Name: Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 학습하세요 쥐의 전정 및 청각 감각 기관 3차원 오가노타이픽 배양법을. 조직 형태를 보존하며 기계적 자극과 유전자 전달이 가능한 이 방법은 내이 발달 연구에 필수적인 플랫폼을 제공합니다.

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우리이 프로토콜 기반으로 원래 연구에 그들의 공헌에 대 한 박사 A. 야 코 보, 닥터 제이 Salvi, 그리고 A. Petelski 감사 합니다. 우리 또한 기술 지원 및 축산에 대 한 제이 라마와 W. Makmura을 감사합니다. 우리 R01DC015530, 로버트 슨 치료 개발 기금, 그리고 자금 카루소 가족 재단 NIDCD 부여 NIDCD 훈련 그랜트 T32 DC009975, 인정 합니다. 마지막으로, 우리는 하 워드 휴즈 의학 연구소, 박사 Hudspeth 탐정은 지원을 인정 합니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 동물 관리 및 사용 위원회의 록펠러 대학와 남부 캘리포니아의 대학 승인 있다.
1. (선택 사항) 준비 콜라겐의 나 Mouse-tail 힘 줄에서 솔루션
참고: 콜라겐 나 솔루션 상업적으로 사용할 수 있습니다. 젤 준비에 대 한 제조업체의 지침을 따릅니다.
<ol><li>5-10 젊은 성인 (3-5 주 이전) 마우스 프로토콜 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회16에 의해 승인에 따라 이산화탄소와 어떤 강포한 유형 긴장의 안락사 꼬리를 수집 하 고 실 온에서 4 h의 최소 70% 에탄올에 잠수 하 여 소독. 참고: 그것은 과도 한 조직 탈수에 결과 힘 줄 추출 과정을 방해 이상 48 h에 대 한 보육은 피해 야 한다.</li>
	<li>메스 칼 날 경도 컷을 소개 하 고 집게로 전체 피부를 제거 하 여 각 꼬리에서 피부를 제거 합니다. 100 mm 페 트리 접시와 10 mm 세그먼트로 그들을 잘라 깨끗 한 70% 에탄올으로 가득 차 피부 꼬리를 전송 합니다. 참고: 조작 하기 어려운 꼬리의 가장 얇은 부분을 삭제 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 페 트리 접시의 바닥에 꼬리의 각 세그먼트를 보안 하 고 좋은 집게의 두 번째 쌍을 사용 하 여 한 번에 하나의 꼬리에서 힘 줄을 추출. 개별 힘 줄 섬유는 최소한의 저항으로 등장 한다. 참고: 오래 된, 둔 #5 포 셉이이 단계에 대 한 잘 작동합니다.</li>
	<li>100 mL의 멸 균, 분자 급 물에 아세트산의 (볼륨)에 의해 0.1% 솔루션을 준비 하 고 살 균 100 mm 페 트리 접시에 해당 솔루션의 10 mL를 추가. 페 트리 접시에 힘 줄을 전송 하 고 콜라겐 변성을 실 온에서 1 h 나 두고.</li>
	<li>무딘, 곡선 팁 살 균 메스 또는 iridectomy가 위를 사용 하 여 1-2 m m 조각으로 힘 줄을 말하다. 살 균 50 mL 튜브에 다진된 힘 줄을 전송 하 고 0.1% 아세트산 50 mL에 볼륨을가지고 추가 합니다. 참고: 4 사용 또는 5 꼬리는 콜라겐을 달성 하기 위해 산의 각 50 ml 나 2.0-2.5 mg/mL의 농도.</li>
	<li>콜라겐을 냉장 나 완전 한 단백질 변성을 촉진 하기 위하여 48 h의 최소 4 ° C에서 솔루션. 탁상 소용돌이와 소용돌이 하루에 두 번 1 분에 대 한 최대 속도를 설정합니다.</li>
	<li>Bicinchoninic 산 분석 결과 사용 하 여 솔루션의 단백질 농도 측정, 조정 하는 콜라겐 나 4 ° c.에 초 산, 그리고 저장소의 0.1% 솔루션을 추가 하 여 2.0-2.5 mg/ml 농도 참고: 콜라겐 나 솔루션 1 ~ 2 년 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>(선택 사항) 콜라겐을 원심 나 2000 x g 1 h 4 ° C와 반투명 최고 분수 (약 절반 볼륨의), 광학 투명 콜라겐을 달성 하기 위해 제 4에 젤 사용에 대 한 솔루션.</li>
</ol>2입니다. Vestibular 및 청각 기관의 해 부
<ol><li>관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회16에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 이산화탄소와 어떤 긴장 든 지의 임신 쥐 안락사 추출 하 고 배아를 목을 벨. 참고: Lfng 크리스챤T2/tdTomato 마우스 지원 4-hydroxytamoxifen17에 노출 시 세포의 영구 라벨 수 있도록 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>모든 작업 표면과 해 부 악기, #5 집게와 머리 칼18의 2 개 쌍을 포함 하 여 70% 에탄올과 그들을 청소 하 여 소독.</li>
	<li>살 균 메스 칼 날 경도 컷을 소개 하거나 #5 집게의 두 쌍을 사용 하 여 두 개의 반쪽에 각 머리 분할. 내부 귀19를 포함 하는 측 뼈를 추출 하 고 차가운 행 크의 균형된 소금물 (HBSS) 60 mm 페 트리 접시에 15 mL에 넣어. 얼음에 접시를 유지. 참고: 배아 단계에서 E13.5 E18.5의 범위에서 성공적으로 사용 되었습니다.</li>
	<li>(선택 사항) 부드럽게 포함 30 mL 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 흔들어 내 귀를 씻고 차가운 HBSS 및 교체는 HBSS 3 ~ 4 번. 얼음에 튜브를 유지. 참고: 이 단계는 조직 문화의 가능한 오염 제한 하 고 신속 하 게 조직의 저하와 세포 죽음을 방지 하는 4 ° C에 온도 가져온다.</li>
	<li>잘 #5 집게의 두 쌍을 사용 하 여, 내부 귀 측 뼈에서 하 고 차가운 HBSS 가득 60 mm 페 트리 접시에 귀, 3 또는 4 한 번에 전송 합니다.</li>
	<li>Vestibular 감각 기관 해 부.<ol>
<li>최대 귀 중간 측 방향 하 고는 utricle 찾습니다. #5 집게의 두 쌍, vestibular 장기 주변 연골을 제거 합니다. 그림 1에서 같이 부드럽게 vestibular 신경은 utricle 및 saccule, 반원의 운하 사이 연결을 끊다. 부드럽게 당겨는 utricle와 귀에서 우수 하 고 수평 반원의 운하의 첨부 ampullae. 참고: 이 메서드는 단계 E16.5-E18.5의 내 귀에 사용할 수 있습니다. 섹션 3 아래 연골 파편을 보존.</li>
	</ol>
</li>
	<li>달팽이 관을 해 부.<ol>
<li>집게를 #5 두 켤레와 청각 기관 주변 연골 조직을 제거 합니다. 그림 1에서 보듯이 부드럽게 사이 인공 와우는 saccule 연결을 끊다. 참고: 위한 단계 E13.5-E14.5, 내부를 치료 하 여 해 부 이전 연골을 부드럽게 귀 0.25% 콜라와 나 실 온에서 5 분에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션. 섹션 3 아래 연골 파편을 보존.</li>
	</ol>
</li>
	<li>넓은 nonstick 팁 장착 200 µ L 피펫으로 사용 하 여, 성장 매체 구성 된 DMEM/F12 33 m m Dglucose, 19 m m 탄산, 15 m m 4(2hydroxyethyl)-보충으로 가득 30 mm 페 트리 접시에 utricles와 cochleae를 전송 1piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 1mm 글루타민, 1mm 니코틴, 20 mg/L와 표 피 성장 인자, 20 mg/L 섬유 아 세포 성장 인자, 10 mg/L 인슐린, 5.5 mg/L 올려진다, 및 5 µ g/L 나트륨 selenite.</li>
	<li>해 부 동안에 소개 하는 상피에 상처의 치유를 허용 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 최대 3 h utricle 준비 유지 합니다. 달팽이 관 준비 해 부 후 콜라겐 젤 10 분에 전송 한다. 참고: 얼음 처럼 차가운 HBSS에서 해 부를 수행 하기 때문에 거기 아무 필요도 사전 37 ° c.에 성장 매체를 따뜻한</li>
</ol>3. (선택 사항) 콜라겐 조정 내가 Chondrocytes의 다양 한 농도 추가 하 여 강성을 젤
참고: Chondrocyte 격리 방법 Gosset 외 에서 수정 된 20
<ol><li>콜라의 1% 솔루션 준비 나 PBS와 저장소-80 ° c.에 100-200 µ L aliquots x 살 균 1 필요할 때 얼음에 서 리 없애다, 여러 freeze-thaw 주기를 피하.</li>
	<li>연골의 조각을 수집 하기 좋은 집게를 사용 10-12 귀에서 vestibular 및 청각 기관의 해 부에서 남은. 연골에서 별도 결합 및 내가 조직. 30 mm 페 트리 접시에 연골을 전송 하 고 살 균 성장 매체의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>무딘 곡선된 팁 살 균 메스 블레이드 또는 iridectomy가 위를 사용 하 여 연골 조각 길이 약 0.5 m m를 달성 하기 위해 조직 말하다.</li>
	<li>콜라를 추가 0.25%의 마지막 효소 농도 달성 하기 위해 연골과 매체를. 37 ° C와 5% 이산화탄소 기름에서 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송. 피펫으로 연골의 해리 조각과 솔루션에서 구별할 수 더 이상 없을 때까지 적극적으로 1000 µ L 피펫으로 매 20 분을 사용 하 여 다음 추가 20 분 동안 품 어. 참고: Utricle 준비 경우 chondrocyte 절연 2.9; 단계 수행할 수 있습니다. 그것은 걸립니다 약 2 시간 (pipetting 라운드 3-4).</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 살 균 1 x PBS와 10 mL을 볼륨을 조정 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 800 x g에서 원심 분리기 상쾌한을 제거 하 고 살 균 1 x PBS의 10 mL에 셀 resuspend. 4 ° C에서 5 분 동안 800 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다. 참고: 셀을 두 번; 세척 하는 것이 중요 모든 나머지 콜라 나 내가 젤 콜라겐을 다이제스트 것입니다.</li>
	<li>200 µ L 피펫으로 사용 하 여 셀 펠 릿을 부드럽게 resuspend을 피펫으로 문화 매체의 100 µ L를 추가 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 사용 하기 전에 얼음에 그들을 유지 하는 것.</li>
	<li>젤 강성을 높이기 위해 추가 chondrocytes 무력화 콜라겐 젤 솔루션 (제 1 항) 하 고 급속 하 게 혼합 응고 전에 젤을 통해 셀을 배포. 참고: 탄성 계수는 콜라겐의 내가 젤 (강성 측정), chondrocytes 수와 선형 증가 추가11. 실험적 결정된 선형 함수 E 에 의해 관계를 설명 하는 206· = Nc + 15, 있는 E 파스칼 및 Nc 에서 탄성 계수는 수백만에서 chondrocytes 수입니다. 젤에 대 한 자세한 프로토콜에 대 한 강성 측정을 참조 하십시오 원래 제11.</li>
</ol>4. 장소 내가 젤 콜라겐에서 Vestibular 또는 청각 감각 기관
<ol><li>살 균 1.5 mL 튜브에 콜라겐 준비 나 페 놀 레드 pH 지시자, 0.34 M 수산화 나트륨의 133 µ L, 0.9 M 나트륨 중 탄산염의 70 µ L와 1 M HEPES의 40 µ L 10 x PBS의 160 µ L를 혼합 하 여 중 합 솔루션. 얼음에 튜브를 유지. 참고: 이 제조 법 합 솔루션을 콜라겐 젤, 하지만 필요에 따라 조정 될 수의 2 개 mL를 준비 하는 데 필요한을 제공 합니다.</li>
	<li>합 솔루션 및 콜라겐의 400 µ L의 믹스 100 µ L 나 부드럽게 위아래로 냉장된 1.5 mL 튜브에 pipetting으로 얼음에 솔루션. 젤 강성을 높이기 위해 chondrocytes 포함 된 성장 매체의 50 µ L을 추가 하 고 섹션 3에 설명 된 대로 부드럽게 혼합 합니다.</li>
	<li>중화 콜라겐의 500 µ L을 전송 나 솔루션 10 m m 유리 하단 삽입 냉장된 30 mm 페 트리 접시 또는 4-잘 접시의 우물. 참고: 그것은 콜라겐의 신속 하 고 고르지 못한 중 합을 방지 하기 위해 얼음에 모든 시 약을 유지 하는 중요 한 나.</li>
	<li>신속 하 게 무력화 콜라겐을 cochleae 또는 utricles를 전송 나 솔루션 메 마른 머리 칼18 와 미세 집게의 쌍 그들의 원하는 위치에 장기 조정. 참고: 콜라겐 나 솔루션 탁 되면서 중 합 1-2 분 후 눈에 띄게 된다.</li>
	<li>조직 중심 솔루션은 생산 후 완전 한 중 합을 보장 하기 위해 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 페 트리 접시 또는 20 분 4-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>페 트리 접시 또는 4-잘 접시의 당 같은 매체의 500 µ L 당 0.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 성장 매체의 3 mL를 추가 합니다. 5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화를 유지 합니다. 원하는 경우, 성장 매체 10 µ M 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀) 세포 확산을 함께 보충. 참고: 원하는 경우 높은 FBS 농도 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 바이러스 주사 Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 문화에
<ol><li>얼음에 원하는 바이러스에 서 리 없애다과 0.05%의 최종 염료 농도 달성 하기 위해 0.5 mL 원뿔 튜브에서 trypan 블루 솔루션 믹스. 10-20 x 염료를 사용 하 여 바이러스의 실질적인 희석을 피하기 위해. 얼음에 계속. 참고: 아 데 노비 루스 serotype 5 작품을 최고의 adeno 관련 바이러스 Anc80 두 세포를 감염 시킬 수 있습니다 반면 utricle19에서 지 원하는 세포를 감염 하 고는 utricle에 달팽이 관21셀을 지원 하기 위한.</li>
	<li>해 부 현미경 쌍안경의 높은 배율에서 관찰 하는 동안 깨끗 한 고 운 집게 micropipette 끌어당기는 사람에 준비 유리 바늘의 팁을 휴식. 참고: 그것은 바늘 끌어당기는 설정을 최적화 하는 것이 중요입니다. 9-12 m m 정강이로 바늘을 20-30 μ m 채용 적합합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 감각 기관 문화를 제거 합니다. microinjector에 바늘을 연결 하 고 염료 및 바이러스 혼합물의 2-3 µ L로 그것을 채우십시오. 해 부 현미경 눈 아래 그것을 관찰 하는 동안 바늘 감각 기관에 사전.</li>
	<li>부드럽게 3 차원 utricular 문화의 엽과 상피 층을 통해 바늘 팁 드라이브. 파란색 염료 채울 utricle ampullae의 충 치 때까지 바이러스 성 혼합물을 주사. 참고: 감각 기관에 쉽게 접근할 수 있기 때문에 10 m m 유리 하단 페 트리 접시 주사에 대 한 최적입니다.</li>
	<li>5% 이산화탄소와 기름 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어. 참고: 녹색 또는 빨간색 형광 단백질을 바이러스 구문에서 사용 될 때 형광은 명백한 24 h 바이러스 성 변환 후.</li>
</ol>

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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).</li>
<li>Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cochlear+convergent+extension+by+the+vertebrate+planar+cell+polarity+pathway+is+dependent+on+p120-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin.</a> Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).</li>
<li>Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulates+extension%2C+growth+and+patterning+in+the+mammalian+cochlear+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct.</a> Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

중재 하십시오 성장 및 개발 하는 동안 내가 차별화 된 분자 신호5,6,7,8,,910광범위 하 게 공부. 그러나 Utricular 모델 시스템에서 얻은 증거는 세포 접합 및 Hippo 신호의 활성화를 통해 감지 기계적 신호 또한 중요 한 역할 이러한 프로세스2,11, 에서 제안 하는, 22. 또한, 모두 감각 상피에서 죽어가는 세포의 압출 및 transdifferentiation 통해 새로운 감각 수용 체의 후속...

대부분의 포유류 기관 개발 측면의 연구 생체 외에서 시스템에 의해 촉진 되었습니다. 두 가지 주요 방법을 지금 vestibular 감각 기관의 문화에 대 한 사용 된다: 부동성1 및 부착2 . 두 방법 모두 머리 세포 취약점3 및 재생1,4 체 외조사를 허용합니다. 또한, 노치5,6, Wnt7,8, 그리고 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)9,10 신호 계곡 내가의 발달 역할을 설립, 부분적으로, 생체 외에서 문화 감각 epithelia 통해. 그러나, 세포 성장과 분화 제어 됩니다, 뿐만 아니라 세포 외 매트릭스의 강성 morphogens 세포 연락처 등 물리적 및 기계적 신호를 통해 뿐만 아니라에 의해 신호 및 기계적 스트레칭 또는 긴축 통해. 이러한 기계적 자극의 역할 개발 내가 vivo에서 조사 도전 이다. 또한, 기존의 자유 부동 및 부착 문화 방법 등 연구 시험관에 대 한 적합 하지 않습니다. 여기 우리는 방법 설명 젤 나 콜라겐에서 3 차원 organotypic 문화에 대 한 다양 한 경직의. 이 방법은 주로 vestibular 및 인공 감각 기관의 비보에 아키텍처를 유지 하며 성장과 분화11기계적인 힘의 효과 조사
기계적 자극 신호 통로12,,1314,15, 마 등 다운스트림 분자 이벤트 활성화 알려져 있습니다 때문에 기계적 자극을 결합할 수 중요 하다 와 생화학 및 유전 조작. 여기에 설명 된 문화 방법 바이러스 중재 유전자 배달 허용 하 고 따라서 공부 기계 기도 하 고 분자 내가 개발11동안 신호를 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>#10 수술용 블레이드</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>#5 집게</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>Sigma</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL 대형 오리피스 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>30mm 유리 바닥 페트리 접시</td><td>Matsunami Glass USA Corporation</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4 웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxytamoxifen&nbsp;</td><td>시그마</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm 페트리 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>아세트산&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, 치킨 IgY 분획</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 항체 (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자</td><td>Sigma</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>혈구계&nbsp;</td><td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>홍채제거 가위&nbsp;</td><td>Zepf 의료 기기</td><td>08-1201-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>Narishige</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 pH 지시약&nbsp;</td><td>시그마</td><td>P4633&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>순수 에탄올, 200 프루프</td><td>데콘 랩스&nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP 항체</td><td>ChromoTek</td><td>&nbsp; 5F8</td><td></td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이</td>트 <td>시그마</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>소듐 수산화물</td><td>시그마</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>소듐 셀렌나이트</td><td>시그마</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>테이블탑 보텍스&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>트랜스페린</td><td>시그마</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루&nbsp;</td><td>시그마</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 organotypic 문화

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

내가 감각 기관 포유류 실험적인 조작 및 광학 관측의 어려움 때문에 공부에 도전 하. 또한, 기존의 문화 기술을 허용 생화학 물결, 이러한 메서드는 내가 감각 기관의 발달 동안에 기계적인 힘 및 조직 경직 효과 공부 하는 방법을 제공 하지 않습니다. 여기는 그대로 murine utricle 이러한 한계를 극복 하는 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화에 대 한 방법에 설명 합니다. 여기에 설명 된 3 차원 매트릭스 강성의 조정 위한 기술 조직의 성장 반대 탄성 력의 조작을 허용 합니다. 이 방법은 따라서 내가 개발 하는 동안 기계적인 힘의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다. 또한, 문화 유전자 바이러스 중재 배달, 이득 및 손실-의-기능 실험을 위해 사용 될 수 있는 허용 한다. 이 문화 메서드는 타고 난 세포를 유지 하 고 지 원하는 세포 vestibular 및 청각 감각 기관의 전통적인 2 차원 문화에 대 한 잠재적으로 우수한 대안 역할.

Vestibular 및 청각 감각 기관 배아 귀에서 교양 40 Pa 콜라겐에서 내가 젤 낮은 강성 미 발달 조건11을 흉내 낸 상대적으로 정상 차원 구조 (그림 1)를 유지 하 고 세포를 유지 하 고 셀 (그림 2 및 그림 3)를 지원합니다. 30% 이상 감소 셀 밀도 지원 하지만 (스튜던트 t-검정: n = 4, p &lt; 0.004) 머리 세포 밀도 60% 감소 (스튜던트 t-검정: n = 5, p &lt; 0.0001) utricular 문화 (그림 2에서에서 3 일 후 ), 복식 시간11 의 같은 기간 ...

Murine utricle에 달팽이 관의 3 차원 organotypic 문화 광학, 콜라겐 보존 타고 난 조직 형태를 젤 취소 조정 매트릭스 강성의 기계적 자극에 대 한 허용 및 바이러스 중재 유전자 납품을 허용.

Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

이 절차의 전반적인 목표는 쥐, 전정 및 청각 감각 기관의 3차원 유기형 배양을 확립하는 것입니다. 이 방법은 내이 감각 기관의 발달 중 기계적 힘과 조직 강성의 역할은 무엇인지와 같은 내이 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 전정 달팽이관의 타고난 구조를 대부분 보존하고 내이 발달 과정에서 분자 및 기계적 신호를 모두 연구할 수 있다는 것입니다.Hudspeth 박사와 저는 3차원 배양이 체외 전정 장기 성장을 연구하기 위한 형태학적 조건을 제공할 수 있다는 것을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 먼저 70% 에탄올을 사용하여 작업 영역과 5번 집게와 헤어 나이프를 포함하여 필요한 모든 해부 도구를 청소하고 소독합니다. 그런 다음 멸균 메스 날을 사용하여 세로로 자르고 쥐의 머리를 두 부분으로 나누고 측두골을 추출합니다.얼음 위에 60mm 페트리 접시에 15ml의 HBSS 버퍼를 옮깁니다. 다음으로, 두 쌍의 미세한 숫자 5 겸자를 사용하여 내이를 측두골에서 분리하십시오. 그런 다음 얼음처럼 차가운 HBSS 완충액이 들어있는 60mm 페트리 접시에 한 번에 3-4 개의 귀를 옮깁니다.다음으로, 난소의 위치를 찾기 위해 내측이 위로 향하도록 귀의 방향을 잡습니다. 두 쌍의 숫자 5 겸자를 사용하여 전정 기관을 둘러싼 연골을 제거합니다. 다음으로, 전정 신경, 난소와 주머니 사이의 연결, 반고리관을 잘라 귀에서 난소와 부속된 팽대를 제거합니다.필요한 경우 과도한 반고리 운하를 다듬습니다. 또는 두 쌍의 5번 겸자를 사용하여 청각 기관을 둘러싼 연골 조직을 제거합니다. 그런 다음 달팽이관을 분리합니다.다음으로, 달라붙지 않는 넓은 팁이 장착된 200마이크로리터 피펫을 사용하여 달팽이관과 난소를 DMEM/F12 기반 성장 배지로 채워진 30mm 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 달팽이관과 난소 조제물을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소가 가스로 주입된 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 이것은 밀폐된 루멘을 가진 장기 배양을 달성하기 위한 것입니다.100마이크로리터의 콜라겐 1중합 용액을 멸균 1.5ml 튜브에 준비합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 두십시오. 다음으로, 조직 배양 인큐베이터에서 달팽이관 및 난소 제제를 제거합니다.중화 콜라겐 원용액을 준비합니다. 이렇게 하려면 얼음 위에서 여러 번 피펫팅하여 100마이크로리터의 중합 용액이 담긴 냉각된 1.5ml 튜브에 콜라겐 1 400마이크로리터를 추가합니다. 500마이크로리터의 중화 콜라겐 1용액을 10mm 유리 바닥 인서트가 있는 30mm 페트리 접시에 옮깁니다.달팽이관 또는 난소를 즉시 중화된 콜라겐 원용액으로 옮기고, 팁이 달라붙지 않는 넓은 피펫을 사용합니다. 멸균 헤어 나이프 또는 가는 집게를 사용하여 양안 해부 현미경으로 장기를 원하는 위치로 조정합니다. 완전한 중합을 위해 페트리 접시를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.20분 후, 각 페트리 접시에 0.5%fetal bovine serum이 보충된 3ml의 성장 배지를 추가합니다. 성장 배지를 첨가 한 후 섭씨 37도에서 배양액을 배양합니다. 먼저 얼음에서 바이러스를 해동합니다.그런 다음 0.5ml 원뿔형 튜브에 바이러스 현탁액과 트리판 블루 용액을 혼합하여 최종 염료 농도를 0.05%로 조정합니다.트리판 블루 용액을 혼합한 후 바이러스 입자를 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 쌍안 해부 현미경을 사용하여 깨끗하고 미세한 집게가 있는 마이크로 피펫 풀러에 준비된 유리 바늘 끝이 파손되는 것을 관찰합니다. 먼저 인큐베이터에서 감각 기관 배양을 제거합니다.마이크로 인젝터에 바늘을 부착합니다. 바늘에 2-3 마이크로 리터의 염료와 바이러스 혼합물을 채 웁니다. 바늘을 감각 기관에 삽입하는 동안 양안 해부 현미경을 통해 살펴봅니다.3차원 난소 배양 지붕의 중간엽 및 상피층을 통해 바늘 끝을 계속 전달합니다. 난소와 팽대의 구멍이 파란색 염료로 채워질 때까지 바이러스 혼합물을 계속 주입하십시오. 그런 다음 5%의 이산화탄소로 가스를 공급한 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 장기 배양을 배양합니다.이것은 3차원 콜라겐 원 젤에 내장된 난소 및 달팽이관 배양의 광학 현미경 이미지입니다. 난소와 달팽이관은 각각 17.5일과 14.5일 된 배아에서 채취하여 48시간 동안 배양합니다. 이 컨포칼 현미경 이미지는 40PA 콜라겐 원 겔에서 이식 직전과 직후의 18.5일 된 배아 난소를 보여줍니다.배양에서 3일이 지난 후에도 Myo7A 양성 유모 세포의 거의 80%가 손상되지 않았습니다. 지지 세포 밀도는 30% 이상 감소하고 유모 세포 밀도는 난소 배양에서 3일 후에 60% 감소합니다. 이 컨포칼 현미경 이미지는 40PA 콜라겐 원 젤에 이식 직전과 직후의 14.5일 된 배아를 보여줍니다.배양 3일 후, Myo7A와 Sox2 양성 내측 및 외측 유모 세포는 형태학적으로 구별할 수 있으며 약 4-5개의 열로 조직됩니다. 여기에서 이미지는 달팽이관 기저부와 각각 배아 15.5일 및 17.5일에서 얻은 요실 3차원 배양 전반에 걸쳐 지지 세포의 성공적인 바이러스 감염을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 온전한 내이 감각 기관을 해부하고, 난소 및 달팽이관 및 콜라겐 1형 젤의 3차원 배양을 확립하고, 이러한 3차원 배양에서 바이러스 형질 주입을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.유전자 화물에 따라 바이러스 입자를 다루는 작업은 위험할 수 있다는 점을 기억하십시오. 개인 보호 장비 착용 및 적절한 바이러스 폐기와 같은 예방 조치를 항상 실천해야 합니다.

three-dimensional-organotypic-cultures-vestibular-auditory-sensory

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

immunohistochemistry과 공촛점 현미경 다음 Corti의 기관을 sectioning vibratome의 간단한 절차 설명합니다. 이 절차는 Corti의 포유 동물 장기의 벌금 cytoarchitecture 개선 보존을 허용하고, 결과적으로 세포 유형의 정확한 양을 정함을 허용합니다.

Vibratome는 Corti의 포유 동물 조직의 Cytoarchitecture의 향상된 보존을위한 Sectioning

이 비디오는 내이에서 나선신경절 외식부위를 분리하고 다전극 어레이에서 코르티 기관과 함께 배양하는 과정을 보여줍니다. 나선신경절(spiral ganglia)은 조심스럽게 추출되어 더 작은 조직 절편 또는 외식부로 절편화됩니다. 이러한 외식은 다전극 어레이의 활성 영역에서 배양되어 신경 세포 프로세스 성장을 촉진합니다.

Culturing Murine Spiral Ganglion Neuron Explants on Multielectrode Arrays(다전극 어레이에 대한 쥐 나선형 신경절 뉴런 배양

전정 헤어 세포 기능의 분석은 두개골, 추체 측두골의 가장 어려운 부분 깊은 곳의 위치가 복잡합니다. 대부분의 기능 모발 세포 연구는 심하게 고립 된 유모 세포를 사용했습니다. 여기에서 우리는 전기 생리학 및 2 광자 현미경 연구를위한 마우스 전정 상피 세포의 반 그대로 준비에 대해 설명합니다.

전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

우리는 뉴런 반응 프로파일을 연구하고 자극 매개변수를 최적화하기 위해 다중 전극 어레이에서 1차 쥐 나선 신경절 뉴런 외식재를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 연구는 인공와우의 뉴런-전극 인터페이스를 개선하여 환자의 청력과 장치의 에너지 소비에 도움이 되는 것을 목표로 합니다.

다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

본 연구에서는, 우리는 코르티의 기관을 포함하는 달팽이관 상피와 전 생체 배양에 의해 손상된 조직을 향해 이동하는 세포를 관찰하는 공초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 방법을 제시한다.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

여기에 제시된 방법은 내이의 전정 신경절 및 나선형 신경절 뉴런에서 해부, 해리, 배양 및 패치 클램프 기록에 대한 자세한 지침을 제공합니다.

Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

현재 프로토콜은 이전 프로토콜을 업데이트하고 고품질 인공와우 배양을 위한 비교적 간단한 접근 방식을 통합합니다. 이를 통해 살아있는 세포와 고정된 세포에서 신뢰할 수 있는 데이터 수집과 고해상도 이미징을 제공합니다. 이 프로토콜은 내이 세포를 연구하는 지속적인 추세를 지원합니다.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

여기에서, 우리는 마우스에서 일차 달팽이관 유모 세포를 분리하고 배양하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 처음에는 Corti의 장기를 현미경으로 신생아(3-5일령) 쥐 달팽이관에서 절개했습니다. 이어서, 세포를 효소에 의해 단일세포 현탁액으로 절단하고, 배양에서 며칠 후에 면역형광을 이용하여 확인하였다.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

여기에서는 미로 절제술 중 생리학적 조건에서 인간 전정 말단을 적출하는 기술과 면역 염색을 사용한 분석에 대해 설명합니다.

Labyrinthectomy 중 생리학적 조건 하에서 전정 말단 장기의 수확

학습하세요 쥐의 전정 및 청각 감각 기관 3차원 오가노타이픽 배양법을. 조직 형태를 보존하며 기계적 자극과 유전자 전달이 가능한 이 방법은 내이 발달 연구에 필수적인 플랫폼을 제공합니다.

Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

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