빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

이 절차의 전반적인 목표는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 상동성 유도 복구 템플릿 및 CRISPR/Cas9 리보핵단백질을 사용하여 C.Elegans에서 게놈 점 돌연변이를 생성하는 것입니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환과 관련된 유전적 변이의 병리학적 결과 결정과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 게놈 점 돌연변이가 빠르게 생성될 수 있어 단백질 과발현의 경고를 피하면서 내적 조절 조절의 맥락 내에서 유전적 변이의 기능적 연구를 수행할 수

sgRNA 타겟 선택을 수행하려면 여기에 표시된 웹페이지를 엽니다. 원하는 관심 편집 옆에 있는 약 60개의 염기 쌍을 입력합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 C.Elegans 게놈과 protospacer 인접 모티프를 선택한 후 submit을 클릭합니다.

결과 페이지에서 관심 있는 편집에 가장 가까운 최상위 대상 시퀀스를 선택합니다. 수령 시, 동결건조된 sgRNA가 함유된 튜브를 실온에서 1분 동안 12, 000g 이상 원심분리합니다. 60마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 TE를 튜브에 추가하고 p200 피펫을 사용하여 15-20회 피펫팅하여 부드럽게 재현탁합니다.

최종 농도는 50 마이크로 몰입니다. 관심 돌연변이, 고유한 프레임 제한 엔도뉴클레아제 부위, NGG PAM 염기서열 내 Gs 중 하나 또는 둘 다의 조용한 돌연변이, 첫 번째 및 마지막 돌연변이 옆에 있는 50개의 염기쌍 5개의 프라임 및 3개의 프라임 상동성 팔을 포함하는 ssODN HDR 템플릿을 설계합니다. 수령 즉시 방금 설명한 대로 동결건조된 ssODN이 포함된 튜브를 원심분리한 다음 뉴클레아제가 없는 DD H20을 사용하여 ssODN을 최종 농도인 100마이크로몰까지 부드럽게 재현탁합니다.

주입 혼합물을 준비하려면 여기에 표시된 시약을 최대 속도와 섭씨 4도에서 2분 동안 원심분리합니다. 나열된 순서대로 nuclease free PCR 튜브에 시약을 추가합니다. 그런 다음 p20 피펫을 사용하여 내용물을 부드럽고 완전히 혼합합니다.

튜브를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 P0 동물을 주입한 후 OP50 파종 35mm NGM 플레이트에서 1-2시간 동안 실온에서 회복하도록 합니다. 그 후, 백금 와이어 웜 픽을 사용하여 단일 주입된 P0 동물을 개별 OP50 파종된 35mm NGM 플레이트로 옮깁니다.

주입 2일 후 형광 현미경을 사용하여 F1 자손이 포함된 P0 플레이트를 식별하고 인두에서 mCherry를 발현합니다. mCherry 양성 F1 동물이 가장 많이 포함된 3개의 P0 플레이트를 선택하십시오. 선택된 3개의 P0 플레이트 각각에서 웜 픽을 사용하여 8-12mCherry 양성 F1 동물을 선별하여 총 24-36mCherry 양성 F1을 만듭니다.

개별 F1이 자가 수정을 하고 실온에서 하루에서 이틀 동안 알을 낳을 수 있도록 합니다. 알을 낳은 지 하루에서 이틀 후, 웜 픽을 사용하여 F1을 7마이크로리터의 웜 용해 완충액이 들어 있는 개별 PCR 스트립 튜브 캡으로 옮깁니다. PCR 튜브를 최대 속도와 실온에서 1분 동안 원심분리하여 동물을 튜브 바닥으로 가져옵니다.

그런 다음 튜브를 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 얼립니다. 다음으로 다음 프로그램을 사용하여 열순환기에서 얼어붙은 웜을 lyse합니다. 그런 다음 이 표와 같이 PCR 마스터 믹스를 설정합니다.

21마이크로리터의 PCR 마스터 믹스를 깨끗한 PCR 튜브에 넣은 다음 4마이크로리터의 웜 용해 튜브를 넣고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 PCR 프로그램을 실행합니다. 제조업체의 지침에 따라 DNA 세척 및 농축 키트를 사용하여 PCR 반응을 정제합니다.

그런 다음 스핀 컬럼에 10마이크로리터의 물을 첨가하여 DNA를 희석합니다. 제한 효소 마스터 믹스를 설정한 후 세척된 각 PCR 반응에 10마이크로리터를 추가하고 튜브를 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 120볼트에서 1x TAE 완충액을 사용하여 1.5% 아가로스 겔에서 분해된 PCR 산물을 분리합니다.

효소로 분해된 샘플에서 잠재적으로 편집된 동물을 나타내는 띠가 있는지 검사합니다. 잠재적인 편집 동물을 식별한 후 나머지 3마이크로리터의 기생충 용해를 사용하고 PCR을 반복합니다. 그런 다음 겔 추출 키트를 사용하여 밴드를 분리 및 추출하기 전에 완료된 반응을 1% 아가로스 겔에 즉시 로드합니다.

F1 프라이머를 사용하여 Sanger 염기서열분석을 수행하여 올바르게 편집된 동물을 식별합니다. 마지막으로, 검증된 이형접합 편집 동물로부터 동형접합 동물을 얻기 위해, 8 내지 12마리의 F2 동물을 선별하고 텍스트 프로토콜에 따라 유전형 분석 및 염기서열 검증을 수행합니다. CRISPR/Cas9 RNP 기반 접근법의 단순성, 실현 가능성 및 효율성을 입증하기 위해 C.Elegans sod-1 유전자를 대상으로 하여 웜 게놈에 질병 관련 인간 G93a 변이체를 도입했습니다.

이 겔 이미지는 24마리의 mCherry 양성 F1 동물에 대한 유전형 분석 결과를 보여줍니다. 10개는 단일알릴 또는 바이알릴 변형을 포함했고, 10개는 야생형, 3개는 잠재적 인델, 1개는 PCR 실패였습니다. 형광 mCherry 마커가 게놈 변형을 위해 풍부해진다는 것을 입증하기 위해 3개의 P0 플레이트 각각에서 8개의 mCherry 음성 동물을 선택했습니다.

단 한 마리의 동물만이 정확하게 변형된 반면, 23마리는 야생형이었다. 이 그림은 ssODN HDR 템플릿에서 설계된 정확한 뉴클레오티드 변화가 이 동형접합 F1 동물의 게놈에 충실하게 통합되었음을 보여주는 전장 겔 추출 PCR 산물의 크로마토그램을 보여줍니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행된다면 4-5일 안에 예쁜꼬마선충의 게놈 점 돌연변이를 생성하고 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 RNase free water, 필터 피펫 팁 및 장갑을 포함한 nucleus free 시약 및 기술을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 관심 돌연변이와 관련될 수 있는 표현형을 조사하기 위해 세포, 분자 및 행동 분석을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 키메라 단일 가이드 RNase 및 CRISPR/Cas9 ribonuclearprotein을 사용하여 C.Elegans에서 게놈 점 돌연변이를 정확하게 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.