Name: CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas9 바이러스 전달을 이용한 쥐 전립선 유전자 편집 방법입니다. 이 기술은 전립선암 연구를 위한 생체 내 유전자 기능 분석과 다중 유전자 동시 편집을 가능하게 합니다.

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미스터 덴마크 암 협회 (R146-A9394-16-S2)에서 친목에 의해 투자 되었다. MFB와 시가 AUFF 노바 (AUFF-E-2015-FLS-9-8)에 의해 투자 되었다. 미스터와 MFB 공동 대학원, 건강, AU에 의해 투자 되었다. E.F.W. 실험실은 경제 (SAF2015-70857, ERDF-유럽 연합에 의해 공동 투자)와 그랜트 (741888-과학 수사 대-재미) 고급 한 ERC의 스페인 정부에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Liliana Fajardo Mellor (유전자, 개발 및 질병; 감사 하겠습니다. 국립 암 연구 센터) 원고의 중요 한 독서에 대 한.

이 프로토콜에는 실험실 쥐에서 수술을 포함 한다. 모든 동물 실험을 개별적으로 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 될 해야 합니다. 동물 복구 및 생존에 접근을 기반으로, 모든 시간에 적절 한 마 취, 통증 관리, 무 균 수술 환경 확인 합니다. 가 열 패드를 사용 하 여 수술 및 마 취에서 회복까지 저체온증을 방지 하기 위해.
1. 시작 시 고려 사항
<ol><li>사용 하는 바이러스에 따라 다른 titer 요구 사항이 적용 될 수 있습니다; 바이러스를 따라 희석. 참고:이 예제에서는 PBS에 희석 한 Adeno 관련 바이러스 titer 1 x 1012 IU/mL에 주입 됩니다. 바이러스 serotype 9 있으며 가이드 RNA Pten 를 유비퀴틴 promotor (그림 1) 아래 Cre 단백질의 표현을 포함 합니다. Pten 의 손실 증가 pAKT 전립선 상피13의 확산.</li>
	<li>수술의 때에 8 주의 나이에 남성 마우스를 사용 하 여 적절 한 전립선 개발 되도록. 참고:이 실험에서 쥐 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쫓 고 마우스 C57BL/6J 배경12 (그림 1)에 있습니다.</li>
	<li>갓 전신 믹스를 준비 하 고 가능 하면 멸 균 유지. 참고: 복구를 위해 더 나은 동물 수술 후, 마 취 해독 제는 좋습니다.<ol>
<li>5 mL 마 취의 전체 볼륨, 혼합 준비 0.15 mL medetomidine 염 산 염 (1mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL), 및 0.25 mL butorphanol (10mg/mL) 4.2 mL와 멸 균 식 염 수 물 한다. 참고: 흡입 가능 isoflurane 등 대체 마 취 방법, 기관 동물 관리 지침에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>Medetomidine 염 수술 후의 효과를, 믹스 0.1 mL atipamezole (5 mg/mL) 4.9 mL와 멸 균 식 염 수 물.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 소독과 멸 균으로 무 균 수술 환경을 준비 합니다. 압력솥 사용 하기 전에 수술 악기입니다.</li>
</ol>2. 바이러스-배달 Murine 전립선에
<ol><li>살 균 1 mL 주사기와 바늘 27G x ½"복 주사 동물을 anesthetize. 0.01 mL/g 몸 무게의 마 취 복용량을 사용 합니다. 절차는 30 분 이상 지속, 유지 마 취 주입 하 여 1/3는 시작 복용량은 매 30 분.</li>
	<li>근육 이완, 페달 철수, 및 종을 반사를 평가 하 여 마 취 깊이 검사 합니다. 반사의 손실, 관찰 하는 경우는 동물의 아랫 면도.</li>
	<li>조심 스럽게 멸 균 면봉을 사용 하 여 각 막 반사의 부족으로 인해 실명을 방지 하기 위해 수의 안과 연 고와 동물의 눈을 커버.</li>
	<li>70% 에탄올과 10 %povidone 요오드 소독 외과 영역을 면도 복 부를 닦아. 주변으로 외과 영역의 중앙에서 외과 영역을 문질러.</li>
	<li>무 균 수술가 위를 사용 하 여 약 1 ㎝의 낮은 복 부 중간에 수직 피부 절 개를 수행 합니다.</li>
	<li>리프트 아래 누워 장기 손상을 방지 하기 위해 좋은 포인트 집게를 사용 하 여 복 막. 신중 하 게 < 8 m m 절 개 통해 복 막 수술가 위를 사용 하 여 확인 합니다. 참고: 인간, 달리 쥐의 전립선 4 개의 별도 돌출부를 구성. 앞쪽 엽 정액 소포에 첨부 됩니다.</li>
	<li>부드럽게 정액 소포를 밝히기 지방 조직 옆으로 이동 합니다. 조심 스럽게 들어올려 링 집게를 사용 하 여 앞쪽 전립선 될 때까지 정액 소포 식별 (그림 1).</li>
	<li>30G x 8 m m 바늘으로 0.5 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 앞쪽 전립선 상피에서 30 µ L 바이러스 (3 x 1010 바이러스 성 입자) 솔루션의 전체 볼륨을 주입. 누설을 최소화 하 고 액체는 작은 거품을 형성 하는 조직 내에서 흡수 합니다. 복 부 구멍에 다시 정액 소포를 놓습니다.</li>
	<li>2-3 13 m m, 3/8 원와 테이퍼 포인트 바늘 6-0 흡수 봉합을 사용 하 여 간단한 중단된 바늘으로 복을 봉합.</li>
	<li>3 살 균 4.8 x 6.5 m m 클립 복 막의 손상을 방지 하려면 집게와 함께 피부 리프팅 피부를 주식.</li>
	<li>더 나은 복구에 대 한 살 균 1 mL 주사기와 바늘 27G x ½ "를 사용 하 여 복 주입 하 여 0.01 mL/g 몸 무게의 복용량에서 마 취 해독 제를 적용 합니다. 신중 하 게 그것의 감 금에 있는 동물 뒤 장소.</li>
</ol>3. 수술 후 절차
<ol><li>1 시간에 대 한 난방 패드에 완전히 복구 될 때까지 저체온증을 방지 하기 위해 수술 후 수술 마우스 케이지를 유지. 해독 제를 적용 하는 경우 동물 이어야 한다 깨어 주사 후 몇 분입니다.</li>
	<li>매일 적절 한 상처 치유와 통증 표시에 대 한 동물을 모니터링 합니다. 필요한 경우, 기관 동물 관리 지침에 따라 추가 진통제를 관리 합니다.</li>
	<li>4-5 일 후, 상처를 닫으면 피부 클립을 제거 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19937345">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li>
<li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+JUNB%2FAP-1+promotes+invasive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy%2C+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
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<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li>
<li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+prostate%3A+an+historical+survey+of+divergent+views%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 바이러스 주입에 의해 murine 전립선의 앞쪽 엽에 유전자 발현을 변경 하는 방법에 설명 하 고 전립선 암 (그림 2)에 대 한 강력한 새로운 마우스 모델을 만드는 우리. 아 데 노 바이러스의 성공적인 관리 Leow 그 외 여러분 20058에 의해 처음으로 설명. 우리는 이전 어떻게 Cre recombinase 단백질에 대 한 코딩 하는 아 데 노비 루스 조직 관련 삭제 9 (그림 2D)에 대 한 Cre 대립 유전자의 시간이 교차 사육을 바꿀 수 있습니다 나타났습니다. 바이러스 감염 몇 셀9, 이후이 모델 클론 확장14,15 의 인간의 시나리오를 모방 하며 암...

검색 및 전립선 암 치료는 지난 10 년간 크게 개선 됩니다. 아직도, 전립선 암 발생률은 증가, 수명에 따라. 약 1.1 백만 새로운 경우 전세계, 그것 남자 1에 암 관련 된 죽음의 일반적인 원인 중 하나입니다. 전립선 암은 그 개발에서 속도가 느린 하지만 암 고급 전이성 상태로 진행, 예 후 불량-제한 된 치료 옵션. 지금까지 몇 가지 유전자만이 암에 일반적인 드라이버 확인 되었습니다 그리고 그것의 및 multifocality 방해 biomarkers 및 대상 질병 드라이버2,3의 탐지.
클래식 기법의 생성 GEMMs는 종종 그들의 복잡성, 적시 비용, 및 비용에 의해 손상 됩니다. 조건부 녹아웃 모델 배아 치 생식4에서 비활성화 하는 경우에 발생 하는 전립선 암 후보 유전자 연구에 널리 사용 되어 왔습니다. 가장 일반적인 모델 수정된 Probasin5 중 하나에 의해 구동 전립선 특정 Cre recombinase 또는 PSA6 발기인 추가 교차 사육으로는 GEMM에 통합을 포함 한다. 이 모델에서 대부분 전립선 상피 세포의 증식을 생성 하는 동물의 요로 기능7저하 될 수 있습니다 전체 기관에 관심사의 유전자를 대상 것입니다.
Murine 전립선의 앞쪽 엽에 주입 하 여 Cre 단백질의 바이러스 배달만 몇 셀8을 대상으로 하 여이 문제를 해결할 수 있습니다. 고려 실험실 기술 필수 구성 요소, 전문성, 그리고 목표, 방법 혜택 가능한 변이의 광범위 한 범위에서. 아 데 노비 루스 JunB 와 Pten9 또는 Lentivirus Pten 및 Trp5310 타겟팅 타겟팅을 활용 하 여 성공적인 접근 다른 표시 되었습니다. 바이러스 성 구조 나는 GEMM transgenes luciferase, 등을 추가 또한 생물 발광 영상11통해 질병 진행의 비-침략 적 모니터링 활성화 됩니다.
게놈 편집 CRISPR/Cas9 기술을 기반으로 새롭고 빠른 기회를 체세포 녹아웃12의 빠른 생성을 통해 암 연구를 보여준다. 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)의 바이러스 배달 murine 전립선의 앞쪽 엽 감독 전립선 암의 순수 더 관련 모델을 설정 합니다. 이 방법으로 단일 셀 선택한 돌연변이 나르는 확장 및 침략 수 있는 클론을 형성할 수 있다. 또한, 여러 대상 유전자에 대 한 가이드 RNAs의 사용 다른 유전자에 변경 셀 클론을 생성 합니다. 이 각 유전자 변경 또는 epistatic 메커니즘의 중요성을 계시 할 수 있다 암 진행에 종양이 고 자연 선택의 압력을 허용할 것 이다.
여기 우리는 유전자 발현의 변경 murine 전립선에 바이러스 성 입자를 전달 하는 방법을 제시. 작은 복 부 절 개 하 여 murine 앞쪽 전립선 엽 노출 하 고 바이러스 성 입자는 엽에 주입 됩니다. 5 일 수술 후, 수술 클립은 피부에서 제거 될 수 있습니다 그리고 전립선 암은 8 주 후에서 분석 될 수 있다. 전반적으로, 이것은 마우스를 타협 하지 않고 개발에 더 큰 종양 하는 마우스에 작은 영향을 신속 하 고 비용 효율적인 절차.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml U-100 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>324825</td><td>바이러스 주입용</td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD</td><td>300013</td><td>마취 주입용</td></tr><tr><td>30 G 1/2' ' 바늘</td><td>BD</td><td>304000</td><td>마취 주사</td></tr><tr><td>6-0 Polysorb 봉합</td>사 <td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>복막을 닫는</td></tr> 일회용 <tr><td>멸균 수술 드레이프</td><td>여러 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>여러 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pad</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>트리밍 </td><td>복부를 면도하는</td>기계 <td>Aesculap</td><td>GT415</td></tr><tr><td>Dumont 집게</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey 마이크로 바늘 홀더</td><td>F.S.T</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>홍채 가위</td><td>F.S.T</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>좁은 패턴 집게</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>링 집게</td><td>F.S.T</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>상처 클립 시스템 핸들 포함</td><td>피부 상처</td>클립 시스템 리무버 <td>F.S.T</td><td>12030-01</td></tr><tr><td>상처 클립 시스템 리무버</td><td>F.S.T</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>다른 모델이 사용되었습니다</td></tr> <tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>동물시설로부터 수득</td></tr>된 <tr>동물<td>시설로부터 수득된</td><td>부토르파놀</td><td></td><td></td></tr><tr><td>동물시설로부터 수득된</td><td>메데토미딘하이드로클로라이드</td><td></td><td></td></tr><tr>미<td>다졸람</td><td></td><td></td><td>동물시설로부터 수득</td>된</tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>바이러스(AAV, AV)</td>이 프로토콜에 사용되는 <td>여러 공급업체</td><td></td><td>바이러스는 사내 생산</td></tr><tr><td>pAKT 항체</td><td>CST</td><td>4060</td><td>사용 1:200 딜루션</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>사용 1:100 딜루션</td></tr>입니다</tbody></table>.

crispr의 바이러스 배달 murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

전립선 암의 증가 발생, 새로운 종양 드라이버 또는 변조기의 식별은 결정적 이다. 전립선 암에 대 한 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 종양이 성분 및 그것의 복잡 한 microevolution 역학에 의해 방해 된다. 전통적인 전립선 암 마우스 모델을 포함, 다른 사람, 사이 생식 및 조건부 녹아웃, oncogenes, 및이 종이 식 모델의 유전자 변형 식. 이러한 모델에 de novo 돌연변이의 발생은, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비용이 많이 드는. 또한, 전통적인 모델의 대부분 인간의 전립선 암 세포의 작은 하위 집합만 있는 고립 된 이벤트로 진화 하는 잘 알려진 반면 전립선 상피의 대다수를 대상. 귀중 한 모델 전립선 암 개시 뿐만 아니라 고급 질병 진행을 시뮬레이션 해야 합니다.
여기는 바이러스 입자에 의해 전립선 상피 세포를 시험 하 여 몇 가지 셀을 대상 하는 방법에 설명 합니다. Murine 전립선에는 설계 된 바이러스의 배달 전립선 epithelia에 유전자 발현의 변경 수 있습니다. 바이러스 유형 및 수량 이로써 암 개시에 대 한 몇 가지 세포 및 유전자 치료에 대 한 많은 셀 시험에 의해 유전자 변경 대상된 셀 수를 정의 합니다. 앞쪽 엽, 비뇨 기 추적에서 원심에서 수술 기반 주사를 통해이 모델에서 종양 동물의 오 줌 기능을 방해 하지 않고 확장할 수 있습니다. 또한, 전립선 상피 세포의 하위 집합만 대상으로 기술, 종양의 클론 확장을 가능 하 게 하 고 따라서 인간의 종양 개시, 진행, 뿐만 아니라 기저 막 통해 침공을 싫어 하지.
이 새로운 기술은 향상 된 생리 적인 관련성 강력한 전립선 암 모델을 제공합니다. 동물의 고통을 제한, 되며 아무 추가 사육 필수 이기 때문에, 전체 동물 수를 줄일 수 있다. 동시에 새로운 후보 유전자 및 통로의 분석 가속, 차례 차례로 더 비용 효율적입니다.

평가 murine 전립선에 바이러스 배달, 샘플 수술 후 3 개월을 분석 했다. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쥐12 셀 Cre 단백질은 바이러스에 의해 표현에 노출에 GFP를 표현 한다. 전립선 샘플 GFP 신호 (그림 2A) 영역을 식별 하는 형광 현미경 검사 법으로 시험 되었다. GFP 신호 전립선 상피만 하지 여부 유전자 편집 유도 하고있다 CRISPR 가이드 Cre 활동을 나타냅니다. Immunohistochemical 섹션 초점 영역 셀 pAKT (그림 2B)의 높은 식이 나타내는 Pten13의 손실을 보였다. 면역 형광 공동 얼룩 pAKT GFP의 두 배 긍정적인 세포 (그림 2C) 확인. 이...

이 프로토콜 murine 전립선에 바이러스 배달 하는 새로 설립된 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 기술, 유전자 overexpression 또는 Cre recombinase 배달 사용 하 여, 기술 유전자 발현의 orthotopic 변경 허용 하 고 전립선 암에 대 한 새로운 마우스 모델을 구현.

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

이 수술 절차의 전반적인 목표는 전립선암 유도를 위한 CRISPR Cas9 가이드의 바이러스 전달을 통해 쥐 전립선의 유전자 발현을 변경하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 환경에서 새로운 유전자를 분석하고 검증하는 것과 관련하여 전립선암 생물학의 새로운 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 시나리오에서 볼 수 있는 전립선 세포의 하위 집합만 표적으로 삼아 여러 유전자의 신속한 유전자 편집이 가능하다는 것입니다.이 시술을 처음 접하는 사람은 장기 크기와 성공적인 수술 완료에 필요한 정밀도 때문에 처음에는 어려움을 겪을 수 있습니다. 총 5 밀리리터의 마취제를 신선하게 준비하려면 메데토미딘 염산염 1 밀리리터 당 1 밀리리터 0.15 밀리리터, 미다 졸람 5 밀리리터 0.4 밀리리터, 밀리리터 부토르페놀 10 밀리리터 0.25 밀리리터를 혼합한다. 그런 다음 멸균 식염수 4.2ml를 넣으십시오.수술 후 메데토미딘 염산염의 효과를 되돌리려면 0.1밀리리터의 아티파메졸 5mg과 4.9밀리리터의 멸균 식염수를 마취 해독제로 혼합하십시오. 적절한 소독 및 살균을 통해 무균 수술 환경을 준비하고 수술 기구를 고압증기멸균합니다. 전립선에 바이러스를 전달하기 위해, 텍스트 프로토콜에 따라 8주 된 수컷 마우스를 마취한 후; 근육 이완, 페달 철수 및 만질 수 있는 반사를 평가하여 마취 깊이를 검사합니다.반사 신경의 상실이 관찰되면 동물의 하복부를 면도하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 안구건조증으로 인한 실명을 방지하기 위해 수의학 안과 연고로 동물의 눈을 조심스럽게 덮습니다. 그런 다음 에탄올 70%와 프로비돈 요오드 10%를 사용하여 면도한 복부를 닦아 수술 부위를 소독합니다.다음으로 멸균 수술용 가위를 사용하여 하복부 정중선에서 약 1cm의 수직 피부 절개를 만듭니다. 그런 다음 미세한 점잣집게로 복막을 들어 올려 아래에 있는 장기가 손상되지 않도록 합니다. 그리고 수술용 가위를 사용하여 복막을 8mm 이하로 조심스럽게 절개합니다. 지방 조직을 부드럽게 옆으로 움직여 정낭을 드러냅니다.그런 다음 고리 겸자를 사용하여 전립선 전립선을 식별할 수 있을 때까지 정낭을 조심스럽게 들어 올립니다. 이제 0.5 밀리리터 인슐린 주사기와 30 게이지 8 밀리미터 바늘이 있습니다. 총 30마이크로리터의 바이러스 용액을 전립선 전방 상피에 주입합니다. 누출을 최소화하고 유체가 조직 내에서 흡수되어 작은 기포를 형성하도록 합니다.그런 다음 정낭을 복강에 다시 놓습니다. 액체가 작은 거품 형태로 조직 내에 흡수되고 누출되지 않도록 하려면 정낭과 평행하게 전방 전립선엽의 모양을 따라 주입해야 합니다. 테이퍼 포인트 바늘과 13mm 3/8 원으로 6-0 흡수성 봉합사의 2-3개의 간단한 중단 스티치로 회음부를 봉합합니다.그런 다음 복막 손상을 방지하기 위해 집게로 피부를 들어 올립니다. 6.5mm 클립으로 3개의 멸균 4.8 클립으로 피부를 스테이플링합니다. 수술 후 더 나은 회복을 위해 멸균 1ml 주사기와 27 게이지 x 1/2인치 바늘을 사용하여 복강 내 주사로 체중 1g당 0.1ml의 용량으로 마취 해독제를 투여합니다. 그런 다음 동물을 조심스럽게 우리에 다시 넣으십시오.완전히 회복될 때까지 저체온증을 방지하기 위해 시술 후 1시간 동안 케이지를 가열 패드에 보관하십시오. 동물은 주사 후 몇 분 후에 깨어나야 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 매일 동물을 계속 모니터링하고 치료하십시오.그리고 상처가 봉합되면 피부 클립을 제거합니다. 쥐 전립선으로의 바이러스 전달을 평가하기 위해 수술 3개월 후 샘플을 분석했습니다. 여기에서 보인 바와 같이, 이 연구에 사용된 마우스는 바이러스에 의해 발현된 Cree 단백질에 노출된 세포에서 GFP를 발현했습니다.GFP 신호는 전립선 상피에서 Cree 활성을 보여주지만 CRISPR 가이드에 의해 유전자 편집이 유도되었는지 여부는 보여주지 않습니다. 이러한 면역조직화학 절편은 pAKT 발현이 높은 세포의 초점 영역을 식별하여 P10의 손실을 나타냅니다. 이 패널에서 pAKT 및 GFP에 대한 염색은 이중 양성 세포를 식별했으며, 이는 아데노 관련 바이러스에 의한 전립선 세포의 변형을 확인했습니다.전반적으로 이러한 결과는 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 마우스와 아데노 관련 바이러스를 사용하여 전립선 상피에서 생체 내에서 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 수행할 수 있음을 보여줍니다. 일단 숙달되면 절차는 15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 전립선암 분야의 연구에서 여러 유전자를 in vivo에서 동시에 검사할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 쥐 전립선에 기질을 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일부 바이러스로 작업할 때 매우 위험할 수 있으므로 이러한 절차를 수행할 때 항상 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 아데노바이러스 기반 전달 시스템을 사용하여 전립선 세포의 특정 유전자를 편집하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 CRISPR 기술을 활용하여 유전자 발현의 정소성 및 국소적 변경을 가능하게 하여 전립선암에 대한 새로운 마우스 모델을 개발할 수 있습니다.

유전자 조작 마우스 모델의 전립선암 모델링: 마우스 전방 전립선 엽 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 국소 유전자 편집 기술

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

이 프로토콜의 목표 후속 거세와 전립선 암 세포의 내부 전립선 주사를 설명 하는 것입니다. 안 드로 겐 의존 및 거세 저항 전립선 암의 Orthotopic 전 임상 모델은 임상 관련 종양 microenvironment 및 immunocompetent 호스트의 컨텍스트에서 질병 연구에 중요 한.

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

여기서 우리는 면역 능력 마우스의 피부와 구강에 있는 몇몇 유전자의 기능을 동시에 평가하기 위하여 자궁 배아 렌즈바이러스 주사에서 초음파 유도를 사용하여 생체 내 CRISPR/Cas9 검열 방법론을 기술합니다.

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝

본 프로토콜은 Gja1에서 전장 Connexin43 생성을 유지하지만 더 작은 GJA1-20k 내부 번역 이소형의 번역을 방지하는 단일 M213L 돌연변이를 기술한다.

전장 단백질의 발현을 유지하면서 mRNA로부터 내부 번역 개시 부위의 제거

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

Cas9 형질전환 마우스의 일차 T 세포로 가이드 RNA를 레트로바이러스 형질전환하기 위한 프로토콜을 제시하여 Th17 분화 연구에서 유전자 편집을 위한 효율적인 대안을 제공합니다.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

학습하세요 CRISPR/Cas9 바이러스 전달을 이용한 쥐 전립선 유전자 편집 방법입니다. 이 기술은 전립선암 연구를 위한 생체 내 유전자 기능 분석과 다중 유전자 동시 편집을 가능하게 합니다.

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

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