Name: Desthiobiotin Streptavidin 선호도 중재 Mesothelioma 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 배우세요 mesothelioma 세포에서 RNA 상호작용 단백질을 desthiobiotin streptavidin 선호도 중재 방법으로 정화하는 기술입니다. 이 방법은 RNA 결합 단백질 연구와 RNA 생물학 이해에 활용됩니다.

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이 작품은 스위스 국립 과학 재단 Sinergia 그랜트 CRSII3 147697, 재단에 Angewandte Krebsforschung와 취리히 Krebsliga에 의해 지원 되었다.

1. Cytosolic 핵 단백질 분수의 준비
<ol><li>플레이트 4 x 106 ACC-MESO-4 셀 RPMI-1640 매체에에서 성장 T150 셀 문화 술병에 보충 10 %FBS, 1 x 페니실린/스 (100 x), 그리고 2 m L-글루타민 (200 m m) m. 셀 80-90% (6 셀 ~5-5.5 x 10)의 합류에 도달, 핵 및 cytosolic 분수의 단백질 추출 진행. 참고: ACC-MESO-4 셀 라인 RIKEN 유관 센터11에서 얻은 했다.</li>
	<li>중간 발음, 1 x PBS의 15 mL을 추가 하 여 셀을 세척, 기울기 접시 부드럽게 몇 번와 1 x PBS 발음. 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 문화 플라스 크 3 분 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 분리;에 대 한 현미경 셀 보고 아직도 수돗물을 연결 하는 경우는 3의 손바닥에 대 한 플라스 크 시간.</li>
	<li>7 mL RPMI 1640 매체와 10 %FBS, 1 x 페니실린/스 (100 배), 2 mM L-글루타민 (200mm) 보충의 추가, 15 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 5 분 동안 200 x g에 아래로 회전.</li>
	<li>중간 발음 그리고 1.5 mL 1 x PBS 가진 펠 릿 셀 resuspend microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 전송. 500 x g와 4 ° C 5 분 삭제는 상쾌한 아래로 회전 합니다. 참고:이 단계 이후,에서 4 ° C에서 원심 분리 단계를 모두 수행 하 고 얼음에 모든 시 약을 계속.</li>
	<li>1 x PBS의 얼음 처럼 차가운 1.5 mL와 셀 펠 릿 resuspend 및 회전 500 x g에서 셀 3 분에 4 ° C 감소 삭제는 상쾌한. 참고: CER의 필요한 금액 나, CER II 및 NER 시 약은 10, 0.55, 및 5 양의 예상된 셀 펠 릿 포장 볼륨, 각각; 다음 프로토콜 20 µ L의 볼륨을 가정합니다. 시 CER의 필요한 만큼만 준비 하는 것이 좋습니다 난.</li>
	<li>200 µ L 얼음 세포질 추출 시 약의 추가 (CER 나) 100 x 재고를 물 500 µ L에서의 프로 테아 제 억제제 (EDTA 무료) 1 태블릿을 희석 2 µ L 성분 억제 물, 예를 들어, x 1의 보완. 이 정도의 시 CER 내가 lyse 세포 펠 릿 포장 볼륨의 20 µ L에 충분 하다.<ol>
<li>셀 펠 릿 포장 볼륨을 추정, 1.5 mL 튜브 셀 펠 릿을 포함 하는 튜브를 비교 하 여 10, 20, 50 또는 100 µ L 1 x PBS의 가득 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적극적으로 vortexing 15 튜브에 의해 셀 펠 릿 resuspend s 10 분 추가 11 µ L의 튜브, 5에 대 한 적극적으로 소용돌이를 얼음 처럼 차가운 세포질 추출 시 약 II (CER II)에 대 한 얼음에 튜브를 품 어와 s, 그리고 얼음에 1 분을 품 어.</li>
	<li>5 s와 분리기 g x 16, 000에서 튜브에 대 한 적극적으로 소용돌이 4 ° C 5 분에 대 한 얼음에 깨끗 한 미리 냉장된 튜브에는 상쾌한을 전송. 상쾌한 더 세포질 분수는 RNA-풀 다운 실험에 사용.</li>
	<li>1 µ L 성분 억제 물 (100 x)와 적극적으로 15 소용돌이의 보충의 얼음 핵 추출 시 약 (NER) 100 µ L에서 나머지 펠 릿 resuspend s. NER 시 약 protease 억제제와 보충의 필요한 만큼만 준비 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>가끔 vortexing 15와 40 분 동안 얼음에 샘플을 품 어 s (매 10 분).</li>
	<li>깨끗 한 미리 냉장된 튜브를 튜브에서 16000 x g 10 분 전송에 대 한 (이것은 핵 단백질 분수) 상쾌한 원심.</li>
	<li>Bicinchoninic (BCA) 메서드를 사용 하 여 단백질 농도 측정 하 여 즉시 진행 ( 재료의 표참조). 각 분수의 단백질 순수성에 대 한 제어, α-tubulin (긍정적인 탐지 cytosolic 분수에만) 및 폴 리 ADP ribose 중 합 효소-PARP (긍정적인 탐지 핵 분수에만)에 대 한 immunoblotting (그림 1)을 수행 합니다. 단백질 시각화, 섹션 4 참조.</li>
	<li>단백질 활동 및 그들의 원시 상태를 유지 하기 위하여 cytosolic 핵 추출 물의 aliquots의 25 µ L를 준비 합니다. 5 s를-80 ° c.에 직접 저장소 액체 질소에 그들을 배치 하 여 스냅-동결이이 aliquots</li>
</ol>2. Desthiobiotin와 RNA의 라벨
<ol><li>상업적으로 합성 하는 RNA 프로브 및 HPLC 정화 있다. 10 µ M에서 nuclease 무료 물으로 resuspend. 참고: 프로브 시퀀스는 표 1에 나열 됩니다.</li>
	<li>RNA의 RNA-풀 다운 반응 당 50 pmol을 사용 합니다. 해 동 하 고 얼음에 목이 30%, RNA oligo의 라벨 3' 말단에 사용 제외 하 고 모든 시 약을 계속.</li>
	<li>5 µ L 10 µ M RNA 프로브, CALB2로 분류 3' UTR (있다)의 전송, CALB2 3' UTR (mtARE), 및 관련 RNA (분노), 0.5 mL 얇은 microcentrifuge로 튜브 5 분 위 튜브 즉시 얼음에 85 ° C에서 PCR 기계에 품 어. 참고:이 단계는 중요 하다, 그것은 휴식 및 라벨에 대 한 RNA 조사의 접근성을 촉진.</li>
	<li>단 하나 30 µ L 반응에 대 한 다음 10 µ L 믹스 RNA 포함 된 튜브에 추가: nuclease 무료 물 3 µ L, RNA 리가 반응 버퍼, RNase 억제제의 1 µ L x 10의 3 µ L (40 U / µ L), Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1mm)의 1 µ L 그리고 T4 RNA 리가 (20 U / µ L)의 2 µ L. 참고: 마스터 믹스 A 초과 (3.2)에서 3 샘플, 혼합 준비 nuclease의 9.6 µ L 무료 물, RNA 리가 반응 버퍼, RNase 억제제의 3.2 µ L x 10의 9.6 µ L (40 U / µ L), Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1mm)의 3.2 µ L 및 T4 RNA 리가 (20 U / µ L)의 6.4 µ L.</li>
	<li>신중 하 게 15 µ L의 말뚝 반응에 30% 추가. 또 다른 팁을 사용 하 여 혼합 반응. 품 어 하룻밤 16 ° c.에 반응</li>
	<li>다음 날, 다음 준비: 5 M NaCl (신선/nuclease-무료), 클로 프롬: isoamyl 알콜 24:1 비율 (예를 들어, 반응-96 µ L 클로 프롬 및 isoamyl 알콜의 4 µ L 당), 얼음 100% 에탄올, 그리고 차가운 70% 에탄올.</li>
	<li>RNA 라벨 반응 관에 nuclease 무료 물 70 µ L를 추가 합니다. 클로 프롬의 100 µ L를 추가: isoamyl 알콜과 소용돌이 짧게. 스핀-다운 13000 x g에서 3 분 신중 하 게 제거만 위 단계와 새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브;에 대 한 낮은 단계를 만지지 마십시오.</li>
	<li>5 M NaCl, 글 리 코겐의 1 µ L 및 얼음 100% 에탄올의 300 µ L 10 µ L를 추가 합니다. 2 시간 동안-20 ° C에 튜브를 놓습니다. 참고:이 단계에서 실험 다음 날에 계속 될 수 있다.</li>
	<li>15 분을 위한 13000 g x 및 4 ° C에서 원심 분리기는 펠 렛을 방해 하지 않고 신중 하 게는 상쾌한을 버리십시오. 얼음 처럼 차가운 70% 에탄올과 원심 분리기 13000 x g에서 다시 및 4 ° C 5 분의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 완전히 무시 하 고 펠 릿 (15 분)를 건조. 20 µ L nuclease 무료 물에 펠 릿을 resuspend. 참고: 같은 날에 RNA-풀 다운으로 진행.</li>
	<li>2 분 동안 90 ° C에서 RNA를 품 어 고 얼음에 놓습니다. Streptavidin 자석 구슬의 사전 세척의 다음 단계 동안 얼음에 셔 서 RNA를 놓습니다. 참고: 장시간 보육 RNA 조사를 손상 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. RNA-단백질 풀 다운
<ol><li>
미리 세척 streptavidin 자석 구슬 및 desthiobiotin RNA를 가진 외피
	<ol>
<li>50 pmol RNA 당 streptavidin 자석 구슬의 50 µ L을 사용 합니다. 그러나,이 실험에 따라 최적화 되어야 합니다.</li>
		<li>소용돌이와 streptavidin 자석 구슬 15 s, 그리고 신속 하 게 제거 200 µ L (마스터 믹스, 3 + 1 반응에 대 한 충분 한) 사용 하 여 깨끗 한 1.5 mL 튜브 안전 잠금에 대 한 튜브 컷 피 펫 팁. 구슬 튜브의 측면에서 수집 하 고 기다리는 1 분 제거 물의 resuspension 액체 튜브 마그네틱 스탠드에 놓습니다.</li>
		<li>구슬 세척, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거, 0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl 솔루션, 그리고 부드럽게 몇 번 위아래로 피펫으로의 400 µ L를 추가 합니다. 마그네틱 스탠드에 다시 튜브를 놓습니다. 1 분 대기 고는 상쾌한을 수집 합니다. 이 단계를 다시 반복 합니다.</li>
		<li>워시 100 m NaCl m의 200 µ L와 구슬. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>트리 스 (pH 7.5), pipetting으로 구슬 resuspend, 튜브 자석 스탠드에, 1 분 동안 대기 놓고 제거는 상쾌한 20 m m의 200 µ L를 추가 합니다. 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거, RNA 캡처 버퍼, x 1의 200 µ L을 추가 하 고 간단히 vortexing에 의해 streptavidin 자석 구슬 resuspend. Streptavidin 자석 구슬의 50 µ L을 제거 하 고 잘라 피 펫 팁을 사용 하 여 각 레이블이 RNA 튜브에 추가. 롤러에 실 온에서 30 분 동안 튜브를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 단백질의 바인딩
	<ol>
<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 배치 하 고 1 분 대기는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>구슬에 20 mM Tris (pH 7.5)의 50 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 resuspend. 마그네틱 스탠드에 튜브를 배치, 1 분을 기다려 하 고 상쾌한을 제거 합니다. 이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>구슬에 단백질-RNA 바인딩 버퍼 x 1의 100 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 resuspend.</li>
		<li>한편, 다음 믹스를 준비: 10 µ L 단백질-RNA 바인딩 버퍼, 50% 글리세롤의 30 µ L, 세포질 단백질의과 nuclease 무료 50 µ g x 10의 최대 100 µ L를 물. 참고: 다음과 같이 초과 (3.3)에서 3 샘플에 대 한 마스터 혼합 B를 준비: 단백질-RNA 바인딩 버퍼 x 10의 33 µ L, 50% 글리세롤의 99 µ L, 세포질 단백질과 nuclease 무료 물까지 330 µ L.의 165 µ g 유지의 마스터 B 얼음에 튜브.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 배치 하 고 1 분 대기는 상쾌한을 수집 합니다. 마스터 혼합 B 100 µ L을 추가 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 resuspend 거품을 만들지 마십시오. 롤러에 4 ° C에서 60 분에 대 한 반응 튜브를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세척 및 차입
	<ol>
<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 배치, (즉, 통해-FT) 상쾌한, 수집 하 고 새 튜브로 전송. 참고: 나중에 분석을 위한 얼음에이 피트 유지.</li>
		<li>플라스틱 구슬에 워시 버퍼 x 1의 100 µ L, 부드럽게 resuspend, 마그네틱 스탠드에 다시 넣어, 1 분, 대기 고는 상쾌한 삭제. 2 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>자성 구슬에 차입 버퍼의 40 µ L를 추가 하 고 아래로, pipetting으로 섞어 30 분 동안 튜브 셰이 커 (950 rpm)에 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>튜브 마그네틱 스탠드에, 1 분을 기다려 놓고 (eluate-E는) eluted 샘플을 수집 합니다. 얼음에 놓고 다운스트림 분석을 위해 사용 합니다. 참고:이 단계에서 각 시험된 RNA 프로브 자형 (FT) 및 eluate (E) 샘플을 구성 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. polyacrylamide 전기 및 서양 오 점 분석
주:이 섹션에서 사용 되는 버퍼에 대 한 조리법에 대 한 표 2를 참조 하십시오. 서 부 수행 Laemmli 방법을12에 따르면 오.
<ol><li>Handcast 12 %SDS 페이지 젤 (10-우물, 1.5 m m 간격, 66 µ L). 실행 중인 젤 믹스 준비: 30% 아크릴-bisacrylamide 재고 솔루션, 낮은 트리 스의 2.4 mL의 4 mL, dH2O, TEMED, 10% 염화 persulfate 솔루션 (APS)의 96 µ L의 9.6 µ L의 3.2 mL 버퍼. 겹쳐 쌓이는 젤 믹스 준비: dH2O, 30% 아크릴-bisacrylamide 재고 솔루션, 위 Tris 버퍼의 1.3 mL의 0.5 mL, TEMED, 10%의 20 µ L의 10 µ L의 3.25 mL AP.</li>
	<li>6 x Laemmli 버퍼의 16.6 µ L을 추가 (예, 트리 스/HCl/SDS pH 6.8의 14 mL (위 Tris 버퍼), sds, DTT, 글리세롤, 및 0.012 %bromophenol 블루; 6 mL의 1.86 g 2 g-20 ° C에 저장) 피트 샘플 및 샘플 전자로 6 x Laemmli 버퍼의 6.6 µ L로. 95 ° c.에 5 분에 대 한 샘플을 품 어</li>
	<li>(피트 및 전체 20 µ L Elute ~ 40 µ L) 샘플 로드 60 V, 20 V 밤새 계속 30 분 동안 그들을 실행 하 고.</li>
	<li>세미 드라이 electroblotting 시스템을 사용 하 여, 단백질 15 V 80 분에 대 한 PVDF 막에 전송 합니다. 참고: PVDF 막 단백질 전송 수행 하기 전에 활성화 해야 합니다. 초순에 2 분 부 화 뒤 1 분에 100% 메탄올에서 막 품 어.</li>
	<li>단백질 전송 후 Coomassie 솔루션 3 h, 초순, 각 30 분 세척의 3 단계 다음에 대 한 SDS 페이지 젤을 품 어.</li>
	<li>단백질의 끝에, 건조 단계 4.5에서 1 헤 막 활성화 위해 PVDF 막 하자. 차단 막 1 x TTBS에 5 %BSA 1 시간.</li>
	<li>첫번째 항 체로 막 품 어: 허 또는 mesothelin, 모두 희석 4 h 실내 온도에 또는 하룻밤 4 ° c.에 대 한 1 x TTBS에 5 %BSA 1:1000</li>
	<li>1 x TTBS에 7 분에 대 한 세 번 막 세척 하 고 토끼 반대로 마우스 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 품 어-활용 된 이차 항 체 희석 5 %BSA, 1 x TTBS에에서 1:10,000.</li>
	<li>향상 된 화학 및 디지털 영상 장치를 사용 하 여 단백질을 시각화.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

3' Utr는 비 코딩 게놈3에 속하고 모든 비 코딩 RNAs 단백질7그들의 기능 발휘 하기 위하여 작용할 수 있습니다. 포유류 게놈 복사할 퍼지 수를 발견 하 고 긴 noncoding RNAs16의 상당 부분을 생산,이 긴 noncoding RNAs로 상호 작용 하는 유전자 발현 조절에 작동 입증 증거를 신흥 개장 하는 chromatin 단지17. 이 정보는 RNA-풀 다운 분석 결과 이용 하 여 얻었다. 따라서, 특정 RNA의 인터 해독 하려면 첫 번째 단계 수 풀 다운 RNA 등 생체 외에서 생 화 확 적인 분석 수행 간단 있습니다.
메모의 시퀀스 모티브 뿐만 아니라 RNA의 이차 구조 역할을 중요 한 RNA 기능에 그들은 필수적인 단백질 상호 작용 도메인을 형성 한다. 이차 구조 생리에 ...

유전자 발현과 유전자 제품의 최종 수준 mRNA 안정성과 mRNA 번역 속도1에 영향을 미치는 하 여 단단히 통제 수 있다. 이러한 post-transcriptional 규제 메커니즘은 타겟된 mRNA와 비 코딩 RNA 또는 RNA 바인딩 단백질 (RBPs)의 상호 작용을 통해 발휘 됩니다. 그것은 일반적으로 특정 cis을 포함 하는 (3' UTR-게놈2의 비 코딩 부분에 속하는) mRNA의 3' 번역된 영역- 트랜스에 의해 인정 되는 규제 요소 (CRE)-미르 등 RBPs 요인 행동 3. 최고의 공부 cis-3' UTR, 내의 요소는 차례에, 그리고 특정 AU-바인딩 단백질 (AUBP)에 의해 인식 되는 아데닌 부자 요소 (는) 모티브 유도 하거나 mRNA 저하/deadenylation (감퇴는 중재) 또는 mRNA의 안정화4.
크기는 3' UTR calretinin의 mRNA (CALB2)은 573 bp 긴 AREsite2, bioinformatic 도구5에의해 예측 상 상속 AUUUA pentamer 포함. Putative는 모티프의 존재와 일치, pmirGLO 벡터 기자 분석 결과 CALB2 mRNA6내에서이 요소의 안정화 역할을 설명 했다. 마지막으로,는 생체 외에서 RNA-풀 다운 사용 되었다 calretinin 안정화 AUBP를 식별 하는 모티브를 통해 mRNA.
모든 비 코딩 RNAs는 단백질7상호 작용에서 생체 외에서 RNA-풀 다운 이므로 좋은 방법과 선택의 첫 번째 분석 결과 RNA-인터 식별 분자 메커니즘을 해독에 도움. 이 RNA-풀 다운 방법에서는 상업적으로 합성된 RNA 프로브, RNA 가닥의 3' 말단에 biotin (desthiobiotin)의 수정 양식을 표시 했다 사용 되었다. RNA-desthiobiotin는 streptavidin 자석 구슬, 풀 다운 단백질 특히 관심의 바운드 RNA 상호 작용 하는 데 사용 되는에의 상호 작용을 통해 움직일 수 있습니다. Mesothelioma 셀의 cytosolic 분수에서 비 변성 및 활성 단백질은 단백질의 원본으로 사용 됩니다. 이러한 RNA 바인딩 단백질은 eluted 자석 구슬, 12 %SDS 페이지 젤 통해 실행 하 고, 막, 전송 하 고 다른 항 체와 조사에서.
표준 streptavidin biotin 선호도 정화 절차, 가혹한 변성 조건8바운드 단백질 elute 강한 돌이킬 수 없는 biotin streptavidin 본드를 방해 하는 데 필요한 어떤의 분리 발생할 수 있습니다. 단백질 복합물입니다. Biotin, 달리 desthiobiotin 역에 streptavidin 바인딩하고 biotin, 단백질의 부드러운 차입에 대 한 허용 하 고 피하는 자연스럽 게 biotinylated 분자9, 격리의 버퍼 솔루션 경쟁력 있 제안 기법 기본 조건에서 네이티브 단백질 복합물을 분리 하는 데 이상적입니다.
생체 외에서 바인딩 조건과 엄중, 소금 농도, 감소 시키는 대리인 및 세제 비율에 의해 결정 됩니다,이 진정한 vivo에서 상호 작용을 식별 하기 위해 그 세포질 문맥에 가까이 있어야 한다. 여기에 구현 된 바인딩 조건 있다 이전 증명 AU-바인딩 단백질10으로 허의 식별을 위해 적절 한. 이 이렇게 어렵고 도전적인 적절 한 바인딩 조건의 최적화 될 수 있으므로 시간을 절약할 수 있다. 또한,이 방법은 어떤 RNA-풀 다운 실험 시작 프로토콜로 사용 될 수 고 소금 및 세제의 농도 변경 하 고, 글리세롤 백분율을 변경 하 고 다른 소금 추가 여 점차적으로 최적화할 수 있습니다. 또한, 우리는 심지어 짧은 25-뉴클레오티드 RNA-조사는 pentamer 은닉는 모티브 사용할 수 특정 AUBP와의 상호 작용을 보여 시연.

<table><tbody><tr><td>NE-PER 핵 및 세포질 추출 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>피어스 프로테아제 억제제 정제, EDTA-free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>피어스 BCA 단백질 분석 키트</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>피어스 자기 RNA-단백질 풀다운 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td>에는 <td>마그네틱 비드가 포함되어 있으므로 키트를 4°C에서 보관해야 합니다. C</td></tr><tr><td>피어싱 RNA 3' 엔드 데스티오비오티닐화 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>이 키트는 "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit"의 일부이며 -20°C에서 보관해야 합니다. C는 풀다운 키트(4 &deg; C)를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&nbsp; 자기 스탠드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Anti - HuR (MOUSE) 단클론 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>이 항체는 Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit에 포함되어 있습니다. - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - &alpha; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9542</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - Mesothelin (MOUSE) 단클론 항체&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>2차 염소 항토끼 항체</td><td>세포 신호</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>2차 토끼 항-마우스 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 중간</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - 여과된 소 혈청</td><td>팬 Biotech&nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토마이신 (100x)</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 용액 (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA (1x)</td><td>Gibco by Life technologies&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean 시스템 유리 플레이트&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>1.5mm 통합 스페이서가 있는 Mini-PROTEAN 스페이서 플레이트</td><td>Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 빗, 10-well, 1.5 mm, 66 &micro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 세포 주조 모듈</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese gel 30 - 37.5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&nbsp의</td> 비율로 30% 아크릴아미드 및 비사아크릴아미드 재고 용액;<td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 전사막&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>순수한 메탄올에서 1분 동안 배양한 후 2분 동안 물로 세척하여 활성화해야 합니다.</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD 반건조 전사 셀&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp; 디지털 이미저</td><td>Vilber-RNA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>올리고 합성</td><td>Mycrosynth AG, 스위스</td><td>-</td><td>합성 규모 - 0.04 &마이크로; mol - HPLC 정제된</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>염산 (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>초순수 1 M Tris, pH 7.5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>50% 멸균 분취량은 -20°C에서 보관해야 합니다. C</td></tr><tr><td>피어스 스트렙타비딘 자석 비즈&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>이 마그네틱 비드의 평균 직경은 1 &마이크로입니다. m (0.5 - 1.5 &micro 범위; 또한, Dynabeads-M280 Streptavidin은 균질화 크기 2.8 &micro의 비드입니다. m은 RNA-pulldown에도 사용되지만 정제 과정에 영향을 미칠 수 있습니다.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄황산염-(14-18)-수화물&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>오르토인산&nbsp;</td><td>애플리켐</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin streptavidin 선호도 중재 mesothelioma 세포에서 rna 상호 작용 단백질의 정화

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

생체 외에서 RNA-풀 다운 특정 RNA 구조와 주제를 인식 하는 RNA 의무적인 단백질을 식별 하기 위한 프로토콜의 첫 번째 단계에서 아직도 크게 사용 된다. 이 RNA-풀 다운 프로토콜에서 상업적으로 합성된 RNA 프로브 biotin, desthiobiotin는 역에 streptavidin 바인딩하고 따라서 더에서 단백질의 차입을 허용 한다 RNA 가닥의 3' 말단에서의 수정 된 형태로 표시 됩니다 생리 조건입니다. RNA-desthiobiotin는 streptavidin 자석 구슬, 풀 다운 단백질 특히 관심의 RNA와 상호 작용 하는 데 사용 되는에의 상호 작용을 통해 움직일 수 있습니다. Mesothelioma 셀의 cytosolic 분수에서 비 변성 및 활성 단백질은 단백질의 원본으로 사용 됩니다. 여기 설명 하는 방법은 알려진된 RNA 의무적인 단백질 25-뉴클레오티드 (nt) 긴 RNA 프로브를 포함 하는 관심사의 순서 사이 상호 작용을 검출 하기 위하여 적용할 수 있습니다. 안정 또는 불안정 기자 벡터 분석 결과 사용 하 여 달성 하는 RNA 분자에 존재 하는 성분의 기능 특성을 완료 하는 데 유용 합니다.

이 실험에서 calretinin 3' UTR 은닉은 모티브의 (CALB2 3' UTR (은) 25-nt) 25-nt 긴 조각 인간 항 R (허) 단백질, 알려진된 mRNA 안정제에 특히 바인딩 되었는지 테스트 하려면 사용 되었습니다. 테스트는 요소, 25 nt RNA의 특이성 조사 CALB2 3' UTR (mtARE)는 모티브의 안정화 효과 폐지 이전 보였다는 모티브는 돌연변이 포함 하 이었다 사용된6. 3 RNA 프로브 28 nt 부정적인 제어 없는 요소를 포함 하는 잘 정의 된 철 반응 (없는 RNA (분노)), 철 응답 cytosolic 단백질13,14바인딩할 알려진 RNA를 나타냅니다. 허 cytosol15mRNA 안정제로는 핵 함수 내에서 지역화 주로 이기 때문에, 핵/cy...

Desthiobiotin 라벨 아데닌 부자 요소 (는) 주제를 포함 하는 합성 25-뉴클레오티드 RNA oligo의 cytosolic는 바인딩 단백질의 특정 바인딩 수 있습니다.

Desthiobiotin Streptavidin 선호도 중재 Mesothelioma 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정화

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

이 절차의 전반적인 목표는 중피종 세포의 RNA 분자에 위치한 특정 염기서열에 결합하는 세포질 단백질을 포착하는 것입니다. 이 방법은 예측된 RNA 결합 단백질이 전사체에서 아데노신 또는 우리딘이 풍부한 서열과 결합할 수 있는지 여부와 같은 RNA 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 리포터 분석으로 평가된 안정화 또는 불안정화 요소의 기능적 특성화를 보완한다는 것입니다.이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Jelena Kresoja-Rakic 박사입니다. 프로토콜을 시작하려면 80-90% confluence를 가진 이전에 준비된 ACC-MESO-4 세포를 얻습니다. 배지를 흡인하고, 15mL의 1X 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하고, PBS를 흡인합니다.다음으로 0.25%트립신-EDTA 3ml를 첨가하고 배양 플라스크를 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다. 7ml의 RPMI-1640 배지를 첨가하고 15ml 튜브에 세포를 모은 다음 200배 g에서 5분 동안 스핀다운합니다. 그런 다음 배지를 흡인하고 1.5ml의 1X PBS로 세포 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 세포를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 500 곱 g과 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 다시 회전시킵니다. 스핀 후 상층액을 버리고 1.5ml의 얼음처럼 차가운 1X PBS로 세포 펠릿을 재현탁시킨 다음 3분 동안 500배 g 및 섭씨 4도에서 세포를 스핀다운합니다.상층액을 버리고 세포 펠릿이 들어 있는 튜브를 10, 20, 50 및 100 마이크로리터의 1X PBS가 있는 1.5 밀리리터 튜브와 비교하여 세포 펠릿 충전 부피를 추정합니다. 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포질 추출 시약(CER I)에 2마이크로리터의 1X 단백질분해효소 억제제를 추가합니다. 펠릿을 15초 동안 격렬하게 소용돌이치고, 얼음 위에서 튜브를 10분 동안 배양합니다.11마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포질 추출 시약 II(CER II)를 넣고 5초 동안 격렬하게 소용돌이치게 한 다음 얼음 위에서 1분 동안 튜브를 배양합니다. 와류는 5 초 동안 표본을 격렬하게 하고, 16, 5 분 동안 000 시간 g에 관을 분리기를 설치한다. 상층액을 얼음 위의 깨끗하고 미리 냉각된 튜브로 옮깁니다.100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 핵 추출 시약(NER)에 남은 펠릿을 재현탁하고 1마이크로리터의 단백질분해효소 억제제를 보충하고 15초 동안 격렬하게 와류를 일으킵니다. 얼음 위에서 40분 동안 샘플을 배양하고 15초 동안 10분마다 소용돌이칩니다. 16, 000 시간 g에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리하십시오.핵 단백질 분획인 상층액을 깨끗하고 미리 냉각된 튜브로 옮깁니다. 즉시 bicinchoninic 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 세포질 및 핵 추출물 분취액을 준비합니다.이러한 부분 표본을 액체 질소에 5초 동안 넣어 급속 냉동하고 섭씨 영하 80도에서 직접 보관합니다. 5마이크로리터의 10마이크로몰 RNA 프로브를 0.5밀리리터의 얇은 벽 마이크로원심분리 튜브에 옮기고 섭씨 85도의 PCR 기계에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 즉시 얼음 위에 올려 놓습니다.단일 30마이크로리터 반응의 경우, 이전에 준비된 혼합물 10마이크로리터를 RNA 함유 튜브에 추가합니다. 15마이크로리터의 PEG 30%를 반응에 조심스럽게 첨가하고 새 팁을 사용하여 반응을 혼합합니다. 섭씨 16도에서 밤새 반응을 배양합니다.다음 날, 시약을 준비합니다. 70마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 RNA 라벨링 반응 튜브에 추가합니다. 클로로포름 isoamyl 알콜의 100개 마이크로리터를 추가하고, 짧게 와류를 치고 13, 3 분 동안 000 시간 g에 표본을 회전시키십시오.상부 단계만 조심스럽게 제거하십시오. 아래쪽 위상을 만지지 마십시오. 뉴클레아제가 없는 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다.10마이크로리터의 5몰 염화나트륨, 1마이크로리터의 글리코겐, 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 100% 에탄올을 추가합니다. 튜브를 섭씨 영하 20도에서 2시간 동안 놓습니다. 2 시간 후에, 15 분 동안 13, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에 분리기.펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 버리십시오. 얼음처럼 차가운 70% 에탄올 300마이크로리터를 추가하고 5분 동안 13, 000회 g 및 섭씨 4도에서 다시 원심분리합니다. 상등액을 완전히 버리고 펠릿을 15분 동안 자연 건조합니다.펠릿을 뉴클레아제가 없는 물 20마이크로리터에 재현탁합니다. RNA를 섭씨 90도에서 2분 동안 배양하고 얼음 위에 놓습니다. streptavidin 마그네틱 비드를 사전 세척하는 다음 단계에서 라벨링된 RNA를 얼음 위에 놓습니다.RNA 50피코몰당 50마이크로리터의 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 사전 세척합니다. 스트렙타비딘 마그네틱 비드로 튜브를 15초 동안 소용돌이칩니다. 빠르게 볼텍싱한 후 절단된 피펫 팁을 사용하여 200마이크로리터를 깨끗한 1.5ml Safe-Lock 튜브에 넣습니다.그런 다음 비드가 튜브 측면에 모이도록 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 1분 동안 기다립니다. 재현탁액을 제거합니다. 비드를 세척하려면 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 400마이크로리터의 0.1몰 수산화나트륨, 0.05몰 염화나트륨 용액을 넣고 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅합니다.튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 1분 정도 기다립니다. 그런 다음 상층액을 수집합니다. 200마이크로리터의 100밀리몰 염화나트륨으로 비드를 세척하고 상층액을 제거합니다.200마이크로리터의 20밀리몰 트리스를 추가하고 피펫팅으로 비드를 다시 매달아 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 1분 후 상층액을 제거합니다. 그런 다음 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 200마이크로리터의 1X RNA 캡처 버퍼를 추가한 다음 잠시 볼텍싱하여 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 다시 현탁시킵니다.50마이크로리터의 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 제거하고 절단된 피펫 팁을 사용하여 라벨링된 각 RNA 튜브에 추가합니다. 롤러에서 실온에서 30분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 올려놓은 후 상층액을 제거합니다.비드에 50마이크로리터의 20밀리몰 트리스를 추가하고 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣습니다. 1분 후 상층액을 제거합니다.100마이크로리터의 1X 단백질 RNA 결합 완충액을 비드에 추가하고 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓습니다. 튜브가 1분 동안 스탠드에 있으면 상층액을 수집합니다.100마이크로리터의 마스터 믹스 B를 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 다시 부유하고 기포가 생성되지 않도록 합니다. 롤러에서 섭씨 4도에서 60분 동안 반응 튜브를 배양합니다. 세척 및 용리 단계로 이동합니다.튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 흐름을 모아 새 튜브로 옮깁니다. 피펫 100 마이크로 리터의 1X 세척 버퍼를 비드에 부드럽게 재현탁 한 다음 스탠드에 다시 놓고 1 분 동안 기다렸다가 상층액을 버립니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.마그네틱 비드에 40마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고, 위아래로 피펫팅하여 혼합한 후 튜브 셰이커에서 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 1분 정도 기다린 후 용리액 샘플을 수집합니다. 얼음 위에 놓고 다운스트림 분석에 사용합니다.핵/세포질 분획의 순도를 입증하기 위해 웨스턴 블롯으로 단백질을 분석한 결과, 알파-튜불린은 세포질 분획에서만 검출되고 PARP 단백질은 핵 분획에서만 검출되는 것으로 나타났습니다. CALB2 three-prime UTR ARE 프로브의 용리액은 인간 R의 결합을 입증했으며 철 반응성 단백질과 결합하는 돌연변이 프로브와 관련 없는 RNA 프로브의 용리액에는 없었습니다. CALB 3-프라임 UTR과 인간 R 사이의 특이성을 추가로 입증하기 위해 멤브레인을 항메소텔린 항체로 조사한 결과 3개의 용출 샘플 모두에서 메소텔린의 존재가 나타나지 않았으며, 이는 CALB2 3-프라임 UTR 내의 안정화 ARE 모티프가 인간 R 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 나타냅니다.겔의 Coomassie 염색은 동일한 양의 단백질이 세 가지 다른 RNA 프로브로 배양하는 데 사용되었음을 보여줍니다. 이 절차에 따라 주어진 단백질의 면역침전과 같은 추가 단백질 중심 방법을 수행하여 어떤 염기서열이 결합하는지와 같은 추가 질문을 해결할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 RNA 생물학 분야의 연구자들이 특정 RNA의 가능한 상호 작용 파트너를 탐색할 수 있는 길을 열었습니다.

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

이 비디오는 mRNA에서 아데닐레이트-우리딜레이트-풍부 요소(ARE) 염기서열과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질(RBP)을 식별하기 위한 체외 RNA 풀다운 분석을 보여줍니다. 세포 용해물의 표적 RBP는 RNA 프로브와 혼합되어 RNA 단백질 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 RNA 프로브의 desthiobiotin 라벨과 streptavidin-labeled magnetic bead의 친화성을 활용하여 친화성 정제를 통해 분리됩니다.

친화성 추출을 통해 RNA 결합 단백질을 분리하기 위한 RNA-단백질 풀다운 분석

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

Rhipicephalus microplus gut tissue로부터 상피 세포를 분리하기 위해 modified density centrifugation gradient-based 방법을 사용 하였다. 표면 결합 단백질은 스트리타비딘 자성 비드를 통해 바이오 티 닐화되고 정제되어 하류 적용에서 이용되었다.

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

Botin streptavidin 전략을 사용 하 여 정화 RNA 또는 단백질 복합물은 eluted 더 정화와 기능 분석에 대 한 부적 절 한 형태로 변성 조건에서 솔루션. 여기, 우리가 네이티브 및 완전 한 기능 RNA 또는 단백질 복합물 저조한 RNA와 부드러운 UV 차입 단계 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여이 전략의 설명.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.

플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

여기에서 우리는 인간 세포의 총 단백질 추출물, 비오티닐화 RNA로 코팅된 스트렙타비딘 비드 및 질량 분석 분석을 사용하여 특정 RNA 서열의 단백질 상호작용자를 발견, 정량화 및 검증하기 위한 최적화된 시험관 내 방법을 제시합니다.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

이 논문에서는 스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계(BLI) 시스템을 사용하여 DNA-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 상호 작용의 평형 결합 친화도(KD)를 결정하기 위해 기본 또는 고급 결합 역학을 활용하기 위한 필수 단계와 고려 사항을 간략하게 설명합니다.

스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계를 사용한 DNA-단백질 상호작용 분석

배우세요 mesothelioma 세포에서 RNA 상호작용 단백질을 desthiobiotin streptavidin 선호도 중재 방법으로 정화하는 기술입니다. 이 방법은 RNA 결합 단백질 연구와 RNA 생물학 이해에 활용됩니다.

Desthiobiotin Streptavidin 선호도 중재 Mesothelioma 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정화

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