평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서
2018년 5월 11일
다양 한 센스 oligonucleotides (AONs) exon 포함 (스플라이스 변조) 유도 및 SMN 식 척수 근육 위축 증 (SMA)에 대 한 구조를 보였다. 여기, 우리는 SMN2 유전자와 SMA 환자의 섬유 아 세포에서 효능을 결정 하는 평가 방법에 exon 포함 유도 하 이온 lipotransfection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
이 lipotransfection 프로토콜의 전반적인 목표는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입하고 SMA 세포에 엑손 함유에 대한 이러한 약물의 효능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 안티센스 요법 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 환자에게 치료를 제공하기 위한 새로운 안티센스 올리고의 효능
.이 기술의 주요 장점은 다양한 안티센스 올리고뉴클레오티드 화학 물질을 테스트할 수 있을 만큼 빠르고 쉬우며 민감하다는 것입니다. 이 방법은 안티센스 올리고를 섬유아세포로 형질주입하는 데 사용할 수 있지만, 1차 근아세포 및 기타 다양한 세포주와 같은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Aleks입니다.
먼저 LNA/DNA 혼합체의 10마이크로몰 용액을 얼음에서 해동합니다. 혈청이 결핍된 매체의 혼합체 용액을 1.5ml 튜브에서 필요한 농도로 희석합니다. 다음으로, transfection 시약을 희석하고 희석된 transfection 시약을 1:1 비율로 mixmer에 첨가합니다.
transfection을 수행하는 동안 세포 밀도가 약 65-80%가 되는 것이 중요합니다. 포화도가 80% 이상이면 형질주입 효율이 감소합니다. 그런 다음 형질주입 시약 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.
10분 후, 5% 소 태아 혈청이 함유된 혈청이 결핍된 배지 900마이크로리터를 튜브에 피펫으로 주입합니다. transfection 시약 및 LNA/DNA mixmers와 함께 배양하기 전에 FBS를 추가하면 transfection 효율에도 영향을 미치므로 FBS를 추가하지 마십시오. 그런 다음 배양 플레이트에서 오래된 배지를 흡인합니다.
이제 LNA/DNA 혼합체가 포함된 배지 1ml를 배양 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 24-48시간 동안 그대로 두십시오. 배양 후 배양 플레이트에서 배지를 흡입합니다.
그런 다음 GPC 시약 1ml를 세포에 피펫팅합니다. 다음으로, GPC 시약으로 웰을 여러 번 세척합니다. 여러 번 세척한 후 1.5ml 튜브에 세포를 수집하고 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
다음으로, 30초 동안 튜브를 고속으로 와류시킵니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 영하 80도에서 한 시간 동안 보관하십시오. 이제 샘플을 실온에서 해동하고 빠르게 와류로 만듭니다.
다음으로, 샘플에 클로로포름 200마이크로리터를 넣고 15초 동안 세게 흔듭니다. 그런 다음 실온에서 3분 동안 튜브를 배양합니다. 3 분 후에, 12, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 g에 표본을 원심 분리하십시오.
원심분리가 끝나면 원심분리기 튜브 상단에서 수성상을 수집합니다. 그런 다음 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 500마이크로리터의 이소프로판올과 1마이크로리터의 RNA 등급 글리코겐을 마이크로리터당 8마이크로그램으로 수성상에 추가합니다.
10초 동안 샘플을 빠르게 소용돌이치고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 외피 후에, 12, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 g에 표본을 분리기. 실행이 끝난 후 상층액을 디캔팅합니다.
차가운 75% 에탄올 1ml를 넣고 잠시 와류를 일으켜 얻은 펠릿을 세척합니다. 다시 7500g의 시료를 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 모든 에탄올을 배출하고 펠릿을 실온에서 건조시킵니다.
펠릿이 건조된 후 30마이크로리터의 DNAse/RNAse 자유수에 용해시킵니다. 그런 다음 섭씨 60도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 분광 광도계에서 260 나노 미터에서 RNA의 농도를 읽고 마이크로 리터당 15 나노 그램으로 조정합니다.
RT-PCR 마스터 믹스를 구성하기 위해 2개의 X RT-PCR 반응 완충액, 1단계 RT-PCR 효소 혼합물, 정방향 및 역방향 프라이머, RNAse/DNAse 무함유 증류수를 추가합니다. 마스터 믹스를 0.2mm PCR 튜브에 분배하고 각 샘플에 대한 총 RNA를 추가합니다. 그런 다음 PCR 반응을 시작합니다.
RT-PCR이 완료된 후 증폭된 산물에 5마이크로리터의 6X 로딩 염료를 추가합니다. 그런 다음 2% 아가로스 젤에 혼합물 5마이크로리터를 로드합니다. 전기영동 장치를 100볼트에서 40분 동안 시작합니다.
먼저 다양한 믹싱머의 효율성을 연구합니다. 이를 위해 믹스머로 transfection된 SMA 섬유아세포에 SMN2, 엑손 7 및 GAPDH 수준의 포함을 분석합니다. 겔 이미지는 엑손 7의 포함을 보여주며, 상단 및 하단 밴드는 SMN2 RNA가 포함되거나 제외된 엑손 7을 나타냅니다.
함유 효율은 또한 1 - 5 mixmers로 transfection될 때 78 - 98%로 정량화됩니다. 반면에, 환자 SMA 섬유아세포를 형질주입하기 위해 mixmer 6 내지 8을 사용하는 경우 대조군과 비교하여 유의한 결과를 얻지 못했습니다. 실험에서는 GAPDH가 대조군으로 사용됩니다.
다음으로, GAPDH와 비교하여 전장 SMN2의 상대적 발현을 분석하기 위해 정량적 PCR을 수행합니다. SMN2 전사체 수준의 급격한 증가는 대조군과 비교하여 1-3 및 5번 혼합체로 transfection할 때 관찰됩니다. SMN 단백질 발현 수준도 연구되었는데, 이는 1번부터 5번까지의 믹스머로 transfection된 환자 섬유아세포에서 SMN 단백질 발현 수준의 증가를 보여줍니다.
SMN 단백질 수치가 1.5배에서 1.9배까지 급격히 증가하는 것이 관찰됩니다. 여기서 사용되는 컨트롤은 코필린입니다. 반대로, 6 내지 8 믹스머는 SMN 단백질 발현 수준을 변화시키지 않습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 안티센스 올리고를 섬유아세포에 transfection하고 in vitro에서 효능을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 논문은 척수성 근위축증(SMA) 치료를 목적으로 SMN2 유전자의 엑손 포함(exon inclusion)을 유도하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)를 세포 내로 도입하는 리포트랜스펙션(lipotransfection) 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 효율성은 SMA 환자 유래 섬유아세포에서 평가되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 유전학
- 세포생물학
배경
- 척수성 근위축증(SMA)은 운동 뉴런에 영향을 미치는 유전 질환입니다.
- 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 스플라이싱을 조절하여 SMN 발현을 회복시킬 수 있습니다.
- AON의 효과적인 전달 방법은 치료적 응용에 있어 매우 중요합니다.
- 본 프로토콜을 통해 다양한 AON 화학 구조를 테스트할 수 있습니다.
연구 목적
- SMA 세포에 AON을 효과적으로 도입하기 위함입니다.
- 엑손 포함(exon inclusion)을 유도하는 AON의 효능을 평가하기 위함입니다.
- AON 테스트를 위한 빠르고 민감한 방법을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 섬유아세포로의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 리포트랜스펙션.
- SMN2 유전자의 엑손 포함 여부 평가.
- 일차 근아세포를 포함한 다양한 세포 유형으로의 방법 적용.
- 실험실 기술자에 의한 절차 시연.
주요 결과
- 리포트랜스펙션(lipotransfection) 방법은 AON 전달에 효과적입니다.
- SMN2 유전자의 엑손 포함(exon inclusion)이 성공적으로 유도되었습니다.
- 이 프로토콜은 다양한 세포 유형에 적용 가능합니다.
- 결과는 SMA 치료제로서 AON의 가능성을 뒷받침합니다.
결론
- 이 리포트랜스펙션 프로토콜은 안티센스 치료 연구를 위한 가치 있는 도구입니다.
- 이를 통해 SMA 세포에서 AON의 효능을 빠르게 테스트할 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 이 방법을 확장하여 새로운 AON을 탐색할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업 관련성 요약
본 프로토콜은 환자 유래 섬유아세포에서 SMN2 엑손 포함(exon inclusion)을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)의 효능을 신속하고 민감하게 평가할 수 있게 하여, 스플라이싱 조절 치료제의 초기 단계 표적 검증 및 리드 물질 발굴을 지원합니다. 낮은 AON 농도에서 엑손 포함 정도와 단백질 복원력을 정량화함으로써, 효능이 개선되고 독성 프로파일이 낮은 후보 물질의 우선순위를 정하는 데 예측 신뢰도를 제공합니다. 이 방법은 세포 유형 및 화학적 구조에 따른 적응성이 뛰어나, SMA 약물 개발 파이프라인에서 전임상 리스크 감소와 중개 연구의 연속성을 촉진합니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 타겟 결합의 기능적 판독값으로서 SMN2 엑손 7 포함 효율을 측정함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: RT-PCR 및 qPCR을 사용하여 엑손 포함 및 전사체 수준을 정량화함으로써 타겟 검증을 위한 재현 가능한 정량적 결과물을 제공합니다.
- 예측적 가치: Western blot을 통해 용량 의존적인 SMN 단백질 회복을 입증하여, AON 후보 물질의 기전적 리스크 감소 및 포트폴리오 선별을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: LNA/DNA 믹스머(mixmers)를 포함한 다양한 AON 화학 구조의 고처리량 테스트와 호환되는 리포트랜스펙션(lipotransfection) 기반 워크플로우를 구축합니다.
- 재현성: 트랜스펙션 조건(65–80% 합류도, 시약 비율)과 GAPDH 및 cofilin 대조군에 대한 정규화를 표준화하여 실험 간 일관성을 보장합니다.
- 확장성: 일차 배양 근아세포 및 기타 세포주와 호환되어, 질병 관련 모델 전반에서 플랫폼 재사용이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: SMA 환자 유래 섬유아세포를 사용하여 유전적 및 표현형적 충실도를 유지함으로써, AON 스크리닝 데이터의 중개 타당성을 높입니다.
- 전임상 연속성: 엑손 포함(exon inclusion)을 SMN 단백질 발현과 연결하여, 분자 표적 조절부터 기능적 표현형 회복까지의 기전적 가교를 제공합니다.
- 위험 조정 추진: 엑손 포함 효율(78–98%) 및 단백질 배수 변화(1.5–1.9)를 바탕으로 진행 여부(go/no-go)를 결정할 수 있어, 후기 단계의 생물학적 위험을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 표적 검증부터 리드 화합물 발굴, 전임상 평가에 이르는 발견 연속체에 통합되어, in vivo 연구 전 AON 효능에 대한 반복적인 평가를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: GAPDH 정규화를 통해 오프타겟 효과를 배제하고 엑손 포함 정도를 정량화함으로써 스플라이스 전환 메커니즘의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 다양한 AON 화학 구조에 걸쳐 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 위해 분석 준비도와 정량적 출력값(엑손 포함 %, 전사체 배수 변화)을 제공합니다.
- 분석: 조건별 비교 분석이 가능하도록 측정 가능한 판독값(RT-PCR 밴드 정량화, qPCR 상대적 발현량, Western blot 단백질 수준)을 생성합니다.
- 중개 연구: 환자 유래 세포에서 분자적 효능을 단백질 복원과 연결하여, 바이오마커 일치 및 전임상 연속성을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 여러 AON 유형 및 세포 시스템에 적용 가능한 표준화된 리포트랜스펙션(lipotransfection) 프로토콜을 수립하여 중복되는 방법 개발을 줄입니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 엑손 포함(exon inclusion) 및 SMN 단백질 복원을 직접 측정하여 타겟 검증에 대한 예측 신뢰도를 제공합니다.
- 운영적 가치: 저농도에서 다양한 AON 화학 구조를 테스트하기 위한 표준화, 재현성 및 민감도를 보장합니다.
- 전략적 가치: 엑손 포함 효율과 단백질 발현을 연계함으로써 go/no-go 결정을 개선하고 후기 단계의 실패 위험을 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 정량적 효능 임계값을 기반으로 AON 후보 물질의 리스크 조정 우선순위 설정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 핵산 취급, 형질전환 최적화 및 RNA/단백질 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 형질전환 시약의 호환성, RNA 정량을 위한 분광광도계, 그리고 겔 전기영동/qPCR/Western blot 장비의 가용 여부에 따라 달라집니다.
- 재현 가능한 결과를 얻기 위해 형질전환 조건(세포 밀도, 시약 비율) 및 대조군 표준화(GAPDH, cofilin)에 대한 팀 간의 표준화가 필요합니다.
- 일차 근아세포(primary myoblasts) 또는 다른 세포주에 적용할 경우 형질전환 효율의 최적화와 세포 독성 평가가 필요할 수 있습니다.
- 실질적인 제약 사항으로는 환자 유래 섬유아세포의 계대 수에 따른 변동성과 추출 과정 중 RNA 무결성 유지의 필요성이 있습니다.
