Name: 번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 학습하세요 포유류 mRNA의 번역 개시 복합체 형성을 토프린팅 분석으로 관찰하는 방법을. IRES 매개 번역 메커니즘과 리보솜 상호작용을 상세히 연구하여 유전자 발현 조절의 핵심 원리를 밝히는 데 활용할 수 있습니다.

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이 작품 혁신 존 R. 에반스 지도자 기금 (35017), 캠퍼스 앨버타 혁신 프로그램 및 앨버타 정부는 자연과학 및 공학 연구 위원회의 캐나다 발견 그랜트 (RGPIN-2017-05463), 캐나다 기초에 의해 투자 되었다 경제 개발 및 무역입니다.

참고: RNA는 ribonucleases (RNases)에 의해 저하에 매우 취약. RNA를 그대로 유지 하는 표준 예방 조치. 글러브를 자주 변경 합니다. 프로토콜의 모든 단계에서 필터링 된 피 펫 팁, nuclease 무료 plasticware 및 nuclease 없는 화학 물질을 사용 합니다. Nuclease 무료 사용 또는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)-모든 솔루션에 대 한 물 처리.
1입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>Toeprinting 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.6), 100 mM KOAc, 2.5 m m Mg(OAc)2, 5% (w/v) 자당, 2 m m dithiothreitol (DTT), 그리고 0.5 m m spermidine.<ol>
<li>DTT와 spermidine 반복된 freeze-thaw 주기를 피하기 위해-20 ° C에서 단일 사용 aliquots에 저장. 참고: DTT와 spermidine는 사용 하기 바로 전에 toeprinting 버퍼에 추가 되어야 합니다. DTT와 spermidine 솔루션-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	</ol>
</li>
	<li>85 m m 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP PNP)와 91 m m 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 aliquots를 준비 합니다. -20 ° c.에 aliquots 저장</li>
	<li>450 mL 6 %polyacrylamide-7 M 요소 젤 믹스의 준비: 40 %acrylamide:bis 67.5 mL-아크릴 (19:1), 요소, TBE (트리 스/borate/thylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)), x 5의 112.5 mL 및 물 120 mL의 189 g. 37 ° C 물 목욕 또는 감동과 뜨거운 접시에 온난 하 여는 요소를 분해. 필터링 솔루션 (예., 0.2 μ m 니트로 진공 필터). 참고: 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 한 달 이상. 주의: 아크릴 단위체는 피부를 통해 흡수 될 수 있는 neurotoxin입니다. 피부 접촉을 피하기 위해 상당한 주의 (즉., 장갑, 실험실 외 투를 착용 하 고 눈 보호). 으로 중 합을 100% 완료 진행 하지 않을 수 있습니다 polyacrylamide 또한 주의 처리 되어야 합니다.</li>
	<li>Formamide 로드 염료 준비: 95 %formamide, 18 mM EDTA, 0.025% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 0.025% (w/v) bromophenol 블루, 0.025% (w/v) 자일 렌 cyanol. -20 ° c.에 게</li>
	<li>10 pmol/μ의 작업 집중에 대 한 물 100 μ로 1 nmol 뇌관 (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' 끝-IRDye 800으로 표시)의 분해. 빛에서 보호 하에 단일 사용 aliquots (약 10 µ L),-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
</ol>2입니다. mRNA의 준비
<ol><li>적절 한 서식 파일에서 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 mRNA의 합성에 대 한 서식 파일 DNA 증폭 (즉., 게놈 DNA 또는 플라스 미드 DNA, 적절 한). 높은 충실도 제조업체의 지침에 따라 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 다음 반응 조건 (35 주기): 녹기, 98 ° C, 10 s; anneal, 53 ° C, 20 s; 확장, 72 ° C, 30 s. 참고: 앞으로 뇌관 (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) 통합 RNA 녹음 방송; 있도록 T7 발기인 순서 반전 뇌관 (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) 51 thymine 잔류물 베낀된 RNA에 대 한 폴 리 A 꼬리를 제공 하기 위해 포함 되어 있습니다. Note RNA에 생체 외에서 플라스 미드 DNA에서에서 복사할 수도 있습니다.</li>
	<li>체 외에 적절 한 전송 키트를 사용 하 여 IRES 포함 된 RNA 또는 DNA 템플렛에서 출장된 RNA를 고쳐 쓰다 제조업체의 지침을 따릅니다. 표준 20 μ 반응 볼륨에서 RNA 샘플을 준비 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 RNase 무료 DNase의 2 대와 새로 합성 RNA를 취급</li>
	<li>110 DNase 취급 RNA 희석 nuclease 무료 물 µ L 110 µ L 산 페 놀, 소용돌이 5 s와 3 분 동안 원심 분리기 실 온에서 20000 x g에 추가. 새로운 1.5 mL microfuge 관에 수성 단계의 100 µ L를 제거 3m 나트륨 아세테이트, 및 소용돌이 2 미 추가, 100% 에탄올, 소용돌이 5 s의 3 볼륨 10 µ L을 추가 하 고 하룻밤-20 ° C에서 RNA 침전.</li>
	<li>원심 > 삭제는 상쾌한 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g. 얼음 처럼 차가운 70% (v/v) 에탄올의 500 µ L와 펠 릿을 세척 하 고는 원심 분리를 반복. 많은 가능한 상쾌한으로 발음 하 고 5-10 분에는 펠 릿을 꺼내 려 하지 않도록 주의 대 한 펠 릿을 건조.</li>
	<li>Nuclease 무료 물 0.5 μ g/μ의 작업 농도를 적절 한 볼륨에는 RNA를 resuspend. 이-80 ° C에 저장 하거나 즉시 사용 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. Toeprinting 반응
<ol><li>토끼 1 μ (40 대) RNase 억제제, 1 µ L 91 mM ATP의 (최종 1.82 m m) 및 1.5 mL microfuge 관 85 mM GMP PNP (최종 1.7 m m)의 1 μ의 Reticulocyte Lysate (RRL, nuclease 치료 하지 않을)의 혼합 15 μ. 5 분 30 ° C에서 품 어. 참고:는 RRL 반복적인 동결 해빙을 피하기 위해 단일 사용에 대 한 aliquoted 이어야 한다. 중요 한 제어 RRL, 반전 녹음 방송 RNA의 이차 구조 때문의 자연 일시 중지를 명료 하 게 하기 위해 부족 한 반응입니다. Toeprinting 버퍼 RRL이이 컨트롤에 대 한 대체를 추가 합니다.</li>
	<li>RNA의 0.5 µ g (1 µ L)를 추가 하 고 5 분 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>Toeprinting 버퍼의 22 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>IRDye 표시 된 뇌관의 0.5 µ L (5 pmol)를 추가 하 고 10 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>2 µ L 25 mM dNTPs의 추가 (최종 농도: 1 m m), 2 µ L 100 mM Mg(OAc)2, 1 µ L의 조류 Myeloblastosis 바이러스 역전사 (AMV-RT)과 Toeprinting 버퍼의 3.5 µ L의. 마지막 볼륨은 50 μ.</li>
	<li>45 분 30 ° C에서 반응을 품 어.</li>
	<li>Nuclease 무료 물 200 µ L을 추가 하 고 즉시 25:24:1 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (pH 약 8.0)의 250 µ L를 추출. 소용돌이 5 s 하 고 실 온에서 3 분 20000 x g에서 원심 분리기. 새로운 1.5 mL microfuge 관에 수성 단계 제거 100% 에탄올, 소용돌이 5 s의 3 볼륨을 추가 하 고 하룻밤-20 ° C에서 침전.</li>
	<li>원심 > 삭제는 상쾌한 4 ° C에서 30 분 동안 20000 x g. 얼음 처럼 차가운 70% (v/v) 에탄올의 500 µ L로 DNA 펠 릿을 세척. 원심 > 20000 x g 4 ° c.에서 15 분 Aspirate 가능한 및 5-10 분에 대 한 펠 릿은 펠 릿을 꺼내 려 하지 않도록 주의 해야 건조 공기 만큼 표면에 뜨는.</li>
	<li>Nuclease 무료 물 6 μ에 펠 릿을 녹이 고 염료를 로드 하는 formamide의 3 μ를 추가.</li>
</ol>4. 연속 반응
<ol><li>2.1에서 DNA 템플렛 및 3.4 단계에서 IRDye 라는 뇌관을 사용 하 여 체인 출현으로 dideoxynucleotides (ddNTPs)를 사용 하 여 표준 연속 반응에 대 한. 적절 한 DNA 시퀀싱 장비를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.</li>
	<li>Formamide 로드 하는 염료의 3 μ와 각 연속 반응의 믹스 6 μ</li>
</ol>5입니다. 시퀀싱 하는 젤 전기 이동 법의 준비
참고:이 프로토콜 사용 하 여 형광 젤 기반 영상 고는 21 cm x 23cm x 0.2 m m 젤 하지만 필요한 경우 다른 시퀀서 또는 젤-크기, 적응 시킬 수 있다.
<ol><li>0.2 m m 간격으로 짧은 (23 × 25 cm) 및 긴 100% 에탄올 (30 × 25 cm) 유리 접시를 철저 하 게 청소. 건조 공기.</li>
	<li>6 %polyacrylamide-7 M 우 레 아 젤의 믹스 30 mL 200 μ 10% (w/v) 암모늄 persulfate (AP)의 혼합 및 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 μ. 젤, 거품을 피하기 위해 돌을 부 어 하 고 ' 상어 이빨 ' 젤 빗을 삽입 합니다. 실 온에서 1 h에 대 한 유해를 젤을 수 있습니다.</li>
	<li>시퀀싱 기구를 조립 하 고 1 저수지를 채울 x TBE.</li>
	<li>사전 실행 15 분 1500 V에서 55 ° C의 최적의 온도 달성 될 때까지.</li>
	<li>샘플/로드 염료 혼합 (3.9 또는 4.2 단계)에서 85 ° C 5 분 부하 1 μ 시퀀싱 젤에 대 한 열.</li>
	<li>1500 V 8 h에 젤을 실행 합니다. 기계는 실시간으로 밴드를 읽을 것 이다.</li>
	<li>분해 장치, 그리고 아크릴 아 미드 젤 실행 버퍼를 처분.</li>
</ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15803138">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+just+scanning%3A+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li>
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<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295(2014).</li>
<li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).</li>
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</ol>

저자 관심을가지고 아무 충돌-의-공개.

Toeprinting 직접 고도로 제어 된 상황에서 번역 개시 복합물의 대형을 지원 하기 위해의 RNA의 능력을 측정 하는 강력한 기술입니다. Toeprinting에 대 한 단순화 된이 프로토콜 설명 포유류 RNAs. 토끼 reticulocyte lysate (RRL) 리보솜, eIFs, 초기자의 편리한 원본으로 사용 되, tRNA와 IRES 트랜스-행동 요인 (ITAFs). 실험 선택의 그들의 RNA를 제공 하 고 또한 그들의 선택의 특정 공동 인자와 toeprinting 반응을 보충할 수 있다. 예를 들어, 번역 개시 단지 대 80 48S toeprints7의 형광 농도의 분포에 따라 분화 될 수 있습니다. 관찰 개시 복잡 한 사용 하는 구 아닌 뉴클레오티드의 종류에 따라 달라 집니다. 여기 논의 XIAP IRES 경우 GMP PNP 플러스 ATP 안정화 48S 전 개시 복합물, toeprint 메일 + 17≥ + 18 특징 > + 19. GMP PN...

으로 번역 가장 세포 에너지 소비, 그것은 말 번역은 단단히 규제1. 반대로, 번역의 dysregulation-그리고 단백질 출력에 따른 변경-암1,2등, 스트레스 반응과 질병의 상태에서 자주 관찰 됩니다. 변환 제어의 주요 장점은 속도는 셀 다양 한 자극3에 대응 하기 위해 그들의 단백질 출력 변경할 수입니다. 번역 규정 따라서 세포 생존과 죽음1,2,3에 영향을 미칠 수 있는 중요 한 메커니즘을 나타냅니다. 번역의 단계의 개시는 대부분 높은 규제 하 고 복잡 한3입니다. 짧게, 가장 진 핵 mRNAs 포함 5' m7G 모자는 거의 항상 그들의 번역에 대 한 필수. 모자-종속 개시 진 핵 개시 요인 eIF4E, eIF4A, 및 eIF4G 필요 (모자 인식 복합)는 mRNA의 5' 끝에 상호 작용. 43S preinitiation 리보솜, eIF2 바인딩된 초기자를 포함 하는 mRNA를 통해 eIF3와 eIF4G의 상호 작용의 5' 끝에 tRNA와 eIF3, 모집. 복잡 한 괴롭힘 스캔 mRNA, eIF4A에 의해도 왔 생각 된다 (RNA helicase) 시작 codon (8 월)는 때까지. 복잡 한 48S 개시 이후에 형성 그리고 tRNA는 리보솜의 P 사이트에 전달 됩니다. 마지막으로, 60와 40 리보솜 소 단위 번역 신장1,,34다음 80 개시, 복잡 한 형태로 결합 된다. 반면, 내부 리보솜 입장 위치 (IRESes) 개시 코 돈3에 직접 40 ribosomal 소 단위를 모집 하 여 5' 모자에 대 한 요구 사항을 무시할. 생리 적 스트레스 상태 감소 글로벌 mRNA 번역 키 일반 진 핵 개시 요인 (eIFs)의 수정으로 인. 그러나, 종종 스트레스 대응 단백질을 인코딩하는 특정 mRNAs의 선택적 번역 비 정식 번역 개시 메커니즘을 사용 하 고 비 정식 번역 개시의 dysregulation 암 같은 질병 상태에 연루 1 , 2. 세포 IRESes 등 신중 RNA 규제 요소 같은 mRNAs2,3의 번역에 대 한 허용.
변환 제어의 1 개의 특히 재미 있는 양상은 특정된 mRNA의 비 정식 번역 대 정식의 메커니즘을 이해 하는 것입니다. Toeprinting 특정 RNAs 체 외의 번역 개시의 상세한 기계 연구를 허용 하는 기술입니다. Toeprinting의 전반적인 목표는 시퀀스, 구조 요소 또는 액세서리 결정 하기 위해 다양 한 조건에서 리보솜으로 복잡 한 번역 개시의 형성을 nucleate 관심의 RNA의 능력을 평가 하는 요소는 효율적인 번역 개시에 대 한 필요 합니다. 예를 들어, 리보솜 모집 5' 캡의 부재에 방해 수도 있습니다 하지만 한 IRES의 존재에 의해 자극.
체 외에서 하는 것입니다 기술의 원리 개시 단지 형태로, 그리고 반전 녹음 수 있도록 변환 컴포넌트 (또는 순화 된 구성 요소)을 포함 하는 세포 추출의 존재 그것을 품 어 관심, RNA 녹음 특정 뇌관는 RNA 안정적인 RNA 리보솜 단지 반전 녹음 방송에 리보솜의 소위 'toeprint'5,,67의 3' 가장자리에 발생 합니다.
이 프로토콜, ribosomal 소 단위, eIFs, tRNAs, 및 IRES 트랜스-행동 요인 (ITAFs)는 편리 하 게 토끼 reticulocyte lysate (RRL)에 의해 기여. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 붙일 표시 된 뇌관 및 형광 젤 기반 영상, 보다는 오히려 방사선된 뇌관의 사용 이다. 이 등 radiolabeling 뇌관로 젤을 건조 강화 화면에 노출 하는 추가 단계를 제거 합니다. 형광 밴드는 큰 해상도 대 한 허용 젤 실행으로 실시간으로 기록 됩니다. 비록 출장된 mRNAs 또한이 기술을8에 의해 분석 될 수 있다 apoptosis 단백질 (XIAP) IRES RNA의 세척제 X 연결 억제제 여기, 예를 들어 사용 됩니다.
세포 lysates의 번역 과정의 최종 출력을 측정, 서쪽 분석, 달리 toeprinting은 번역 개시는 RNA에 복잡 한 대형을 측정 하기 위해 생체 외에서 접근 이다. 이 reductionist 접근 기판 또는 번역 개시 통제 요인의 매우 상세한 연구에 대 한 수 있습니다 (예., 출장 또는 취소 출장 mRNA, IRES 구조, 존재 또는 부재 특정 단백질 요인의, 폴 리 A 꼬리의 등)입니다. 따라서, toeprinting 번역8 다른 모드 또는 mRNA, 같은 구조 IRESes, 단백질 합성9,10의 효과 연구에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DEPC (디 에틸 피로 카보네이트)</td> <td>시그마</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>트리스베이스, 초순수</td><td>JT 베이커</td><td>4109-01</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (칼륨 아세테이트)</td> <td>바이오 베이직</td><td>PB0438</td><td></td></tr><tr><td>mg (OAc) 2 (마그네슘 아세테이트 테트라 하이드레이트)</td> <td>바이오 베이직</td><td>MB0326</td><td></td></tr><tr><td>자당, 분자 생물학 학년</td><td>Calbiochem</td><td>573113-1KG</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>시그마</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PNP (구아노신 5 &prime; -[&beta;,&gamma; -imido] 트리 포스페이트 트리 소듐 염 수화물) 0.1 M 용액</td><td>시그마</td><td>G0635</td><td></td></tr><tr><td>ATP (아데노신 5 &프라임; -트리 포스페이트) 디 소듐 염, 100 mM 용액</td><td>시그마</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>19 : 1 아크릴 아미드 : 비스- 아크릴 아미드, 40 %</td> <td>바이오 베이직</td><td>A0006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Bio Basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>500mL 병 상단 여과 장치, 0.2 &micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.101</td><td></td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>시그마</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (디 소듐 염, 이수화 물)</td> <td>바이오 베이직</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>바이오 베이직</td><td>SB0485</td><td></td></tr><tr><td>브로모 페놀 블루</td><td>바이오 베이직</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>자일렌 시아놀 FF</td><td>바이오 베이직</td><td>XB0005</td><td></td></tr><tr><td>MEGA짧은 스크립트 T7 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>산성 페놀 : 클로로포름 (5 : 1)</td> <td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>25:24 : 1 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>토끼 망상 적혈구 용해물 (RRL). 뉴클레아제 치료를 해서는 안 됩니다.</td><td>Green Hectares, 미국</td><td></td><td>Green Hectares에 연락하여 1:1 RRL:water</td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor (40 U/&micro; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>E00382</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Invitrogen</td><td>56172, 56173, 56174, 56175</td><td>각각 25 mM의 재고에 대해 동일한 부품을 혼합합니다.</td></tr><tr><td>AMV-RT, 10 U/&마이크로; L</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Sequenase 버전 2.0 DNA 염기서열분석 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>707701KT</td><td></td></tr><tr><td>모델 4200 IR2 DNA 분석기</td><td>LI-COR</td><td></td><td>제품이 단종되었습니다</td></tr><tr><td>APS (Ammonium Persulfate)</td><td>Bio Basic</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Basic</td><td>TB0508</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>New 잉글랜드 Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>터보 Dnase</td><td>써모 피셔</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

번역 개시 포유류 mrnas에 복잡 한 대형의 toeprinting 분석

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

번역 개시 단백질 합성의 속도 제한 단계 이며, 세포 단백질 출력을 조절 하는 핵심을 나타냅니다. 단백질 합성의 세포질 긴장 응답, 열쇠 이며 dysregulation 암 등 많은 질병 상태에 중앙 이다. 예를 들어, 세포 스트레스 글로벌 번역의 억제를 약하게 모자 종속 개시 리드, 비록 특정 스트레스 응답 단백질에 모자 독립적인 방식으로 선택적으로 변환 됩니다. 신중한 RNA 규제 등의 요소, 세포 내부 리보솜 입장 위치 (IRESes),이 특정 한 mRNAs의 번역에 대 한 수 있습니다. 이러한 mRNAs의 식별 및 그들의 규제 메커니즘의 특성 분자 생물학에는 핵심 영역 되었습니다. Toeprinting 번역 개시에 관련 된 RNA 구조와 기능 연구에 대 한 방법입니다. Toeprinting의 목표는 생체 외에서 의 능력을 평가 하는 시퀀스, 구조 요소 또는 액세서리 요인 리보솜에 참여를 결정 하기 위해 다양 한 조건에서 리보솜과 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 RNA 베 껴 바인딩-효율적인 번역 개시에 대 한 사전 커서. 서쪽 분석 및 polysome 프로 파일링와 같은 다른 기술 함께 toeprinting 번역 개시의 규칙에 대 한 메커니즘의 강력한 특성에 대 한 수 있습니다.

우리는 이전 모자 독립적인 번역 개시 생체 외에서8,10을 지원 하기 위해 XIAP IRES의 능력을 설명 했습니다. Toeprinting 복잡 한 XIAP IRES 개시의 기계적 세부가 핵심 기술 했다. 인코딩 XIAP IRES (그림 1A)를 포함 하는 mRNA는 DNA 구조에 생체 외에서 복사할 및 toeprinting 분석을 받게 했다. 여기 사용 IRES XIAP mRNA의 돌연변이 변종 그림 1B에 표시 됩니다. 반전 녹음 방송 XIAP mRNA 리보솜 복잡 한의 전형적인 toeprints + 17 + 19 나왔고 nt 하류 (<strong class="xfi...

Toeprinting 목표 체 외에서 의 능력을 측정 하는 다양 한 조건에서 리보솜과 양식 번역 개시 복합물에 RNA를 복사할 수 있습니다. 이 프로토콜 toeprinting 포유류 RNA에 대 한 메서드를 설명 하 고 모자-종속 및 IRES 기반 번역 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

이 발자각 분석의 전반적인 목표는 포유류 mRNA에서 번역 시작 복합체 형성을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 IRES 매개 번역 시작과 같은 mRNA 번역 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 mRNA에서 번역 시작 복합체 형성에 대한 자세한 분석을 수행할 수 있다는 것입니다.전사 반응을 조합하여 XIAP IRES RNA 또는 그 돌연변이를 인코딩하는 PCR 증폭 DNA 템플릿에서 RNA를 전사합니다. 다음으로, RNase의 각 20 마이크로리터 반응에 대한 DNA 템플릿을 제거하기 위해 두 단위의 RNase-free DNase를 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 DNase 처리된 RNA를 뉴클레아제가 없는 물로 최종 부피 110마이크로리터로 희석합니다. 다음으로, 110 마이크로 리터의 산 페놀을 첨가하여 RNA 정제를 시작합니다. 20, 000 x g에 20, 실내 온도에 3 분 동안 원심 분리기를 위한 5 초 및 원심분리기를 위한 와류.페놀을 추출하기 전에 RNA 또는 CDNA를 희석하는 것이 중요합니다. 부피가 너무 낮으면 수성상을 물리적으로 회수하기 어렵고 최종 수율이 낮아집니다. 그런 다음 RNA 함유 수성상 100마이크로리터를 새 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.10마이크로리터의 3M 아세트산나트륨, pH 5.5를 넣고 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 100% 에탄올 3부피를 첨가하여 RNA를 침전시키고 5초 동안 샘플을 와류로 회전시킵니다. 섭씨 20도에서 밤새 배양합니다.다음날, 20, 000 x g에 4 섭씨 온도에 30 분 동안 표본을 원심 분리하고 상등액을 버리십시오. 그런 다음 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 70% 에탄올로 펠릿을 세척하고 원심분리를 반복합니다. 펠릿을 빼내지 않고 가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오.그런 다음 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조시킵니다. 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물에 최종 농도 마이크로리터당 0.5마이크로그램으로 재현탁합니다. 발짝 프린팅 분석을 시작하려면 야생형 XIAP IRES RNA 및 그 돌연변이를 나타내는 각 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 15마이크로리터의 비뉴클레아제 처리된 토끼 망상적혈구 용해물을 추가합니다.RNase 억제제, ATP 및 GMP-PNP를 각 튜브에 추가합니다. 섭씨 30도에서 5분 동안 배양합니다. 그 후, 각 튜브에 각 RNA를 1마이크로리터씩 추가하고 추가로 5분 동안 섭씨 30도에서 배양합니다.잠복기 동안 DTT와 스페르미딘을 발자판 완충액에 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 22마이크로리터의 발자취 버퍼를 추가하고 섭씨 30도에서 3분 동안 배양합니다. 다음으로, 0.5 마이크로 리터의 IR 염료로 표시된 발자판 프라이머를 추가하고 10 분 동안 얼음에서 반응을 배양합니다.그런 다음 2마이크로리터의 dNTP, 2마이크로리터의 마그네슘 아세테이트, 1마이크로리터의 조류 골수모세포증 바이러스 역전사효소를 추가합니다. 발자취 버퍼로 최종 부피를 50마이크로리터로 가져옵니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 45분 동안 프라이머 확장이 발생하도록 합니다.발자판 반응에 마그네슘 아세테이트를 추가하는 것도 중요하며, 그렇지 않으면 역전사 효소가 최적으로 기능하지 않습니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물 200마이크로리터를 추가합니다. 250 마이크로 리터의 25 : 24 : 1 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올, pH 8.0을 첨가하여 cDNA 정제를 시작합니다.5 초 동안 표본을 와동 치기 후에, 20, 3 분 동안 실내 온도에 000 x g에 표본을 원심 분리하십시오. 다음으로, DNA를 포함하는 수성상을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 100% 에탄올 3부피를 첨가하여 DNA와 와류를 5초 동안 침전시킵니다.섭씨 20도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 20, 000 x g에 4 섭씨 온도에 30 분 동안 관을 원심 분리하고 상등액을 버리십시오. 다음, 얼음 차가운 70%ethanol의 500 마이크로리터를 가진 DNA 펠릿을 20, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 x g에 분리기 세척하십시오.펠릿이 빠지지 않도록 주의하면서 가능한 한 상층액을 흡입하십시오. 그런 다음 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조시킵니다. DNA 펠릿을 6마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 용해시킵니다.그런 다음 3마이크로리터의 포름아미드 로딩 염료를 추가합니다. 염기서열분석 키트를 사용하여 발지문 프라이머와 XIAP IRES RNA를 인코딩하는 DNA 구조체로 dideoxy 뉴클레오티드 염기서열분석 래더를 준비합니다. 그런 다음 각 염기서열분석 반응 6마이크로리터를 포름아미드 로딩 염료 3마이크로리터와 혼합합니다.플레이트를 청소하고 조립한 후 젤을 붓고 빗을 삽입합니다. 겔의 중합 후 염기서열분석 장치를 조립하고 저장소를 1x TBE로 채웁니다. 그런 다음 섭씨 55도의 온도에 도달할 때까지 1500볼트에서 15분 동안 사전 실행합니다.포름아미드 염료가 포함된 모든 샘플을 5분 동안 섭씨 85도로 가열합니다. 그런 다음 각 샘플의 1마이크로리터를 6% 폴리아크릴아미드 염기서열분석 겔에 넣고 1500볼트에서 8시간 동안 겔을 실행합니다. 마지막으로, 형광 기반 이미저로 실시간으로 밴드를 읽습니다.이 방법은 RNA의 확인이 번역 시작 복합체 형성에 중요하다는 것을 보여줍니다. XIAP mRNA 리보솜 복합체의 역전사는 AUG의 다운스트림에서 17-19개의 뉴클레오티드를 형성하는 전형적인 발자국을 생성합니다. 5'PPT 돌연변이는 손상된 발가락 자국 형성을 보여줍니다.그러나 5'cap으로 전사하면 개시 복합체 형성이 발생합니다. 마찬가지로, 3'PPT 돌연변이도 발자국 형성이 손상된 것을 보여줍니다. 그러나 5'cap을 사용한 전사는 개시 복합체 형성으로 이어집니다.5'PPT와 3'PPT 돌연변이를 모두 가지고 있는 이중 PPT 돌연변이는 5'cap 없이 개시 복합체를 형성할 수 있습니다. 발자국 형성은 RRL과 GMP-PNP 및 Poly A 꼬리가 없는 경우 시작 코돈 돌연변이에 대해 크게 손상됩니다. CDNA 산물은 dideoxy nucleotide sequencing ladder와 비교됩니다.인간 베타 글로빈 또는 HBB mRNA는 5'cap이 없을 때 발가락 자국을 보이지 않습니다. 그러나, 개시 복합체는 HBB의 뚜껑이 있는 5'UTR에 형성되어 AUG의 다운스트림에서 16-18개의 뉴클레오티드를 생성합니다. 이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행될 경우 체외 전사 템플릿 및 RNA 준비를 포함하여 3일 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라 IRES의 야생형 또는 돌연변이 변이체의 2차 구조와 같은 추가 질문에 답하기 위해 구조적 프로빙과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 mRNA 번역 분야의 연구자들이 IRES 매개 in vitro 번역을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 포유류 mRNA의 발지문을 수행하는 방법과 번역 시작 복합체의 형성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.산-페놀, 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 및 아크릴아미드는 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 시약을 사용하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.

toeprinting-analysis-translation-initiation-complex-formation-on

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다.

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

이 프로토콜은 시험관 내 성숙 시 단일 난초에서 mRNA 번역의 조절을 연구하기 위해 기자 분석에 설명합니다.

단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

학습하세요 포유류 mRNA의 번역 개시 복합체 형성을 토프린팅 분석으로 관찰하는 방법을. IRES 매개 번역 메커니즘과 리보솜 상호작용을 상세히 연구하여 유전자 발현 조절의 핵심 원리를 밝히는 데 활용할 수 있습니다.

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

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