Name: Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 서부옥수수뿌리벌레 배아의 미세주사를 통한 생식계 변환 및 CRISPR/Cas9 게놈 편집 방법을. 이 기술은 해충 내성 메커니즘 연구와 기능유전체 분석에 필수적인 도구입니다.

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이 작품 몬산토 옥수수 Rootworm 지식 연구 프로그램에서 교부 금에 의해 지원 되었다, NCSU에서 MDL 번호 AG/1005 (MDL을 YC) 및 시작 자금 부여. FC 몬산토의 옥수수 Rootworm 지식 연구 프로그램 (AG/1005)와 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 부여 번호 MCB-1244772 (MDL). 저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다. FC 및 MDL 잉태와 설계 실험; FC, 비밀 번호 및 SP 수행 실험; FC 및 MDL 분석 결과; 그리고 FC, NG 및 MDL 원고를 썼다. 우리 감사 테레사 오리 어 리, 윌리엄 Klobasa, 그리고 스테파니 고르 WCR 심사에서 그들의 전문가 도움. 우리는 또한 양육 프로토콜을 제공 하 고 실험실 식민지를 설치 하는 계란의 출하에 대 한 박사 웨이드 프랑스어 (미국 농 무부-ARS, 북쪽 중앙 농업 연구소, 브루킹스, SD) 감사 합니다.

1. 식민지 수준 WCR 성인의 양육
<ol><li>충분 한 양의 WCR 성인 구하는 (500-1000)에서 신뢰할 수 있는 회사 또는 연구 실험실 ( 테이블의 자료 에 대 한 참조 예) 30cm3 장에 배치. 참고: 비-diapausing 긴장의 사용이 좋습니다.</li>
	<li>제조 업체의 프로토콜을 따르고 WCR 인공 다이어트 준비 하 고 38 온스 컨테이너 1 cm 두꺼운 레이어를 붓고 ( 재료의 표참조). 혼합 후, 최대 2 개월까지 4 ° C에서 사용 하지 않는 다이어트를 저장 합니다.</li>
	<li>30cm3 케이지에 성인 다이어트 (10-15 g) 페 트리 접시 (100 x 15 m m)를 넣어. 음식이 부족 하거나 건조 할 때 더 많은 다이어트를 추가 합니다.</li>
	<li>물 소스로 봉사 하 면 롤 (6 "x 3/8"), 장소에서 개최 하는 데 사용 되는 면봉으로 덮여 물 플라스 크 (300 mL)을 넣어. 그것은 부족 하면 물을 변경 합니다.</li>
	<li>WCR 습도 60%와 26 ° C에서 유지 하 고 14:10 빛 인큐베이터 양육 곤충에 주기.</li>
</ol>2. 배아 수집 및 정렬
<ol><li>1% 한 천은 물에을 사용 하 여 살 균 100 x 15 m m2 페 트리 접시에에서 달걀 수집 챔버를 확인 합니다. agar 굳은 후 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>새로 놓인된 달걀을 수집, 필터 종이, 한 천 (그림 1A)의 표면에 투박한 (크기 각 컷)의 4 층에 의해 다음의 단일 레이어를 놓습니다. 참고: 투박한 다시 사용할 수 있습니다, 후 표 백제에 세척 하 고 압력가, 하지만 그것은 처음 사용을 위해 이것을 할 필요가 없습니다. 필터 종이 재사용 되지 않을 하 고 살 균 될 필요는 없습니다.</li>
	<li>계란 컬렉션 접시 WCR으로 가능 (작업 일의 끝)으로 하루에 늦게 놓고 은박지 텐트와 함께 커버 합니다. 하룻밤 둡니다. 실험실 직원으로 늦은 밤 컬렉션 챔버를 필요 없이 microinjection에 대 한 젊은 계란의 수집을 촉진 따라서 참고: 데 불 오전 10 시에서 오전 12 시 (14 h) 지연 달걀 누워.</li>
	<li>약 8 또는 오전 9 시부터 계란 수집 약 실 제거</li>
	<li>집게를 사용 하 여 투박한의 1 층의 물 비 커 (500ml)에 장소와 시간에 데리 러. 부드럽게 (그림 1B 및 1 C) 교 반에 의해의 투박한 계란을 세척.</li>
	<li>전구 피 펫을 사용 하 여 다른 비 커 (500ml) 물에 계란을 전송. 계란을 청소 2-3 배를 반복 합니다.</li>
	<li>필터 종이 (그림 1D)에 계란을 전송 전구 피 펫을 사용 하 여 물 수행의 양을 최소화 하면서.</li>
	<li>단단히 되도록 슬라이드에 검은 필터 종이 테이프를 유리 슬라이드 너비 스트립으로 잘라 종이 평면 (그림 2A) 낳는다. 참고: 검은 필터 종이 반사 된 빛의 양을 줄여 현미경 가시성을 향상 도움이 됩니다.</li>
	<li>비-독성 접착제를 적용 (예를 들어에 대 한 재료의 표 참조) 단서 (그림 2B)에 필터 종이에. 접착제 라인 유지 되지 않도록 접착제 코팅 계란 달걀의 직경 보다 얇은.</li>
	<li>좋은 브러시를 사용 하 여 부드럽게 이동 WCR 계란 하나에 의해 그들의 필터 종이에서 접착제 라인. 접착제에는 알을 낳 기 전에 그것을 밖으로 건조 하 고 각 계란 사이 적어도 1 개의 계란의 거리를 유지.</li>
	<li>하나의 필터 종이 슬라이드 (그림 3)에 계란의 여러 줄을 배치 하 여 주입 효율을 극대화 합니다.</li>
	<li>후 모든 계란 필터 종이에 뻗어 있다, 모든 접착제 microinjection 전에 건조 때까지 기다립니다. 참고: 생식 변환 및 편집 CRISPR/Cas9-중재 게놈 주사 모든 배아 정오 (12 시)에 의해 가장 오래 된 배아는 19 h 더 이상. 그러나, RNAi에 대 한 제한은 없는 시간 WCR에 dsRNA 셀 사이 이동할 수 있기 때문 에입니다. 사실, RNAi, 노화 배아 더 나은 생존 율에서 발생할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 플라스 미드 DNAs와 주사 바늘의 준비
<ol><li>내 무료 광고를 사용 하 여 높은-품질 supercoiled 플라스 미드 DNA 준비 키트 (예에 대 한 재료의 표 참조).</li>
	<li>주입 솔루션을 준비 하려면 각 플라스 미드의 농도 확인 하 고 도우미 플라스 미드 (250 ng / µ L 최종 농도), 기증자 플라스 미드 (750 ng / µ L 최종 농도) 및 페 놀 레드 버퍼 (최종 농도 20%)를 결합 합니다. 소용돌이 솔루션 짧게 하 고 바늘을 방해할 수 있는 입자 침전을 최대 속도에서 3 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>붕 규 산 유리 바늘 (마약 1 mm, 아이디 0.58 m m, 10 cm 길이)를 당겨 불타 는/브라운 유형 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여. 저장, 페 트리 접시 또는 다른 분명 컨테이너에 이중 면 끈끈한 테이프에 가져온된 바늘을 보안 합니다. 참고: micropipette 끌어당기는 시스템에 대 한 설정을 사용 했다: 열 335, FIL = = 4, 벨 = 40, 델 = 200, 풀 = 100.</li>
	<li>백필 마이크로 로더를 사용 하 여 주사 바늘 팁 ( 테이블의 자료를 참조) 피펫으로 0.5-1.0 µ L 아래로 테이퍼 끝부분 바늘 내부. 발생 하는 경우는 바늘의 팁에서 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>바늘 홀더에 주사 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>부드럽게 집게의 좋은 쌍을 함께 하거나 부드럽게 터치/드래그 coverslip 또는 유리 슬라이드에 팁으로 바늘의 팁을 엽니다. 참고:는 목표는 아직도 주입 혼합 밖으로 나올 수 있도록 작은 개방 (작은 구멍 일반적으로 더 높은 주입 압력을 필요로). 이후 그들은 이미 열려 경사진된 바늘이이 단계를 필요 하지 않습니다.</li>
</ol>4. microinjection 및 포스트 주입 치료
<ol><li>좋은 페인트 브러시를 사용 하 여 신중 하 게 살 균 물으로 1-3 계란의 표면에 젖은, 바늘, 넣고 솔루션을 주입 합니다. 표면 건조 하기 전에 각 계란을 주사. 찾습니다 모양 달걀 안에 붉은 색의 작은 금액을 성공적인 microinjection을 가리키도록 주입 하는 동안. 분쇄 또는 손상, 빈, 또는 그렇지 않으면 주입 수 없습니다 모든 계란을 제거 합니다. 참고: 비록 사출 압력 바늘 구멍 크기에 따라 다릅니다, 10-13 psi 좋은 출발점입니다.</li>
	<li>모든 계란은 주입 후 유리 슬라이드에서 필터 용지를 제거 합니다.</li>
	<li>(위에서 설명한) 1% 한 천은 접시의 표면에 필터 종이 놓습니다.</li>
	<li>플라스틱 파라핀 영화를 사용 하 여 요리를 봉인 하 고 12 일 동안 인큐베이터 양육 26 ° C 곤충에 넣어. 참고: 파라핀 영화 요리 사이 형의 교차 오염을 방지 도움이 됩니다. 그러나, 금형 및 박테리아의 성장을 방지 하기 위해 다른 치료는 주입 된 배아의 생존을 줄일 수 있습니다.</li>
</ol>5. 배양 및 배아의 부 화
<ol><li>태아 12 일 후 주입 새로 부 화 애벌레에 대 한 검사를 시작 하 고 2 주 동안 매일 계속.</li>
	<li>애벌레, 부 화 한 옥수수와 토양 양육 상자에 좋은 브러쉬를 사용 하 여 전송 합니다. 참고: 형 한 접시에 성장 수 있습니다 하지만 애벌레 여전히 대부분의 경우에 해치 것입니다. 신중 하 게 모든 그들을 잡으려고 금형 내에서 애벌레를 찾고 있습니다. 일부 애벌레 수 접시의 뚜껑을 이동한 결로에 갇혀 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>다음 표준 WCR 양육 방법2526 ° C에서 애벌레 후면.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

비록 dsRNAs RNAi 목적으로 WCR의 microinjection 보고9, 이것이 microinjecting precellular WCR 배아 생식 변환 수행을 위한 중요 한 과정에 대 한 우수 사례를 확립 하는 첫 번째 프로토콜 및 CRISPR/Cas9 게놈이이 종에서 편집입니다. WCR 배아의 성공적인 microinjection 변환 효율성은 여러 요소에 따라 달라 집니다. 아래는 몇 가지 주요 문제에 영향을이 프로토콜을 사용 하 여 생식 변혁이이 딱정벌레에 대 한 결과.
Precellular 배아를 얻기 위에서 설명 했 듯이, DNA는 세포 막 방법 dsRNA 수 교차 하지 않습니다. 즉, 그것이 중요 한 중요성의 DNA, mRNA, 또는 단백질 cellularization 발생 하기 전에 주입 수 있습니다. 주입의 타이밍은 중요 한, 때문에 embryogenesis 완료 하려면 nondia...

서 부 옥수수 rootworm (WCR) Diabrotica virgifera virgifera, 옥수수1의 중요 해충 이다. 흥미롭게도, WCR 제어를 극복 하기 위해 표시 됩니다 그들은 뿐만 아니라 적응 뿐만 아니라 순수 행동2,3,,45, 이후 가장 농업 해충 보다 더 빠르게 측정 6. 지난 10 년간, RNA 간섭 (RNAi), 강력한 기능 게놈 도구 WCR7,8에 대 한 잠재적인 제어 방법으로 조사 되 고 유전자 기능9공부 하는 수단으로도 사용 되었습니다. 그러나, RNAi 다른 종에서 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 microinjection에 의해 자주 수행 하는 동안 주입 기반 RNAi WCR에 드문 경우입니다. 사실, 몇 가지 보고서만 RNAi 통해 microinjection dsRNA의 WCR9에 있다. 이유는 심지어 어머니11dsRNA를 먹이로 미 발달 효과의 연구를 허용 하 게 되는 높은-수준의 유전자 때 려 눕 힘 을 통해 섭취 dsRNA7,10, WCR에 달성할 수 있다. 이 방법을 만드는 동안 WCR 기능 게놈 분석 통해 RNAi를 위한 우수한 주제, 그것은 배아 microinjection이 수이 종에 대 한 방법론의 개발 진행을 둔화 했다.
RNAi의 힘에도 불구 하 고 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어 모든 유전자 RNAi를 동등 하 게 응답합니다. 이 변화는 더 어려운 기능 유전체학 시험의 결과 해석 할 수 있습니다. 또한, RNAi는 일시적 이며 상속 돌연변이 생성 하지 않습니다. 다른 한편으로, 생식 변환, 다른 기능 게놈 도구, 상속 돌연변이 통해 삽입 표시 transposable element의 게놈12,13으로 생성할 수 있습니다. 이것은 생식 변환 장기 유전 연구에 사용 하기 위해 돌연변이 종자를 만들기 위한 훌륭한 도구. 변환 돌연변이 게놈14에 유전자의 기능 복사본을 제공 하 여 돌연변이 구출 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 생식 변환 다양 한 분자 유전 기법의 초석입니다. 밖으로 노크 및 유전자 기능 구조, 뿐만 아니라 생식 변환 증강 트래핑15, 유전자 트래핑16, Gal4 기반 소성 식17, 및 게놈 넓은 mutagenesis18사용할 수 있습니다.
더 최근에, 정교한 게놈 편집 사용할 수 있는 도구 개발 되었습니다. 이러한 도구에는 전사 Activator-Like 이펙터 Nucleases (TALEN) 및 CRISPR/Cas9-nuclease 시스템19,20포함 됩니다. 이러한 새로운 도구의 장점은 그들은 거의 모든 게놈 내의 거의 모든 위치에서 이중 가닥 DNA 휴식을 유도 하는 능력 연구원을 제공. 삭제 또는 타겟된 유전자에 삽입 발생할 수 있습니다, 어느 비 동종 끝, 또는 상 동 감독 수리, 설계 구축 존재 촉매 수 있습니다 통해이 나누기를 복구할 수 있습니다 유발, 일단은 전체 유전자 또는 유전 지역21,22의 교체. 그러나, 이러한 방법을 사용 하려면 아주 어린 배아로 DNA, RNA 및 단백질의 microinjection.
중요 한 것은, RNAi, 핵 산 및 단백질 생식에 대 한 사용 사용 dsRNAs 달리 변환 및 게놈 편집 교차할 수 없습니다 쉽게 세포 막. 따라서, 플라스 미드 DNAs, mRNAs, 단백질의 microinjection syncytial blastoderm 단계 (즉 곤충 태아 cellularizes 전에) 자리를 차지할 해야 합니다. 이것은 주사의 타이밍 중요 한 요소. 예를 들어 초파리 melanogaster, 배아 달걀 누워12후 2 시간 이내에 주입을 해야 합니다. 따라서, 여성 달걀 누워, precellular 배아의 충분 한 수량을 수집 하기 위한 가장 좋은 방법에 대 한 최상의 조건 WCR에 대 한 성공적인 배아 microinjection 프로토콜의 개발 계정에 취해야 합니다.
다양 한 분자 유전 도구 WCR 생물학에 대 한 부담을가지고 노력 수집 및 microinjecting precellular WCR 배아에 대 한 방법을 개발 해야 합니다. 여기 우리 WCR 연구에서 변환 기반 기술을 사용 하 여 다른 사람들을 돕고 팁과 트릭, 함께 자세한 지침을 제공 합니다. 기능적 게놈 연구에 사용 하기 위해 유전자 변형 기술을 WCR 연장, 뿐만 아니라 이러한 기술 또한 테스트할이 경제적으로 중요 한 유전자 드라이브23,24 등 강력한 새로운 해충 제어 전략 사용 해충입니다.

<table><tbody><tr><td>품질 필터 종이 (검정)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>계란 마이크로 주입</td></tr>용 <tr><td>1 oz 용기&nbsp;</td><td>Anny's 플라스틱 식기</td><td>ASET101</td><td>계란 용기</td></tr><tr><td>초파리 아가르 타입 II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>WCR 알을 낳는 접시용</td></tr><tr><td>깃털 무게 펜치&nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>유충과 번데기 다루기&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>옥수수와 접시 세척</td></tr><tr><td>트럭 운전사가 가장 좋아하는 노란색</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>WCR</td></tr><tr><td>미세주입 시스템 공급용 옥수수(수제)</td><td>NA</td><td>요청 시 부품 및 지침</td><td>사용 가능 사출 압력(0-20psi) 제어 사출 압력(0-20psi)</td></tr><tr><td>Elmer's 무독성 접착제</td><td>Elmer's Products, Inc.</td><td>E304</td><td>여과지에 달걀을 붙입니다</td></tr><tr><td>epTIPS 마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>되메우는 바늘 로딩 팁</td></tr><tr><td>Falcon 조직 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>싹 옥수수 /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 정량적 등급 필터 페이퍼 서클</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S47576C</td><td>알낱/9cm</td></tr><tr><td>스파</td>클린 <td>피셔 사이언티픽</td><td>04-320-4</td><td>세척 접시</td></tr><tr><td>일반 현미경 슬라이드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-549-3</td><td>마이크로주입용 필터지와 달걀 보유</td></tr><tr><td>꽃가루 대체품 웨스턴 옥수수 루트웜 프</td><td>론티어 농업 과학&nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR 성인용 인공 식단</td></tr><tr><td>면봉, 대형</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>플라스크 닫기</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL 소형 전구 전송 피펫</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>계란 수집 및 전송</td></tr><tr><td>Leica M165 FC 형광 실체현미경&nbsp;</td><td>라이카</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>WCR 스크리닝</td></tr><tr><td>DsRed 필터 세트, 형광 스테레오현미경</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>여기 필터: 510-560 nm, 방출 필터: 590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFP 필터</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>여기 필터: 440&ndash; 520 nm, 방출 필터: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView 과학</td><td>DP1000_5P</td><td>케이지 성인 콜로니</td></tr><tr><td>미니어처 페인트 브러시</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>라이너 2/0&nbsp;</td></tr><tr><td>조이스틱 마이크로매니퓰레이터</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>마이크로매니퓰레이터 및 바늘 홀더</td></tr><tr><td>현미경 XY 스테이지</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>현미경 스테이지 (스테레오스코프 사용에 적합)</td></tr><tr><td>등급 90 치즈클로</td>스 <td>온라인 패브릭 스토어</td><td>CHEE90</td><td>달걀 놓기</td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름용&nbsp;</td><td>Pechiney 플라스틱 포장</td><td>PM-996</td><td>마이크로 주입 후 밀봉 아가 접시/롤 크기 4 인치 x 125 피트</td></tr><tr><td>Percival 인큐베이터</td><td>Percival&nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR 성장 챔버 (곤충 사육 인큐베이터)</td></tr> <tr><td>좁은 입 삼각 플라스크</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>성체 식민지용 물통&nbsp;</td></tr><tr><td>그리핀 로우 폼 비커</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>계란 세척</td></tr><tr><td>꼰 코튼 롤</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>성인 식민지를 위한 물 공급에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>페트리 접시 (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>다이어트 플레이트용</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>미세주입 버퍼</td></tr><tr><td>레이저 기반 마이크로피피엣 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-2000/G</td><td>니들 풀러/열 = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>프리미엄 표토</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>크론 재배</td></tr><tr><td>용 토양Reloc Zippit 2 Mil 지퍼 가방</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>가방 미세주입 후 한천 접시/5x7</td></tr><tr><td>페트리 접시 (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>달걉기 만들기 / 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz 용기</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR 단일 쌍 짝짓기 챔버&nbsp;</td></tr><tr><td>38 oz 컨테이너</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>애벌레 사육 상자/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. 전자레인지 가능한 투명 플라스틱 델리 컨테이너</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>애벌레 사육 상자/16 oz</td></tr><tr><td>미세주입 스코프&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Microinjection Scope XY 스테이지</td></tr><tr><td>표준 유리 모세 혈관</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Microinjection 바늘</td></tr><tr><td>성인 서부 옥수수 뿌리 벌레</td><td>North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td><td>Non-diapase strain</td><td>Dr. Bryan Wade French의 연구실</td></tr><tr><td>요청 플라스미드 DNA 미디 키트</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>주입 가능한 플라스미드 DNA의 정제</td></tr></tbody></table>

microinjection 웨스턴 옥수수 rootworm, diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 crispr/cas9 게놈 편집과

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

서양 옥수수 rootworm (WCR) 옥수수의 중요 한 해충 이며, 해충 관리 전략에 빠르게 적응 하는 능력으로 잘 알려져 있다. RNA 간섭 (RNAi) WCR 생물학 공부를 위한 강력한 도구가 될 수 입증 하고있다, 그것은 한계가 있다. 특히, RNAi 자체는 일시적 (즉 귀착되 지 않는다 관련 된 표현 형의 장기 Mendelian 상속), 그것은 대상 유전자의 DNA 순서를 알고 필요 합니다. 후자 수 수 제한 관심의 표현 형이 제대로 보존 하 고, 또는 심지어 새로운 유전자에 의해 제어 되는 경우 유용한 목표 식별 도전 될 것 이라고, 때문에 불가능. 따라서, 안정적인 돌연변이 체 긴장을 만들고 WCR 게놈의 순서에 관계 없이 조사를 활성화 하는 데 사용할 수 있는 방법의 개발에 의해 WCR의 게놈 도구 상자에서 도구 수를 확장 한다. 여기, 우리가 수집 하 고 핵 산와 precellular WCR 배아를 microinject 하는 데 사용 하는 방법 자세하게. 여기에 설명 된 프로토콜은 유전자 변형 WCR의 생성을 위한, 그러나 CRISPR/Cas9-게놈 편집 수 또한 수행 유일한 차이 배아에 주입 하는 솔루션의 구성 되 고 동일한 프로토콜을 사용 하 여.

이 프로토콜을 개발할 때 중요 한 고려 사항은 microinjection의 때에 미 발달 발달의 단계 이었다. 특히, 생식 변환 배아 cellularization 이전 DNAs의 microinjection를 요구 한다. DNAs 쉽게 세포 막을 교차할 수 없습니다 때문입니다. WCR 배아 개발 핵 얼룩을 사용 하 여 단계를 시각화 하는 시도 dechorionation WCR 배아의 기본적으로 모든 태아의 무결성에 대 한 책임 보호 막을 녹이 고 때문에 실패 했다. 그러나, 질문의이 라인은 다른 어려움-배아의 충분 한 수량을 적시에 취득에 의해 바 뀌. 필드에서 WCR 여성 토양에 자신의 알을 낳는, 따라서 그것은 놀랄 그 연구실에서 여성만 알을 어둠 속에서 이어야 한다. 이 어려운 짧은 낮 컬렉션 (2-4 h) 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 단일 하룻밤 달걀 누워 수행 하 고 많은 양의 태아를 발견 했다. (그림 1</strong...

여기 우리가 수집 하 고 microinjecting precellular 서쪽 옥수수에 대 한 프로토콜 rootworm 배아 생식 변환 및 CRISPR/Cas9-게놈 편집과 같은 게놈 기능 분석을 수행 하기 위해 제시.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

이 Microinjection 프로토콜의 전반적인 목표는 Western Corn Rootworm 게놈을 변형하는 것입니다. 이 방법은 Western Corn Rootworm 생물학과 BT 독소 및 RANI와 같은 해충 방제 방법을 신속하게 극복하는 능력에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 서부 옥수수 뿌리벌레 외에도 이 방법은 남부 및 북부 뿌리벌레와 같은 유사한 종에도 적용할 수 있습니다.이 방법에 대한 아이디어는 90년대에 Western Corn Rootworm에서 주입 기반 RANI를 도와달라는 요청을 받았을 때 처음 떠올랐습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다. 실험실에서 서부 옥수수 뿌리 벌레를 사육하는 것은 노동 집약적이기 때문입니다.그리고 생존율은 현재 기술을 사용하여 낮은 상태로 유지됩니다. 신뢰할 수 있는 회사나 연구소에서 500-1,000마리의 비일석(non-diapausing rootworm) 성충을 구하십시오. 그리고 30입방센티미터의 케이지에 수용합니다.표준 뿌리벌레 인공 사료는 약 1cm 깊이의 식품 저장 용기에 보관하십시오. 사용하지 않은 식단은 섭씨 4도에서 최대 2개월 동안 보관할 수 있습니다. 뿌리벌레에게 먹이를 주려면 100cm의 페트리 접시에 10-15g의 사료를 넣으십시오.각 뿌리벌레 우리에 한 접시의 음식을 넣으십시오. 그리고 공급이 부족하거나 식단이 건조할 때 보충하십시오. 또한 각 케이지에 면봉으로 덮인 300ml의 물통을 수원으로 사용할 수 있도록 하십시오.물이 부족할 때 교체하십시오. 우리에 갇힌 뿌리벌레를 섭씨 26도, 습도 60%, 14/10 조명 주기로 곤충 사육 인큐베이터에서 유지하십시오. 자정과 같이 늦은 시간에 불을 끄도록 설정하여 아침 근무 시간 전에 알을 낳습니다.먼저 배아를 채취합니다. 난자 채취 표면의 경우 100mm 페트리 접시에 30ml의 1%한천과 물을 넣습니다. 다음으로, 한천에 여과지를 한 겹 바르고 치즈 천 4 층을 놓습니다.각 레이어는 크기에 맞게 잘라야 합니다. 다음으로, 가능한 한 늦은 시간에 알 채취 플레이트를 뿌리벌레 케이지에 넣고 은박지 텐트로 덮습니다. 그런 다음 다음 아침에 난자 채취실을 제거하십시오.집게를 사용하여 한 번에 한 겹의 치즈 천을 집어 물이 담긴 500ml 비커에 넣습니다. 치즈 천에 묻은 달걀을 물에 휘저어 씻어냅니다. 그런 다음 전구 피펫을 사용하여 세

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

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