와 항생제가 보충된 5-10% FBS와 항생제를 함유한 갓 배양된 HEK 293 세포를 포함하는 4개의 세포 배양 접시를 준비하며, 이를 이하 배양 배지라고 합니다. 세포를 섭씨 37도로 유지하십시오. 세포 밀도가 50-60%에 도달하면 DNA가 포함된 희석액 200마이크로리터에 3마이크로리터의 형질주입 시약을 추가합니다.

반응을 실온에서 30분 동안 배양한 후, 혼합물을 HEK 293 셀에 첨가합니다. transfection을 위해 두 개의 접시를 사용하고 다른 두 개는 대조군으로 처리하지 않은 상태로 둡니다. 섭씨 37도에서 12-24시간 동안 세포를 배양합니다.

배양 후 형질주입된 샘플 중 하나와 형질주입되지 않은 대조군 중 하나에 Teb를 추가합니다. 다른 두 샘플은 실험 대조군으로 처리하지 않은 상태로 둡니다. 플레이트를 12-48시간 동안 배양합니다.

EGFP 인서트를 사용하는 경우 형광 현미경에서 EGFP 발현을 분석합니다. 그렇지 않으면 면역 블로팅을 위해 세포를 수확하려면 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 세포를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 제거하고 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 21, 000 회 g, 섭씨 18-25도에서 2 분 동안 튜브를 돌립니다. 그런 다음 PBS를 버린 후 0.5ml의 얼음처럼 차가운 포유류 단백질 추출 시약(M-PER)과 프로테아제 억제제를 펠릿에 첨가합니다. 여러 차례의 피펫팅으로 세포를 재현탁합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 섭씨 18-25도에서 15분 동안 실온에서 배양합니다. 세포 용해물을 21, 000 회 g와 섭씨 4도에서 10 분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 수성 상등액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 적절한 항체로 면역 블로팅하여 분석합니다.

Teb 자극을 소멸시키려면 세포에서 Teb 함유 배양 배지를 제거하고 예열된 PBS를 사용하여 세포를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 0.25%트립신/EDTA 1ml를 넣고 섭씨 37도에서 1분 동안 세포를 배양합니다. 10ml의 예열된 Teb-free 배양 배지를 세포에 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확합니다.

세포를 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 21, 000 회 g와 섭씨 18-25도에서 2 분 동안 세포를 회전시킵니다. 50ml의 예열된 Teb-free 배양 배지에 세포를 재현탁시키고 5ml의 세포를 3개의 60mm 신선한 세포 배양 접시로 옮깁니다.

세포를 섭씨 37도에서 각각 24시간, 48시간, 72시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 서로 다른 시점의 세포를 수확하고 면역블로팅(immunoblotting)을 사용하여 전이유전자의 발현 수준을 측정합니다. pEUI-plus-EGFP의 활성과 누출을 평가한 이 실험에서 모의 벡터 transfectants는 Teb 처리에 관계없이 형광 신호를 나타내지 않았습니다.

그러나, pEUI-plus-EGFP 트랜스펙턴트는 증가하는 Teb의 양에 점진적으로 감작되었다. 더 중요한 것은 Teb로 처리되지 않은 pEUI-plus-EGFP 형질주입체는 검출 가능한 EGFP 신호를 유도하지 않았다는 것입니다. TEB에 대한 pEUI-plus의 응답성을 추가로 검증하기 위해 FLAG 태그가 지정된 ANKRD13A 사용되었습니다.

항-FLAG 항체를 사용한 이 웨스턴 블롯에서 볼 수 있듯이, transfection된 HEK 293 세포는 Teb으로 24시간 처리한 후 강력한 ANKRD13A 발현을 나타냈습니다. 또한, Teb의 고갈은 Teb 없이 배양된 세포에서 더 이상 검출되지 않기 때문에 pEUI-plus 유전자 스위치의 가역성을 입증ANKRD13A. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 거의 모든 실험을 무균 조건에서 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템과 같은 다른 방법을 적용하여 두 개의 별개의 전이유전자를 차등적으로 발현할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구자들이 세포 수준에서 분자 생리학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 원하는 시간에 원하는 강도로 transgene 발현을 유도하기 위해 pEUI-plus gene switch vector를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 테부페노자이드로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.