CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

이 수술 절차의 전반적인 목표는 전립선암 유도를 위한 CRISPR Cas9 가이드의 바이러스 전달을 통해 쥐 전립선의 유전자 발현을 변경하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 환경에서 새로운 유전자를 분석하고 검증하는 것과 관련하여 전립선암 생물학의 새로운 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 시나리오에서 볼 수 있는 전립선 세포의 하위 집합만 표적으로 삼아 여러 유전자의 신속한 유전자 편집이 가능하다는 것입니다.

이 시술을 처음 접하는 사람은 장기 크기와 성공적인 수술 완료에 필요한 정밀도 때문에 처음에는 어려움을 겪을 수 있습니다. 총 5 밀리리터의 마취제를 신선하게 준비하려면 메데토미딘 염산염 1 밀리리터 당 1 밀리리터 0.15 밀리리터, 미다 졸람 5 밀리리터 0.4 밀리리터, 밀리리터 부토르페놀 10 밀리리터 0.25 밀리리터를 혼합한다. 그런 다음 멸균 식염수 4.2ml를 넣으십시오.

수술 후 메데토미딘 염산염의 효과를 되돌리려면 0.1밀리리터의 아티파메졸 5mg과 4.9밀리리터의 멸균 식염수를 마취 해독제로 혼합하십시오. 적절한 소독 및 살균을 통해 무균 수술 환경을 준비하고 수술 기구를 고압증기멸균합니다. 전립선에 바이러스를 전달하기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 8주 된 수컷 마우스를 마취한 후; 근육 이완, 페달 철수 및 만질 수 있는 반사를 평가하여 마취 깊이를 검사합니다.

반사 신경의 상실이 관찰되면 동물의 하복부를 면도하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 안구건조증으로 인한 실명을 방지하기 위해 수의학 안과 연고로 동물의 눈을 조심스럽게 덮습니다. 그런 다음 에탄올 70%와 프로비돈 요오드 10%를 사용하여 면도한 복부를 닦아 수술 부위를 소독합니다.

다음으로 멸균 수술용 가위를 사용하여 하복부 정중선에서 약 1cm의 수직 피부 절개를 만듭니다. 그런 다음 미세한 점잣집게로 복막을 들어 올려 아래에 있는 장기가 손상되지 않도록 합니다. 그리고 수술용 가위를 사용하여 복막을 8mm 이하로 조심스럽게 절개합니다. 지방 조직을 부드럽게 옆으로 움직여 정낭을 드러냅니다.

그런 다음 고리 겸자를 사용하여 전립선 전립선을 식별할 수 있을 때까지 정낭을 조심스럽게 들어 올립니다. 이제 0.5 밀리리터 인슐린 주사기와 30 게이지 8 밀리미터 바늘이 있습니다. 총 30마이크로리터의 바이러스 용액을 전립선 전방 상피에 주입합니다. 누출을 최소화하고 유체가 조직 내에서 흡수되어 작은 기포를 형성하도록 합니다.

그런 다음 정낭을 복강에 다시 놓습니다. 액체가 작은 거품 형태로 조직 내에 흡수되고 누출되지 않도록 하려면 정낭과 평행하게 전방 전립선엽의 모양을 따라 주입해야 합니다. 테이퍼 포인트 바늘과 13mm 3/8 원으로 6-0 흡수성 봉합사의 2-3개의 간단한 중단 스티치로 회음부를 봉합합니다.

그런 다음 복막 손상을 방지하기 위해 집게로 피부를 들어 올립니다. 6.5mm 클립으로 3개의 멸균 4.8 클립으로 피부를 스테이플링합니다. 수술 후 더 나은 회복을 위해 멸균 1ml 주사기와 27 게이지 x 1/2인치 바늘을 사용하여 복강 내 주사로 체중 1g당 0.1ml의 용량으로 마취 해독제를 투여합니다. 그런 다음 동물을 조심스럽게 우리에 다시 넣으십시오.

완전히 회복될 때까지 저체온증을 방지하기 위해 시술 후 1시간 동안 케이지를 가열 패드에 보관하십시오. 동물은 주사 후 몇 분 후에 깨어나야 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 매일 동물을 계속 모니터링하고 치료하십시오.

그리고 상처가 봉합되면 피부 클립을 제거합니다. 쥐 전립선으로의 바이러스 전달을 평가하기 위해 수술 3개월 후 샘플을 분석했습니다. 여기에서 보인 바와 같이, 이 연구에 사용된 마우스는 바이러스에 의해 발현된 Cree 단백질에 노출된 세포에서 GFP를 발현했습니다.

GFP 신호는 전립선 상피에서 Cree 활성을 보여주지만 CRISPR 가이드에 의해 유전자 편집이 유도되었는지 여부는 보여주지 않습니다. 이러한 면역조직화학 절편은 pAKT 발현이 높은 세포의 초점 영역을 식별하여 P10의 손실을 나타냅니다. 이 패널에서 pAKT 및 GFP에 대한 염색은 이중 양성 세포를 식별했으며, 이는 아데노 관련 바이러스에 의한 전립선 세포의 변형을 확인했습니다.

전반적으로 이러한 결과는 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 마우스와 아데노 관련 바이러스를 사용하여 전립선 상피에서 생체 내에서 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 수행할 수 있음을 보여줍니다. 일단 숙달되면 절차는 15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 전립선암 분야의 연구에서 여러 유전자를 in vivo에서 동시에 검사할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 쥐 전립선에 기질을 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일부 바이러스로 작업할 때 매우 위험할 수 있으므로 이러한 절차를 수행할 때 항상 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.