Name: 통합 이미징 Cytometry Transcriptomic 변경된 Endocytic CD1d 매매 평가 하 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 학습하세요 이미징 유세포측정법과 전사체 분석을 결합하여 오염물질에 노출된 인간 수지상세포의 형태학적 변화와 기능적 변화를 평가하는 방법을. 이 기술은 유전자 발현과 단백질 기능을 연결하여 독성학적 진단 능력을 향상시킵니다.

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저자는 인간의 혈액 샘플에 대 한 로버트 Giulitto (Hoxworth 혈액 센터) 감사 및 유전자 발현의 정규화에 대 한 박사 Liang Niu 읽습니다. 우리는 또한 보조금 지원에서 국립 연구소의 환경 건강 과학 (ES006096) 감사, 환경 유전학 (CEG) 파일럿 프로젝트 (상훈), 알레르기 국립 연구소와 전염병 (AI115358)를 위한 센터 (상훈)의 대학 신시내티 대학 연구 위원회 포상 (상훈), 그리고 대학의 신시내티 대학의 약 코어 향상 자금 (X. Z.).

이 연구에서 인간의 프로토콜 신시내티 대학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 했다 및 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 건강 한 기증자 로부터 혈액 샘플은 신시내티 대학 의료 센터에서 Hoxworth 혈액 센터에서 얻은 했다.
1. Transcriptomic 오염 물질에 노출 된 인간 Monocyte 파생 된 Dc의 프로 파일링
<ol><li>BaP에 노출 된 Dc의 총 RNA 추출<ol>
<li>인간의 Dc cytokines GM-CSF와 IL-4를 사용 하 여 차별화 하 고 BaP Dc 4 일13노출.</li>
		<li>BaP에 노출 된 Dc cytometry 표면 표현된 마커 (-계보 HLA-DR+)에 따라 기존 DCs의 구성의 대부분을 사용 하 여 정렬 (CD11c+CD1c+)13. 일반적으로 10%를 포함 하는 문화 매체로 10000 Dc 정렬 FBS, Dc 600 g x 6 분, 4 ° C에서 원심 및 포부 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 여는 상쾌한을 즉시 제거.</li>
		<li>일단은 상쾌한 포부에 의해 제거, RNA 격리 킷 RNA 추출 전에-80 ° C에 저장에서에서 세포/바인딩 버퍼의 0.4 mL를 추가 하 여 셀 펠 릿을 lyse.</li>
		<li>총 RNA 추출 프로토콜 RNA 격리 키트를 사용 하 여 전체 RNA14추출. Bioanalyzer15를 사용 하 여 RNA 무결성을 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정렬 된 Dc (그림 1A)의 Transcriptomic 분석<ol>
<li>RNA-seq RNA 라이브러리 준비 키트를 사용 하 여에 대 한 라이브러리를 준비 합니다. 간단히 말해서, 격리 된 폴 리 A RNA 조각 (~ 200 bp), 녹음, cDNA의 1 가닥을 조각 하 고 dUTP 표시 두 번째 가닥 cDNA 합성에 의해 따라.</li>
		<li>비드 정화, 최종 수리 및 다 미행 후 줄기 루프 구조와 어댑터를 이중 가닥 cDNA를 선. 2 가닥 가닥 특이성을 유지 하 고 PCR 위한 어댑터 루프를 열고 사용자 (Uracil 전용 절단 시 약) 효소로 cDNA 및 어댑터 루프에서에서 uracil 잔류물 삭제하시오<ol>
<li>인덱싱된 라이브러리를 풍부 하 게 보편적이 고 인덱스 전용 프라이 머를 사용 하 여 PCR의 13 주기를 수행 합니다. 라이브러리를 청소 하 고 라이브러리 품질을 확인 하 고 배포 크기를 Bioanalyzer DNA 높은 감도 칩에서 실행.</li>
		</ol>
</li>
		<li>라이브러리 정량화 키트를 사용 하 고 실시간 PCR 시스템 결합 라이브러리 크기 정보 도서관 농도 를 통해 계산 하는 표준 곡선 방법.</li>
		<li>비례적으로 개별적으로 인덱싱된 호환 라이브러리 수영장 하 고 15 최종 총 농도 조정 오후. 라이브러리 클러스터 생성을 수행 하 고 시퀀스 샘플 당 ~ 25 백만 읽기를 생성 하기 위해 단일 읽기 1 x 50 bp의 설정에서 라이브러리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시퀀싱<ol>
<li>시퀀싱 및 SBS와 PE 시 약 선반에 시 약을 각각 색인을 로드 합니다. 시 약 1 시간에 대 한 실험실 급 물 욕조에 모든 얼음이 녹아 때까지 놓고 각 병/튜브에 약 제대로 혼합 됩니다.</li>
		<li>병 해 동된 염료와-20 ° C 효소를 추가 하 여 ICB 믹스를 준비 하 고 혼합. 시퀀싱의 지침에 따라 NaOH 솔루션을 준비 합니다. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 모든 시 약을 배치 합니다.</li>
		<li>1 시간 동안 전원 시퀀서에 대기 기간. DONOTEJECT 드라이브를 표시 하 고 네트워크 드라이브를 컴퓨터에 연결을 기다립니다.</li>
		<li>시퀀서 제어 소프트웨어를 시작 합니다.</li>
		<li>ProClin 300에서 실험실 급 물 2 L 0.5% 트윈 20, 0.03% 포함 된 유지 관리 세척 솔루션의 준비.</li>
		<li>SBS 시 약 선반에 각 8 병, 그리고 병에 나사 깔때기 뚜껑의 정비 세척 솔루션의 ~ 100 mL를 추가 합니다. PE 시 약 선반에 10 15 mL 원뿔 튜브의 각 유지 관리 세척 솔루션의 ~ 12 mL을 추가 하 고 모자를 삭제 합니다.</li>
		<li>시퀀서에 가득 솔루션 병/튜브와 함께 두 개의 선반을 로드 합니다.</li>
		<li>시퀀서 제어 소프트웨어에서 선택 유지 관리 세척; 프로세스가 완료 될 때까지 시퀀서 유체 시스템을 청소 하려면 화면의 지침을 따릅니다.</li>
		<li>소프트웨어;에서 "시퀀스" 탭에서 새로운 실행을 시작합니다 네트워크 드라이브에 출력 데이터를 직접. 단일 인덱스 멀티플렉스 라이브러리와 단일 읽기 1 x 50 bp에 대 한 매개 변수를 선택 합니다.</li>
		<li>필요에 따라 로그인 BaseSpace 시퀀스 허브는 컴퓨터 또는 스마트 휴대 전화를 통해 시퀀싱 상태를 원격으로 모니터링할 수 있습니다.</li>
		<li>샘플 시트를 디 멀티플렉싱에 대 한 업로드 하 고 소프트웨어 요구에 따라 시 약 정보를 제공.</li>
		<li>시퀀서에 SBS와 PE 시 약을 로드 합니다. 프라임 시스템 사용된 흐름 셀 (~ 15 분).</li>
		<li>클러스터 생성이 완료 되 면 (~4.5 h), 흐름 셀을 꺼내, 가볍게 닦아 렌즈 종이 사용 하 여 건조와 물, 흐름 셀을 스프레이. 가볍게 흐름 셀 95% 에탄올 스프레이 하 고 닦아 건조. 표면 파편 또는 소금 잔여물 없이 깨끗 한 있는지 확인 하는 빛에 대 한 확인 하십시오.</li>
		<li>주요 단계를 완료 한 후 클러스터 된 흐름 셀을 로드 하 고 시퀀싱을 시작. 시퀀스 분석 뷰어 소프트웨어가 자동으로 시작 됩니다.</li>
		<li>SAV 클러스터 밀도, 읽기 패스 필터, 클러스터 패스 필터 %, ≥Q30%, 레거시 위상/의향 %, QC, 등 이 데이터 품질을 이해 하 고 문제를 해결 하는 데 도움이 인덱싱을 통해 시퀀싱 데이터 품질을 모니터링 합니다.</li>
		<li>흐름 세포 가스 켓을 변경 하 고 시퀀싱을 완료 한 후 유지 관리 세척을 수행. 시퀀서는 다음 실행에 대 한 준비가 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioinformatic 분석<ol>
<li>생물 정보학 RNA-seq 데이터 분석13를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 경로 분석 Transcriptomic 프로필 (그림 1B)의
<ol><li>저 Bioconductor를 사용 하 여 결과 유전자 표현 강도 카운트 3 기증자 로부터 BaP 노출, 비 노출 Dc 사이 비교. 다음, 절대 배 변화에 따라 BaP 노출, 비 노출 Dc 사이 차동 표현한 유전자를 식별 (> 2 겹)과 거짓 발견 비율 (FDR)-조정된 p-값 (< 0.05).</li>
	<li>차동의 기능 클러스터 예측 유전자 표현, ToppCluster 소프트웨어 패키지 KEGG 및 REACTOME를 포함 하 여 여러 데이터베이스에 대해 변경 된 유전자 검색 및 클러스터링 데이터 생성을 사용 하 여. ToppCluster 사용 초기 하 시험 유전자 목록 농축 분석16통해 기능 풍부 합니다.</li>
	<li>또한 이러한 기능 클러스터에서 Cytoscape17,18 버전 3.3.0, 복잡 한 네트워크를 시각화에 대 한 광범위 하 게 사용 되는 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼의 결과 입력 합니다. 따라서, 다른 클러스터 또는 경로 endocytic 클러스터 등 지질 대사에 관여 하는 유전자는 유전자 (그림 1B) 식13의 평균된 배 변경의 컬러 주석 사용 하 여 네트워크에 표시 됩니다.</li>
</ol>3. 이미징 Cytometry CD1d 및 Lamp1 Colocalization
<ol><li>항 체는 BaP 노출 Dc의 라벨<ol>
<li>완전 한 Dulbecco의 2 개 mL에서 37 ° C에서 4 일 동안 5.94 m m BaP에 노출 0.5 x 106 인간의 Dc 수정 독수리의 매체. 수확 Dc 10 분 블록에 대 한 400 x g에서 원심 분리 하 여 차별화 된 Dc 인간의 혈 청 차단기와 얼음, 안티-인간의 CD16, CD32, 및 CD64 항 체를 포함 하 여 10 분 동안 안티 인간 Fc 수용 체 항 체는 세포를 배양 하 여.</li>
		<li>화려한 바이올렛 421-안티-CD1c (L161)를 품 어, phycoerythrin/cyanine 염색 7 (PE/Cy7)-안티-HLA-DR, 그리고 PE/Cy5-안티-CD11c 얼음에 20 분에 대 한 Dc와. 표 1 항 체의이 목록을 보여 줍니다.</li>
		<li>PBS에서 4 %paraformaldehyde Dc를 수정 하 고 Permeabilization 워시 버퍼 permeabilize. 알 렉 사 Fluor 647 표시 된 안티-Lamp1 (CD107a)와 PE 라는 순화 안티 인간 CD1d의 혼합물 (51.1) 얼룩이 지는 세포내 수행 (H4A3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>영상 교류 cytometry 측정 (그림 2)<ol>
<li>약 10 m m 직경에 있는 셀에 대 한 300 픽셀을 40 X 목표를 사용 하 여 신시내티 아동 병원의 교류 cytometry 핵심 영상 교류 cytometer를 사용 하 여 스테인드 샘플을 분석 합니다. 1 픽셀 크기는 개체의 0.5 m m로 약 0.5 m m입니다.</li>
		<li>제조업체의 지시에 따라 공평한 방식으로 10000 세포 이미지를 획득.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 영상 분석 흐름 Cytometry 이미지의
<ol><li>Colocalization 분석 아이디어 소프트웨어 (그림 2)를 사용 하 여<ol>
<li>수행과 보상 비 묻은 샘플 대 BaP autofluorescence, 일상적인 흐름 cytometry 데이터에서와 BaP 노출 Dc 스테인드 비를 포함 하 여 임계값 비 물 샘플의 형광 강도 설정 하 여 단일 스테인드 분석입니다.</li>
		<li>+CD1d HLA-DR+CD11c의 하위 집합을 얻기 위해 셀 스테인드 게이트+Lamp1+ 세포 (그림 2A)와 (그림 2B) 문이 하위 집합에 표시 세포 이미지.</li>
		<li>Png 형식 두 기술 포함 기준에 따라 강력한 공동 스테인드 신호의 시각적 존재와 ImageJ 피지 (그림 2B)를 사용 하 여 colocalization 분석 CD1d 및 Lamp1 단백질의 subcellular 지 방화 셀 이미지를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소프트웨어 ImageJ 피지를 사용 하 여 수행 하는 colocalization 분석 (그림 3).<ol>
<li>비 노출 및 BaP에 노출 된 인간의 Dc에 대 한 각각 100 저장된 셀 이미지를 병합 하 여 입력된 이미지 파일 준비 (그림 3A).</li>
		<li>CD1d 분석 (빨강) 및 Lamp1 (그린) colocalization는 scatterplot를 사용 하 여.<ol>
<li>ImageJ 피지 프로그램을 실행 합니다. 100 셀 이미지 (그림 3B 와 그림 4A).png 파일을 열고: "파일 | 열기".</li>
			<li>빨간색 또는 녹색 채널 두 이미지로 병합 된 빨간색과 녹색 채널 이미지를 분할: "이미지 | 컬러 | 채널 분할".</li>
			<li>명령을 사용 하 여 scatterplot 그리기 "분석 | Colocalization | Colocalization 임계값". Scatterplot "PrintScreen" 키를 사용 하 여 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 단일 세포 이미지 Mander의 colocalization 계수를 계산 (n = 100) (그림 4B)<ol>
<li>분할 채널 사용 하 여 이미지 파일에 이미지를 단일 셀을 선택 합니다 "타원형" 선택 도구.</li>
			<li>명령을 사용 하 여 "분석 | Colocalization | Colocalization 임계값". 관심 (ROI) 영역 대화 상자에서 "채널 1"을 선택 합니다. 각 셀 이미지 "Mander의 사용 하 여 임계값"을 비롯 한 모든 계산 옵션을 유지 합니다.</li>
			<li>모든 100 셀 이미지에 대 한이 계산을 반복 합니다.</li>
			<li>저장 하 고 스프레드시트를 사용 하 여 결과 엽니다.</li>
			<li>평균 및 표준 오류 "thresholded Mander의 계수" 플롯 (n = 100, 0은 아무 colocalization 및 1 의미 완벽 한 colocalization). 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 BaP 노출, 비 노출 그룹 (그림 4B) 사이 비교에 대 한 p 값을 계산.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Thresholded 픽셀 강도 공동 CD1d와 Lamp1 사이 여러 셀 이미지에 대 한 지역화의 %를 계산 (n = 100) (그림 4C).<ol>
<li>4.2.3에 동일한 분석 프로토콜을 사용 하 고 또한 결과 옵션 "colocalized 임계값 % 강도"를선택 합니다.</li>
			<li>Mander의 colocalization 계수 함께이 분석을 수행 합니다.</li>
			<li>마찬가지로 평균 및 표준 오류 CD1d와 Lamp1 사이 colocalized % 강도 플롯. 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 BaP 노출, 비 노출 그룹 (그림 4C) 사이 비교에 대 한 p 값을 계산.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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변경 된 유전자 통로의 기능 확인 널리 영향 을된 유전자 발현 포함 여러 통로 개인과 populational 세포 활동을 통합 하는 데 어려움 때문에 도전적 이다. 우리는 특별히 테스트 CD1d endocytic 구획에 인신 매매를 이미징 cytometry 고용. Cytometry 이미징 셀의 populational 측정 및 여러 단백질의 subcellular colocalization의 개별 데모 통합 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 이전 단백질 colocalization를 측정에 높은 해상도 제공 하 고 cytometry 다른 세포 인구에 대 한 포괄적인 형질을 제공할 수 있다. Confocal 현미경 검사 법 및 cytometry transcriptomic 변경의 기능 확인에 대 한 높은-프로 파일 방식으로 환경에 의해 단백질 colocalization 분석 하 허용 이미지 해상도 장점을 결합 cytometry 이미징 오염 물질입니다.
Populational 규모...

프레 젠 테이 션 항 원 일반적으로 자주 조사 형태학 상 특성 및 phenotypic 항 원 제시 세포1,2,3의 프로 파일링을 사용 하 여, 세포내 단백질을 포함 . 이미징 및 형질 방법의 장점을 통합 하는 이미징 분석 플랫폼 단일 세포 및 인간 모 수석 세포 (DCs)에서 변경 된 단백질 colocalization를 보여 인구 수준에서 설명 합니다. 펩 티 드 항 원 프레 젠 테이 션에서 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 I 분자 활성화 기존의 CD8 바인딩과 그물에 짧은 펩 티 드 (8-10 잔류물)을 바인딩할+ T 세포, MHC 종류 II 분자 바인딩 상대적으로 더 오래 동안 기존의 CD4 활성화 endocytic 구획에 있는 펩 티 드 (~ 20 잔류물)+ T 세포1,4. 반면, 지질 관련 T 세포 지질 항 원 endocytic 구획5,6에 주로 로드와 CD1 단백질에 의해 활성화 됩니다. 지질 항 원 프레 젠 테이 션에서 지질 물질 대사7,8,,910 와 로드에 CD1 단백질 기능 지질 대사 산물의 생산 지질 대사 산물의 공급 필요 endocytic 구획5,6. 이러한 맥락에서 변조 지질 항 원 프레 젠 테이 션, 질 성 오염 물질 및 면역 장애, 환경 노출에서 특히 다양 한 세포 요소는 정의할 수 중요 합니다. 이 연구에서 우리가 사용 transcriptomic 분석, 이미지 프로 파일링, 인간 monocyte 파생 된 Dc의 셀룰러 및 populational 이미징 분석 endocytic 단백질 오염 물질 노출에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 기여 매매 결정 하. 물론,이 결합 된 플랫폼 subcellular 단백질 매매 및 다른 생물학 과정에 colocalization를 공부 하 고 적용할 수 있습니다.
기술적으로, 단백질 subcellular 지 방화는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 검색된 셀1,2,,311의 한정된 된 수에서 분석과 통계를 시연 일반적으로 했다. 또한, cytometry 광범위에 적용 된 세포 레벨12;에 여러 단백질의 공동 스테인드 신호 게이트 세포 인구 그러나,이 상세한 시각화 subcellular 단백질 colocalization의 부족. 휴대 및 인구 수준 비율 단백질 colocalization의 포괄적이 고 통계 분석을 달성 하기 위해 우리 이미징 생물학과 단백질 colocalization의 기능을 확인 하려면 프로 파일링 및 분석 접근 통합 관련성입니다. 특히, 우리를 사용 하 여 이미징 cytometry CD1d lysosomal 관련 막 단백질 1 (Lamp1)의 colocalization를 검출이 연구에서 단백질. Colocalized 분자의 정량 분석 populational 규모에서 이전 어려웠다. 이 연구에서 우리는 populational 및 개별 세포 수준에서 공동 스테인드 세포 수가 많은 단백질 colocalization의 비율을 조사 ImageJ 피지 프로그램 적응. 특히, 강도, 공동 화 된 지역과 CD1d 단백질 질 성 오염 물질 benzo [a] pyrene (BaP)13에 노출에 인간의 Dc의 늦은 endocytic 구획에 크게 유지 했다 결론을 지원 하기 위해 populational 크기 측정 . 이 결합 된 셀룰러 및 인구 분석 이미징 CD1d-Lamp1 colocalization 저해 지질 항 원 프레 젠 테이 션 관련의 높은 재현성, 포괄적인, 통계적으로 유의 한 결과 제공 합니다.
BaP에 노출 된 인간의 Dc transcriptome 강하게 endocytic 지질 대사 및 CD1d endocytic 밀매 BaP 노출에서 손상 했다 가설을 지원. 이 가설을 테스트 하기 위해 우리는 CD1d, endocytic 마커 및 DC 마커 포함 하는 여러 단백질으로 얼룩진 공동 했다 DC 인구의 이미지를 프로 파일링 하려면 이미징 cytometry 적용. 마지막으로, 공동 스테인드 셀 강도의 비율 및 CD1d 및 Lamp1 colocalization의 영역을 통계적으로 분석 되었다.

<table><tbody><tr><td>전사체학</td>: <td>Illumina</td><td>HiSeq 2500 v4</td>, <td>Illumina HiSeq 시스템</td></tr>, <tr><td>ImagingStream X,</td><td>Millipore</td><td>100220</td>, <td>이미징, 유세포 분석,</td></tr><tr><td>mirVana miRNA 분리 키트</td><td>, Thermo Fisher</td><td></td>, <td>총 RNA 추출</td></tr><tr><td>, Agilent RNA 6000, Pico 키트</td><td>, Agilent</td><td></td><td>Total RNA QC 분석</td></tr><tr><td>, Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>, <td>Thermo Fisher</td><td></td><td>PCR, 효소 반응</td></tr><tr><td>NEBNext Poly(A) mRNA 자기 분리 모듈&nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>PolyA RNA 정제</td></tr><tr><td>자동화 SMARTer Apollo 시스템</td><td>Takara</td><td></td><td>PolyA RNA 정제</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Library 준비</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 자석 구슬</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA 정제&nbsp;</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, 크기 분포 분석</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, 크기 분포 분석</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Library 정량화</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Library 정량</td></tr> <tr><td>분석cBot</td><td>Illumina</td><td></td><td>라이브러리 클러스터 생성</td></tr><tr><td>TruSeq SR 클러스터 키트 v3 - cBot &ndash; HS</td><td>Illumina</td><td></td><td>Library 클러스터 생성</td></tr><tr><td>HiSeq 1000</td><td>Illumina</td><td></td><td>염기서열분석</td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td><td>Illumina</td><td></td><td>염기서열</td></tr>분석 <tr><td>Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td><td>Bio Legend</td><td>L243</td><td></td></tr><tr><td>Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td><td>Bio Legend</td><td>3.9</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant violet 421</td><td>Bio 레전드</td><td>L161</td><td></td></tr><tr><td>PE-안티 마우스 IgG2b</td><td>바이오 레전드</td><td>51.1</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루어 647 (AF647)</td><td>바이오 레전드</td><td>CD107a(H4A3)</td><td></td></tr></tbody></table>

통합 이미징 cytometry transcriptomic 변경된 endocytic cd1d 매매 평가 하 프로 파일링

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Endocytic 단백질의 형태 및 기능 변경의 populational 분석은 이미지 캡처 populational 수준에서 단일 셀 수준 및 통계 이미지 분석에서의 수요로 인해 도전. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 사용 이미징 cytometry transcriptomic (RNA-seq)를 프로 파일링 관련 차별화 1 d 단백질 (CD1d)의 클러스터의 변경 된 subcellular 지역화가 결정을 인간에서 손상된 endocytic 유전자 발현과 닥터지 일반에 노출 된 수지상 세포 (DCs), 공기 오염 물질 benzo pyrene [a]. CD1d 셀 이미지 이미징 cytometry 점령의 수천에서 endocytic 마커 Lamp1 단백질의 colocalization 아이디어와 ImageJ 피지를 사용 하 여 분석 프로그램. CD1d에 게이팅 후 공동 스테인드 CD1d 및 Lamp1 단백질 많은 세포 이미지 시각화 했다+Lamp1+ Dc 아이디어를 사용 하 여. BaP 노출 했다 Mander의 계수 공동 지역화 된 강도를 테스트 하 고 플롯 thresholded scatterplots를 사용 하 여 입증 시 향상 된 CD1d 및 Lamp1 colocalization ImageJ 피지를 사용 하 여 공동 화 된 영역의 비율 기반으로 합니다. 우리의 데이터 오염 물질에 노출 된 인간의 transcriptomic 변경의 장애인된 기능 결과 지 원하는 단일 및 populational 세포 수준에서 단백질 colocalization를 측정 하는 유리 기 악 및 bioinformatic 접근 방식을 제공합니다 Dc입니다.

질 성 오염 물질 BaP 변경 각 기증자 로부터 인간의 Dc. 인간의 monocyte 파생 된 Dc에서 endocytic 유전자 클러스터 (n = 3) BaP 함께 incubated 되었고 기존의 DCs, RNA 추출 및 분석용 transcriptomic 설명 된 대로 추가 사용에 대 한 정렬 . 유전자 발현의 정규화에 따라 BaP 노출, 비 노출 그룹 간의 변경된 유전자 차동 표현한 유전자의 기능 상관 관계에 따라 클러스터 했다. 우리는 Toppcluster 프로그램16 관련 세포 경로 분석에 대 한 변경 된 유전자 목록을 입력 하 고 p 값 (그림 1B)의 틀린 발견 비율 (FDR) 보정을 사용 하 여 통계 시험을 수행. 지질 대사 및 endocytic 기능을 포함 하 여 몇 가지 주요 변경된 유전자 클러스터 BaP 노출 Dc에서 발견 됐다. 이 연구에서 ...

Cytometry 이미징 개인과 populational 수준에서 세포의 형태학 적 및 기능적 변경 감지 하는 이상적인 접근을 제공 합니다. 오염 물질에 노출 된 인간의 수지상 세포에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 대 한 방해 endocytic 기능 유전자 발현 및 단백질 매매의 형태학 데모의 프로 파일링 결합된 transcriptomic 시연 했다.

통합 이미징 Cytometry Transcriptomic 변경된 Endocytic CD1d 매매 평가 하 프로 파일링

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

이러한 방법은 차세대 시퀀싱 및 유동 세포측정 이미징 분석을 통합합니다. 그것은 흥미로운 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다., 일부 표현 변경 연루 여부, 대신 전사, 특히 오염 물질 노출 환경에서. 이 간단한 방법의 주요 장점은 생물학적으로 중요한 단백질의 지역화를 측정하여 기능적 수준에서 주요 차등 유전자 발현의 결과를 해석하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 병리학적 및 독성 결과의 진단으로 확장됩니다. 일반적인 심조 접근법으로서, 예측은 유전자 발현을 단백질 기능에 연결하는 능력을 갖는다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 화상 진찰 및 전사 분석의 높은 기술적인 요구 때문에 투쟁할 것입니다.인간 단세포 유래 수지상 세포 라이브러리를 서열화하기 위해, 먼저 시퀀싱 및 인덱싱 시약 랙에 시퀀싱 및 인덱싱 시약을 각각 로드하고, 모든 얼음이 녹을 때까지 실험실 급수 욕조에 랙을 1시간 동안 배치하고, 시약은 철저히 혼합된다. 시약이 해동하는 동안 시퀀서의 전원을 켜고, 컴퓨터를 네트워크 드라이브에 연결하고, 이젝트 금지 드라이브가 나타날 때 네트워크 드라이브에 연결하고 시퀀서 제어 소프트웨어를 시작합니다. 다음으로, 시퀀싱 생합성 시약 랙의 각 병에 약 100 밀리리터의 유지 보수 세척 솔루션을 추가하고 깔때기 캡을 각 병에 나사로 넣습니다.인덱싱 시약 랙의 각 15 밀리리터 원모형 튜브에 약 12밀리리터의 유지 보수 세척 솔루션을 추가하고 캡을 폐기합니다. 그런 다음 두 랙을 시퀀서에 로드합니다. 시퀀서 제어 소프트웨어 내에서 유지 보수 세척을 선택하고 시퀀서 유체 시스템을 청소하는 지침을 따릅니다.손전등을 사용하여 차선을 통과하는 거품의 흐름 셀을 시각적으로 검사하여 누출이 없는지 확인합니다. 세척 순서가 완료되면 시퀀스 탭을 열고 새 실행을 시작하여 출력 데이터를 네트워크 드라이브로 안내합니다. 다중 해제를 위해 샘플 시트를 업로드하고 적절한 시약 정보를 입력합니다.사용 된 흐름 셀을 사용하여 시퀀싱 시약을 사용하여 시스템을 프라임합니다. 클러스터 생성이 완료되면 흐름 셀을 제거합니다. 그리고 가볍게 물로 세포를 스프레이.렌즈 종이로 흐르는 셀건조를 닦은 다음 95%에탄올이 있는 가벼운 스프레이를 뿌립니다. 유동 셀을 다시 닦은 후, 유동 셀의 표면을 빛에 대 고 확인 하 고 이물질이나 소금 잔류물 없이 깨끗 한 있는지 확인 합니다. 프라임 단계가 완료되면 클러스터된 유동 셀을 로드하고 시퀀싱을 시작합니다.시퀀스 분석 뷰어 소프트웨어가 자동으로 시작됩니다. 약 26시간 후, 고시퀀스 제어 소프트웨어를 통해 시퀀싱 데이터 품질을 모니터링하고 분석 뷰 소프트웨어를 시퀀싱하여 데이터 품질을 평가하고 문제 해결을 모니터링합니다. 이어서, 시퀀스가 끝나면, 유동셀 개스킷을 변경하고, 다음 실행을 시작하기 전에 유지 보수 세척을 수행한다.오염물질-노출된 수지상 세포의 유동 세포 측정 영상 후, ImageJ 피지를 열고, 치료군에 따라 비노출 및 오염물질-오염물질-노출된 인간 수지상 세포 샘플 그룹에 대해 저장된 100개의 세포 이미지를 병합한다. 두 집단 내에서 CD1d 및 Lamp1 colocalization을 분석하려면 오염 물질 에 노출된 100개의 병합된 셀 이미지를 열고 이미지, 색상 및 분할 채널을 선택하여 채널을 당 단일 플루오로포어로 두 개의 개별 이미지로 이미지를 분할합니다. 공동화된 픽셀의 분산 플롯을 만들려면 분석, 공동 현지화 및 공동 화 임계값을 선택하고 인쇄 화면을 눌러 분산 플롯을 저장합니다.각 단일 셀룰러 이미지에 대한 Mander의 지역화 계수를 계산하려면 타원형 선택 도구를 사용하여 분할 채널이 있는 이미지 파일의 단일 셀 이미지를 선택하고 분석, Colocalization 및 Colocalization 임계값을 다시 선택합니다. 그런 다음 관심 영역의 대화 상자에서 채널 1을 선택하고 확인을 클릭합니다. 계수가 모든 100개의 셀 이미지에 대해 계산된 경우 결과를 적절한 스프레드시트로 가져오고, 비노출된 셀 샘플 제어를 위한 분석을 반복한다. RNA 염기서열 분석 및 전사 데이터 분석을 사용하여 지질 대사 및 내세포 기능을 포함한 여러 가지 주요 변경 된 유전자 클러스터가 오염 물질 노출 DC에서 확인되었습니다.개별 세포 영상 수준에서 HLADR 양성 CD11c 양성 수지상 세포는 CD1d 및 Lamp1 공동발현에 따라 게이트될 수 있다. 제어 비 노출 수지상 세포는 최소한의 CD1d 및 Lamp1 단백질 colocalization화를 나타내며, 이는 CD1d 내막 인신 매매의 기저 수준을 나타내고, 생리적 조건 하에서 높은 수준의 표면 발현을 나타낸다. CD1d는 오염 물질 노출 수지상 세포의 늦은 내세포 구획에서 유지되는 반면, 이 실험적인 세포 집단에 있는 변경한 내낭성 유전자 단면도를 확인합니다.개별 셀룰러 이미지를 단일 이미지 파일로 병합한 후, 개별 이미지는 형광식에 따라 분할될 수 있으며, 두 채널 간의 픽셀 강도의 공존화는 분산 플롯에서 시각화될 수 있다. 두 치료 군에서 CD1d와 Lamp1 단백질 사이의 코현지화 정도는 Mander의 계수를 사용하여 정량화 될 수 있습니다. 단백질 강도가 지역화 영역과 비지역화된 영역 간의 이질적인 경우, 지역화된 강도는 지역화 부위와 평행하지 않으므로 픽셀 강도에 기초하여 두 단백질의 공동 현지화를 더욱 평가하는 것도 중요하다.일단 마스터되면, 각 기술이 제대로 수행되는 경우, 2시간 안에 화상 분석을 완료할 수 있고, RNA 시퀀싱 설정을 3시간 안에 완료할 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 시약이 올바른 위치에 올바르게 로드되고 시퀀서에 누출이 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 마이크로 RNA, 엑소메 또는 마스트 세포 염기서열분석과 같은 다른 방법은 각각 글로벌 마이크로 RNA 발현, 유전자 돌연변이 또는 DNA 메틸화에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.그래서 개발 후, 이 기술은 세포 화상 진찰 분석의 필드에 있는 연구원을 도울 것입니다, 그리고 차세대 순서는 유전자 발현 및 단백질 기능에 환경 오염 물질의 효력을 탐구하기 위하여. 이 비디오를 시청한 후에는 차세대 시퀀싱을 설정하는 방법과 단백질 합리화의 이미저 분석을 잘 이해해야 합니다. 인간의 혈액 샘플에서 독성 오염 물질 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험 할 수 있음을 잊지 마십시오.화학 연기 후드 및 개인 보호 장비를 사용하는 것과 같은 예방 조치는 이러한 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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