Name: 분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 학습하세요 분열 효모에서 무작위 돌연변이를 이용해 rpt4+ 유전자를 타겟팅하고 불안정 헤테로크로마틴 돌연변이를 선별하는 방법을. 이 기술은 필수 유전자 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트에 대 한 지원 자금 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 과학과 ICT (2016R1A2B2006354)에 의해 자금에 의해 제공 되었다.

1입니다. 미디어 준비
<ol><li>준비 효 모 추출 보충 교재 (예), 네 아데닌 (예 로우 에이드), Pombe 조미료 매체 (PMG12), 그리고 PMG 없이 아데닌 (PMG-Ade) 없이 표 1에 설명 된 대로 구성 요소를 혼합 하 여. 예-에이드 (Ade 낮은)와 PMG-에이드 접시 같은 구성 요소를 모두 하지만 아데닌 후자에서 생략 됩니다.<ol>
<li>다음 소금 (50 x) 주식을 사용: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L 나24 에 증류수 그래서. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장</li>
		<li>다음과 같은 비타민을 사용 하 여 (1, 000 x) 주식: 1 g/L pantothenate, 10 g/L 니코틴산 산, 이노 시 톨 10 g/L, 증류수 비오 틴 10 mg/L. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장</li>
		<li>다음 미네랄을 사용 하 여 (10, 000 x) 주식: 붕 5 g/L, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0.4 g/L MoO3, 1 g/L 0.4 g/L CuSO4·5H2O 기 증류수에 연산 10 g/L. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장 참고: 네 액체 매체는 agar를 생략 하 여 만들 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>압력솥 매체 200 rpm의 속도로 저 어 바 교 반 하면서 60 ° C 아래에 그것을 냉각 하 고.</li>
	<li>예 + G418 (geneticin) 판 예 매체 1 mL/L G418 재고 솔루션을 추가 합니다.<ol>
<li>다음 G418 사용 (1, 000 x) 주식: 100 mg/mL 증류수에 G418. 필터-20 ° c.에 0.22 μ m 기 공 크기 필터, 1.5 mL 원심 분리기 튜브 및 저장소에 aliquot를 사용 하 여 소독</li>
	</ol>
</li>
	<li>또 다른 5-10 분, 약 수에 대 한 미디어 90 mm 페 트리 접시 (대략 40 접시를 중간 aliquots의 1 L에 저. 4 ° c.에 접시를 저장</li>
</ol>2. 복제 rpt4 + 와 그것의 5' / 3' Utr의
<ol><li>PCR 뇌관 p1와 p2 수행 (그림 1A) 분열을 사용 하 여 50 µ L (~ 1 µ g DNA, 20 U 효소 반응 버퍼 x 1)의 총 볼륨에 템플릿으로 genomic DNA (gDNA)를 효 모 그리고 3,315 베이스 증폭 반응 사이클을 표 2 에 설명 된 적용 쌍 (bp) 조각 rpt4 + 및 그것의 5' / 3' Utr. (그림 1A) 제조업체 지시에 따라 정화 키트13 를 사용 하 여 PCR 제품을 정화.</li>
	<li>PBlueScript KS(-) 벡터14 16 18 물 목욕에서 37 ° C에서 rpt4 + 와 그것의 5' / 3' Utr BamH1 와 Xho1 (~ 1 µ g의 DNA, 효소, U-20-1 x 소화 버퍼) 20 µ L의 전체 볼륨에 포함 된 증폭된 한 DNA 파편을 소화 h (그림 1B)입니다.</li>
	<li>젤 소화 벡터 (1.2 %agarose 젤)를 정화 하 고 태 기반 agarose 젤 전기 이동 법 (100 V, 1 시간)을 수행, 원하는 크기의 DNA 밴드를 절 개 하 고 젤 추출 키트15DNA를 분리 하 여 DNA 삽입.</li>
	<li>벡터 및 벡터 DNA의 50-100 ng를 포함 20 µ L 결 찰 반응을 수행 하 여 T4 DNA 리가 사용 하 여 DNA 삽입을 위하여는 ~ 삽입 DNA, 400 U T4 DNA 리가 고 결 찰 버퍼 x 1의 3 어 금 니 과잉. 16-18 h 18 ° C에이 혼합물을 품 어.</li>
	<li>열 충격 70을 적용 하 여 합자 DNA를 대장균 DH5α의 100 µ L에 변환 42 ° c.에 s 파운드의 1 mL을 추가 하 고 복구에 대 한 37 ° C에서 1 시간에 품 어. 원심 (13,800 x g)를 변형된 대장균 의 모든 파운드-암 피 실린 (라) 접시에 셀 16 h 37 ° C에서 품 어, 표면에 뜨는 접시를 삭제 합니다.</li>
	<li>이쑤시개와 4-8 식민지를 선택 하 고 하룻밤 3 mL 라 중간에서 37 ° C에서 성장.</li>
	<li>한 플라스 미드 정화 키트16 제조업체의 프로토콜에 따라 사용 되는 플라스 미드를 분리 하 고 고립 된 플라스 미드, 각 제한 효소 (BamH1 및 의 U 5의 5 µ L로 분석 금지 효소 소화를 수행 Xho1) 제한 버퍼 1. 3 헤 시퀀싱 후보 플라스 미드로 복제 하는 확인에 대 한 물 목욕에서 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.</li>
</ol>3. 침묵 돌연변이 (Xho1 제한 사이트) 소개
<ol><li>한 쌍의 33-bp 뇌관 (p3 및 p4) 그렇지 않으면 보완 순서로 원하는 돌연변이 포함 하는 디자인.</li>
	<li>25 µ L의 전체 볼륨에 높은 중 합 효소17 (그림 1C) PCR을 수행 (10 복제 플라스 미드, 10 pmol 뇌관 믹스, 2 U 효소, 1 x 반응 버퍼 2 µ L의 ng) 자전거 매개 변수를 사용 하 여 표 3에 나열 된.</li>
	<li>DpnI 20 µ L (20 U 효소, 1 x 소화 버퍼) 37 ° c 물에서의 전체 볼륨에 h 1에 대 한 목욕으로 템플릿 플라스 미드를 소화.</li>
	<li>변환 하 고, 전파 하 고 분리, 한 시퀀싱 단계 2.5-2.7에서에서 설명한 대로 자동 돌연변이 포함 하는 플라스 미드. 참고: 또한 단일 반응18여러 DNA 파편의 합류에 대 한 허용 하는 복제 메서드를 사용 하 여 자동 돌연변이 도입 수 있습니다.</li>
</ol>4. 무작위 Mutagenesis의 rpt4 + 오류가 PCR에 의해
<ol><li>서식 파일, 뇌관 p5 및 p6, 50 µ L (단계 4.1.1, 10 pmol 뇌관 믹스, 2.5 U 효소, 1 x 반응 버퍼 2 µ L에서에서 정의 하는 서식 파일의 금액)의 총 볼륨으로 침묵 돌연변이 (Xho1 사이트)와 플라스 미드를 사용 하 여 오류가 PCR을 수행 그리고 높은 오류를 생성 하도록 설계 된 특별 한 중 합 효소 평가19 (그림 1D). 표 2에 설명 된 대로 PCR을 수행 합니다.<ol>
<li>서식 파일 플라스 미드의 4-5 µ g를 사용 하 여 1 bp/kb (kilobase) 돌연변이 주파수를 제어. 참고: 고 농도 (> 500 ng / µ L) 소형 예비 키트20를 사용 하 여 얻을 수 있습니다, 플라스 미드의 필수입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤 전기 이동 법을 사용 하 여 확인 (1.2 %agarose 젤) 2670 bp의 PCR 제품. 2.5 단계에서 설명한 대로 젤이 PCR 제품을 정화.</li>
</ol>5. 퓨전 PCR 파편 (칸, 3' UTR)의 준비
<ol><li>서식 파일, 프라이 머 p 7과 p8,으로 pFA6a KANMX621 을 사용 하 여 PCR을 수행 하 고 마커 (칸) 조각을 표 4에 나열 된 조건. 젤 단계 2.5 (그림 1E)에 설명 된 대로 결과 1480-bp 조각 정화.<ol>
<li>정지 codon 돌연변이 그것의 인접 한 유전자의 코딩 지구에 대 한 타겟 유전자의 500 이상의 구분 됩니다 경우 확인 혈압. 이 지구는 500 미만 때 생 터미네이터 사용할 수 없습니다 혈압; 오히려, ADH 터미네이터 생 터미네이터 대신 사용 되어야 한다. ADH 터미네이터를 사용 하는 데 필요한 프로토콜 변경 표 5에 표시 됩니다. 참고: 이러한 변경 내용은 ADH 터미네이터 pFA6a-3HA-KANMX6 플라스 미드에서 사용할 수 있는 내 생 터미네이터 대신 사용 하는 경우에 적용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR를 수행 하는 복제 rpt4 +-템플릿과 뇌관 p9, p10 50 µ L의 총 볼륨에서으로 벡터를 포함 (20 복제 플라스 미드, 10 pmol 뇌관 믹스, 2 U 효소, 1 x 반응 버퍼 2 µ L의 ng), 표 6에 제시 하는 조건을 사용 하 여. 젤 정화 획득 506-혈압 3' UTR 조각 (그림 1E).</li>
</ol>6. 퓨전 PCR (그림 1E)에 의해 변환 구문이 생성
<ol><li>50 ng / µ L에서 3 조각 (mutagenized rpt4 +, 칸, 그리고 3' UTR)를 준비 합니다.</li>
	<li>퓨전 3의 PCR 파편 뇌관 p11 및 p12를 사용 하 여 표 7에 설명 된 대로 수행 합니다. (융해 PCR 프로토콜은 원래 프로토콜22의 수정입니다.) 주요 4,398 bp의 PCR 제품을 정화.<ol>
<li>Rpt4 +사용: KAN:3'UTR 1의 비율로 조각: 최적의 결과 대 한 3:1. 참고: 삽입 DNA의 총 금액 500을 넘지 말아야 한다 니. Rpt4 +의 권장된 금액: KAN:3' UTR는 50 ng:150 ng:50 ng. Mutagenized 지역에서 약 1.6 kb가 이므로 다른 3 돌연변이 되 고 각 자료의 모든 가능한 조합에 대 한 계정을 것 이라고 하는 효 모 식민지의 최소 수는 1, 600 x 3 = 4800 식민지. 한 변환 반응 일반적으로 400-500 식민지 수율, PCR 건설 융합의 가치가 10 반응 필요 합니다. 이 필요 10의 요인에 의해 단순히 증가 반응 (즉, PCR 튜브의 수)에 의해 충족 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 변화의 Electroporation (그림 1 층)으로 분열 효 모
<ol><li>16 시간 이상 배양 하 여 누 룩 채도 예 매체의 10 mL을 접종.</li>
	<li>600에서 광학 밀도를 셀 희석 예 매체의 0.2에서 200 mL의 nm (OD600)와 OD600 5-6 h 동안 흔들어 30 ° C에 품 어 = 0.6-0.8.</li>
	<li>OD600 세포 집중 = 30, 4 개의 50 mL 원뿔 관에 분배 하 고 10 분 동안 얼음에 진정.</li>
	<li>4 ° c.에 3 분 1050 x g에서 원심 분리를 수행 하 여 셀을 수확 얼음에 튜브와 10 전기-큐 벳을 놓습니다. 얼음에 7.3 7.8 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 1.2 M sorbitol의 15 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브 resuspend 세포를 흔들어.</li>
	<li>1050 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 원심</li>
	<li>7.4 및 7.5 단계를 반복 합니다. 폐기는 상쾌한. 각 관에 1.2 M sorbitol의 500 µ L을 추가 하 고 셀, resuspend 한 15 ml 원뿔 튜브에 세포의 모든 수집.</li>
	<li>1.2 M sorbitol 추가 최대 2.4 mL (OD600 = 0.2 mL 당 10). 얼음에 튜브를 유지.</li>
	<li>Sorbitol 중단 셀 (그들은 완전히 일시 중지 되었는지 확인)의 200 µ L 추가 퓨전 PCR을 포함 하는 EP 튜브 구성, 잘, 그리고 전기 멧에 샘플을 전송.</li>
	<li>Electroporate 다음 옵션으로 셀: 버섯, ShS (2.00kV, 1 펄스).</li>
	<li>800 µ L의 전체 볼륨에 대 한 각 전기 멧을 1.2 M sorbitol의 600 µ L을 추가 하 고 4 예 판 (200 µ L/접시)에 셀을 확산. 10 전기-큐 벳 것 이다 분배 40 예 판.</li>
	<li>24 h 30 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>예 + G418 도금 복제를 수행 하 고 3 일 동안 30 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
</ol>8. 섬으로 불안정 돌연변이 및 판정에 대 한 검사의 선택
<ol><li>각 예 + G418 플레이트에 대 한 예-에이드 (Ade 낮은) PMG-에이드 (Ade 없음) 접시를 복제 도금을 수행 합니다. 예-에이드 접시에 식민지의 일부 빨간 채색 (그림 1G) 표시 될 때까지 30 ° C에서 1-2 일에 대 한 복제 판을 품 어.</li>
	<li>예-에이드와 PMG-에이드와 예 에이드 접시에 분홍색 또는 흰색을 표시 하 고 또한 PMG-에이드 접시에 성장 하는 선택 셀을 비교 합니다. 그들은 가양성 (예를 들어, 칸 카세트는 게놈에서 비 대상 사이트에 통합 되어 반영) PMG-에이드에 성장 없이 식민지를 선택 하지 마십시오.</li>
	<li>각 식민지에서 약 1 × 105 셀을 선택 하 고 포함 된 식민지 PCR (그림 1 H)에 대 한 시작 템플릿으로 수행 하기 위해이 솔루션의 적어도 30 분 사용 1 µ L 37 ° C에서 2.5 mg/mL zymolyase 100 T SPZ 솔루션의 10 µ L에서 품 어.<ol>
<li>2m sorbitol의 30 mL, 4.05 mL의 1 M 나2HPO4, 0.95 mL NaH2포4 증류수 (최종 pH 7.5) 15 mL를 혼합 하 여 SPZ (50 mL)을 확인 합니다. 샘플 (5 mL) zymolyase 보충 고 사용까지-20 ° C에서 500 µ L aliquots에 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤 전기 이동 법 (1.2 %agarose 젤, 180V, 20 분)의 결과 + 식민지 PCR 시각화를 수행 합니다. 선택 적절 한 크기의 PCR 악대를 전시 하 고 Xho와 각 반응 제품의 5 µ L를 소화 하는 반응 (4 U 효소, 1 x 소화 버퍼, 37 ° C 물 목욕, 1 시간)을 화면으로 가양성 (그림 1 H).</li>
	<li>XhoI 소화 (1.2 %Agarose 젤, 180 V, 20 분)을 시각화 하기 위해 젤 전기 이동 법을 수행 합니다. 식민지 PCR 제품은 XhoI, 절단 및 예 + G418 번호판 (그림 1I) 패치를 표시 합니다.</li>
	<li>분열 효 모 세포에서 gDNA를 분리 하 고 PCR 제품23의 시퀀싱을 수행. 돌연변이 (그림 1I)를 식별 하는 야생-타입 시퀀스와 얻은 시퀀스를 비교 합니다.</li>
	<li>직접 다시 돌연변이 세포23에서 PCR에 의해 증폭 퓨전 구문으로 변환 하 여 야생-타입 셀에 mutation(s)를 소개 합니다. 새로 만든된 돌연변이 세포 (그림 1J)에 표현 형을 확인 하기 위해 안보를 사용 합니다.<ol>
<li>퓨전 변환 구문을 증폭 하실 수 있습니다 쉽게 PCR에 의해 뇌관 p1와 p10 50 µ L (~ 1 µ g DNA, 20 U 효소 반응 버퍼 x 1)의 총 볼륨에 템플릿으로 돌연변이의 게놈 DNA를 사용 하 고 표 2에에서 설명 된 반응 사이클을 적용 . 구성의 변화 단계 7.1-7.13에 따라 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

오류가 PCR 통해 임의의 mutagenesis 주어진된 지역에서 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 특정 상황에서 단백질의 기능을 평가 하는 연구에 대 한 특히 유용 합니다. 예, 우리는 여기는 19S 프로테아좀 소 단위, Rpt4, 섬으로 유지 보수에서의 기능을 평가 하기 위해 오류가 PCR을 사용. 변화 하 여 지역 오류가 PCR에 의해 표적으로 하 고 심사 조건 조정, 우리 관심 및 원하는 표현 형에 대 한 스크린의 게놈 영역에서 셀을 변경할 수 있었다. 최근, 스핀 들 극 신체 구성 요소25에서 돌연변이 은닉 하는 분열 효 모 세포를 분리 하는 유사한 방법 사용 되었다.
무작위 mutagenesis의 주요 장점은 모두 비 필수 및 필수 유전자에 적용할 수 있습니다. 필수적인 유전자의 무작위 mutagenesis 세포 생존 능력 지속 될 수 있도록 하는 미묘한 또는 부분적 기능 오류 등 다양 한...

앞으로 유전학 연구원 추구 특정 표현 형을 표시 하는 자연적 사건 돌연변이 및 유전 분석을 수행 고전적인 방법입니다. 반전 유전학에서 관심사의 유전자에 돌연변이 소개 하 고 표현 형 검사. 후자의 경우 대상 유전자의 무작위 mutagenesis 이후에 온도 감도 등 원하는 고기에 대 한 선택 또는 효소 활동을 변경 하는 돌연변이의 풀을 생성 하 자주 사용 됩니다. 다양 한 방법은 오류가 PCR1;를 포함 하 여 임의의 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다. UV 방사선 조사2. 화학 mutagens, 에틸 methanesulfonate (EMS) 등 질소 산3; - mutD5 4; 표현 등 임시 mutator 긴장의 사용 그리고 DNA5를 걸어 갔다입니다.
여기, 우리는 우리 분열 효 모에 대상 유전자 돌연변이 풀을 생성 하는 오류가 PCR을 이용 하는 반전 유전학 전략을 설명 합니다. 로 한의 이름에서이 메서드는 PCR 동안 일부러 오류를 도입 하 여 돌연변이 생성 합니다. 다른 mutagenesis 방법과 달리 오류가 PCR mutagenized 될 영역을 정의 하는 사용자 수 있습니다. 이것은 관심사의 단백질/도메인의 기능을 연구 하는 노력에 특히 유용 하다.
이 무작위 mutagenesis 절차를 보여, 우리 여기 사용 rpt4 +, 19S 프로테아좀 소 단위를 인코딩하는 예를 들어. Rpt4 분열 효 모6,7,,89, 다른 유기 체에 있는 베이스-독립적인 기능을가지고 표시 되었습니다 및 베이스 결함 단백질을 변경 하 여 간접 효과 일으킬 수 있습니다. 수준입니다. 우리는, 그러므로, 섬으로에 프로테아좀의 기능을 조사 하는 목적으로 베이스-독립적인 변화를 유발 하는 돌연변이 대 한 검사.
오류가 PCR 뇌관을 바인딩할 위치를 조정 하 여 어떤 유전자 영역에 적용할 수 있습니다. 적절 한 기자와 원하는 phenotypic 변화 하는 돌연변이 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 ade6 + 기자 삽입 활용는 centromere 1 외부 반복 (otr) 지역10. Ade6 + 기자 야생-타입 상태;에서 침묵은 그래서 제정 섬으로이 지역11에 형성 된다 이 빨간 식민지10으로 표시 됩니다. Centromere는에 제정 섬으로 destabilizes 하는 돌연변이 ade6 + 기자, 백색 식민지로 시각 이다는 식으로 이어질 것입니다.

<table><tbody><tr><td><강한>1. 미디어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-히스티딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>시그마-알드리치</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>시그마-알드리치</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>프탈레이트 칼륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>이노시톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>비오틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마-알드리치</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>시그마-알드리치</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7H2O&nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&bull; 4H2O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 몰리브덴산염 이수화물</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5H2O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>판토텐산</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>니코틴산</td><td>시그마-알드리치</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>바이오베이직</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, 게네틱인</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>2. 효소 반응</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>현장 지시 돌연변이 유발</td></tr><tr><td>GeneMorphII 무작위 돌연변이 유발 키트</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>오류 발생 PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA 중합효소</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>융합 PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&nbsp; DNA 중합효소</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>일반 PCR</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>3. 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen 사각형, 검은색</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td></td></tr><tr><td>복제품용 복제품 도금 도구</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>복제품</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&nbsp;</td><td>핵분열 효모 형질전환용</td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳, 0.2cm 간격</td><td>Biorad</td><td>1652086&nbsp;</td><td>핵분열 효모 형질전환용</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>융합 PCR 램프 반응용&nbsp;</td></tr></tbody></table>

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 mutagenesis 유전자 타겟팅

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

대상 유전자의 무작위 mutagenesis 원하는 표현 형을 생성 하는 돌연변이 식별 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 무작위 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다 방법의 오류가 PCR는 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 편리 하 고 효율적인 전략 이다 (즉., 돌연변이 도서관). 연구원은 다른 게놈 영역을 영향을 받지 떠나는 동안 유전자의 코딩 지구 같은 미리 정의 된 영역을 변형 하고자 하는 경우 오류가 PCR 방법의 선택입니다. 돌연변이 라이브러리 오류가 PCR에 의해 증폭 되어, 후 적당 한 플라스 미드로 복제 해야 합니다. 오류가 PCR에 의해 생성 된 라이브러리의 크기는 복제 단계의 효율에 의해 제한 됩니다. 그러나, 분열 효 모, Schizosaccharomyces pombe, 복제 단계는 매우 효율적인 원스텝 퓨전 변환에 대 한 구문을 생성 하는 PCR의 사용으로 대체할 수 있습니다. 원하는 고기의 돌연변이 다음 적절 한 기자를 사용 하 여 선택할 수 있습니다. 여기,이 전략 자세하게, 예를 들어, centromeric 섬으로에 삽입 기자 복용 설명 합니다.

그림 1 에 설명 된 절차에 따라 인수 Rpt4 돌연변이 식민지의 색상을 평가 하 여 분석할 수 있습니다. 식민지의 색상은 그림 2에 셀 수 감소에 관련 된 접시에 발견 했다. 섬으로 지역에 삽입 기자 ade6 + 야생-타입에 침묵 하 고 예 에이드 접시에 빨간 식민지를 보여줍니다. 일단는 섬으로 불안정 하 고 ade6 + 기자 표현, 백색 식민지 clr4Δ 돌연변이로 예 에이드 접시에 관찰할 수 있습니다. 스크린된 Rpt4 돌연변이 같이 있습니다. rpt4-1 돌연변이 가장 심각한 섬으로 불안을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/...

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

이 무작위 돌연변이 유발의 전반적인 목표는 이염색질을 불안정하게 만드는 돌연변이를 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 이염색질의 형성 및 유지를 조절하는 요인과 같은 이염색질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자가 필수적이더라도 돌연변이 유발을 위해 원하는 유전자를 특이적으로 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다.시작하려면 이 표와 같이 성분을 혼합하여 보충제가 있는 효모 추출물 또는 아데닌이 없는 YES, 아데닌이 없는 폼베 글루타메이트 배지 또는 PMG를 준비합니다. 오토클레이브 및 필요한 경우 G418을 첨가한 후 배지를 5-10분 더 교반합니다. 그런 다음 미디어를 90ml 페트리 접시에 나누고 플레이트를 섭씨 4도에서 보관합니다.그것의 5개의 주요한 및 3개의 주요한 UTRs 및 침묵하는 돌연변이, 뿐 아니라 뇌관 p5와 p6 및 특별한 폴리메라이제와 더불어, 복제한 rpt4 긍정을 사용하여, 높은 과실률을 생성하기 위하여 디자인된 특별한 폴리메라이제는, 50 마이크로리터의 총 양에 있는 과실 수그린 PCR를 실행합니다. 형질전환-융합 구조체를 생성한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 10ml의 YES 배지에 효모를 접종하고 16시간 이상 포화될 때까지 배양합니다. 200 밀리리터의 YES 배지를 사용하여 세포를 0.2의 OD600으로 희석하고, 섭씨 30도에서 5-6 시간 동안 흔들면서 0.6-0.8의 OD600으로 배양합니다.30의 OD600까지 더하는 셀의 부피를 계산합니다. 그런 다음 세포를 50ml 원뿔형 튜브 4개에 넣고 얼음에서 10분 동안 식힙니다. 1050G와 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.그런 다음 카세트 DNA가 있는 마이크로분리 튜브와 10개의 전기 큐벳을 얼음 위에 놓습니다. 얼음 위에 있는 동안 상층액을 버리고 1.2몰 소르비톨 15ml를 넣고 튜브를 부드럽게 흔들어 세포를 다시 현탁시킨 다음 1050G와 섭씨 4도에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 두 번째 소르비톨 세척을 수행합니다.원심분리 후 상층액을 버리십시오. 그런 다음 세포를 다시 현탁시키고 하나의 15ml 원추형 튜브에 모두 모읍니다. 다음으로, 1.2 몰 소르비톨을 최대 2.4 밀리리터까지 첨가하십시오.세포 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음, 200마이크로리터의 소르비톨 현탁 세포를 융합 PCR 구조체가 포함된 튜브에 추가하고 잘 혼합한 다음 샘플을 전기 큐벳으로 옮깁니다. 배출 오류가 발생하므로 과도한 양의 PCR 카세트를 사용하지 않는 것이 중요합니다.뒤에 오는 선택권을 사용하여 세포를 전기로 천공하십시오: 800 마이크로리터의 총량을 위한 각 전기 큐벳에 1.2 몰 소르비톨의 600 마이크로리터를 추가하십시오. 그런 다음 세포를 4개의 YES 플레이트에 펴 놓습니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 24시간 동안 배양합니다.그런 다음 YES plus G418에서 복제 도금을 수행한 후 추가로 3일 동안 플레이트를 배양합니다. 각 YES plus G418 플레이트에 대해 아데닌 플레이트가 없는 YES 및 아데닌 플레이트가 없는 PMG로 복제 도금을 수행합니다. 아데닌이 없는 YES 플레이트의 일부 콜로니가 흰색을 나타낼 때까지 섭씨 30도에서 1-2일 동안 복제 플레이트를 배양합니다.아데닌 플레이트가 없는 YES와 아데닌 플레이트가 없는 PMG를 비교하고, 아데닌 플레이트가 없는 YES에서 분홍색 또는 흰색으로 표시되는 세포를 선택하고 아데닌 플레이트가 없는 PMG에서도 자랍니다. 아데닌이 없는 PMG에서 성장이 없는 콜로니는 위양성이므로 선택하지 마십시오. 각 콜로니를 선택하고 zymolyase 100T의 밀리리터당 2.5mg을 포함하는 10마이크로리터의 SPZ 용액에 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 군체를 배양합니다. 배양 후 이 용액 1마이크로리터를 콜로니 PCR의 시작 템플릿으로 사용합니다. 선택한 콜로니를 분해하고 텍스트 프로토콜에 따라 겔 전기영동을 수행한 후, PCR 산물이 XHO1에 의해 절단된 콜로니를 표시하고 YES 플러스 G418 플레이트에 패치합니다.핵분열 효모 세포에서 gDNA를 분리하고 텍스트 프로토콜에 따라 PCR 산물을 염기서열분석한 후 얻은 염기서열을 야생형 염기서열과 비교하여 돌연변이를 식별합니다. 돌연변이가 야생형 세포에 다시 도입되면 스포팅을 사용하여 새로 만들어진 돌연변이 세포에서 표현형을 확인합니다. 이 비디오에서 시연된 프로토콜을 사용하여 생성된 rpt4 돌연변이는 군체의 색상을 평가하여 분석할 수 있습니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 군체는 세포 수가 감소하는 관련 플레이트에 발견되었습니다. 헤테로크로마틴 영역에 삽입된 아데닌 리포터는 야생형 세포에서 침묵하고 아데닌 플레이트가 없는 YES에 적색 콜로니를 생성합니다. 헤테로크로마틴이 불안정해지고 아데닌 리포터가 발현되면 clr4-델타 돌연변이에서 볼 수 있듯이 아데닌 플레이트가 없는 YES에서 흰색 콜로니를 관찰할 수 있습니다.스크리닝된 rpt4 돌연변이는 가장 심각한 헤테로크로마틴 불안정화를 나타내는 rpt4-1 돌연변이와 함께 표시된 바와 같습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 원하는 돌연변이를 얻기 위해 2주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 예상보다 빈번한 오탐을 제거하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 단백질의 특성과 같은 추가 질문에 답하기 위해 단백질 정제 및 효소 활성 테스트와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원하는 표현형을 가진 표적 유전자에서 돌연변이를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

여기에서는 발아 효모에서 화학적-유전적 상호 작용을 정의하기 위한 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 효모 분자 생물학의 기본 기술을 기반으로 하며 중소 규모의 화학 물질 및 기타 매체 환경에 대한 기계론적 조사에 매우 적합합니다.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

우리는 높은 처리량 시퀀싱을 이용하여 단백질의 종합적인 단일 사이트 포화 돌연변이 라이브러리의 기능 평가를위한 프로토콜을 제시한다. 중요한 것은,이 방법은 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 다중화하는 직교 프라이머 쌍을 사용한다. 암피실린의 임상 적 투여 량에서 선택 TEM-1 β-lactamase를를 사용하는 대표적인 결과가 제공된다.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

유전자 인코딩 히스톤 - miniSOG는 푸른 빛 의존적으로 게놈 전체의 유전 변이를 유도한다. 이 돌연변이 유발 방법은 빠르고 간단 독성 화학 물질의 자유, 앞으로 유전자 검사 및 유전자 통합에 적합합니다.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Saccharomyces cerevisiae의 내인성 위치에서 히스톤 유전자의 돌연변이를 생성하는 전략이 제시됩니다.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

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이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.

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온도에 민감한(ts) 치명적인 돌연변이는 필수 기능을 식별하고 분석하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 높은 처리량으로 ts의 치명적인 돌연변이를 생성하고 분류하는 방법을 설명합니다.

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