Name: 빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 학습하세요 C. elegans에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오프로틴을 활용한 신속한 게놈 점돌연변이 생성 방법을. 이 기술은 신경퇴행성 질환 관련 유전적 변이의 기능 연구에 필수적입니다.

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모든 동물 보호 및 실험 절차에서 건강의 국가 학회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 미시간 대학에서는 가이드라인에 따 랐 다. RNase 무료 솔루션을 사용 하 고 플라스틱 프로토콜에 걸쳐 팁. RNase 오염 제거 솔루션 ( 자료 표참조) 제조업체 지침에 따라 작업 영역, 펫, 튜브, 그리고 원심 분리기를 청소.
1입니다. sgRNA 대상 선택
<ol><li>웹 페이지를 열고 웹 브라우저를 사용 하 여: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>~ 60의 기본적인 쌍 (bp) 측면에 서는 관심의 원하는 편집 시퀀스의 입력 (즉 30 bp 5'과 3' 원하는 편집의).</li>
		<li>꼬마 선 충 게놈 풀 다운 메뉴에서 선택 합니다.</li>
		<li>Protospacer 인접 한 모티브를 선택 (HF1-20 bp-NGG-SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) 풀 다운 메뉴에서.</li>
		<li>전송을 클릭 합니다. 결과 페이지에서 최고 순위 대상 시퀀스의 편집에 가까운 선택 합니다. 측면에 서 60 bp 입력된 시퀀스 내의 아무 적당 한 대상 사이트 경우 확장 쿼리 시퀀스 100 bp (즉 50 bp는 원하는의 양쪽 편집).</li>
	</ol>
</li>
	<li>예: synthego, 사용 가능한 소스에서 얻을 다음 사양 20-메 르 대상 sgRNA: 3 nmol; 아니 수정입니다.</li>
	<li>접수 한 후, 원심에서 튜브를 포함 하는 동결 건조 된 sgRNA > 실 온에서 1 분 동안 12000 x g. 튜브, nuclease 무료 테의 60 µ L을 추가 하 고 부드럽게 다시 15-20 회 P200 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 일시 중단. 최종 농도 50 μ M 이다입니다.</li>
</ol>2. 상 동 감독 복구 템플릿 디자인
<ol><li>SsODN HDR 템플릿을 포함 하는 디자인: 1)의 돌연변이, 2)는 독특한 프레임에서 금지 endonuclease 사이트, 3) NGG 팸 시퀀스 내의 Gs 중 하나 또는 모두의 침묵 돌연변이 4) 50 bp 5'과 3' homology 팔 성과 돌연변이 측면. (그림 1C) 9 , 10.<ol>
<li>NGG 팸 시퀀스의 돌연변이 가능 하지 않으면 sgRNA이 중재 ssODN HDR 서식 파일의 분열을 방지 하기 위해 sgRNA 대상 인식 시퀀스 내에서 5-6 침묵 돌연변이 소개 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사용 가능한 소스, 예를 들면 idtdna에서에서 다음 매개 변수는 "Ultramer DNA oligonucleotide" 얻을: 규모: 4 nmol; 배합: 없음; 정화: 표준 담입니다.</li>
	<li>접수 한 후, 원심에서 튜브를 포함 하는 동결 건조 된 ssODN > 실 온에서 1 분 동안 12000 x g. 부드럽게 다시 일시 중단 100 µ M의 최종 농도에 ssODN nuclease 무료 ddH2O에서에서 15-20 회 P200 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로.</li>
</ol>3. 디자인 유전형 뇌관
<ol><li>400 ~ 700 bp의 PCR amplicon11생성 하 게놈 수정 측면을 설정 하는 뇌관 디자인.</li>
	<li>단일 및 특정 amplicon11생산 PCR 순환 상태를 최적화 합니다.</li>
</ol>4. 주입 혼합 준비
<ol><li>표 1 시 약 4 ° c.에서 2 분 최대 속도로 원심</li>
	<li>순서 대로, nuclease 무료 PCR 튜브에 표 1 시 약을 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 pipetting 아래로 10 번 P20 피 펫과에 의해 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 주입 혼합 품 어.</li>
</ol>5. 주입 프로토콜
<ol><li>사출 micropipette 주입 혼합12의 약 절반으로 로드 합니다. 주사 바늘 나 막 신 또는 나누기 경우 주입 혼합 나머지 저장 합니다.</li>
	<li>있도록 ~ 20-30 p.s.i.는 점진적 흐르는 솔루션12micropipette 팁을 휴식. 참고: 큰 직경 팁 부정적인 동물의 건강에 영향을 미칠 및 F1 자손 수확량 감소.</li>
	<li>10-15 영 주사 성인 gonadal 양팔의 벌레 가능한 경우12. 그렇지 않으면, 주입 한 gonadal 팔으로 충분 하다.</li>
	<li>OP50-시드 35 m m 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시에 주입 된 동물 (P0) 실 온에서 1-2 h에 대 한 복구를 허용 합니다. 그 후, 개별 OP50 시드 35 m m NGM 판 백 금 철사 벌레를 사용 하 여 단일 주입된 P0 동물12를 선택 합니다.</li>
</ol>6. 스크린 P0 격판덮개 및 단일 mCherry(+) F1s
<ol><li>2 일 후 주입, P0 판 F1 자손 표현 mCherry 형광 stereomicroscope를 사용 하 여 인 두에 포함 된 식별 (그림 1D, 하루 2-3). 대부분의 mCherry(+) F1 동물을 포함 하는 3 개의 P0 플레이트를 선택 합니다.</li>
	<li>3 선택한 P0 플레이트의 각 단일 24-36 mCherry(+) F1의벌레를 사용 하 여 총 8-12 mCherry(+) F1 동물 선택 (그림 1D, 하루 2-3). 참고: mCherry(-) 동물 또한 이러한 P0 플레이트에서 안타 수 있습니다 하지만 올바르게 식별 확률 편집 동물 훨씬 낮은 (그림 2A).</li>
	<li>개별 F1s self-fertilize 하 여 실 온에서 1-2 일에 대 한 알 수 있습니다.</li>
</ol>7. 단일 벌레 PCR과 유전형
<ol><li>1-2 일 후 계란-누워, 개별 PCR 스트립 튜브 캡 포함 된 웜 선택 (표 2, 그림 1D, 하루 4-5)를 사용 하 여 웜 세포의 용 해 버퍼의 7 µ L로 F1s를 전송 합니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 하단에 동물을가지고 1 시간-80 ° C에서 튜브를 고정을 실 온에서 1 분 동안 최대 속도로 PCR 튜브. 참고: 웜 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한.</li>
	<li>Thermocycler 다음과 같은 프로그램을 사용 하 여 냉동된 벌레를 lyse: 60 ° C 60 분, 15 분 동안 95 ° C에 4 ° C를 개최.</li>
	<li>설정 PCR mastermix 표 3에서 같이</li>
	<li>깨끗 한 PCR 튜브에 PCR mastermix의 21 µ L을 추가 하 고 3 단계에서 웜 세포의 4 µ L를 추가 합니다. 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합 하 고 PCR 프로그램 제조 업체 지침 ( 자료 표참조)를 실행.</li>
	<li>제조업체 지침에 따라 DNA 깨끗 하 고 집중 키트를 사용 하 여 PCR 반응 정화 ( 자료 표참조). 10 µ L 물 회전 열을 추가 하 여 DNA을 elute.</li>
	<li>설정 제한 효소 mastermix 표 4와 같이</li>
	<li>10 µ L의 제한 효소 mastermix 각 청소 PCR 반응에 추가 하 고 1-2 h 37 ° C13에서 품 어.</li>
	<li>별도 소화 120 V 1 x 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼14를 사용 하 여에서 실행 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품.</li>
</ol>8. 신분증 및 편집 된 동물의 시퀀스 확인
<ol><li>잠재적인 편집 동물14 (그림 1D, 하루 4-5)을 표시 하는 밴드의 존재에 대 한 소화 효소 샘플을 검사 합니다. 참고: 밴드 크기 또는 예기치 않은 하 고 복잡 한 금지 효소 소화 패턴 밴딩 교대로 관찰 될 수 있는 잠재적인 indel 돌연변이 식별 하는 N2 컨트롤을 로드 합니다.</li>
	<li>확인 후 잠재적인 편집된 동물, 웜 세포의 나머지 3 µ L를 사용 하 고 PCR 반응을 반복 합니다. 청소 하지 않는 또는 금지 효소 소화 PCR 반응 완료 되 면 프로그램. 별도 1 %agarose 젤에 PCR 반응을 로드 하 고 젤 추출 키트15 를 사용 하 여 밴드를 추출 ( 자료 표참조).</li>
	<li>생어 시퀀스16 젤 올바르게 편집된 동물 (그림 1A)를 식별 하는 F1 뇌관을 사용 하 여 DNA를 추출 참고: Heterozygote 읽기 포함 됩니다 야생 타입의 존재로 인해 봉우리 중첩 그리고 대립 유전자를 설계.</li>
	<li>Homozygous 동물에서에서 얻이 검증된 heterozygous 편집된 동물, 단일 8-12 F2 동물 7-8 단계를 수행 하려면.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
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<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
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<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

우리는이 논문의 중요 한 독서에 대 한 애 원 실험실의 구성원 감사. 종자는 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 애 원 실험실에 있는 연구는 교부 금에 의해에서 지원 NIH (R01 NS094678)와 근 위축 증 협회 (MDA382300) A.A.B.

CRISPR-Cas9 시스템 모델 생물의 게놈을 정확 하 게 수정에 대 한 강력 하 고 효과적인 도구입니다. 여기, 우리는 그 공상 sgRNAs20 ssODN HDR 템플릿 사용 C. 선 충게놈 점 돌연변이의 고효율 세대 결합 보여 줍니다. 중요 한 것은, 시연 RNP 배달에 편집 고효율 생산 형광 공동 선택 마커로 사용할 때 편리 함과 기술의 안정성을 강조 합니다.
C. 선 충 게놈 엔지니어링에 대 한 CRISPR Cas9 메서드의 대부분 특정 유전 배경 또는 공동-CRISPR 전략1에 의존합니다. Co CRISPR 메서드는 성공적인 게놈 편집의 가능성을 증가 하는 유용한 도구가 될 입증 되었습니다. 그러나, 공동-CRISPR 방법을 소개 하는 관심의 게놈 편집에 대 한 풍요롭게 마커 로커 스에 표현 형을 선택할 수 있는 편집 해야 합니다. 강력 하 고, 하는 ...

최근의 기술 진보 근본적으로 변형 하 고 정확 하 게 엔지니어 유전자 수를 가속. 특히, RNA 기반 endonuclease 관심의 대상 시퀀스 근처 두 배 물가 틈 (DSB)를 유도 하는 Cas9에 의존 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 광범위 하 게 사용 되었습니다 정확 하 게 대부분에 사용 되는 모델 생물의 게놈 엔지니어링 생물 의학 연구1,2,,34. 크게, CRISPR-Cas9를 사용 하 여 게놈 C. 선 충5같은 어려운 종에도 편집 잠금을 해제 했다. 종에 세 가지 핵심 구성 요소에 의존 편집 시스템 CRISPR-Cas9 기반으로 게놈으로 포인트 돌연변이 생성: 1) Cas9 endonuclease, 대상 시퀀스와 설계 3)는 사용자에 게 Cas9 endonuclease 지휘 2)는 하나의 가이드 RNA (sgRNA) 관심2의 원하는 개의 편집 항목을 포함 하는 homology 감독 수리 (HDR) 템플릿.
대상 sgRNA 및 Cas9를 소개 하는 데 사용할 수 있는 여러 방법이 있다 nuclease 플라스 미드, RNA, 그리고 바이러스 성 기반 배달 방법6을 포함 하 여 셀에. 최근, 사전 complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs)의 직접 배달 CRISPR-Cas9-기반 게놈7편집에 강력 하 고 효율적인 도구로 떠오르고 있다. 사전 complexed CRISPR Cas9 RNPs의 직접 배달 여러 가지 이점이 있다, 즉: RNPs 1) 세포 녹음 방송에 대 한 필요를 무시 하 고 번역, 2) RNPs는 급속 하 게 삭제는 사용할 수 있는 시간을 줄임으로써 특이성을 증가 시킬 수 있습니다 오프-대상 분열, 그리고 3) circumvents 아닌 임의의 통합을 통해 호스트 게놈 시퀀스의 소개는 아무 외국 DNA/RNA 요소를 포함 하는 RNPs. 함께, 이러한 특성 가능성이 대상에 CRISPR에서 대상 효과 최소화 하면서 편집의 짧은 버스트를 제공 합니다.
C. 선 충에서 사이트별 게놈 변화를 도입에 대 한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 sgRNA 및 단일 좌초 oligonucleotide (ssODN) HDR 서식 파일 디자인, sgRNA-Cas9 RNP complexing 및 납품, 및 제대로 편집된 동물의 명확한 식별을 위해 유전형 전략 대상으로 포함 되어 있습니다. 이 전략을 사용 하 여, 원하는 사이트 변경 내용을 복구할 수 있습니다, 뿐만 아니라 다른 일반적인 indel 돌연변이 복구할 수 있습니다. 따라서, 모노-유전자, bi-유전자, 어디 하나의 전략을 사용 하 여 유전자 시리즈의 생성을 허용 하는 우리의 전략 그리고 indel 돌연변이 F1 세대에서 생성 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp; EZ 키트</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>키메라 sgRNA</td></tr><tr><td>뉴클레아제 프리 TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>sgRNA 키트와 함께 제공, EZ 키트</td><td></td></tr><tr><td>, 뉴클레아제가 없는 물</td><td>, Synthego, Inc.</td><td>sgRNA 키트와 함께 제공되는 EZ 키트</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>ssODN HDR 템플릿</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>통합 DNA 기술</td><td>1078728</td><td>Cas9 단백질</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2 :: mCherry 마커 플라스미드</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA 클린 & 농축기</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean 젤 DNA 회수 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 핫 스타트 고충실도 2X 마스터 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>유리 붕규산 유리 마이크로피펫</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1.0mm. ID: 0.78mm</td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap 오염 제거 솔루션</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

빠른 고 손쉬운 파이프라인 c. 선 충 을 사용 하 여 crispr/cas9 ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

클러스터 된 정기적으로 산재 된 구조 반복 (CRISPR)-CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9) 간결한 적응 면역 방어 시스템을 공동 정확한 진 핵 게놈 엔지니어링에 대 한 강력한 도구로 선택한 되었습니다. 여기, 선물이 C. 선 충의 게놈 포인트 돌연변이 들의 효율적이 고 정확한 세대에 대 한 공상 단일 가이드 RNAs (sgRNA)와 CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs)를 사용 하 여 신속 하 고 간단한 방법. 우리는 sgRNA 대상 선택, 호몰로지 감독 수리 (HDR) 템플릿 디자인, CRISPR-Cas9-RNP complexing 및 배달 및 올바르게 편집된 동물의 강력 하 고 급속 한 식별 수 있도록 유전형 전략 파이프라인을 설명 합니다. 우리의 접근 허용 손쉬운 생성 및 원하는 게놈 포인트의 돌연변이 동물, 뿐만 아니라 또한 높은 효율성 및 감소 된 심사 작업 약 4-5 일에 다른 복잡 한 indel 대립 유전자의 탐지를 용이 하 게 한다.

인간의 superoxide dismutase 1에에서 돌연변이 (SOD1) 가족 루 경화 증, 마비와 죽음17변함없이 이끌어 치명적인 신경 질환의 10 ~ 20% 위한 계정. 인간의 떼-1 (그림 1B) C. 선 충 떼-1 단백질으로 55% 정체성과 70% 유사성을 공유 하는 진화론 보존된 단백질 이다. 단순, 타당성, 및 CRISPR Cas9 RNP-기반 접근의 효율성을 입증, 우리는 질병 관련 인간의 G93A 변종 웜 게놈 (그림 1A)에서 소개 하는 C. 선 충 떼-1 유전자 대상.
C. 선 충 게놈에 G93A 돌연변이를, sgRNA는 그 팸 인식...

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

이 절차의 전반적인 목표는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 상동성 유도 복구 템플릿 및 CRISPR/Cas9 리보핵단백질을 사용하여 C.Elegans에서 게놈 점 돌연변이를 생성하는 것입니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환과 관련된 유전적 변이의 병리학적 결과 결정과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 게놈 점 돌연변이가 빠르게 생성될 수 있어 단백질 과발현의 경고를 피하면서 내적 조절 조절의 맥락 내에서 유전적 변이의 기능적 연구를 수행할 수 있다는 것입니다.sgRNA 타겟 선택을 수행하려면 여기에 표시된 웹페이지를 엽니다. 원하는 관심 편집 옆에 있는 약 60개의 염기 쌍을 입력합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 C.Elegans 게놈과 protospacer 인접 모티프를 선택한 후 submit을 클릭합니다.결과 페이지에서 관심 있는 편집에 가장 가까운 최상위 대상 시퀀스를 선택합니다. 수령 시, 동결건조된 sgRNA가 함유된 튜브를 실온에서 1분 동안 12, 000g 이상 원심분리합니다. 60마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 TE를 튜브에 추가하고 p200 피펫을 사용하여 15-20회 피펫팅하여 부드럽게 재현탁합니다.최종 농도는 50 마이크로 몰입니다. 관심 돌연변이, 고유한 프레임 제한 엔도뉴클레아제 부위, NGG PAM 염기서열 내 Gs 중 하나 또는 둘 다의 조용한 돌연변이, 첫 번째 및 마지막 돌연변이 옆에 있는 50개의 염기쌍 5개의 프라임 및 3개의 프라임 상동성 팔을 포함하는 ssODN HDR 템플릿을 설계합니다. 수령 즉시 방금 설명한 대로 동결건조된 ssODN이 포함된 튜브를 원심분리한 다음 뉴클레아제가 없는 DD H20을 사용하여 ssODN을 최종 농도인 100마이크로몰까지 부드럽게 재현탁합니다.주입 혼합물을 준비하려면 여기에 표시된 시약을 최대 속도와 섭씨 4도에서 2분 동안 원심분리합니다. 나열된 순서대로 nuclease free PCR 튜브에 시약을 추가합니다. 그런 다음 p20 피펫을 사용하여 내용물을 부드럽고 완전히 혼합합니다.튜브를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 P0 동물을 주입한 후 OP50 파종 35mm NGM 플레이트에서 1-2시간 동안 실온에서 회복하도록 합니다. 그 후, 백금 와이어 웜 픽을 사용하여 단일 주입된 P0 동물을 개별 OP50 파종된 35mm NGM 플레이트로 옮깁니다.주입 2일 후 형광 현미경을 사용하여 F1 자손이 포함된 P0 플레이트를 식별하고 인두에서 mCherry를 발현합니다. mCherry 양성 F1 동물이 가장 많이 포함된 3개의 P0 플레이트를 선택하십시오. 선택된 3개의 P0 플레이트 각각에서 웜 픽을 사용하여 8-12mCherry 양성 F1 동물을 선별하여 총 24-36mCherry 양성 F1을 만듭니다.개별 F1이 자가 수정을 하고 실온에서 하루에서 이틀 동안 알을 낳을 수 있도록 합니다. 알을 낳은 지 하루에서 이틀 후, 웜 픽을 사용하여 F1을 7마이크로리터의 웜 용해 완충액이 들어 있는 개별 PCR 스트립 튜브 캡으로 옮깁니다. PCR 튜브를 최대 속도와 실온에서 1분 동안 원심분리하여 동물을 튜브 바닥으로 가져옵니다.그런 다음 튜브를 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 얼립니다. 다음으로 다음 프로그램을 사용하여 열순환기에서 얼어붙은 웜을 lyse합니다. 그런 다음 이 표와 같이 PCR 마스터 믹스를 설정합니다.21마이크로리터의 PCR 마스터 믹스를 깨끗한 PCR 튜브에 넣은 다음 4마이크로리터의 웜 용해 튜브를 넣고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 PCR 프로그램을 실행합니다. 제조업체의 지침에 따라 DNA 세척 및 농축 키트를 사용하여 PCR 반응을 정제합니다.그런 다음 스핀 컬럼에 10마이크로리터의 물을 첨가하여 DNA를 희석합니다. 제한 효소 마스터 믹스를 설정한 후 세척된 각 PCR 반응에 10마이크로리터를 추가하고 튜브를 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 120볼트에서 1x TAE 완충액을 사용하여 1.5% 아가로스 겔에서 분해된 PCR 산물을 분리합니다.효소로 분해된 샘플에서 잠재적으로 편집된 동물을 나타내는 띠가 있는지 검사합니다. 잠재적인 편집 동물을 식별한 후 나머지 3마이크로리터의 기생충 용해를 사용하고 PCR을 반복합니다. 그런 다음 겔 추출 키트를 사용하여 밴드를 분리 및 추출하기 전에 완료된 반응을 1% 아가로스 겔에 즉시 로드합니다.F1 프라이머를 사용하여 Sanger 염기서열분석을 수행하여 올바르게 편집된 동물을 식별합니다. 마지막으로, 검증된 이형접합 편집 동물로부터 동형접합 동물을 얻기 위해, 8 내지 12마리의 F2 동물을 선별하고 텍스트 프로토콜에 따라 유전형 분석 및 염기서열 검증을 수행합니다. CRISPR/Cas9 RNP 기반 접근법의 단순성, 실현 가능성 및 효율성을 입증하기 위해 C.Elegans sod-1 유전자를 대상으로 하여 웜 게놈에 질병 관련 인간 G93a 변이체를 도입했습니다.이 겔 이미지는 24마리의 mCherry 양성 F1 동물에 대한 유전형 분석 결과를 보여줍니다. 10개는 단일알릴 또는 바이알릴 변형을 포함했고, 10개는 야생형, 3개는 잠재적 인델, 1개는 PCR 실패였습니다. 형광 mCherry 마커가 게놈 변형을 위해 풍부해진다는 것을 입증하기 위해 3개의 P0 플레이트 각각에서 8개의 mCherry 음성 동물을 선택했습니다.단 한 마리의 동물만이 정확하게 변형된 반면, 23마리는 야생형이었다. 이 그림은 ssODN HDR 템플릿에서 설계된 정확한 뉴클레오티드 변화가 이 동형접합 F1 동물의 게놈에 충실하게 통합되었음을 보여주는 전장 겔 추출 PCR 산물의 크로마토그램을 보여줍니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행된다면 4-5일 안에 예쁜꼬마선충의 게놈 점 돌연변이를 생성하고 식별하는 데 사용할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 RNase free water, 필터 피펫 팁 및 장갑을 포함한 nucleus free 시약 및 기술을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 관심 돌연변이와 관련될 수 있는 표현형을 조사하기 위해 세포, 분자 및 행동 분석을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 키메라 단일 가이드 RNase 및 CRISPR/Cas9 ribonuclearprotein을 사용하여 C.Elegans에서 게놈 점 돌연변이를 정확하게 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 PCR 스크리닝을 통해 단일 선충에서 유전자 마커를 빠르게 스크리닝하는 기술을 설명합니다. 예시 프로토콜에서는 CRISPR 기반 게놈 편집을 스크리닝합니다.

Single Worm PCR: 게놈 DNA를 추출하고 증폭하는 방법

이 동영상은 형질전환 예쁜꼬마선충 균주를 만드는 일반적인 방법인 미세주입에 대해 설명합니다. 이 예에서는 CRISPR 염기 유전자 편집을 위한 리보핵단백질(RNP) 복합체를 도입하는 데 사용되는 미세주입을 볼 수 있습니다.

생식선 미세주입: 예쁜꼬마선충의 생식세포에 직접 화합물을 전달하는 방법

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

이 논문은 곤충병원성(EPN: 곤충기생) 선충이자 신흥 유전 모델인 Steinernema hermaphroditum 에서 CRISPR-Cas9 매개 게놈 공학을 시연합니다. 기술이 설명한 기술은 돌연변이를 생성하는 데 유용하며, 상리공생 및 기생 공생과 관련된 선충 생물학의 유전자 기능을 밝히는 데 도움을 줍니다.

곤충병원성 선충 Steinernema hermaphroditum 의 CRISPR-Cas9 기반 돌연변이 유발과 돌연변이 계통의 유지

Caenorhabditis elegans 생식계통에서 동형접합 노크인 라인을 얻기 위한 CRISPR/Cas9 미세 주입 워크플로우.

카에노르랍디티스 엘레간스에서 생식계 특이 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 내인성 형광 태깅

학습하세요 C. elegans에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오프로틴을 활용한 신속한 게놈 점돌연변이 생성 방법을. 이 기술은 신경퇴행성 질환 관련 유전적 변이의 기능 연구에 필수적입니다.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

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