Name: 절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 Schistosoma japonicum 성충의 세포외 소포체를 체외 배양액에서 분리하는 방법을. 이 기술은 스트레스를 최소화하여 생리학적 EV 분비를 유지하며, 기생충학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는, 일부 또는 전체, 국가 자연 과학 재단의 중국 (31472187 및 31672550) 및 농업 과학, 농업 과학의 중국 아카데미의 기술 혁신 프로그램 지원.

모든 동물 실험 상하이 수의학 연구소, 농업 과학의 중국 아카데미의 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 (허가 번호: SHVRIAU-14-0101).
1. Schistosomes 의 생체 외에서 문화
참고: Schistosomes 는 생물을 나타냅니다. 노동자 때 생물 학적 재료 관련 웜, schistosomal 정지, 또는 다른 처리 시간 라텍스 장갑을 전혀 착용 해야 한다. 뉴질랜드 토끼 복 부 노출 통해 ~ 2000 cercariae 감염 되었습니다. 간 단계에서 schistosomes 토끼 간 및 mesenteric 혈관의 관류에 의해 감염 된 후 28 일에 미 나무 cercariae 감염에서 수집 했다. 웜 컬렉션의 절차 이전 간행물 쥐18연구 보고에서 참조 되어 있다.
<ol><li>500 mL 비 커에 기생충을 수집 합니다. 그들을 철저 하 게 세척 하 고 200 mL와 함께 부드럽게 3 x preheated (37 ° C) PBS (pH 7.4).</li>
	<li>각 90 mm 페 트리 접시 ~ 200 벌레 쌍을 구분 합니다. 다음 기생충을 철저 하 게 세척 하 고 50 mL와 함께 부드럽게 2 x preheated (37 ° C) 페니실린과 스의 100 mg/mL의 U 100을 포함 된 RPMI-1640 문화 매체.</li>
	<li>37 ° C 미만 5% CO2 ~ 5 웜 쌍 /mL 90 mm 페 트리 h 2의 조밀도에 접시에 항생제 없이 데워 RPMI 1640 문화 매체의 40 mL에 기생충을 유지 합니다. 노트: RPMI 1640 매체 혈 청을 포함 해서는 안, 그렇지 않으면 exogenous extracellular 소포를 소개 합니다.</li>
</ol>2. 사전 처리 상태 미디어
<ol><li>문화 매체를 수집 하 고 계란을 제거 하 고 웜 tegmental 파편 30 분 2000 × g에서 4 ° C에서 매체를 원심.</li>
	<li>신선한 튜브는 상쾌한 전송 하 고 0.22 μ m 주사기 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>Dialyzed 가방에 필터링된 솔루션을 수집 (분자량 컷오프: 3.5kD)와 다음 하룻밤 4 ° C에서 8 %PEG8000 솔루션을 사용 하 여 솔루션을 dialyze. 노트: 이 단계는 SjEVs 절연의 수율을 높이기 위한 SjEVs을 풍부 하 게 하는 것이 중요.</li>
</ol>3입니다. SjEVs의 격리
<ol><li>새로운 튜브에 dialyzed 솔루션을 전송 하 고 총 exosome 격리 시 약의 0.5 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>솔루션 vortexing 또는 솔루션의 동질성을 되도록 아래로 pipetting으로 잘 섞는다.</li>
	<li>2 ° C ~ 8 ° C에 혼합물을 밤새 품 어.</li>
	<li>2 ° C 8 ° c에서 1 시간을 위한 15000 × g에서 혼합물을 원심</li>
	<li>발음 하 고는 상쾌한 삭제. 노트: EVs (대부분의 경우에는 표시 되지 않음) 튜브의 하단에 펠 릿에 포함 됩니다.</li>
	<li>2 ml PBS의 EVs 펠 릿을 resuspend 하 고 추가 분석까지-80 ° C에서 EVs 솔루션을 저장 합니다.</li>
</ol>4입니다. 서 부 Blotting에 의해 EVs의 특성
<ol><li>SjEVs 샘플, 예, BCA 분석 결과 의해의 단백질 농도 결정 합니다.</li>
	<li>22.5 µ L RIPA 버퍼에 EVs의 10-20 µ g을 준비 합니다. 그런 다음 버퍼와 95 ° c.에 5 분에 대 한 열 로드 x 4의 7.5 µ L을 추가</li>
	<li>12 %SDS 페이지 젤에 의해 별도 SjEVs 단백질.</li>
	<li>PVDF 막에는 단백질을 전송 하 고 안티-CD63 항 체 (1:1, 000 희석), 뒤에 안티-토끼 IgG-HRP (1:5, 000 희석)와 프로브와 프로브.</li>
	<li>막 개발을 위한 ECL 검출 시 약을 사용 하 고 화학 이미징 시스템에 의해 신호를 감지.</li>
</ol>5. 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 EVs의 특성
<ol><li>200 메쉬 formvar 코팅 격자를 고립 된 SjEVs의 2 µ L을 추가 하 고 실 온에서 건조를 허용.</li>
	<li>1 분에 대 한 Phosphotungstic 산 2 %stain 고 실 온에서 건조.</li>
	<li>전송 전자 현미경 샘플 홀더에 격자를 로드 하 고 이미지 캡처에 대 한 80 kV 전자 빔에 노출.</li>
</ol>6. SjEVs 레이블 PKH67와 셀 이해 분석 결과
노트: 달리 명시 하지 않는 한 모든 후속 단계 온도 (20-25 ° C)에서 수행 했다.
<ol><li>원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 튜브에 5 µ g SjEVs 솔루션을 전송 및 RPMI 1640 매체를 추가 하 여 12 mL을 볼륨을 조정.</li>
	<li>SjEVs 펠 렛을 4 ° C에서 90 분 동안 110000 × g에서 SjEVs 원심</li>
	<li>원심, 후 신중 하 게는 상쾌한 발음. 참고: PKH67 ethanolic 염료 이기종 얼룩 및 감소 된 세포 생존 능력에 발생할 것이 SjEV 펠 릿에 직접 추가할 수 없습니다.</li>
	<li>SjEV 펠 릿;에 희석제 C의 1 mL을 추가 하 여 2 x EV 정지 솔루션 준비 완전 한 분산 되도록 부드러운 pipetting으로 resuspend.</li>
	<li>희석제 C, 얼룩이 지기 전에 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브에서 희석제 C의 1 mL를 PKH67 ethanolic 염료 해결책의 2 µ L을 추가 하 고 분산을 잘 혼합 하 여 신선한 2x 염료 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>빠르게 EV 정지 (단계 6.4) 즉시 염료 솔루션 (단계 6.5) x 2의 1 mL를 혼합 샘플 pipetting 2 x의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.</li>
	<li>FBS의 4 mL를 추가 하 여 얼룩을 중지 하 고 1 분 동안 품 어.</li>
	<li>12 mL을 볼륨을 조정 하 고 다음 90 분 동안 4 ° C에서 110000 × g에서 원심을 RPMI1640 매체를 추가 합니다.</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 RPMI1640 매체 SjEV 펠 릿을 표시 하는 PKH67 resuspend를 추가 합니다.</li>
	<li>한번 세척 한 후 PBS resuspend SjEVs 펠 릿을 추가 90 분 동안 4 ° C에서 110000 × g에서 원심.</li>
</ol>7. SjEVs 셀 이해 분석 결과
<ol><li>NCTC 같은 종자 포유류 세포 1469 셀 또는 HEK293T 셀 6 잘 플레이트 (잘 당 2 × 105 셀)에 복제 하 고 하룻밤 셀 문화.</li>
	<li>5 µ g PKH67 표시 SjEVs를 추가 하 고 2-4 h 37 ° C에서 세포 문화.</li>
	<li>후에 부 화, 매체를 제거 하 고 PBS 가진 셀을 두 번 세척.</li>
	<li>15 분 동안 4% 포름알데히드 솔루션 셀을 수정 하 고 PBS를 가진 더 두 번 세척.</li>
	<li>4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 세포 핵 얼룩.</li>
	<li>형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀을 관찰 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Extracellular+Vesicles%3A+Biogenesis%2C+RNA+Cargo+Selection%2C+Content%2C+Release%2C+and+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Riaz, F., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+of+helminths%3A+implication+of+pathogenesis+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development.</a> Ann Transl Med. 5 (7), 175(2017).</li>
<li>Zhang, H. G., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+cancer%3A+a+newly+described+pathway+of+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression.</a> Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+is+enriched+and+stable+in+exosomes%3A+a+promising+biomarker+for+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.</a> Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).</li>
<li>Marcilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+parasitic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in parasitic diseases.</a> J Extracell Vesicles. 3, 25040(2014).</li>
<li>Cwiklinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Vesicles+of+the+Helminth+Pathogen%2C+Fasciola+hepatica%3A+Biogenesis+Pathways+and+Cargo+Molecules+Involved+in+Parasite+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).</li>
<li>Buck, A. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25421927">Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity.</a> Nat Commun. 5, 5488(2014).</li>
<li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Nowacki, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665(2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li>
<li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li>
<li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26616523">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319(2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885(2016).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).</li>
<li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+roles+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

EVs에 대 한 최근 연구는 schistosome EVs 호스트 병원 체 상호 작용3,9,,1216에 중요 한 역할을 설명 했다. 추가 주소에 그들의 규정 하는 기능 필수적 이다 schistosomes에서 EVs를 분리. 여기, 우리 SjEV 절연을 위한 다른 방법을 설명합니다. 이 메서드 생성, SjEVs의 넓은 범위 크기 100에서 400 nm nm, 성인 미 나무에. 다음 셀 이해 분석 결과 EVs 설명된 프로토콜에서 고립 된 받는 사람 세포에 의해 성공적으로 내 면 그들의 관련 된 miRNAs 잠재적으로 규제 역할17재생 표시.
EVs, 셀의 많은 다른 종류에 의해 분 비 될 수 있습니다...

Extracellular 소포 (EVs)는 작은 막 도약 소포와 다양 한 단백질, 지질, 핵 산 캡슐화의 인구. 최근 연구 보여준 EVs 셀 셀 통신에 중요 한 역할을 하 고 셀 개발, 면역 조절, 신생, 세포 마이그레이션2, 등 수많은 생리 적 프로세스의 규칙에 관련 된 3,,45. 증거를 축적 EVs, exosomes, 그리고 그들의 miRNA 화물 순환 특정 질병6의 잠재적인 생체 나타냅니다 나타냅니다.
여러 가지 원생 동물 Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, 등 Leishmania spp., EVs;를 분 비 수 표시 되었습니다 helminths 발견 되었습니다 또한7호스트 생활에 EVs를 분 비. 기생 EVs pathogenicity8, 감염과 면역 규칙9의 유지 보수에 포함 될 표시 되었습니다. 최근 두 Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 schistosomes에서 공부와 미 나무12 성인 schistosomes 분 수 있는 exosome 같은 소포 비 표명 특정 생물 학적 과정의 기능 규정에 참여.
날짜 하려면, 여러 가지 방법은 extracellular 소포, ultracentrifugation, 외13, 폴리머 기반 시 약, 크기 배제 크로마토그래피, immunoaffinity 격리의 사용을 사용 되었습니다. 이러한 다른 방법을 그들의 자신의 이점 및 제한 사항14. 일반적으로, ultracentrifugation는 소포 격리에 대 한 표준 방법으로 간주 됩니다. 그러나,이 방법은 잠재적인 EV 집계14의 한계에서 고통.
Schistosomes에서 방법의 몇 가지 EV 격리에 대 한 보고 되었습니다: ultracentrifugation11,,1210 와 여러 단계 (달걀16, 상업 EV 격리 키트16 를 사용 하 여 포함 됩니다 schistosomula11, 성인 schistosomes10,,1217). Microvesicles 천 나노미터 몇 백 나노미터 크기의 넓은 범위는, 그 주어진 우리 벤치 원심 분리기, 한, 그리고 분리에서 EVs 상업 킷은 절연을 사용 하 여 결합 하는 대체 방법 개발 성인 Schistosoma 나무. 격리 된 EVs는 일반적으로 100-400 nm의 직경을 소유 하 고 성공적으로 받는 세포에 의해 내 면화 했다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>For isolatating S. japonicum extracellular vesicles</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>For labeling Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>For parasite culture</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.22&mu; m 주사기 필터</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin 투석 튜빙</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD 밀리포어&트레이드; 이모빌론&트레이드; 서부 화학발광 HRP 기판(ECL)</td><td>Fisher 과학</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCA 키트</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 항체</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>포스포텅스텐 산</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC 클론 1469 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CCL-9.1&무역;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE 화학발광 이미징 시스템</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 물</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor 원심분리기&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP 초원심분리기</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 extracellular 소포 특성 성인 schistosoma 나무 에서

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular 소포 (EVs)는 막 소포 세포 외 microenvironment로 셀의 다양 한 발표. EVs는 누구의 크기 범위 40 1000 nm 사이 이기종 vesicles의 인구를 나타냅니다. 축적 된 증거는 EVs에 중요 한 역할 규정 호스트 병원 체 상호 작용에 표시. Schistosome EVs에 대 한 깊은 이해는 기본 schistosomiasis에 대 한 새로운 전략의 개발을 활성화 하는 schistosome-호스트 상호 작용 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 해야 합니다. 여기, 우리는 성인 Schistosoma 나무 (S. 머 위)에서 절연 및 EVs의 특성화에 대 한 프로토콜을 제시 하 여 EVs 함수 schistosomes에 진학 하고자 합니다. EVs 문화 매체 체 외에 상업 exosome 격리 키트와 결합 하는 원심 분리를 사용 하 여 격리 했다. 고립 된 미 나무 EVs (SjEVs) 일반적으로 100-400 nm의 직경을가지고 그리고 전송 전자 현미경 검사 법 및 서쪽 blotting에 의해 특징입니다. 염료-표시 된 SjEVs PKH67의 사용 SjEVs 받는 사람 세포에 의해 내 면화는 설명 했다. 전반적으로, 우리의 프로토콜 성인 schistosomes;에서 EVs를 격리 하기 위한 대체 방법을 제공 한다 격리 된 SjEVs 기능 분석에 적합 수 있습니다.

설명 된 프로토콜을 사용 하 여 격리 된 SjEVs의 수익률을 계량, 우리는 28 일 성인 schistosomes에서 고립 된 SjEVs의 단백질 농도 액세스할 수 BCA 단백질 분석 결과 사용. 표 1에서 같이, SjEV 단백질 농도의 매체 (표 1) 100 mL 당 250 µ g을 208 µ g에서 배열 했다. 입자 크기 Malvern 나노 분석에 의해 결정 된 대로 표시 된 격리 SjEVs 100에서 240 400 nm nm, 높은 인구 약 220 nm의 크기 (그림 1). 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 SjEVs의 더 특성 직경 (그림 2)에 약 100-200 nm의 둥근 소포를 되도록 EVs를 공개 했다. 분석을 더럽혀 서는 고립된 SjEVs 인식 되었다 CD63 항 체를 사용 하 여 일반적인...

여기, 선물이 성인 Schistosoma 나무에서 체 외에서 배양된 매체에 extracellular 소포 (EVs) 격리를 설명 하는 프로토콜.

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

이 절차의 전반적인 목표는 체외 배양 성체 Schistosoma japonicum의 배지에서 세포외 소포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 체외 배양 배지에서 EV를 성체 주혈흡충(Schistosoma japonicum)으로부터 효율적으로 분리할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단기 체외 배양 배지에서 세포 외 소포를 효율적으로 분리할 수 있다는 것인데, 이는 잠재적으로 비생리학적 EV 분비를 초래할 수 있는 스트레스를 최소화할 수 있습니다.시연은 제 연구실의 기술자인 Juntao Liu가 담당합니다. 500ml 비커에 기생충을 모으고 200ml의 따뜻한 PBS를 사용하여 꼼꼼하고 부드럽게 세 번 씻습니다. 세척을 짧게 유지하고 중력 침전을 사용하여 기생충을 분리하십시오.다음으로, 90mm 접시에 접시당 약 200쌍의 지렁이를 접시에 담습니다. 접시에서 중력 침전을 사용하여 기생충을 두 번 더 씻습니다. 이러한 세척을 위해 펜 스트렙이 보충된 따뜻한 RPMI 배지를 사용하십시오.두 번째 세척은 항생제가없는 40ml의 배지로 교체하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 2시간 동안 기생충을 배양합니다. 2 시간 후에, 격판덮개에서 분리기 관으로 매체를 옮기고, 그 후에 4 섭씨 온도에 30 분 동안 2, 000 g에 계란 및 벌레 파편을 모으십시오.그런 다음 상등액을 모아 새 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 상층액을 여과하고 여과 된 용액을 3.5 킬로달톤의 분자량 컷오프로 투석 백에 수집합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 8%PEG8000 용액을 사용하여 하룻밤 동안 용액을 투석합니다.이 단계는 세포외 소포체의 수율을 높이는 데 중요합니다. 다음 날, 투석된 용액을 새 튜브로 옮기고 총 엑소좀 분리 시약 0.5 부피를 추가합니다. 용액이 균질해질 때까지 혼합하고 약 섭씨 5도에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음날 아침, 15, 대략 5 섭씨 온도에 1 시간 동안 000 g에 혼합물을 원심 분리하십시오. 다음으로, 상등액을 흡입 및 폐기하고 EV 펠릿을 2밀리리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다. 펠릿은 보이지 않을 것입니다.웨스턴 블롯 분석의 경우 먼저 BCA 분석과 같이 샘플의 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음 22.5마이크로리터의 RIPA 버퍼에 10-20마이크로그램의 EV를 준비합니다. 다음으로, 7.5마이크로리터의 4X 로딩 버퍼를 추가하고 혼합물을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.열처리 후에, 12%SDS-PAGE 젤에 세포외 소포 단백질을 분리하십시오. 젤을 실행한 후에, 단백질은 PVDF 막으로 옮겨집니다. 1에서 1, 000 희석에 항 CD63 항체로 멤브레인을 조사합니다.다음, 1개에서 5에 반대로 토끼 IgG-HRP를 가진 막, 000 희석을 대우하십시오. 이제 ECL 검출 시약을 사용하여 멤브레인을 개발하고 화학발광 이미징 시스템에 대한 분석을 수행합니다. 5마이크로그램의 샘플을 폴리프로필렌 초원심분리기 튜브에 옮기는 것으로 시작하고 RPMI-1640 매체를 사용하여 부피를 12ml로 조정합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 90분 동안 110, 000g에서 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 조심스럽게 흡인하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 펠릿에 1ml의 희석제 C를 추가하여 2X 세포외 소포 현탁액을 준비합니다.부드러운 피펫팅으로 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이제 새로운 2X 염료 용액을 준비합니다. 마이크로분리 튜브에 있는 희석제 C 1밀리리터에 PKH67 에탄올 염료 2마이크로리터를 넣고 잘 섞습니다.그런 다음 두 용액을 함께 혼합하고 혼합물을 실온에서 4분 동안 배양하여 샘플을 염색합니다. 다음으로, FBS 4ml를 첨가하고 1분 더 기다려 염색을 멈춥니다. 그런 다음 RPMI-1640 배지를 추가하여 부피를 12ml로 조정하고 현탁액을 스핀다운하여 염색된 소포를 분리합니다.상층액을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 펠릿화된 PKH67 표지 EV를 12ml의 RPMI-1640 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 원심분리를 반복하되 이번에는 PBS 1밀리리터에 소포를 수집합니다.흡수 분석을 위해 6웰 플레이트에서 포유류 세포의 하룻밤 배양을 준비합니다. 다음 날 아침, 각 웰에 5마이크로그램의 PKH67 표지 소포를 추가하고 2-4시간 동안 배양을 계속합니다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.그런 다음 15분 동안 세포를 고정하고 PBS로 두 번 세척한 다음 이미징하기 전에 DAPI로 염색합니다. 간 단계의 주혈흡충은 감염 후 28일 후에 토끼에서 채취했습니다. 그런 다음 주혈흡충(schistosomes worms)에서 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 수집하여 분석했습니다.Malvern 나노 입자 분석에 의해 결정된 입자 크기는 100에서 400 나노 미터 사이였으며 인구의 대부분은 220 나노 미터에 가깝습니다. 투과 전자 현미경은 세포외 소포가 둥글고 직경이 100에서 200 나노미터 사이인 것으로 나타났습니다. 웨스턴 블로팅 분석(Western blotting analysis)은 전형적인 세포외 소포 마커인 CD63 항체를 사용하여 분리된 세포외 소포체를 인식하는 것으로 나타났습니다.NCTC 클론 1469 세포에 의해 내재화된 PKH67 표지된 세포외 소포체의 형광 현미경 검사는 세포외 소포가 주로 수용 세포의 세포질에 분포되어 있음을 보여주었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 체외 배양 배지에서 EV를 성인 주혈흡혈 자포니쿰으로부터 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-from-adult

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

이 기사에서는 예쁜꼬마선충을 세포외 소포를 생성, 정화 및 정량화하는 방법을 제시합니다.

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

본 프로토콜은 진드기 타액선 및 정제된 세포밖 소포로부터 마이크로RNAs의 단리를 기술한다. 이것은 일반적으로 사용되는 시약과 공급을 결합하는 보편적 인 절차입니다. 이 방법은 또한 적은 수의 틱을 사용할 수있게하여 쉽게 시퀀싱 할 수있는 양질의 microRNA를 생성합니다.

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.

간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포체의 농축 방법

여기에서는 콜라겐분해효소 I형과 초원심분리를 통한 소화를 조합하여 생쥐 비장 유래 엑소좀을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues(생쥐 비장 조직에서 유래한 엑소좀의 분리 및 특성 분석)

이 프로토콜은 기계적 분리, 효소 해리, 여과 및 차등 초원심분리를 통해 설치류 근육 조직에서 골격근 간질성 세포외 소포체(SkM-EV)를 분리하고 정제하는 것을 목표로 합니다. 일관성과 신뢰성을 보여줍니다. 분리된 SkM-EV는 근육 항상성 및 질병에 대한 통찰력을 제공하며, 진단 바이오마커 또는 치료 수단으로 응용될 수 있습니다.

골격근 간질성 세포외 소포체의 효소 분리

여기에서는 체외 배양 조건, 격리 및 Echinococcus granulosus의 세포외 소포체(EV) 생성 증가에 대해 설명합니다. 소형 EV는 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경이 특징이었습니다. 골수 유래 수지상 세포의 흡수와 표현형 조절은 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 연구되었습니다.

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus(Echinococcus granulosus에서 작은 세포외 소포의 분리 및 수지상 세포 흡수)

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

Cercarial 변화와 체외에서</em의> 양성 Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosoma mansoni 달걀은 T 도우미 유형 2 (Th2) 면역 반응, 기생충 감염의 특징, 천식과 알레르기 염증의 강력한 stimulators 있습니다. 이 프로토콜은 S.을 활용 CD4 Th2 시토킨 유도된 염증성 계란 주위에 폐 granuloma 형성을 특징으로 폐에 반응, eosinophilia와 대식 세포 대안 활성화를 생성하는 mansoni 계란 분사.

에서 계란을 사용하여<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; 등<em&gt; 생체내에서</em기생충 유도된 폐 염증의&gt; 모델

배우세요 Schistosoma japonicum 성충의 세포외 소포체를 체외 배양액에서 분리하는 방법을. 이 기술은 스트레스를 최소화하여 생리학적 EV 분비를 유지하며, 기생충학 연구에 활용됩니다.

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

더 많은 동영상 탐색