Name: Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 학습하세요 쥐 두뇌 분할 영역을 활용한 ex vivo 기법으로 신경퇴행성 질환의 초기 분자 변화를 동시 비교 분석하는 방법입니다. 이 기술은 알파7 니코틴 수용체, 타우 인산화 및 아밀로이드 베타 수준 변화를 정밀하게 측정하여 신경퇴행 메커니즘 연구에 필수적인 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 신경-바이오 회사에 의해 투자 되었다 우리는 그들의 의견 및 조언을 원고에 대 한 박사 조반니 Ferrati와 박사 세르지오로 톤도 (신경-바이오) 감사 하 고 싶습니다.

모든 동물 연구 승인된 프로토콜에서 수행 되었습니다.
참고:이 섹션에서는 실험 절차 동안 수행의 주요 단계 순서와 제안된 시간 간격 (그림 1)를 제공 됩니다. 또한, 프로토콜에 대 한 단계별 설명 (그림 2) 잠복기 후 조직 균질 뇌 제거에서까지 중요 한 작업을 보여주는 설명 패널에 의해 보충 된다. 재료 및 기구 및 WB 분석에 대 한 후속 단계 지침에 관한 내용은 앞에서 설명한22있습니다.
1. 수술 도구, Vibratome 설정 및 치료 준비
참고: 실험 절차를 시작 하기 전에 다음 단계를 실행:
<ol><li>두 다른 인공 뇌 척추 액체 (aCSFs), 뇌 조각화에 대 한 사용을 준비 하 고 인큐베이션 단계에 대 한 다른 이전29설명. 짧게, 두 aCSFs의 (mmol)에서 작업 농도 "슬라이스" 실제는: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2포4및 10 포도 당; 6.7 HEPES 소금과 3.3 HEPES 산; pH: 7.1. "녹음" 실제 대: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2포4및 10 포도 당; pH: 7.1.</li>
	<li>솔루션을 잘 섞어 다음 얼음에 넣어 하 고 두뇌와 후속 단면을 제거 하는 동안 감기를 가지기 위해 조각화 실제 산소. 녹음 실제를 실 온 (RT)와 공급 산소에서 유지.</li>
	<li>잘린 및 뇌 제거, 즉, 단두대, 수술 해 부 키트 (가 위, 집게, 블레이드), 및 주걱 절 개 후드 악기를 놓습니다.</li>
	<li>슬라이스 두께 (이 준비에서 300 µ m)와 7에 주파수와 6 속도 선택 하 여 vibratome 매개 변수를 설정 합니다. Vibratome 챔버의 적절 한 공간에 삽입 하 고 그것을 포위 하는 얼음.</li>
	<li>"조각화" (실제) 뇌 단면 중 산소 carbogen (95% O2, 5% CO2) 밸브를 엽니다. 최소 유량 2 mL/min의 주위를 선택 합니다.</li>
	<li>테스트 조건을 준비 하 두 15 mL 튜브를 가져가 라. "녹음" 실제의 10 mL T30 2 µ M (대우 그룹)의 농도에 농축 한 튜브는 "기록" 실제 혼자 (제어 그룹) 10 mL와 다른,를 추가 합니다. 와 동 모두 튜브와 설치 준비 단계 (제 3)에서 사용까지 얼음에 그들을 유지.</li>
</ol>2입니다. 마 취, 뇌 추출 및 슬라이스
참고:이 연구에서 9 야생 타입 P14 남성 Wistar 쥐 사용 되었다. 뇌 추출 및 후속 슬라이스 이후 그들은 신속 하 게 수행 해야 (10 분) 이내 방지 하거나 적어도 조직 변성 과정 감속 프로토콜의 중요 한 부분을 구성 합니다.
<ol><li>유도 챔버로 면 레이어에 isoflurane의 100 %w / w 1.5 mL을 추가, 내부, 동물 놓고 뚜껑을 닫습니다. 동물 깊이 취 페달 반사의 부재를 확인 될 때까지 기다립니다 고 단두대를 사용 하 여 동물을 목을 벨.</li>
	<li>계속 차가운 남 비를 포함 하는 내에서 동물의 머리 두뇌 제거 단계 동안 실제 조각화 (그림 2A -C).</li>
	<li>외과 블레이드, 두개골을 통해 피부를 incise 다음 후부 부분에서 중간, 다음가 위를 사용 하 여 두개골을 잘라 고 anteriorly OBs (그림 2A) 위에 뼈를 도달할 때까지.</li>
	<li>옆 뇌 (그림 2B)에 액세스할 수 있습니다 한 쌍의 집게를 사용 하 여 두개골의 두 측면을 당겨. 뇌에 ventrally 주걱을 삽입, 그것을 밖으로, 그리고 그것은 약 5 분 (그림 2C)에 대 한 차가운 "슬라이스" 실제에 충분 한지 체크 해 계속 부드럽게 푸.</li>
	<li>필터 종이에 두뇌를 처분 하 고 (그림 2D) 블레이드를 사용 하 여 소 뇌를 잘라. Vibratome 디스크에 세로로 두뇌 접착제 및 단면 챔버 내부 삽입, 차가운 "슬라이스" 실제 그것을 채울 제공 되며 산소 (그림 2E).</li>
	<li>절단 간격을 조정 하 고 뇌 단면 (그림 2F)와 함께 진행. 앞에서 설명한22로 중간 심장 (MS), Broca (DBB), 그리고 substantia innominata (SI)의 대각선 밴드 등 관심 영역을 포함 하는 섹션을 수집 합니다. 위에서 아래, 3 조각 rostral (R), 중급 (I), 그리고 BF (그림 2G)의 꼬리 (C) 부분을 포함합니다.</li>
	<li>작은 위, 각 섹션 중간 선 따라 분할 취득 두 반사 hemislices (그림 2 H), 개별적으로 제어와 같은 해 부 비행기에서 대우 조건 사용.</li>
	<li>5-10 분, vibratome 챔버에는 hemisections를 계속 한 다음 녹음 실제를 포함 하는 버블링 냄비에 유리 피 펫과 그들을 전송. 복구를 약 30 분 동안 RT에서 유지.</li>
	<li>한편, 혼자 녹음 실제의 3 mL (이전 단계 컨트롤 그룹에 대 한 1.6에서에서 준비)와 함께 3 개의 유리 튜브와 실제 T30 (이전 단계 1.6에서에서 준비) 대우 그룹에 대 한 강화의 3 mL와 함께 3 개의 튜브 작성.</li>
</ol>3. 설치 준비
<ol><li>제어 그룹 (녹색 프레임, 그림 2J) 3 연속 hemislices (rostral, 중간, 및 꼬리 BF 지역 포함) 순서는 hemisections 그들의 해당 유리 튜브 (그림 2I)로 전송 하 고 그들의 대우 그룹 (레드 프레임, 그림 2J)에 대 한 대응을 일치.</li>
	<li>조건 사이 어떤 오염 든 지 방지 하기 위해 제어 hemislices 및 다른 처리 대응에 대 한 두 개의 다른 붓과 뇌 조직의 전송.</li>
	<li>각 유리 유리병 oxygenating 바늘 (21 G) (그림 2J) 제시 해당 뚜껑을 봉인. Carbogen 소스 (그림 2 K) 기구의 주요 튜브를 연결 합니다. 실험 기간 동안 뇌 조직과 기계적 손상의 어떤 움직임을 피하기 위하여 2 mL/min의 최소 유량과 인큐베이션 기간 동안 hemislices에 산소를 제공 합니다. 5 h 부 화를 시작 합니다. 5 분 이내 3.1-3.3 단계를 실행 합니다. 참고: 체크 자주 (매 15-20 분) 모든 튜브에 산소 제공 여부와 흐름 아래에서 조직을 이동 하지 않습니다.</li>
</ol>4. 샘플 균질
<ol><li>부 화 후 산소 흐름을 중지 하 고 튜브에서 모든 뚜껑을 제거 합니다. Hemislices, 얼음 (그림 2 L)에 튜브를 유지 세포의 용 해 버퍼의 250 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 적절 한 브러쉬를 사용 하 여 전송 합니다. 세포의 용 해 버퍼, PBS 1 인산 가수분해 효소와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 모두에서 1: 100, 희석와 조직 샘플 중 오염을 방지 하기 위해 다른 pestles와 균질. 10-15 분 내에서 이러한 작업을 완료 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 1000 x g에서 lysate 뇌 원심 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 샘플-80 ° c.에 유지</li>
</ol>5. 단백질 농도 및 서쪽 오 점 분석의 읽기
<ol><li>각 샘플의 단백질 농도 확인 하 고 이후에 aliquots 앞에서 설명한22로 서쪽 오 점 분석을 위한 준비.</li>
	<li>단백질 표정에 치료의 효과 평가 하기 위해 통계 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Schliebs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+forebrain+cholinergic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease--interrelationship+with+beta-amyloid%2C+inflammation+and+neurotrophin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling.</a> Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).</li>
<li>Schmitz, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+forebrain+degeneration+precedes+and+predicts+the+cortical+spread+of+Alzheimer%27s+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology.</a> Nature Communications. 7, 13249(2016).</li>
<li>Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+normal+in+normal+aging%3F+Effects+of+aging%2C+amyloid+and+Alzheimer%27s+disease+on+the+cerebral+cortex+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus.</a> Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).</li>
<li>Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+centres+in+Alzheimer%27s+disease%3A+olfactory+bulb+is+involved+in+early+Braak%27s+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages.</a> Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).</li>
<li>Winblad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defeating+Alzheimer%27s+disease+and+other+dementias%3A+a+priority+for+European+science+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society.</a> The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).</li>
<li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li>
<li>De Strooper, B., Karran, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Phase+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular Phase of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 164 (4), 603-615 (2016).</li>
<li>Scheltens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(15)01124-1/abstract">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).</li>
<li>Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+in+Alzheimer%27s+disease+resemble+embryonic+development-A+study+of+molecular+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms.</a> Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).</li>
<li>Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+and+the+basal+forebrain+cholinergic+system%3A+relations+to+%CE%B2-amyloid+peptides%2C+cognition%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies.</a> Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).</li>
<li>Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neurone+loss+in+Alzheimer%27s+disease%3A+cortical+or+subcortical%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical?</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 10(2015).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+Pivotal+Factor+or+The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+Pivotal+Factor+or+Side+Show%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show?</a> Learn Mem. , 43-49 (2004).</li>
<li>Schliebs, R., Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholinergic+system+in+aging+and+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The cholinergic system in aging and neuronal degeneration.</a> Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).</li>
<li>Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cholinergic+pathways+in+the+rat%3A+An+overview+based+on+an+alternative+nomenclature+%28Ch1-Ch6%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6).</a> Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).</li>
<li>Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+cortex+by+the+basal+forebrain%3A+cytochemistry+and+cortical+connections+of+the+septal+area%2C+diagonal+band+nuclei%2C+nucleus+basalis+%28substantia+innominata%29%2C+and+hypothalamus+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey.</a> J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).</li>
<li>Greenfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+and+targeting+the+basic+mechanism+of+neurodegeneration%3A+The+role+of+peptides+from+the+C-terminus+of+acetylcholinesterase%3A+Non-hydrolytic+effects+of+ache%3A+The+actions+of+peptides+derived+from+the+C-terminal+and+their+relevance+to+neurodegenerat%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat.</a> Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).</li>
<li>Garcia-Ratés, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28I%29+Pharmacological+profiling+of+a+novel+modulator+of+the+%CE%B17+nicotinic+receptor%3A+Blockade+of+a+toxic+acetylcholinesterase-derived+peptide+increased+in+Alzheimer+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">(I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains.</a> Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).</li>
<li>Eimerl, S., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantity+of+calcium+that+appears+to+induce+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The quantity of calcium that appears to induce neuronal death.</a> Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).</li>
<li>Greenfield, S., Vaux, D. J. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/0d25/c7e053b9eed98e759c2e2879cb53195c084e.pdf">Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism.</a> Science. 113 (3), 485-492 (2002).</li>
<li>Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28II%29+Physiological+profiling+of+an+endogenous+peptide+in+the+basal+forebrain%3A+Age-related+bioactivity+and+blockade+with+a+novel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">(II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator.</a> Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).</li>
<li>Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+Vivo+Model+to+Investigate+the+Underlying+Mechanisms+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291(2017).</li>
<li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+rat+hippocampus+slices+following+in+vivo+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia.</a> Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).</li>
<li>Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Adenosine+Receptor-Mediated+Regulation+of+Diverse+Thalamocortical+Short-Term+Plasticity+in+the+Mouse+Whisker+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway.</a> Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Badin, A. S., John, E., Susan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+spatio-temporal+bioactivity+of+a+novel+peptide+revealed+by+optical+imaging+in+rat+orbitofrontal+cortex+in+vitro%3A+Possible+implications+for+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases.</a> Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).</li>
<li>Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+rat+brain+suggests+a+previously+missing+link+between+top-down+and+bottom-up+nervous+system+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function.</a> Neurophotonics. 4, 31213(2017).</li>
<li>Opitz-Araya, X., Barria, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3197400/">Organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).</li>
<li>Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+active+rat+brain+slices+as+a+model+to+study+the+regulation+of+protein+phosphorylation+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain.</a> Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).</li>
</ol>

저자는 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 수잔 A. 그린 필드는 설립자 이자 신경-바이오 제한, 개인 소유의 회사, 및 보유 주식 회사의 사장. 에마누엘레 땋 고 Antonella Cogoni는 신경-바이오 회사의 직원

잘 설립 비보 전 뇌 기술에 따라,이 프로토콜의 주요 측면 동기적으로 특정의 신청 후에 그들의 응답을 모니터링 같은 해 부 비행기에서 얻은 두 개의 반사 hemislices 테스트를 수합니다 조건 제어 (치료를); 이 따라서 최대한으로 엄격 하 게 제어 하는 실험 패러다임을 제공 합니다. 시간-, 복용량-및 특정 방식으로 서로 다른 neurochemicals 신경 장애에 관련 된 신경 이벤트22, 동안 본 평가의 가능성 필수적인 기능을 나타냅니다. 이 방법론 그 시험관에서 준비, 관심 영역 및 이상적인 extracellular 컨텍스트를 만드는 정확도 등의 생체 내에서 생리 적 환경의 장점을 연결 합니다. 이 프로토콜 나타냅니다 비보 전 electrophysiological 녹음25,,26<sup c...

광고는 점진적 신경 장애 entorhinal 외피 (EC), BF, 해 마 (HC), 및 후 각 전구 등의 서로 다른 뇌 영역에 영향을 미치는 만성 병 리 특징 (OB)1,2,3, 4,5. 광고 개발의 후반 단계에서 만드는이 질병 약 모든 경우6의 70%를 차지, 치 매의 가장 일반적인 형태는 진보적인 인식 쇠퇴에 리드. 광고에 발생 하는 초기 단계를 이해 하 광범위 한 시도도 불구 하 고 되지 않습니다 현재 그들 elucidating 정의 실험 표시. 또한, 가장 인기 있는 이론-"녹말 체 가설은"-점점 문제 시 된다 광고 pathobiology도 효과적인7,8 입증 제약 대상 설명에 완전 한 단면도 제공 하지 않기 때문 ,9.
증가 주목 받고 있는 대체 이론 neurodegeneration 중 발생 하는 초기 메커니즘 광고3,,1011 에 주로 감염 신경 클러스터에 관련 된 제안 , 12 , 13 , 14. EC, HC, 및 산부인과15,16등 여러 영역에 BF, midbrain, 및 brainstem, 프로젝트 내에서 포함 하 고이 다른 유형의 세포 허브. 신경 형태학 및 신경 전달 물질 합성에 그것의 다양성에도 불구 하 고 셀의이 핵심 표현 하는 통증 또한 비 효소 기능17,18을 가질 수 있는 일반적인 기능을 공유 합니다. 신호 분자 중재 Ca2 + 복용량, 가용성, 그리고 신경 나이17,18 에 관하여 영양 또는 독성 이벤트를 받을 수 있는 신경 세포로 칼슘 (캘리포니아2 +) 흐름 소설이 아닌 클래식 역할 , 19.
Neurodegeneration, 동안 관찰된 셀룰러 손실 수 있습니다 따라서 연결 될이 비 효소 기능17,,1820는 이다 30mer 펩타이드 (T30) 통증 C-말단은 에서 죽 습에 기인 20. 세포 배양 및 광학 이미징18,21 에 이전 결과 따라 우리 시연, ex vivo 쥐 뇌 조각 T30 유도 하는 BF 구조를 포함에 따라 새로운 접근 방식을 통해 광고 같은 프로필22. 특히,이 새로운 방법론까지 해부학에서 회로 보존, 이기는 하지만 시간의 시간 창 그대로 직물의 특성의 많은 유지 이후 세포 배양 보다 더 생리 적인 시나리오를 제공 합니다. 우리는 T30 응용 프로그램에 심각한 응답을 모니터링 neurodegeneration의 초기 단계에서 일어나는 이벤트를 탐험이 프로토콜을 적용 했다.
뇌를 사용 하 여 문학의 큰 신체에도 불구 하 고 분자 경로 조사 하는 조각 신경 손상에 대 한 묵시적인 또는 신생23,24이 프로토콜 보다 즉각적인 처음으로 제공 하 고 밖으로 읽기에 민감한 비교 organotypic 조각의 일반적인 사용 하. 그러나, 사건으로 organotypic에 대 한 뇌 섹션,이 심각한 슬라이스 절차 또한 채택 될 수 특정 프로세스에서 발생 하는 주요 분자 변화의 발견 신경 또는 신경 분자의 평가 등 여러 가지 목적 immunohistochemical 분석, 및 중앙 신경 조직에 대 한 약리학 적인 분석 실험 병 리 관련.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>S7653</td><td>aCSF 준비용 시약</td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>P9333</td><td>aCSF 준비용 시약</td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>S5761</td><td>aCSF 준비용 시약</td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4(7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>63138</td><td>aCSF 준비용 시약</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>P5655</td><td>aCSF 준비용 시약</td></tr><tr><td>Hepes salt</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>H7006</td><td>aCSF 준비용 시약</td></tr><tr><td>Hepes acid</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>H3375</td><td>aCSF 준비용 시약</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>g7528</td><td>aCSF 제제용 시약</td></tr><tr><td>염화칼슘 탈수</td><td>Sigma-Aldrich, 독일</td><td>223506</td><td>aCSF 제제</td></tr><tr><td>T30 펩타이드</td><td>Genosphere Biotechnologies, 프랑스</td><td></td><td>AChE 유래 펩타이드 테스트 수술</td></tr><tr><td>용 해부 키트</td><td>World Precision Instruments, 미국</td><td>항목 #: MOUSEKIT</td><td>뇌 제거 단계</td></tr><tr><td>수술용 블레이드</td><td>Swann-Morton, 영국</td><td>BS 2982</td><td>뇌 제거 단계</td></tr><tr><td>여과지 Fisher</td><td>Scientific, 미국</td><td>11566873</td><td>슬라이싱을 위한 뇌 준비</td></tr><tr><td>접착제</td><td></td><td></td><td>슬라이스를 위한 뇌 준비</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, 독일</td><td>VT1000 S</td><td>슬라이싱</td></tr><tr><td>브러시</td><td></td><td></td><td>조직 취급</td></tr><tr><td>산소 용기</td><td></td><td></td><td>절편 및 배양 단계</td></tr><tr><td>1x 인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td>Fisher Scientific, 미국</td><td>BP2438-4</td><td>균질화 단계</td></tr><tr><td>인산가수분해효소 억제제</td><td>Fisher Scientific, 미국</td><td>1284-1650</td><td>균질화 단계</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Roche complete PIC, 미국</td><td>4693116001</td><td>균질화 단계</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Starlab, 영국</td><td>I1415-5390</td><td>균질화 단계</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm 단백질 분석</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>22660</td><td>단백질 농도</td></tr></tbody></table>

neurodegeneration ex vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

기본 neurodegeneration을 처리 하는 기본을 반영 하는 신뢰할 수 있는 동물 모델 개발을 시도 하는 수많은 연구에도 불구 하 고 거의 널리 허용 되었습니다. 여기, 우리는 유명한 비보 전 뇌 조각 기술는 가까이 vivo에서제공에서 적응 하는 새로운 절차 제안- 생체 외에서 준비로 세포 변성을 트리거링 초기 이벤트 조사에 대 한 보다 시나리오 처럼 Alzheimer의 질병 (광고)에서 관찰 됩니다. 선택 된 두뇌 지구 및 생리 적인 환경에서의 로컬 기능 해 부 cytoarchitecture의 보존을 가능 하 게 간단 하 고 쉽게 재현 가능한 단계,이 변이 의하여 이루어져 있다. 다른 해 부 지역 사이트-, 복용량-및 시간에 따른 방식으로 문제의 치료와 여러 실험을 수행할 수 있는 기회를 제공 하는 동일한 뇌에서 얻을 수 있습니다. 이 방법론에 관련 된 결과 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 제한 조직, 즉, 자국과 인큐베이션 단계와 섹션 두께 동안 해부학의 무결성의 유지 관리의 보존에 관련 된 어떤 생화학 및 immunohistochemical 분석을 좌우할 수 있다. 이 방법은 생리 적 또는 병 적인 조건, 마약 검사, 또는 복용량 응답 분석 실험에 참여 하는 분자 메커니즘을 탐구 하는 등 다른 용도로 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜 또한 동물 행동 연구에서의 수를 줄일 수 있습니다. 여기에서 보고 된 응용 프로그램은 최근 설명 되었고 슬라이스에 비보 전 쥐 뇌 기저 개 (BF)는 광고에 주로 영향을 대뇌 영역 중 하나를 포함 하는 처음으로 테스트. 특히, 그것은 입증 되었습니다 acetylcholinesterase (통증)의 C-말단에서 파생 된 독성 펩 티 드의 트리거링, BF의 antero 후부 축 차동 식의 광고와 같은 프로 파일을 프롬프트 수 있습니다. 단백질 alpha7 nicotinic 수용 체 (nAChR α7), 등의 광고에서 변경 phosphorylated (p-타우), 타우 및 아 밀 로이드 베타 (Aβ).

여기에 제시 된 프로토콜 나타냅니다 독성 펩 티 드, T30, 관리 사이트-종속 방식에서 p α7 nAChR의 표현을 변조-타우, 그리고 Aβ BF-포함 된 섹션 (그림 3A). Nicotinic 수용 체의 제어 대응에 비해 rostral 처리 hemislice에서는 크게 증가 (슬라이스 1, p = 0.0310) (그림 3B), 동안 중간 슬라이스 두 가지 조건 (사이 어떤 변화를 공개 하지 않습니다 슬라이스 2, p = 0.1195) (그림 3B). 후부 섹션에서 상당한 감소의 제어 측면에 T30 노출 부분에는 (슬라이스 3, p = 0.0476) (그림 3B). T30 응용 프로그램에 따라 p-타우 레벨은 ...

선물이 추가 neurodegeneration 기본 초기 이벤트에 대 한 통찰력을 제공할 수 설립된 전 비보 두뇌 기술에 기반 한 메서드가 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험의 장점이 결합. 또한, 같은 해 부 비행기에서 치료 및 치료 그룹의 직접 비교를 위한 독특한 기회를 나타냅니다.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

이 절차의 전반적인 목표는 동일한 해부학적 평면에서 얻은 두 개의 정반사 반절편을 동시에 조사하고 치료 후 효과를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 신경 퇴행성 과정에 관련된 주요 분자에 영향을 미치는 주요 이벤트와 같은 분자 신경 과학 분야의 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 퇴행성 사건의 기저에 있는 분자 캐스케이드를 제공하고 배지를 제공할 수 있다는 것입니다.이 방법은 신경 퇴행에서 발생하는 주요 사건에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 장애의 동물 모델이나 다른 장기 및 조직 특성을 조사하는 데에도 적용할 수 있습니다. 두 가지 다른 인공 뇌척수액을 준비하는 것으로 시작한다. 하나는 뇌 절단에 사용되고 다른 하나는 배양 단계에 사용됩니다.슬라이싱 ACSF를 준비한 후 용액을 섞어 얼음 위에 보관하십시오. 마찬가지로 ACSF 기록을 준비하되 실온에서 보관하십시오. 두 용액에 모두 산소를 공급하십시오.다음으로, 해부 후드에서 참수 및 뇌 제거를 위한 기구를 준비합니다. 그런 다음 vibratome 매개변수를 설정합니다. 필요에 따라 슬라이스 두께를 설정합니다.300 미크론과 같은. 주파수를 7로, 속도를 6으로 설정합니다. 그런 다음 비브라톰 챔버를 삽입하고 얼음으로 둘러쌉니다.뇌 절편의 경우 탄수화물 판막을 열어 슬라이싱 ACSF에 산소를 공급합니다. 분당 약 2밀리리터의 최소 유속을 선택합니다. 이제 두 개의 15 밀리리터 튜브에 tus 조건을 준비하십시오.10밀리리터의 기록 ACSF가 있는 튜브 하나를 대조군으로 로드합니다. 다른 한 쪽에는 트리트먼트로 강화된 10ml의 ACSF 기록을 로드합니다. 이 경우 T30의 2 마이크로 몰.두 튜브를 모두 소용돌이치고 필요할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 수술용 칼날로 두개골 위의 피부를 절개합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 후구에서 후각구 위의 뼈까지 정중선을 따라 두개골을 자릅니다.그런 다음 뇌에 접근하기 위해 집게를 사용하여 두개골의 양쪽을 옆으로 당깁니다. 주걱을 뇌 복부에 삽입합니다. 부드럽게 퍼내고 얼음처럼 차갑게 썰어 약 5분 동안 ACSF에 수분을 공급합니다.차가운 ACSF에서 휴식을 취한 후 뇌를 여과지로 옮깁니다. 그리고 소뇌를 제거한 후 비브라톰 디스크에 뇌를 수직으로 붙입니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 슬라이싱 ACSF로 채워진 절편 챔버로 옮깁니다.이제 챔버 용액으로의 산소 흐름을 시

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E18 랫 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화

이 문서는 뇌의 노화 및 알츠하이머 질환 같은 나이와 관련된 neurodegenerative 질병와 관련된 시냅스 변경의 연구를위한 유전자 변형 쥐 및 생쥐에서 hippocampal 조각 준비 절차를 설명합니다.

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

이 보고서는 첨부 presynaptic 부튼스을 유지 가능한 개별 뉴런의 기계적 분리를위한 기술을 보여줍니다. Vibrodissociated 뉴런은 빠른 생산, 뛰어난 약리 제어 및 인접 세포의 영향없이 향상된 공간 클램프의 장점이 있습니다. 이 방법은 시냅스 요소 및 패치 - 클램프 녹화 영상에 사용될 수 있습니다.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

이 비디오는 rhinal cortex-hippocampus organotypic slices에서 신경 세포 사멸을 평가하는 기술을 보여줍니다. 신경 세포 사멸은 생체 내 간질과 유사한 진화하는 간질 발작을 통해 발생하며, 프로피듐 요오드화물과 면역 형광을 사용하여 죽은 세포의 이중 염색을 통해 감지됩니다.

생체 외 간질 모델에서 세포 사멸을 평가하기 위한 신경 세포 사멸 분석

이 비디오는 신경 퇴행을 모방하기 위해 신경독성 펩타이드로 쥐의 뇌 반조각을 준비하고 치료하는 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜은 동일한 해부학적 평면에서 대조군과 처리된 절편을 직접 비교하여 신경퇴행성 사건을 분석할 수 있습니다.

신경독성 펩타이드를 사용한 Rat Coronal Slices의 치료

신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

이 프로토콜은 자발적인 날카로운 파도 잔물결 활동을 나타내는 마우스에서 수평 해마 내톨리날 피질 (HEC) 슬라이스의 준비를 설명합니다. 슬라이스는 단순화 된 인터페이스 보유 챔버에서 배양되고 기록은 조직의 산소화와 네트워크 수준의 활동의 자발적출현을 촉진하기 위해 빠르게 흐르는 인공 뇌척수액과 침수 된 조건에서 수행됩니다.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

학습하세요 쥐 두뇌 분할 영역을 활용한 ex vivo 기법으로 신경퇴행성 질환의 초기 분자 변화를 동시 비교 분석하는 방법입니다. 이 기술은 알파7 니코틴 수용체, 타우 인산화 및 아밀로이드 베타 수준 변화를 정밀하게 측정하여 신경퇴행 메커니즘 연구에 필수적인 통찰을 제공합니다.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

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