번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

이 발자각 분석의 전반적인 목표는 포유류 mRNA에서 번역 시작 복합체 형성을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 IRES 매개 번역 시작과 같은 mRNA 번역 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 mRNA에서 번역 시작 복합체 형성에 대한 자세한 분석을 수행할 수 있다는 것입니다.

전사 반응을 조합하여 XIAP IRES RNA 또는 그 돌연변이를 인코딩하는 PCR 증폭 DNA 템플릿에서 RNA를 전사합니다. 다음으로, RNase의 각 20 마이크로리터 반응에 대한 DNA 템플릿을 제거하기 위해 두 단위의 RNase-free DNase를 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 DNase 처리된 RNA를 뉴클레아제가 없는 물로 최종 부피 110마이크로리터로 희석합니다. 다음으로, 110 마이크로 리터의 산 페놀을 첨가하여 RNA 정제를 시작합니다. 20, 000 x g에 20, 실내 온도에 3 분 동안 원심 분리기를 위한 5 초 및 원심분리기를 위한 와류

페놀을 추출하기 전에 RNA 또는 CDNA를 희석하는 것이 중요합니다. 부피가 너무 낮으면 수성상을 물리적으로 회수하기 어렵고 최종 수율이 낮아집니다. 그런 다음 RNA 함유 수성상 100마이크로리터를 새 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

10마이크로리터의 3M 아세트산나트륨, pH 5.5를 넣고 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 100% 에탄올 3부피를 첨가하여 RNA를 침전시키고 5초 동안 샘플을 와류로 회전시킵니다. 섭씨 20도에서 밤새 배양합니다.

다음날, 20, 000 x g에 4 섭씨 온도에 30 분 동안 표본을 원심 분리하고 상등액을 버리십시오. 그런 다음 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 70% 에탄올로 펠릿을 세척하고 원심분리를 반복합니다. 펠릿을 빼내지 않고 가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오.

그런 다음 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조시킵니다. 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물에 최종 농도 마이크로리터당 0.5마이크로그램으로 재현탁합니다. 발짝 프린팅 분석을 시작하려면 야생형 XIAP IRES RNA 및 그 돌연변이를 나타내는 각 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 15마이크로리터의 비뉴클레아제 처리된 토끼 망상적혈구 용해물을 추가합니다.

RNase 억제제, ATP 및 GMP-PNP를 각 튜브에 추가합니다. 섭씨 30도에서 5분 동안 배양합니다. 그 후, 각 튜브에 각 RNA를 1마이크로리터씩 추가하고 추가로 5분 동안 섭씨 30도에서 배양합니다.

잠복기 동안 DTT와 스페르미딘을 발자판 완충액에 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 22마이크로리터의 발자취 버퍼를 추가하고 섭씨 30도에서 3분 동안 배양합니다. 다음으로, 0.5 마이크로 리터의 IR 염료로 표시된 발자판 프라이머를 추가하고 10 분 동안 얼음에서 반응을 배양합니다.

그런 다음 2마이크로리터의 dNTP, 2마이크로리터의 마그네슘 아세테이트, 1마이크로리터의 조류 골수모세포증 바이러스 역전사효소를 추가합니다. 발자취 버퍼로 최종 부피를 50마이크로리터로 가져옵니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 45분 동안 프라이머 확장이 발생하도록 합니다.

발자판 반응에 마그네슘 아세테이트를 추가하는 것도 중요하며, 그렇지 않으면 역전사 효소가 최적으로 기능하지 않습니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물 200마이크로리터를 추가합니다. 250 마이크로 리터의 25 : 24 : 1 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올, pH 8.0을 첨가하여 cDNA 정제를 시작합니다.

5 초 동안 표본을 와동 치기 후에, 20, 3 분 동안 실내 온도에 000 x g에 표본을 원심 분리하십시오. 다음으로, DNA를 포함하는 수성상을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 100% 에탄올 3부피를 첨가하여 DNA와 와류를 5초 동안 침전시킵니다.

섭씨 20도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 20, 000 x g에 4 섭씨 온도에 30 분 동안 관을 원심 분리하고 상등액을 버리십시오. 다음, 얼음 차가운 70%ethanol의 500 마이크로리터를 가진 DNA 펠릿을 20, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 x g에 분리기 세척하십시오.

펠릿이 빠지지 않도록 주의하면서 가능한 한 상층액을 흡입하십시오. 그런 다음 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조시킵니다. DNA 펠릿을 6마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 용해시킵니다.

그런 다음 3마이크로리터의 포름아미드 로딩 염료를 추가합니다. 염기서열분석 키트를 사용하여 발지문 프라이머와 XIAP IRES RNA를 인코딩하는 DNA 구조체로 dideoxy 뉴클레오티드 염기서열분석 래더를 준비합니다. 그런 다음 각 염기서열분석 반응 6마이크로리터를 포름아미드 로딩 염료 3마이크로리터와 혼합합니다.

플레이트를 청소하고 조립한 후 젤을 붓고 빗을 삽입합니다. 겔의 중합 후 염기서열분석 장치를 조립하고 저장소를 1x TBE로 채웁니다. 그런 다음 섭씨 55도의 온도에 도달할 때까지 1500볼트에서 15분 동안 사전 실행합니다.

포름아미드 염료가 포함된 모든 샘플을 5분 동안 섭씨 85도로 가열합니다. 그런 다음 각 샘플의 1마이크로리터를 6% 폴리아크릴아미드 염기서열분석 겔에 넣고 1500볼트에서 8시간 동안 겔을 실행합니다. 마지막으로, 형광 기반 이미저로 실시간으로 밴드를 읽습니다.

이 방법은 RNA의 확인이 번역 시작 복합체 형성에 중요하다는 것을 보여줍니다. XIAP mRNA 리보솜 복합체의 역전사는 AUG의 다운스트림에서 17-19개의 뉴클레오티드를 형성하는 전형적인 발자국을 생성합니다. 5'PPT 돌연변이는 손상된 발가락 자국 형성을 보여줍니다.

그러나 5'cap으로 전사하면 개시 복합체 형성이 발생합니다. 마찬가지로, 3'PPT 돌연변이도 발자국 형성이 손상된 것을 보여줍니다. 그러나 5'cap을 사용한 전사는 개시 복합체 형성으로 이어집니다.

5'PPT와 3'PPT 돌연변이를 모두 가지고 있는 이중 PPT 돌연변이는 5'cap 없이 개시 복합체를 형성할 수 있습니다. 발자국 형성은 RRL과 GMP-PNP 및 Poly A 꼬리가 없는 경우 시작 코돈 돌연변이에 대해 크게 손상됩니다. CDNA 산물은 dideoxy nucleotide sequencing ladder와 비교됩니다.

인간 베타 글로빈 또는 HBB mRNA는 5'cap이 없을 때 발가락 자국을 보이지 않습니다. 그러나, 개시 복합체는 HBB의 뚜껑이 있는 5'UTR에 형성되어 AUG의 다운스트림에서 16-18개의 뉴클레오티드를 생성합니다. 이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행될 경우 체외 전사 템플릿 및 RNA 준비를 포함하여 3일 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 IRES의 야생형 또는 돌연변이 변이체의 2차 구조와 같은 추가 질문에 답하기 위해 구조적 프로빙과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 mRNA 번역 분야의 연구자들이 IRES 매개 in vitro 번역을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 포유류 mRNA의 발지문을 수행하는 방법과 번역 시작 복합체의 형성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

산-페놀, 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 및 아크릴아미드는 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 시약을 사용하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.