절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

이 절차의 전반적인 목표는 체외 배양 성체 Schistosoma japonicum의 배지에서 세포외 소포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 체외 배양 배지에서 EV를 성체 주혈흡충(Schistosoma japonicum)으로부터 효율적으로 분리할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단기 체외 배양 배지에서 세포 외 소포를 효율적으로 분리할 수 있다는 것인데, 이는 잠재적으로 비생리학적 EV 분비를 초래할 수 있는 스트레스를 최소화할 수 있습니다.

시연은 제 연구실의 기술자인 Juntao Liu가 담당합니다. 500ml 비커에 기생충을 모으고 200ml의 따뜻한 PBS를 사용하여 꼼꼼하고 부드럽게 세 번 씻습니다. 세척을 짧게 유지하고 중력 침전을 사용하여 기생충을 분리하십시오.

다음으로, 90mm 접시에 접시당 약 200쌍의 지렁이를 접시에 담습니다. 접시에서 중력 침전을 사용하여 기생충을 두 번 더 씻습니다. 이러한 세척을 위해 펜 스트렙이 보충된 따뜻한 RPMI 배지를 사용하십시오.

두 번째 세척은 항생제가없는 40ml의 배지로 교체하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 2시간 동안 기생충을 배양합니다. 2 시간 후에, 격판덮개에서 분리기 관으로 매체를 옮기고, 그 후에 4 섭씨 온도에 30 분 동안 2, 000 g에 계란 및 벌레 파편을 모으십시오.

그런 다음 상등액을 모아 새 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 상층액을 여과하고 여과 된 용액을 3.5 킬로달톤의 분자량 컷오프로 투석 백에 수집합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 8%PEG8000 용액을 사용하여 하룻밤 동안 용액을 투석합니다.

이 단계는 세포외 소포체의 수율을 높이는 데 중요합니다. 다음 날, 투석된 용액을 새 튜브로 옮기고 총 엑소좀 분리 시약 0.5 부피를 추가합니다. 용액이 균질해질 때까지 혼합하고 약 섭씨 5도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음날 아침, 15, 대략 5 섭씨 온도에 1 시간 동안 000 g에 혼합물을 원심 분리하십시오. 다음으로, 상등액을 흡입 및 폐기하고 EV 펠릿을 2밀리리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다. 펠릿은 보이지 않을 것입니다.

웨스턴 블롯 분석의 경우 먼저 BCA 분석과 같이 샘플의 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음 22.5마이크로리터의 RIPA 버퍼에 10-20마이크로그램의 EV를 준비합니다. 다음으로, 7.5마이크로리터의 4X 로딩 버퍼를 추가하고 혼합물을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.

열처리 후에, 12%SDS-PAGE 젤에 세포외 소포 단백질을 분리하십시오. 젤을 실행한 후에, 단백질은 PVDF 막으로 옮겨집니다. 1에서 1, 000 희석에 항 CD63 항체로 멤브레인을 조사합니다.

다음, 1개에서 5에 반대로 토끼 IgG-HRP를 가진 막, 000 희석을 대우하십시오. 이제 ECL 검출 시약을 사용하여 멤브레인을 개발하고 화학발광 이미징 시스템에 대한 분석을 수행합니다. 5마이크로그램의 샘플을 폴리프로필렌 초원심분리기 튜브에 옮기는 것으로 시작하고 RPMI-1640 매체를 사용하여 부피를 12ml로 조정합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 90분 동안 110, 000g에서 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 조심스럽게 흡인하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 펠릿에 1ml의 희석제 C를 추가하여 2X 세포외 소포 현탁액을 준비합니다.

부드러운 피펫팅으로 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이제 새로운 2X 염료 용액을 준비합니다. 마이크로분리 튜브에 있는 희석제 C 1밀리리터에 PKH67 에탄올 염료 2마이크로리터를 넣고 잘 섞습니다.

그런 다음 두 용액을 함께 혼합하고 혼합물을 실온에서 4분 동안 배양하여 샘플을 염색합니다. 다음으로, FBS 4ml를 첨가하고 1분 더 기다려 염색을 멈춥니다. 그런 다음 RPMI-1640 배지를 추가하여 부피를 12ml로 조정하고 현탁액을 스핀다운하여 염색된 소포를 분리합니다.

상층액을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 펠릿화된 PKH67 표지 EV를 12ml의 RPMI-1640 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 원심분리를 반복하되 이번에는 PBS 1밀리리터에 소포를 수집합니다.

흡수 분석을 위해 6웰 플레이트에서 포유류 세포의 하룻밤 배양을 준비합니다. 다음 날 아침, 각 웰에 5마이크로그램의 PKH67 표지 소포를 추가하고 2-4시간 동안 배양을 계속합니다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.

그런 다음 15분 동안 세포를 고정하고 PBS로 두 번 세척한 다음 이미징하기 전에 DAPI로 염색합니다. 간 단계의 주혈흡충은 감염 후 28일 후에 토끼에서 채취했습니다. 그런 다음 주혈흡충(schistosomes worms)에서 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 수집하여 분석했습니다.

Malvern 나노 입자 분석에 의해 결정된 입자 크기는 100에서 400 나노 미터 사이였으며 인구의 대부분은 220 나노 미터에 가깝습니다. 투과 전자 현미경은 세포외 소포가 둥글고 직경이 100에서 200 나노미터 사이인 것으로 나타났습니다. 웨스턴 블로팅 분석(Western blotting analysis)은 전형적인 세포외 소포 마커인 CD63 항체를 사용하여 분리된 세포외 소포체를 인식하는 것으로 나타났습니다.

NCTC 클론 1469 세포에 의해 내재화된 PKH67 표지된 세포외 소포체의 형광 현미경 검사는 세포외 소포가 주로 수용 세포의 세포질에 분포되어 있음을 보여주었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 체외 배양 배지에서 EV를 성인 주혈흡혈 자포니쿰으로부터 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.