Name: Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 학습하세요 tebufenozide를 이용한 pEUI(+) 단일 유전자 스위치로 트랜스진 발현을 정밀하게 조절하는 방법을. HEK 293 세포에서 원하는 시점과 강도로 유전자 발현을 제어하여 세포 및 분자생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 소중한 의견 및 우리의 원고의 철저 한 독서에 대 한 S Y 최 (전남 대학교) 감사합니다. 이 작품은 충남 대학교의 연구 기금에 의해 지원 되었다.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>PEUI(+)의 MCS에 적절 한 제한 효소 인식 사이트 (또는 사이트)을 선택 하 고 원하는 방향으로 (그림 1) 관심사의 유전자를 subclone. 참고: EGFP 또는 플래그 피토 프 태그 ankyrin 반복 도메인 13A EcoRI 사이트에 시퀀스 및 결 찰-독립적인 방법19를 복제 T4 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 pEUI(+) 벡터의 transgene (ANKRD13A) subcloned 이었다.</li>
	<li>37 ° c.에서 1 h EcoRI와 pEUI(+) 선형화 믹스 50 ng / µ L의 PCR 증폭 EGFP 또는 ANKRD13A, µ 40 ng/L 함께 pEUI(+) 선형화 및 T4 DNA 중 합 효소 (1 U) 10 분에 대 한 얼음에 부 화 하기 전에 실내 온도 (RT)에 1 분 동안 추가 10 µ L의 100 µ L 직접 반응 혼합물의 반응 다음 변환에 대 한 DH10B 유능한 세포 실험. 참고: 몇 가지 제한 효소 인식 사이트 pEUI(+) (그림 1B)의 MCS에 추가 된, 있지만 좋습니다 EcoRI 사이트에 대상 유전자 subcloning 결 찰 독립적인 복제 기술19,20를 사용 하 여.</li>
	<li>연속 삽입을 확인 하 고 transfection 적합 DNA 정제 키트를 사용 하 여 DNA를 정화.</li>
</ol>2. 과도 Transfection 및 Teb 치료
<ol><li>4 셀 문화 요리 (60 m m 직경) 5-10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 항생제 (100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스) 보완 수정된이 글 Dulbecco의 매체 (DMEM) 5 mL에 갓 passaged HEK293 세포를 준비 합니다. 여기서 부터는, "세포 배양 매체" 또는 단순히 "문화 매체" FBS와 항생제 보충 DMEM을 나타냅니다. 37 ° c.에 HEK293 세포 유지</li>
	<li>HEK293 세포 transfection 시 약의 3 µ L를 사용 하 여 50-60%의 밀도 순화 된 DNA의 1 µ g transfect. Transfection 시 희석제 (FBS와 항생제 없이 DMEM)의 200 µ L을 추가 포함 하는 DNA. RT에서 30 분 동안 반응 혼합물의 부 화 후 HEK 293 세포 문화 접시에 혼합물을 추가 합니다. Transfection에 대 한 두 가지 요리를 사용 하 고 다른 두 컨트롤로 치료 떠나.</li>
	<li>Transfection의 12-24 h 후 transfected 샘플 중 하나를 아닌 페 컨트롤 중 하나에 Teb (최종 농도, 0.2-10 µmol)를 추가 합니다. 다른 두 개의 샘플 실험 컨트롤로 치료를 둡니다. 참고: Teb 재고 솔루션 (디 메 틸 sulfoxide에 녹아 50 m m) 세포 배양 매체, DMEM, 또는 실험적인 매개 변수에 따라 경작된 한 세포에 추가 하기 전에 적절 한 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 희석 수 있습니다. 그러나, 수성 해결책에 있는 Teb의 낮은 가용성, 때문 매체; Teb의 높은 농도 가진 마스터 믹스를 준비 하지 않도록 대신, 원하는 농도 Teb 포함 된 신선한 매체와 완전 한 세포 배양 매체를 교체 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 12-48 h Teb 치료 및 치료 세포 배양</li>
	<li>EGFP 를 사용 하 여 삽입 하는 경우 ( 그림 2) 형광 현미경 EGFP 식 분석. 그렇지 않으면, immunoblotting 분석 결과 대 한 셀을 수확.<ol>
<li>Immunoblotting 분석 결과 대 한 차가운 PBS로 두 번 셀 린스 하 고 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 밖으로 그들을 긁어.</li>
		<li>셀, 말뚝에 대 한 21000 x g 18-25 ° C (RT)에서 2 분 동안에 15 mL 원뿔 튜브에 수확 아래로 회전 합니다.</li>
		<li>PBS를 완전히 삭제 후 차가운 포유류 단백질 추출 시 약 0.5 mL을 추가 (M-당), 프로 테아 제 억제 물 (프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 100의 5 µ L), 셀 60 mm 접시에 교양 경우 펠 릿을 함께.</li>
		<li>다시 pipetting의 몇 라운드와 셀을 일시 중지 하 고 18-25 ° C (RT)에서 15 분 동안 정지 셀을 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 21000 x g에서 lysate 셀 회전</li>
		<li>Microcentrifuge 신선한 1.5 mL 튜브에 수성 상쾌한을 전송 합니다.</li>
		<li>상쾌한 immunoblotting, 적절 한 항 체와 다음 표준 프로토콜 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. pEUI(+) 유전자 스위치의 게놈 통합 안정적인 HEK293 세포 라인의 세대
<ol><li>Transfection 시 약의 15-30 µ L를 사용 하 여 90mm 직경 셀 문화 접시에 50-60% 합칠 HEK293 세포에 있는 transgene로 순화 pEUI(+)의 5-10 µ g transfect. Transfection 시 희석제 (FBS와 항생제 없이 DMEM)의 500 µ L을 추가 포함 하는 DNA. RT에서 30 분 동안 반응 혼합물의 부 화 후 HEK 293 세포 문화 접시에 혼합물을 추가 합니다.</li>
	<li>Transfection, 후 성장 하 고 표현 하는 37 ° c.에 24-48 시간 (puromycin) 없이 비 선택적 문화 매체에서 puromycin 저항 유전자 제품 transfectants 허용</li>
	<li>Trypsinization 여 문화 요리에서 세포를 분리. 문화 매체를 삭제 후 씻어 미리 데워 공영 (37 ° C)와 transfectants, 0.25 %trypsin / ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 품 어 미리 데워 진된 문화 매체 (10 mL, 37 ° C)를 추가 하 여 트립 신/EDTA를 냉각 후 셀 스 크레이 퍼, 뒤에 21000 x g 18-25 ° c.에 2 분 동안에 15 mL 원뿔 튜브에 원심 분리를 사용 하 여 셀을 수확</li>
	<li>다시 미리 데워 진된 문화 매체 (37 ° C), 및 90 m m 신선한 세포 문화 요리에 전송 셀의 10 mL 50 mL에는 transfectants를 일시 중단 합니다. 37 ° C에서 셀 puromycin 치료 전에 50-60 %confluency 문화 (일반적으로,이 약 24-48 시간 걸립니다).</li>
	<li>배양 세포 배양 매체 3 µ g/mL puromycin 3-4 주 보충에서 37 ° C에서 transfectants. 선택 기간 동안 세포 배양 매체 선택의 압력을 유지 하기 위해 2-3 일 마다 puromycin (3 µ g/mL)에 포함 된 변경. 셀이 될 때 완전히 confluent, 절차 단계 3.3-3.4 puromycin 포함 된 문화 매체에 따라 그들을 분할. 필요 하지 않은 경우 문화 매체에 나머지 셀을 삭제 합니다. 참고: Puromycin 선택 조건은 특정 종류에 대 한 실험적으로 설정할 수 있어야 합니다. 우리 세포 배양 매체;에 puromycin의 3 µ g/mL을 사용 이것은 비 페 HEK293 세포 죽음을 유도 하기에 충분 했다.</li>
	<li>복제 실린더를 사용 하 여 개별 식민지에서 세포를 수확 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.<ol>
<li>세포 배양 매체를 버리십시오. 미리 데워 진된 (37 ° C) 떠 있는 세포를 제거 하는 PBS로 두번 접시를 헹 구 십시오.</li>
		<li>소독 집게를 사용 하 여 개별 식민지 복제 실린더를 설정 합니다.</li>
		<li>각 실린더에 0.35 %trypsin / EDTA의 0.2 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>세포를 분리, 하 서 다음 실린더에 미리 따뜻하게 (37 ° C) 문화 매체의 몇 방울을 추가 때까지 1 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
		<li>문화 매체의 2 mL 및 1 µ g/mL에 각 잘 puromycin 6 잘 플레이트의 개별 우물에 각 실린더에서 세포를 전송. 참고: 셀 될 때 confluent, 문화를 확장. 이제 clone(s)는 설정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 배양 매체 1 µ g/mL puromycin의 보충에 개별 복제를 유지 관리 합니다.</li>
	<li>개별 식민지 immunoblotting와 transgene의 식 수준을 분석 하 여 24 h. 테스트에 대 한 Teb 치료 (최종 농도, 10 µ M)에 그들의 감도 Teb에 클론의 응답 속도 테스트 하 여 확인 합니다. 원하는 복제 (클론)를 선택 합니다. transgene의 유도 수준을 분석 하기 전에 Teb 취급 하 고 37 ° C에서 12-48 시간 배양에서 치료 샘플을 배양. 식 수준 transgene immunoblotting, 단계 2.5.1-2.5.7에서에서 절차를 통해 측정할 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. Teb의 고갈
<ol><li>Teb 무료 매체 Teb 포함 세포 배양 매체를 대체 하 여 Teb 자극을 끄다. 참고: 먼저 새로운 문화 접시에 셀 reseeding 없이 성장 매체를 대체 하기 위하여 추천 된다. 잔여 Teb 플라스틱 접시에 집착에 나타나고는 transgene의 강한 배경 식을 이끌어내는 것입니다. 새로운 문화 접시에 셀 reseeding 전에 수확된 세포 배양 또는 PBS로 여러 번 씻어.<ol>
<li>Trypsinization 여 문화 요리에서 세포를 분리. Teb 문화 매체를 포함, 삭제 후 미리 데워 공영 (37 ° C)와 두 번 Teb 자극 세포를 씻어, 0.25 %trypsin / EDTA의 1 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 품 어 미리 따뜻하게 Teb 무료 문화 매체 (10 mL, 37 ° C)를 추가 하 여 트립 신/EDTA를 냉각 후 셀 스 크레이 퍼, 뒤에 21000 x g 18-25 ° c.에 2 분 동안에 15 mL 원뿔 튜브에 원심 분리를 사용 하 여 셀을 수확</li>
		<li>다시 미리 따뜻하게 Teb 무료 문화 매체 (37 ° C), 및 3 개의 60mm 신선한 세포 문화 요리에 전송 셀의 5 mL 50 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 각각 24, 48, 및 72 h 37 ° C에서 세포 문화.</li>
		<li>다른 시간 지점에서 세포를 수확 하 고 immunoblotting를 사용 하 여 식 수준 있는 transgene의 측정. 참고: 이러한 실험 조건 transgene 식 Teb 무료 문화 매체 (그림 3)에서 세포의 탐지 약 3 일 후 문화 되었다. 식 수준 transgene immunoblotting 단계 2.5.1-2.5.7 당에 의해 측정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

우리는이 보고서와 관련 된 충돌의 관심 있다.

이진 진 식 스위치를 사용 하 여의 주요 단점은 동시에 대상 셀에 두 개의 별도 플라스 미드 (드라이버 및 이펙터)를 제공 하는 필요. 이 플라스 미드와 inducers,12,3스위치의 일관성이 응답에서 결과의 부동 한 배급을 이어질 수 있습니다. 두 벡터 시스템의 또 다른 단점은 항생제 선택의 2 라운드의 최소 유망한 셀 라인을 식별 하는 데 필요한 것입니다. 따라서, 하나의 단위를 구성 된 유전자를 유도할 수 있는 카세트 오래 생물학 연구에 사용 하기 위해 모색 되었습니다. PEUI(+) 단 수 transgene 식 스위치 transgene 자극에 필요한 모든 규제 장치를 갖춘 단일 벡터에 포함 됩니다. 따라서, pEUI(+), subcloned transgene의 유도 수준 과도 transfection 실험 및 화학 유도의 복용량에서 transfected D...

여러 다른 유전자 스위치는 transgene 식 세포 배양 및 동물 모델, 성공1,2,3의 다양 한 각도 정확 하 게 조절 하는 능력에 대 한 탐험 되었습니다. 잠재적인 유전자 스위치 시스템 등 몇 가지 엄격한 기준을 충족 해야: transgene, inducers, 발기인의 무시할 수 시키는, 가역 transgene의 복용량 및 시간에 따른 응답의 정확한 방향 표현 유도 제거, 및 유도 독성 레벨 셀 라인을 실험실 동물1,2,3쾌활 통해 활성화. 항생물질4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10를 포함 하 여 몇 가지 작은 분자 inducers 악용 되어 그리고 ecdysone11,12,,1314. 일반적으로 이러한 시스템 2 개 또는 3 개의 개별 식 단위를 포함 하는 두 개 이상의 플라스 미드, 하나 또는 두 작성 transcriptional 활동을 얻기 위해 작은 분자 유도 규제 요소 (유도 플라스 미드) 그리고 또 다른 플라스 미드 (effector 플라스 미드) 유도 바인딩된 규제 요소에의 액세스를 허용 하는 규제 DNA 영역 통제 transgene를 포함. 이진 시스템의 주요 단점은 대상 셀에 두 개의 벡터 (유도 및 effector)의 수 반하는 도입 필요. 과도 transgene 식 실험에서 두 개의 플라스 미드의 동시 transfection 필연적으로 생산 하지는 유도 또는 이펙터, 페 단독 또는 공동 하지 똑같이 페 셀의 인구. 또한, 이진 시스템 2 라운드는 어렵고 힘 드는 안정 세포 선 확립 항생제 선택의 필요 합니다. 따라서, transgene 식에 필요한 모든 구성 요소를 결합 하 고 단일 벡터에 규제의 단일 셀의 모든 필수 요소 부수적인 표현 보장 transgene 표현의 규제에 대 한 허용을 이상적인 것 통해 작은 분자 inducers와 치료.
이진 진 스위치의 단점을 극복 하기 위해 우리 최근 개발 단 수 유전자 스위치는 초파리 melanogaster EcR 기반 유전자 유도할 수 있는 시스템15를 사용 하 여. Ecdysone 중재 유전자 발현 DNA 규제 요소3,11EcR의 바인딩 차례로 유도 EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer를 묶을 때. 척 추가 있는 retinoid X 수용 체 (RXR), 곤충, USP의 ortholog EcR 활성 transcriptional 활성 제16를 보충 한다. 따라서, 척추 세포 또는 조직에 있는 transgene의 타겟된 식 EcR과 RXR 해야 공동 표현한 동시에 ecdysone 또는 그 촉진제에 의해 자극 되 고 전에. 때문에 EcR 기반 유전자 스위치의 heterodimeric 기능 생 RXR 수준, Padidam 외에의해 영향을 받을 수 있습니다. EcR DNA 바인딩 및 활성화 도메인 분리 GAL4 DNA 바인딩, 포진 심 플렉스 바이러스 단백질 vmw65 교체 (VP16) 활성화 도메인 다음 생 RXR 응답 되었고 한 homodimer 형성 EcR의 ligand 바인딩 도메인에 융합 에 transcriptional 활동17를 얻을. EcR 기반 유전자 스위치는 homodimer 형성 ecdysone 주 작동 근, Teb16의 부재에 cytosol에는 GvEcR와 함께 최소한의 VP16 활성화 도메인의 구성 공상 단백질을 구성 하 여 더욱 향상 되었다 18. Teb에 바인딩하여는 GvEcR 변경의 subcellular 지 방화는 cytosol에서 핵 zebrafish E1b 10 탠덤와 함께 최소한의 발기인의 구성 하이브리드 발기인 반복 상류 활성화 순서 (UASs) 시작을 인식 하는 16대상 유전자의 전사
16,18전환 이전에 보고 된 EcR 기반 유전자를 단순화 하기 위해, 우리는 자극 transgene 식에 대 한 모든 필수 요소를 갖춘 다음 지정 된 단일 벡터에 결합 시스템의 바이너리 기능 새로 생성 된 벡터, pEUI(+) (은행 승인 번호: KP123436, 그림 1A)15. GvEcR 드라이버 (이 드라이버)에 응답 하는 이펙터 EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 인식 시퀀스 (그림 1B) 10 탠덤 UAS E1b 최소한의 발기인을 여러 복제 사이트 (MCS)에 의해 다음 다음 반복 구성 됩니다. 페의 선택을 촉진 하는 또한, 세포는 SV40 발기인 기반 puromycin N-아 세 틸-안정적인 셀 라인 (그림 1)를 유지 하기 위해 드라이버와 이펙터 영역 사이 전이 (PAC) 효소 유전자 배치 했다.
우리는 transgene 식 pEUI(+)를 사용 하 여의 과도 하 고 안정적인 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 ecdysone 주 작동 근으로 Teb의 성공적인 사용에 대 한 자세한 지침을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>특허 라이선스가 TransLab Inc.로 이전되었습니다.</td></tr><tr><td>Gene-Fect 형질주입 시약</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>클로닝 실린더</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>항생제</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>SPL 생명 과학</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>마우스 FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>안티 알파 튜불린 항체</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>복제 실린더</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER 포유류 단백질 추출 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X 프로테아제 억제제 수탉. III</td><td>T& 나는</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 transgene의 의도적인 표현에 대 한

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Transgene 식의 정확한 제어 생물 학적 및 임상 연구에 바람직합니다. 그러나, 현재 고용된 유전자 스위치의 바이너리 기능을 단일 셀으로 두 치료 식 단위 전송 동시에 사용 하려면, 때문에 유전자 치료에 대 한 시스템의 실용적인 응용 프로그램 제한 됩니다. Transgene 식 시스템을 단순화 하기 위해 단일 벡터의 transgene 식 모듈의 완전 한 세트를 포함 하는 pEUI(+)로 지정 하는 유전자 스위치를 생성 했습니다. 새로 개발된 된 단일 유전자 스위치 높은 GAL4 DNA 바인딩 도메인의 구성 및 수정된 EcR (GvEcR), 최소 VP16 활성화 도메인 GAL4 DNA 바인딩 도메인 (EcR), 수정 된 초파리 ecdysone 수용 체와 융합 시간 복용량에 따라 방식으로 화학 유도의 관리에 응답. PEUI(+) 벡터는 transgene 식 생물 학적 연구와 전 임상 연구에서의 제어를 향상 시키기 위한 잠재적으로 강력한 도구입니다. 여기, 우리 tebufenozide (Teb)의 치료에 의해 pEUI(+) 벡터를 사용 하는 과도 하 고 안정적인 transgene 식의 변조에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 화학 유도로 Teb의 사용에 대 한 중요 한 지침을 공유합니다.

GvEcR 기반 단일 유전자 스위치 그림 1A에서 묘사 된다. PEUI(+) 벡터 Teb와 치료에 의해 규제 transgene 식을 위해 최적화 되었다. PEUI(+) 이펙터 지역 한 10xUAS는 E1b MCS EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI, 및 AflII 제한 효소 인식 사이트를 포함 하 여 최소한의 발기인 따라 구성 되어 있습니다. SV40 많은 신호는 MCS (그림 1B) 뒤에 추가 되었습니다. PAC 유전자 puromycin 저항을 수 여 하는 pEUI(+)의 드라이버와 이펙터 지역 사이 삽입 되었다.
활동을 시키는 pEUI(+)의 평가, 하 우리는 MCS의 EcoRI 사이트에 EGFP 를 su...

여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.

Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

이 실험의 전반적인 목표는 화학적 유도제인 테부페노자이드(tebufenozide)를 투여하여 전이유전자 발현을 조절하는 것입니다. 이 방법은 세포 및 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 원하는 시간에 원하는 강도로 관심 유전자의 발현을 자극해야 하는 경우와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 벡터 내에서 전이유전자 발현에 필요한 모든 요소를 결합함으로써 화학적 유도제인 테부페노자이드의 투여에 의해 전이유전자 발현을 자극할 수 있다는 것입니다.텍스트 프로토콜에 따라 EGFP 또는 ANKRD13A 전이유전자를 서브클로닝한 후, 5-10% FBS와 항생제가 보충된 5-10% FBS와 항생제를 함유한 갓 배양된 HEK 293 세포를 포함하는 4개의 세포 배양 접시를 준비하며, 이를 이하 배양 배지라고 합니다. 세포를 섭씨 37도로 유지하십시오. 세포 밀도가 50-60%에 도달하면 DNA가 포함된 희석액 200마이크로리터에 3마이크로리터의 형질주입 시약을 추가합니다.반응을 실온에서 30분 동안 배양한 후, 혼합물을 HEK 293 셀에 첨가합니다. transfection을 위해 두 개의 접시를 사용하고 다른 두 개는 대조군으로 처리하지 않은 상태로 둡니다. 섭씨 37도에서 12-24시간 동안 세포를 배양합니다.배양 후 형질주입된 샘플 중 하나와 형질주입되지 않은 대조군 중 하나에 Teb를 추가합니다. 다른 두 샘플은 실험 대조군으로 처리하지 않은 상태로 둡니다. 플레이트를 12-48시간 동안 배양합니다.EGFP 인서트를 사용하는 경우 형광 현미경에서 EGFP 발현을 분석합니다. 그렇지 않으면 면역 블로팅을 위해 세포를 수확하려면 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 세포를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 제거하고 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.다음으로, 21, 000 회 g, 섭씨 18-25도에서 2 분 동안 튜브를 돌립니다. 그런 다음 PBS를 버린 후 0.5ml의 얼음처럼 차가운 포유류 단백질 추출 시약(M-PER)과 프로테아제 억제제를 펠릿에 첨가합니다. 여러 차례의 피펫팅으로 세포를 재현탁합니다.그런 다음 세포 현탁액을 섭씨 18-25도에서 15분 동안 실온에서 배양합니다. 세포 용해물을 21, 000 회 g와 섭씨 4도에서 10 분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 수성 상등액을 새로운 1.5ml 마이크

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

특성에 대한 Phenotypic 변형 CIS - 규제 요소 (CRE) 시퀀스 제어하는​​ 유전자 발현 패턴의 변이에서 발생할 수 있습니다. Drosophila melanogaster에 사용하기 위해 파생된 방법은 양적 수정하거나 자연 발생 CRE 변종으로 인한 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴의 수준을 비교할 수 있습니다.

의 양적 비교 CIS</em트렌스 제닉에서> - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster</em

출처: Berens, C. 외. 유도성 발현 시스템을 적용하여 박테리아 병원성 인자가 세포 내 신호 전달에 미치는 간섭을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 박테리아 효과 단백질 CaeB가 숙주 세포자사멸 연쇄 반응을 방해하는 위치를 식별하기 위해 유도 발현 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 CaeB 발현 세포를 테트라사이클린 반응 시스템으로 형질전환하여 프로세포자사멸 유전자 발현을 유도하는 과정을 개괄하며, 이를 통해 연쇄 반응 내 교란 지점을 식별합니다.

박테리아 효과 단백질을 발현하는 세포로의 유도성 유전자 발현 시스템과의 형질전환

이 비디오는 마우스 모델의 테트라사이클린 또는 Tet-On 유전자 발현 시스템을 보여줍니다. 테트라사이클린 유도체인 독시사이클린(doxycycline)이 존재할 때, 역테트라사이클린(reverse tetracycline)으로 제어되는 트랜스액티베이터(transactivator) 단백질로 구성된 Tet-On 시스템이 활성화되고 관심 유전자를 발현합니다.

Inducible Tet-On 조절 가능한 시스템 기반 유전자 발현 In Vivo: 마우스 모델에서 표적 유전자 전사 활성화를 위한 테트라사이클린 유도 유전자 발현 시스템

이 프로토콜은 동족 GFP 기자 및 유동 세포 계측법을 통해 GFP 발현을 자극하는 ATFs 능력의 정량화 인공 전사 인자 (ATFs)의 신속한 건설을위한 실험 절차를 설명합니다.

빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

여기에 설명된 방법은 anti-apoptotic bacterial effector 단백질의 활성을 해부하기 위해 정의된 단계에서 apoptotic signaling cascade를 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 또한 pro-apoptotic 또는 독성 단백질의 유도성 발현 또는 다른 신호 경로와의 간섭을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

여기, 우리가 첫 번째 코딩 exon 유전자의 전사 드라이버 대체 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 방법 제시. CRISPR/Cas9-기반 방법 대체 유전자의 생 규칙에서 transactivator 시퀀스를 장소 따라서 유전자 특정 spatiotemporal 패턴에 독점적으로 transctivator 식을 촉진 한다.

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

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Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

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Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

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