Name: 전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 배우세요 마우스 배아 뇌 오가노타입 슬라이스 배양에서 전자기천법을 이용한 GABAergic 신경세포의 이동 라이브 이미징 방법. 이 저비용 기술은 신경발달 장애 연구에 활용됩니다.

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이 작품 운영 사 재단 및 치료 간 질 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 하 고 장비에 의해 혁신을 위한 캐나다 기초에서 E.R (confocal 현미경) 및 처리 (회전 디스크 confocal 현미경)을 부여 합니다. 응급실에서 경력 상을 받습니다는 Fonds de 검색 뒤 퀘벡-건강 (FRQ-S; Clinician-scientist 수상) 뿐만 아니라 건강 연구 (CIHR; 위한 캐나다 학회에서 젊은 수 사관 상)입니다. G.H.는 FRQ 미의 고위 학자 이다 르 사 재단, 추 셍 트-쥐스틴 재단 박사 훈련 수상 FRQ S 박사 교육 상 별 재단 협력에서에서 Steriade 사 박사 교육 상 받는 사람입니다. 이 프로젝트는 만들어진 가능한 르에 게 수 여 하는 건강 캐나다의 재정 지원으로 캐나다 뇌 연구 기금을 통해 뇌 캐나다

모든 실험 동물 관련 위원회 회의 Institutionnel des Bonnes 추구는 레 동물 드 Recherche (CIBPAR) 추 셍 트-쥐스틴 연구 센터에 의해 승인 및 동물 관리의 가이드에 캐나다 위원회에 따라 실시 했다 관리 및 실험 동물 (2 호)의 사용 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜 배아 날 (e) 13.5, 한 번에 때 MGE 파생 기능 적극적으로 생성, 피크의 CGE 파생 기능 생산45,46전에 배아의 electroporation에 최적화 되었다. 또한, 바이어스 GABAergic 기능으로 electroporation, 우리 사용 발기인 기능 (예: 그것의 최소한의 증강으로 Dlx5/6 발기인)47에 선택적으로 표현 합니다.
1. Electroporation 및 Organotypic 슬라이스 문화에 대 한 솔루션의 준비
<ol><li>메 마른 문화 매체의 125 mL를 준비 합니다.<ol>
<li>일반 신경 관련 문화 매체의 125 mL을 측정 참조 테이블의 재료 배합에 대 한 이전 UV 소독 biosafety 내각에 소독된 한 병에 70% 에탄올 뿌리. 혈 청 무료 신경 관련 보충, 1.75 mL 200mm 글루타민 (최종 농도 0.5 m m)의 고 열 비활성화 말 혈 청 이전 무 균 조건 하에서 aliquoted의 6.25 mL x 50의 2.25 mL를 추가 합니다. 믹스 철저 하 게, 약 15 mL에 수 메 마른 원뿔 관, 및 4 ° c.에 저장 참고: 준비 문화 매체는 4 ° c.에서 최대 3 주 동안 저장 될 수 있다</li>
		<li>무 균 조건 하에서 150 µ L aliquots에 Botteinstein의 N-2 배합48 의 재고 솔루션 X 100을 분할 하 고 사용까지-20 ° C에서 동결.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 인공 척수 (실제) 1 리터를 준비 합니다.<ol>
<li>1 리터 비 커에 증류수 800 mL를 측정 합니다. 추가 자당의 25.67 g, 염화 나트륨 (NaCl)의 5.08 g, 나트륨 중 탄산염 (NaHCO3)의 2.18 g 포도 당, 염화 칼륨 (KCl), 0.19 g의 1.80 g의 이수소 무수 나트륨 인산 염 (NaH2포4), 0.15 g 1 M 주식 CaCl2의 1 mL .2H2O 2 mL 1 M의 주식 MgSO4.7H2실 온에서 녹을 저 어 오. 증류수 1 l.의 총 볼륨에 도달 추가</li>
		<li>0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독된 biosafety 내각에서 무 균 병에 솔루션을 필터 및 4 ° C에서 최대 1 개월 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 실험 하기 전에 실제에 4 %agarose 새로운 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>살 균 50 mL 원뿔 튜브에 이전 준비 실제의 25 mL를 측정 하 고 낮은 녹는 포인트 agarose의 1 g 추가.</li>
		<li>45 열 렌지에 s. 흘리 고 피하기 위해, 모든 3-4의 시작을 끓는 때 난방 중단, 밖으로, 그것은 다시 닫고는 agarose 혼합 수동으로 선동 압력 수 있도록 튜브를 열고. Agarose 솔루션은 동 질 때까지 반복 합니다. 응고를 피하기 위해 실험의 나머지 기간 동안 42 ° C에서 agarose 솔루션을 유지. 참고: 높은 온도 뇌 조직 손상 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 주입을 위한 플라스 미드의 준비
<ol><li>유리 microinjection 피 펫을 당겨<ol>
<li>Micropipette 끌어당기는 적절 한 매개 변수를 설정 하 고 제공 된 공간에 유리 모 세관을 확보는 필 라 멘 트와 함께 중심 다는 것을 확인 한다.</li>
		<li>풀 버튼을 누릅니다.</li>
		<li>추가 사용 팁의 손상을 방지 하려면 때까지 새로 만든된 microinjection 펫 열 끌어당기는 사람 및 상자 또는 깨끗 한 페 트리 접시에 장소에서 조심 스럽게 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>설정 모든 악기와 함께 캐비닛 biosafety 필요한이 ( 그림 1A참조), 아낌없이 모든 악기 biosafety 내각에 70% 에탄올 스프레이 실험 악기 및 15-20 분 동안 자외선과 환경 소독.</li>
	<li>살 균 단계 얼음 (4 ° C)에 플라스 미드를 녹여.</li>
	<li>깨끗 한 1.5 mL 원심 분리기 튜브로 재고 솔루션 (4 µ g / µ L)에서 플라스 미드의 10 µ L를 측정 합니다. 빠른 녹색 FCF의 0.01%를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 짧게 스핀 사용까지 얼음에 계속. 참고: 맥시 prep DNA도 없는 맥시-준비 키트를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 준비 되어야 한다. DNA는 TE 버퍼 또는 nuclease 무료 solubilized 수 H2O와 무 균 조건 하에서 수행 될 필요가 없습니다 하지만 염료 솔루션 수 있는 플라스 미드의 준비. 맥시 prep에서 플라스 미드는 여러 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 aliquoted 이어야 한다. Aliquoted 플라스 미드 아니 더 그 2 h 사용 하기 전에 염료와 혼합 해야 하 고 추가 사용에 대 한 refrozen 안 한다.</li>
	<li>후 살 균, 나노-인젝터를 다음과 같이 준비 합니다.<ol>
<li>깨끗 한 상자 또는 페 트리 접시에 약 15 µ m의 외부 직경을 달성 하는 경사진된 방법에는 피 펫의 끝을 잘라 작은 핀셋을 사용 하 여 저장 된 이전 준비 유리 microinjection 피 펫 중 하나를 선택 합니다. 참고: 여기에서 주어진 외경 사용자는의 아이디어를 주고 우리가 우리의 실험에서는 대략적인 측정값 이며 액체 한 뇌 손상 없이 플라스 미드 주입에 대 한 두개골의 피어 싱을 촉진 하기 위해 최적화 된 로드 그리고 DNA의 출시입니다. 밝은 분야 현미경 미세 눈금 막대에 apposed 유리 microinjection 피 펫의 끝에 컷 보고 외부 직경을 측정할 수 있습니다.</li>
		<li>주사기를 사용 하 여 (모든 공기를 추방)을 unpulled 끝에서 광 유는 micropipette 채우기 위해.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 나노 인젝터에 채워진된 유리 제 micropipette를 삽입 합니다.</li>
		<li>(공기 항목을 방지 하기 위해 충분 한 석유를 유지 하는) 유리 제 micropipette의 빈 2/3rds.</li>
	</ol>
</li>
	<li>신중 하 게 준비 micropipette 플라스 미드/염료 솔루션이 포함 된 튜브에 넣고 유리 제 micropipette 플라스 미드/염료 솔루션 작성 합니다.</li>
</ol>3. 마우스 배아 임신 여성에서의 컬렉션
<ol><li>질 연결 해, 낫게 동시에 매일 (이른 오후)에 대 한 평가를 매일 번 식 암컷을 모니터링 합니다. 하루 e0.5 질 플러그 관찰 때 첫 번째 날에 해당 합니다. 참고: 여기에 설명 된 실험 야생-타입 마우스에서 수행할 수 있습니다. 그러나,는 MGE의 식별을 용이 하 게 하 고 모든 GABAergic 기능 (또는 기능 MGE 파생 된 특정 하위 집합)를 유전자 변형 동물 사용할 수 있습니다 (예: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre Cre 기자 대립 유전자, 등47,49와 함께). 이 상황에서 주입 실험 플라스 미드 transfected 기능의 시각화 (노란색) 하 비 페 기능 (녹색)와 비교 될 수 있도록 다른 fluorophore (예: mCherry 또는 TdTomato)를 표현 한다.</li>
	<li>목 전위에 의해 배아 일 e13.5에서 여성을 희생. 참고: 희생의 때에 주어진 마 취 에이전트 및 마이그레이션 및 생존50,51 에 영향을 줄 수 있습니다 피해 야 한다.</li>
	<li>제왕 절 개 하 여 태아를 다음과 같이 수집 합니다.<ol>
<li>아낌없이 여성 복 70% 에탄올 스프레이. 소독된 집게의 쌍 복 부 피부를 당겨 하 고, 다른 한편으로는를 사용 하 여 멸 균된 수술가 위 복 부 피부를 잘라.</li>
		<li>소독된 집게와가 위의 두 번째 쌍, 복 부 근 막 올려와 신중 하 게 자 궁을 피하고 있는 동안 그것을 잘라.</li>
		<li>3 켤레 소독된 집게와가 위를 사용 하 여 자 궁 뿔을 당겨 하 고 골반 구멍에서 그들을 잘라. 해 부 자 궁 뿔 신경 기반 문화 매체 아미노산, 비타민 및 무기 염 (상용 제품에 대 한 재료의 표 참조) 보충으로 가득 살 균 60 mm 페 트리 접시에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 biosafety 내각에 태 반 으로부터 태아를 해 부와 머리 잘린 격리 고급 핀셋 (각 손에 하나)의 두 쌍을 사용 합니다.</li>
	<li>베벨 컷 불 임 3 mL 플라스틱 전송 피 펫의 끝 발음 머리 그리고 전송 새로운 살 균 60 mm 페 트리 접시에 그들 응고 블랙 왁 스 층과 같은 신경 기반으로 가득 보충 위와 문화 매체. 참고:이 단계는 오염 물질 (마우스 머리, 혈액)의 전송을 최소화합니다. 블랙 왁 스 해 부 동안 머리를 안정화 하는 데 사용 됩니다. 문화 미디어가이 절차 동안 산소 수 필요가 없습니다.</li>
</ol>4. intraventricular 플라스 미드 주사 및 전 비보 Electroporation MGE는의
참고: 다음 단계는 이전 준비 biosafety 내각에서 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>장소 60 mm 페 트리 접시 블랙 왁 스와 겹쳐 고 biosafety 캐비닛에 쌍안경에서 문화 매체 보충 신경 기반에 목 잘린된 머리를 포함 하.</li>
	<li>머리, 오른쪽, 왼손으로 정밀한 핀셋으로 직면 rostral 부분을 안정 하 고 오른손의 나노-인젝터를 사용 하 여 오른쪽 측면 뇌 실에 플라스 미드/염료 해결책의 1-2 µ L를 주입. 참고: 공동 식 실험 수 실시 공동 electroporating 구조 플라스 미드와 shRNA 표현 플라스 미드 아데닌 농도에서 두 플라스 미드를 혼합 하 여.</li>
	<li>Electroporate 주입된 두뇌입니다.<ol>
<li>Dorsally 위치 및 머리에 병렬 부정적인 전극으로 전극 및 대상 MGE는 머리의 복 부 쪽을 향해 긍정적인 전극 사이 머리를 놓습니다.</li>
		<li>전극이 잘 위치 하 고, 일단 간 펄스 간격 40 V 500 ms에서 50 ms의 4 평방 펄스를 제공 합니다.</li>
		<li>이미에 배치는 biosafety 캐비닛 핀셋을 사용 하 여 전극에서 모든 잔여 조직을 제거 합니다. 참고: 이러한 매개 변수는 특별히 우리의 실험에 사용 된 electroporator에 대 한 최적화 되었습니다. 사용자가 수행 하는 최적화 테스트 미리 electroporator의 다른 종류를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>모든 나머지 두뇌 4.1 4.3 단계를 반복 합니다. 참고:이 프로토콜 설명 한 두뇌에 필요한 조작, 하지만 그것은 주사 electroporating 전에 순차적으로 최대 4 두뇌 수확량 증가, 각 뇌 수 있습니다. 이 전략은 특히 유리한 주입 했을 때 2 또는 더 다른 플라스 미드는 순차적으로 (예: 컨트롤 또는 실험 플라스 미드) (littermates 사이 비교에 대 한 허용 하는) 동일한 실험 기간 동안. 또한, 그것은 가능한 삽입 하 고 electroporate 동시에 완전히 뇌 표면에 병렬 전극 배치 하 여 수율을 증가 두뇌의 양측.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 뇌 해 부와 Organotypic 조각 문화
<ol><li>여전히 biosafety 캐비닛의 메 마른 환경에서 조작 하는 동안 두개골에서 뇌를 해 부.<ol>
<li>신중 하 게 두뇌를 피하는 동안 각각의 눈에 바늘을 삽입 하 여 블랙 왁 스의 층에 머리를 고정 시켜야 합니다.</li>
		<li>고급 핀셋의 쌍을 사용 하 여 목의 왼쪽와 눈물 앞에 다시에서 두개골에서 피부에 좋은 족집게의 두 번째 쌍.</li>
		<li>한 손으로 핀셋으로 옆 머리를 잡고, 신중 하 게 두개골 brainstem의 수준에서 잘라내어 부드럽게 두개골을 올려 또 한 쌍의 다른 한편에서 핀셋을 사용 합니다. 각 트위터, 전면, 화살 비행기 (중간)에 두개골을 잘라와 다음 옆으로 두개골 파편을 해방 하기 위하여 incise.</li>
		<li>Brainstem 들어올린 조심 스럽게 잘라 meninges 및 두개골 신경 두뇌는 두개골에서 완전히 될 때까지. 참고: 5.1에 설명 된 모든 단계는 biosafety 캐비닛에 엄격한 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단면에 대 한 4% 낮은 녹는 포인트 agarose에 두뇌를 포함 합니다.<ol>
<li>채워 35 mm 페 트리 접시 위에 준비 agarose 솔루션 (42 ° C에 액체 유지).</li>
		<li>Electroporated 두뇌 agarose 가득 접시 이전 컷된 전송 피 펫을 사용 하 여 신속 하 게 전송. 실 온에서 접시를 유지.</li>
		<li>(침 몰 방지)을 잘 중간 뇌를 유지 하는 금속 막대기로 agarose를 저 어 접시에 병렬 rostro 꼬리 평면에서 뇌를 위치. 중지는 agarose 공고히 하, 어떤 뇌 손상 방지 하기 시작 될 때 교 반 합니다.</li>
		<li>뇌 주변의 1-2 밀리미터의 마진을 떠나 직사각형 블록을 형성 하기 위하여 뇌를 둘러싼 agarose를 잘라 면도날을 사용 합니다. 두뇌의 rostral 부분 수직 단면 후속 단계에 대 한 오리엔테이션을 촉진 하기 위하여 블록의 앞쪽도 인지 확인 합니다.</li>
		<li>각 두뇌에 대 한 반복 합니다. 참고: 그것은 다른 고도에 각 두뇌를 설정 하는 동안 별도 agarose 블록을 형성 하 여 (최대 3) 한 번에 하나 이상의 뇌를 잘라 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vibratome 코로나 섹션와 슬라이스 문화입니다.<ol>
<li>100 X N-2의 해 동 한 약 수 얼음에 (150 µ L)를 보충 하 고 메 마른 조건 하에서 15 mL aliquoted 문화 매체에 추가.</li>
		<li>6 잘 문화 접시의 각 음을 (1 X N2 보충)와 문화 매체의 750 µ L를 전송 합니다.</li>
		<li>곡선된 핀셋으로 각 매체 잘 가득 한 셀 문화 삽입 (직경 30 m m, 0.4 µ m 기 공 크기, PTFE)를 배치 합니다.</li>
		<li>Vibratome 목욕을 지속적으로 산소 실제 채우십시오. 얼음 목욕, 주변 4 ° C에 냉각 하거나 냉장된 vibratome를 사용 합니다.</li>
		<li>0.150 m m/s와 80 헤르츠 주파수 vibratome 속도 설정 합니다.</li>
		<li>접착제 vibratome 플랫폼, 아래로 rostral 가장자리와 복 부에 agarose 블록 가장자리 사용자를 직면 하 고.</li>
		<li>(4 ° C)에서 250 µ m 두께 섹션을 얻기 위해 코로나 섹션에 뇌를 잘라.</li>
		<li>소독된 주걱와 MGE 장소 신중 하 게 섹션 사이의 중복을 피하는 동안 하나의 30 m m 막에 한 동물에서 모든 뇌 섹션 삽입을 포함 하는 2-3 섹션을 수집 합니다. (위에서 설명한 대로 보충된 문화 매체의 750 µ L 포함) 6-잘 문화 판의 한 잘에 삽입을 배치 합니다. 또는, 각 섹션은 500 µ l 보충 문화 매체 가득 12 잘 문화 접시에 별도 13 m m 직경 멤브레인에 놓일 수 있다. 각 잘 권장 하는 문화 매체의 금액 없이 침수 되는 미디어에 의해 영양 수 뇌 섹션 수 있습니다. 참고: 5.3.6과 5.3.7에 설명 된 단계는 실시 하지 완전 한 무 균 조건 하에서 vibratome을 소독 하 고 biosafety 캐비닛에 사용 수 있습니다. 따라서, 그것은 어떤 오염을 피하기 위하여 신중 하 게 다음이 단계를 수행 하는 중요 한입니다. 적절 한 보호 장비 (깨끗 한 마스크, 수술 장갑 및 실험실 코트) 착용 되어야 한다 모든 시간과 신체 부위도 포함, 머리, 얼굴, 손, 배양 배지 (또는 문화 매체 없이) 통해 전달 한다와 같은. 그것은 또한 자주 장갑 뇌 섹션을 수집 하는 데 사용 하는 주걱에 70% 에탄올을 스프레이 것이 좋습니다.</li>
		<li>48 또는 72 h에 대 한 60% 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 통풍이 무 균 인큐베이터에서 문화 접시를 놓습니다. 참고: 이러한 보육 시간 했다 최적화 MGE 파생 기능의 경과 이미징 및 고정 조각의 confocal 영상 각각. 최적의 부 화 시간 각 실험 설계에 대 한 사전 시험 되어야 한다. 또한, 선택한 보육 72 h 고 아래, 문화 매체를 변경할 필요가 없습니다입니다. 더 이상 보육 시간에 대 한 문화 매체 2-3 일 마다 변경 되어야 합니다.</li>
		<li>원하는 보육 시간 후 관심의 섹션 8 연 발 coverslip 전송 하 고 문화 매체의 3-5 µ L를 추가 합니다. 장소 (37 ° C, 습도 60%, 5% CO2) 환경 챔버에 coverslip 거꾸로 연결 된 회전 디스크 confocal 시간 경과 영상 세션 설정 하는 컴퓨터 기반 수집 소프트웨어를 갖춘. 참고: 또는, 섹션 고쳐질 수 있다 4 %paraformaldehyde (4 ° C에서 하룻밤 또는 실 온에서 2 h)와 이후에 confocal 아래 기능 electroporated의 형태학 상 특징의 시각화를 위한 다른 항 체와 immunostained 현미경입니다. EGFP 및 mCherry 어떤 반대 얼룩 절차 없이 confocal 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다, 좋습니다 immunohistochemistry GFP와 mCherry 이후 고정 프로세스 형광, 줄일 수 있습니다 신호를 향상 시키기 위해 수행 감소 선행 또는 후행 프로세스에서 작은 가지 같은 배아 신경의 미세한 구성 요소 탐지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다. 언급 된 조회는 반드시 보건 장관 또는 캐나다 정부 의견을 대표 하지 않는다.

이 문서에서는, 우리는 e13.5에서 마우스 MGE electroporation utero 전 을 수행 하기 위한 배아 뇌 조각의 organotypic 문화의 세대에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다. 비록 체 외에 , Boyden 챔버 시험 등 비교적 쉽게 수행 하는 방법과 다른 유전자와 다른 요인의 간섭 없이 단백질의 특정 역할을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다, 그들은 조사 배제 마이그레이션 역학 방향 및 마이그레이션 경로25에 관해서. MGE explants 발생 동안 마이그레이션, 우리가 여기에 표시 하지만 그들은 대부분 생 단서 없는 동적 cytoskeletal 변화를 연구 하 고 (비록 이것이 신경 마이그레이션 홍보 지침 단서의 추가 요구 하는 유용한 수단을 제공 크게 대뇌 피 질의 급지대 레이어에 MGE explants 교양 개선)25,<sup class="xref"...

대뇌 피 질의 GABAergic 수 (INs)는 그들의 생 화 확 적인 속성, 생리 적인 속성과 연결에 관해서는 다양 한 그리고 그들은 성숙 네트워크1,2,3 에에서 다른 기능을 중재 ,45. 대뇌 피 질의 기능의 다른 하위 사양 광범위 하 게 공부1,2되었습니다 유전 계곡을 통해 밀접 하 게 통제 된다. 대뇌 피 질의 GABAergic 기능의 대부분 (70%) 중간 절 예 (MGE) ventrally 위치 미 발달 구조에서에서 창시자에서 발생 하 고 외피 격판덮개1, 에 도달 비교적 긴 거리에 걸쳐 마이그레이션 해야 합니다. 2 , 6. 대뇌 피 질의 각 추 모양 세포 (VZ) 심 실 지역에서 광선으로 마이그레이션할 따라 방사형 명과 비 계 외피 격판덮개, 같은 비 계에 연결 되지 않습니다, 기능의 접선 이동 합니다 다양 한 내장과 비 대뇌 피 질의 구조2,7,8에서 그들을 지도 하는 동안 대뇌 피 질의 판으로 마이그레이션 신경 유치의 외부 단서 세포 주기 후, 기능 화학 불쾌 신호 트리거 외피 격판덮개9,10으로 접선 마이그레이션 MGE VZ 내 표현으로 MGE에서 격퇴는. 마이그레이션 기능 방지 다른 불쾌 신호11 의 도움으로가 고, 외피 격판덮개에 도달, 그들은 접선에서 방사형 마이그레이션 모드로 전환 피라미드에서 신호에 응답 부분에서 그들의 마지막 층 류 위치에 도달 셀12 그리고 다른 세포 인구13. 다른 신경 인구에 관해서는, 기능의 마이그레이션 신경의 실제 움직임을 허용 하도록 다양 한 동적 형태학 상 변화를 포함 한다. 이 소위 신경 운동 3 연속 단계 반복 주기 특징 이다: 주요 과정, 핵 (nucleokinesis)의 활성 참가자 움직임과 후행 프로세스14의 철회의 신장. 마이그레이션에를 개장 하는 분기 및 활성 방향 및 마이그레이션14,15의 속도 결정 올바른 방향으로 기능을 안내 하는 최고의 과정의 수많은 기본 및 외부 신호에 의해 통제 된다 ,16.
최근 몇 년 동안1,2,7,17,18,,1920, 마이그레이션에 대뇌 피 질의 규제 결정 광범위 하 게 연구 그리고 이러한 분자 배우의 일부 장애 neurodevelopmental 장애, 소아 내 화 간 질 또는 자폐증 스펙트럼 장애1,2,21, 등으로 이어질 postulated 되었습니다. 22 , 23 , 24. 따라서, 다양 한 생체 외에서 그리고 vivo에서 방법의 개발은 이전 검토25이 동적 과정을 공부 하는 우리의 능력을 크게 추구 되었습니다. 생체 외에서 포함 하 여 방법 Boyden 챔버 분석 결과 스트라이프 선택 분석 결과 신경 마이그레이션 중 요구 사항 및 특정 유전자 또는 단백질의 세포 자치 영향 평가의 빠르고 가장 재생 가능한 수단을 제공 없이 다른 요인25의 영향. 이 분석 실험은 라이브 이미징8,,2627와 결합 될 때 특히 유용 합니다. 이러한 기술로 쉽게 e13.5 MGE에서에서 검색 기능과 같이 이전8,28 후 다른 신호 경로 지도 단서 조사 수 있다, 효소 그리고 기계적인 분리 하 여 격리 . 그러나,이 분석 실험은 3 차원 조직 아키텍처, 잠재적으로 셀 이동 또는 생존25에 영향을 미치는 신경 행동 및 셀 속성을 변경할 수 없을 경우에는 인공 기질에서 일어난다. 이러한 한계를 회피, ex vivo MGE explants 계량 동적 형태학 변화 속도 방향14, 같은 매개 변수와 함께 마이그레이션 중 발생 하는 대체 도구로 개발 되었습니다. 29. MGE explants 생성은 비교적 간단 하 고 광범위 하 게 되었습니다30설명 되어. 그것은 비록 후자는 선택적31matrigel과 콜라겐 매력 또는 반발 신호25, 존재의 혼합물 또는 혼합된 대뇌 피 질의 세포의 단층에 MGE의 작은 추출의 도금을 수반. MGE explants 고해상도 띄엄띄엄 레이블이 지정 된 셀의 이미징, 세포내 프로세스, 분기, 주요 과정 cytoskeletal 개장 같이 이전32,33 등의 연구를 단순화에 대 한 허용 34 및 현재 연구에서. MGE explants 성공적으로 (참조, 예를 들어 Tielens 외. 201633) 예를 들어 특정 약리 또는 혈 조작 후 2D 환경에서 마이그레이션에서 동안 동적 cytoskeletal 변화를 평가 하는 데 사용 되었습니다. . 그러나,이 방식으로 인공 매트릭스 내 마이그레이션 기능 그리고이 재현성 및 실험 결과의 의미와 동작 변경할 수 있습니다.
대조적으로, electroporation utero에서 그들의 네이티브 환경에서의 유전자 조작 가능 하 게 그리고 신속 하 고 효율적으로 유전자 기능의 손실과 이득의 영향의 한계를 우회 하는 동안 평가에 널리 사용 되는 방법 비용과 시간이 많이 걸리는 녹아웃 그리고 노크에서 전략25,35. Electroporation utero에서 수 수 편견으로 창시자에 셀 유형 특정 발기인을 사용 하 여와 MGE36를 포함 하 여 ventromedial 구조 쪽으로 전극을 배치 하 여. 또한, utero에서 electroporation 허용 1-2 일 이내 실험적인 구문의 적시 식 구조 식을 사용 하 여 바이러스에 필요한 7-10 일에 비해 벡터25스 그러나 utero에서 electroporation의 창시자에 낮 열매를 산출 하 경향이 있다. 실제로, 지 심 실 지역에 위치한 피라미드 셀 창시자를 효율적으로 페 수 있지만 utero에서 를 사용 하 여 electroporation, MGE, 같은 더 ventrally 위치 구조를 대상으로 더 기술적으로 도전적인, 작은 e13.5에서 특히 배아 및 배아 치 더 높은 속도 실험 수익률25을 감소 시킨다.
생체 외에서 와 관련 된 기술적 제한 중 일부를 회피 MGE explant 실험 및 electroporation utero에서 vivo에서 , organotypic 슬라이스 문화 비보 전 개발된8,37, 38,39. 뇌 organotypic 슬라이스 문화 제공, vivo에서 흉내 낸의 이용 조건, 저렴 하 고 보다 생성 동물 모델25시간이 되는 동안. 사실, 이러한 준비 기능, 특정 시각화 함께 MGE에 쉽게 액세스할 수 있도록 하 고 더 생리 환경8 마이그레이션 기능에 특정 분자 경로 조사 하기 위해 초점 electroporation 결합 될 수 있다 , 39 , 40 , 41. 우리 따라서 organotypic 문화38, 우리 전 utero electroporation와 시간 경과 confocal 영상 결합에 대 한 접근을 최적화는, 추가 발생 하는 형태학 및 동적 프로세스 평가 동안 MGE INs의 접선 마이그레이션. 현재 프로토콜은 적응 하 고 다른 공부 피라미드 세포42,43 의 마이그레이션 전 utero 또는 utero에서 두뇌 electroporation 그리고 organotypic 슬라이스 문화 사용 최적화 및 대뇌 피 질의 기능36,,3944. 특히, 마우스 배아는 참 하 고는 MGE는 electroporated ex vivo 실험 플라스 미드의 intraventricular 주입 후 보다 효율적이 고 정확 하 게 달성 될 수 있다 무엇 보다 MGE 창시자의 타겟팅 electroporation utero에서 . 두뇌는 다음 추출 하 고 몇 일 동안 경작 될 수 있다 뇌 코로나 조각으로 sectioned, 연속 되므로 추적 transfected 기능 이미징. 이 방법은 일반적으로 레이블 뇌 조각 당 5-20 tangentially 마이그레이션 기능을 실험 반복 동안 라벨의 쉽게 분리 되도록 충분히 스파스 신경 인구 통계적 의미에 도달 하는 데 필요한 수를 최소화 재건 및 미세 형태학 평가 하는 개별 신경 또한, organotypic 문화는 마이그레이션 확인 MGE explants에 비해 기능 로컬로 분 비 발산 및 thalamic afferents에서 입력을 포함 하 여 더 많은 자연 환경에 노출 됩니다. 이 접근은 이렇게 방향 및 주요 프로세스 분기 등 미세한 동적 프로세스의 특성을 허용 하도록 충분 한 해 부 세부 정보를 제공 하면서 transfected 기능 채택한 철새 경로 계량에 적합 nucleokinesis 및 후행 프로세스 철회입니다.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal 배지</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>상업적으로 이용 가능한 뉴런 특이적 배양 배지. 이 웹사이트에서 사용 가능한 전체 제형: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td></tr><tr><td>B-27 무혈청 보충제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>50X 무혈청 뉴런 특정 보충제</td></tr><tr><td>15 mL 멸균 원심분리 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415064</td><td>상업적으로 이용 가능한 아미노산, 비타민 및 무기염이 보충된 신경 기반 배양 배지. 유통업체 웹사이트에서 전체 제형을 확인할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>말 혈청, 열 비활성화</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H1138-500ML</td><td></td></tr><tr><td>신경 세포 보충제 N-2 100X</td><td>Wisent</td><td>305-016</td><td>Botteinstein의 N-2 제형</td></tr><tr><td>VWR Square PETG 미디어 병 125 mL</td><td>VWR</td><td>89132-062</td><td></td></tr><tr><td>클래스 II 유형 A 생물 안전 캐비닛</td><td>Nuaire</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>BioShop</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>BioShop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>D+ 포도</td>당 <td>Millipore-Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 무수</td><td>BioShop</td><td>SPM400.500</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>BiosShop</td><td>MAG522</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>BioShop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>50mL 멸균 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>P-97 화염/갈색 마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 인스트루먼트 컴퍼니(Instruments Co</td><td>모델 P-97</td><td></td></tr><tr><td>0.4mm I.D. x 75mm 모세관</td><td>Drummond scientific</td><td>1-000-800/12</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR</td><td>E193</td><td></td></tr><tr><td>5mL 주사기</td><td>Becton Dickinson & Co</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일(중)</td><td>Rougier Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WPI 스위스 핀셋 #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>504511</td><td>11cm, 직선, 0.06x0.07mm 팁, 항자성. 이 중 2개가 필요합니다.</td></tr><tr><td>WPI 스위스 핀셋 #7</td><td>World Precision Instruments</td><td>504504</td><td>11.5 cm, 0.18x0.2mm, 곡선 팁</td></tr><tr><td>HTC 핀셋</td><td>World Precision Instruments</td><td>504617</td><td>11 cm, 스트레이트, 플랫</td></tr><tr><td>작동 가위</td><td>월드 정밀 머신</td><td>501225</td><td>16 cm, 샤프/샤프, 스트레이트. 이 중 3개가 필요합니다.</td></tr><tr><td>드레싱 펜치</td><td>월드 정밀 기기</td><td>501217</td><td>12.5 cm, 직선, 톱니 모양의</td></tr><tr><td>아이리스 펜치</td><td>월드 정밀 기기</td><td>504478</td><td>10.2 cm, 전체 곡선, 톱니 모양의</td></tr><tr><td>DeBakey 조직 펜치</td><td>월드 정밀 기기</td><td>501996</td><td>15 cm, 45도 각도, 섬세한 턱, 1.5mm 넓이</td></tr>의 <tr><td>Fisherbran 마이크로스패튤라 둥근 끝</td><td>FisherScientific</td><td>21-401-5</td><td>이 중 2개가 필요합니다.</td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 60, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td>60-mm dish</td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>Sarstedt</td><td>83.1800</td><td>35-mm dish</td></tr><tr><td>Black Wax</td><td>FisherScientific</td><td>S17432</td><td></td></tr><tr><td>전송 피펫&nbsp;</td><td>Ultident</td><td>170-CTB700-212</td><td>3 mL, 소형 전구</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica M80</td><td>제조업체에 의해 중단된 실체 현미경 대체품 (FisherScientific의 StereoMaster)</td></tr><tr><td>Electro Square Porator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 1/2</td><td>벡턴 디킨슨 & Co</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000S 진동 블레이드 마이크로톰</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>GEM, 단일 가장자리 면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71952-10</td><td>vibratome&micro의 블레이드 지정 공간에 삽입하기 전에 뭉툭한 끝을 제거하십시오</td></tr><tr><td>.-Slide 8 well</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>15</td></tr><tr><td>밀리셀 세포 배양 인서트</td> <td>팩Millipore-Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td>30mm, 친수성 PTFE, 0.4 &마이크로; M 모공, 50 팩.&nbsp;</td></tr><tr><td>라이카 DMi6000 현미경</td><td>라이카 마이크로시스템즈</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>스피닝 디스크 컨포칼 헤드 Ultraview Vox</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.0 수집 소프트웨어</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LiveCell Stage 상단 배양 시스템</td><td>병리학 장치</td><td>LC30030</td><td>온도, CO2 및 습도 제어를 제공합니다.</td></tr><tr><td>SP8 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry-Lifeact-7</td><td>Addgene</td><td>54491</td><td>Michael Davidson의 선물</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>25G 병, 생물학적 염색 위원회 인증</td></tr></tbody></table>

전 utero electroporation 및 마이그레이션 gabaergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 organotypic 조각 문화

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic 수 (INs)는 인식 및 행동 신경 네트워크의 중요 한 요소입니다. 피 질을 예정 하는 기능 내장 및 외부의 복 부 telencephalon 등는 중간과 꼬리 절 정령 (MGE, CGE)에서 다양 한 응답 등 외피 격판덮개에 그들의 장소에서 접선 마이그레이션 단서. 다른 방법론 유전자 특정 경로 조작 하 고 그들이 적절 한에 필요한 동적 cytoskeletal 변화를 조절 하는 어떻게 조사를 수 년에 걸쳐 개발 된 마이그레이션에서. Electroporation utero에서 광범위 하 게 유전자 억제의 효과 연구 하는 데 사용 되었습니다 또는 형태학 및 마지막 위치에 미치는 영향을 평가 하는 동안 특정에 있는 overexpression 하위. 그러나,이 접근은 쉽게 광선 마이그레이션 피라미드 셀을 수정 하는 데 사용 됩니다, 그것은 더 많은 기술적으로 도전적인 electroporation utero에 기능을 대상으로 주어진 새끼의 감소 생존 율이 낮은 수익률을 생성할 때 때 electroporation은 e14.5, 관례 이다 MGE 파생 기능을 공부 하기 전에 수행 됩니다. 다른 접근 방법, MGE explants는 MGE에 쉽게 액세스를 제공 하 고 촉진 유전자 변형 기능 영상. 그러나, 이러한 explants 기능 생 지도 단서와 thalamic 입력 없는 인공 매트릭스로 마이그레이션합니다. 이 기능 utero에 접근의 기술적인 문제를 우회 하는 동안 더 자연 환경에서 마이그레이션할 수 있는 방법 최적화 하 라는 메시지가 나타납니다. 이 논문에서는, organotypic 슬라이스 문화 쉽게 추적, 이미지 응답으로 그들의 자연적인 경로 따라 이동 하는 유전자 변형된 기능을 재구성 하 여 다음 배아 마우스 두뇌의 전 utero electroporation 조합 설명 생 큐입니다. 이 방법은 마이그레이션 시간 경과 공초점 영상과 동적 측면으로 고정된 immunolabeled 조직에 신경 개조를 사용 하 여 다양 한 형태학 매개 변수의 상세한 분석은 모두 정량화 할 수 있습니다.

이 섹션에서 제공 하는 대표적인 결과 얻은 다음 컨트롤 플라스 미드 또는 e13.5 마우스 배아 organotypic 슬라이스 문화 뒤의 MGE에서 관심사의 유전자를 대상으로 한 실험 플라스 미드의 전 utero electroporation (시간 경과 영상)에 대 한 48 시간 또는 72 h (고정 및 immunohistochemical 라벨) 37 ° C에서 incubated (도식 프로토콜에 대 한 그림 1B 를 참조). MGE explant에서 마이그레이션 기능의 대표적인 예는 그림된 (참조 그림 1 c 도식 프로토콜) 여기에서 설명 하는 방법에 대 한 비교로 있습니다. MGE 창시자에 플라스 미드의 electroporation MGE는 기능의 종료 지연 같고 문화 시간을 적절 하 게 조정 해야 합니다.
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여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

이 실험의 전반적인 목표는 가능한 가장 자연주의적인 환경에서 접선 이동 중에 유전적으로 변형된 피질 GABAergic 중간뉴런을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 뇌 발달 중 단백질의 특정 유전자 기능 상실의 영향을 스크리닝함으로써 발달 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 자궁 electroporation와 같은 다른 유사한 방법과 비교된 값이 싼 상대적으로 쉽다 입니다.따라서 이 기술은 환자에서 확인된 특정 돌연변이의 발병성과 뇌 발달 중 새로운 질병 유전자의 역할을 명확히 함으로써 궁극적으로 자폐증 및 간질과 같은 유전적 신경 발달 장애가 있는 환자의 진단을 개선할 수 있습니다. 해부 및 배양에 필요한 모든 기기가 있는 생물안전 캐비닛을 설정하는 것으로 시작합니다. 생물 안전 캐비닛의 모든 기기에 70% 에탄올을 넉넉하게 분사하고 기기와 캐비닛 내부를 자외선으로 15-20분 동안 살균합니다.배아를 채취할 준비가 되면 안락사 댐의 복부에 70%에탄올을 넉넉하게 뿌립니다. 멸균된 집게로 복부 피부를 위로 당기고 다른 손으로 멸균된 수술용 가위를 사용하여 복부 피부를 자릅니다. 두 번째 멸균 집게와 가위를 사용하여 복부 근막을 위로 당겨 자궁을 조심스럽게 피하면서 자릅니다.세 번째 멸균 된 집게와 가위를 사용하여 자궁 뿔을 잡고 골반강에서 잘라냅니다. 절개된 자궁 뿔을 아미노산, 비타민 및 무기염이 풍부한 신경 기반 레보비츠 배양 배지로 채워진 60mm 페트리디쉬에 넣습니다. 멸균 생물 안전 캐비닛에서 두 쌍의 미세한 핀셋을 사용하여 태반에서 배아를 해부하고 참수하여 머리를 분리합니다.Bevel은 멸균 3밀리리터 플라스틱 전사 피펫의 끝을 자르고 이를 사용하여 머리를 흡인하고 동일한 보충된 신경 기반 배양 배지로 채워진 새로운 멸균 60mm 페트리 접시로 옮겨 혈액을 씻어냅니다. 응고된 블랙 왁스로 층을 이루고 신경 기반 보충 배양 배지로 채워진 세 번째 페트리 접시로 다시 옮깁니다. 검은색 왁스로 층을 이루고 참수된 머리를 신경 기반 보충 배양 배지에 담은 16mm 페트리 접시를 생물 안전 캐비닛의 해부 현미경 아래에 놓습니다.왼손에 들고 있는 가는 핀셋을 사용하여 머리 부분이 오른쪽을 향하도록 머리를 고정합니다. 그런 다음 오른손에 있는 나노 주입기를 사용하여 1-2마이크로리터의 염료 스파이크 플라스미드 용액을 우측 측심실에 주입합니다. MGE를 표적으로 하기 위해 음극을 머리와 등쪽으로 평행하게 배치하고 양극을 머리의 복부 쪽을 향해 배치하여 전극 사이에 머리를 배치하여 주입된 뇌를 전기천공합니다.전극이 잘 배치되면 500밀리초 인터펄스 간격으로 50밀리초 동안 40볼트의 4제곱 펄스를 전달합니다. 생물 안전 캐비닛의 무균 환경에서 계속 작업하면서 두개골에서 뇌를 해부하기 시작하십시오. 우선, 뇌를 조심스럽게 피하면서 양쪽 눈에 바늘을 삽입하여 블랙 왁스 층 위에 머리를 안정시킵니다.그런 다음 가는 핀셋으로 목의 왼쪽을 잡고 두 번째 가는 핀셋으로 두개골의 피부를 뒤에서 앞으로 뜯어냅니다. 한 손에는 핀셋으로 머리를 옆으로 잡고 다른 손에는 다른 핀셋을 사용하여 두개골을 조심스럽게 뇌간 높이에서 자르고 두개골을 위로 당깁니다. 각 핀셋으로 시상면의 두개골을 앞쪽으로 자른 다음 옆으로 절개하여 두개골 조각을 해방시킵니다.그런 다음 뇌간을 들어 올리고 뇌가 두개골에서 완전히 나올 때까지 수막과 뇌 신경을 조심스럽게 잘라냅니다. 35mm 페트리 접시에 액체를 섭씨 42도로 유지한 용융 아가로스 용액으로 채웁니다. 그런 다음 이전에 절단된 전사 피펫을 사용하여 전기로 천공된 뇌를 아가로스로 채워진 접시로 빠르게 옮깁니다.금속 막대기로 아가로스를 저어 뇌가 우물 중앙에 있도록 하여 가라앉는 것을 방지하고 뇌를 접시와 평행한 꼬리 평면에 배치합니다. 아가로스가 굳기 시작하면 뇌 손상을 방지하기 위해 젓는 것을 멈추십시오. 아가로스 임베딩이 응고될 때까지 기다리는 동안, 처리할 뇌의 수에 따라 6개의 웰 배양판의 각 웰에 750마이크로리터의 N2 보충 배양 배지를 이송합니다.그리고 잘 채워진 각 매체에 30mm 멤브레인 인서트를 놓습니다. 면도날을 사용하여 뇌를 둘러싼 아가로스를 잘라 뇌 주위에 1-2mm의 여백을 남기는 직사각형 블록을 만듭니다. 뇌의 상부 부분이 블록의 전방 한계에 수직인지 확인하여 후속 절편 단계를 위한 방향을 용이하게 합니다.비브라톰 플랫폼의 아가로스 블록을 풀로 붙이고, 가장자리는 아래를 향하고 복부 가장자리는 사용자를 향하도록 합니다. 뇌를 관상동맥 절편으로 절단하여 섭씨 4도에서 250미크론 두께의 절편을 얻습니다. 멸균된 주걱으로 MGE를 포함하는 2-3개의 절편을 수집하고 한 동물의 모든 뇌 절편을 단일 30mm 멤브레인 삽입물에 배치합니다.섹션 간의 겹침을 조심스럽게 피하십시오. 배양 플레이트를 섭씨 37도, 습도 60%, CO2 5%의 통풍이 잘되는 멸균 인큐베이터에 48시간 또는 72시간 동안 놓습니다. 원하는 배양 시간이 지나면 관심 섹션을 3-5마이크로리터의 배양 배지로 채워진 8개의 챔버 커버슬립으로 옮깁니다.커버슬립을 환경 챔버에 놓고 컴퓨터 지원 수집 소프트웨어가 장착된 역 회전 디스크 컨포칼에 연결하여 타임랩스 이미징 세션을 설정합니다. TD 토마토 카세트 및 관심 유전자를 표적으로 하는 SH RNA를 발현하는 실험용 플라스미드로 E 13.5에서 전기천공된 인터뉴런은 배양 48시간 후 DLX5 6Cre RCEE GFP 마우스 배아에서 얻은 유기형 뇌 절편에서 접선 이동에서 볼 수 있습니다. 인터뉴런은 8시간 동안 타임 랩스 라이브 이미징을 사용하여 시각화되었습니다.이 예에서는 동일한 전기천공된 중간뉴런이 핵동형성 과정에서 볼 수 있습니다. 껍질 표면과 평행한 피질에서 접선으로 이동하는 동안. 뉴런은 처음에 핵동태화 과정에서 길쭉한 세포체를 표시합니다.후행 프로세스와 분기 선행 프로세스뿐만 아니라. 3시간의 라이브 이미징 후 핵동형성이 완료됩니다. 후행 프로세스는 후퇴하고 선행 프로세스는 두 개의 긴 가지를 확장하고 있습니다.5시간 30분이 지나면, 주요 돌기 분지 중 하나가 후퇴하고 뉴런 세포체가 약 10미크론 앞으로 이동했습니다. 마지막으로, 8시간의 이미징 후 이동이 일시 중지되고 뉴런이 선행 과정을 다시 확장하며 후행 과정이 나타났습니다. 그러나 핵심은 아직 앞으로 나아가지 않았다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 가능한 한 항상 멸균 환경을 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 이 절차에 따라 MG 전기천공법과 같은 다른 방법을 수행한 후 외식법을 수행하여 초세포 수준에서 뉴런 이동 중에 발생하는 동적 세포골격 과정을 설명하기 위한 답변에 대한 추가 질문을 해결할 수 있습니다.

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-cultures-embryonic-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 주변 신경 가지의 재배와 시간 경과 영상을위한 중간 회임 마우스 배아의 organotypic 조각을 준비하는 방법을 제시한다.

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

E12.5 murine 배아 midbrain에서 organotypic 조각을 생성하는 방법을 설명합니다. organotypic 슬라이스 문화가 dopaminergic 신경이나 다른 복부 midbrain의 뉴런의 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을...

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

Source:&lt;span style='background-color:#f9f9f9;color:#1155cc;'&gt;Wiegreffe, C., et. al.,  배아 마우스 뇌의 유기형 슬라이스 배양에서 이동하는 뉴런의 타임랩스 공초점 이미징 자궁에서 Electroporation. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오는 심실하 영역에서 피질 뉴런 방사상 이동을 관찰하기 위한 타임랩스 컨포칼 현미경을 보여줍니다. 형질도입된 마우스 배아 뇌 절편에서 방사형 신경교골(radial glial scaffolds)을 통해 피질 플레이트(cortical plate)로.

transducted mouse embryonic brain slices에서 피질 뉴런 요골 이동의 타임랩스 이미징

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

여기에서는 해마 발달 중 특정 유전자의 조절 메커니즘을 조사하는 도구를 제공하는 프로토콜을 제시합니다. 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation) 및 유기형 절편 배양을 사용하면 단세포에서 관심 유전자의 발현을 상향 및 하향 조절하고 발달 과정에서 이들의 운명을 따를 수 있습니다.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 마우스 배아 뇌 오가노타입 슬라이스 배양에서 전자기천법을 이용한 GABAergic 신경세포의 이동 라이브 이미징 방법. 이 저비용 기술은 신경발달 장애 연구에 활용됩니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

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