Name: 평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 척수성 근위축증 환자 섬유아세포에서 SMN2 유전자 엑손 포함을 유도하는 리포트랜스펙션 방법을. 이 기술은 다양한 화학 구조의 항센스 올리고뉴클레오티드 효능을 빠르게 평가할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 실험에 대 한 니콜 McRorie 감사합니다. 이 작품은 의학 및 치과, Slipchuk SMA 연구 재단 연구 그랜트, 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 친구의 개렛 Cumming 연구 자금, HM Toupin Neurological의 앨버타의 대학 교수에 의해 지원 되었다 과학 연구 자금, 근 위축 증 캐나다, 혁신, 앨버타 기업 및 고급 교육 및 여 성과 어린이 건강 연구소 (WCHRI)를 위한 캐나다 기초.

1. 세포 배양
<ol><li>37 ° c.에 CO2 배양 기에 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간 1: 【-12 (햄) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 0.5% 페니실린/스)에서 문화 SMA 환자의 섬유 아 세포</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 하 고 세포에서 성장 매체, 다음 적절 한 판에 씨앗 1 x 105 셀/mL를 희석. RT-PCR 또는 정량에 대 한 12-잘 접시 (우물 당 1 mL)을 사용 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 CO2 배양 기에서 24 h에 대 한 번호판을 품 어</li>
</ol>2. LNA/DNA mixmer transfection
<ol><li>최적의 transfection 효율 약 65-80%의 셀 confluency를 확인 하십시오.</li>
	<li>10 μ M LNA/DNA mixmers 얼음에 천천히 녹여</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 최종 볼륨 도달 50 μ 혈 청을 박탈 미디어는 mixmers를 추가 하 여 20 x mixmer 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>Mixmer 솔루션 50 μ 3 %transfection 시 약 (1:1 비율)를 포함 하는 혈 청을 박탈 미디어의 혼합.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>추가 5 %900 μ 혈 청을 박탈 매체 FBS 각 관에.</li>
	<li>접시에서 오래 된 미디어를 발음 하 고 1 mL transfection 시 약을 포함 하는 LNA/DNA mixmer 솔루션으로 바꿉니다.</li>
	<li>CO2 배양 기에서 37 ° C에서 24-48 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
</ol>3. RNA 추출
<ol><li>매체를 제거 하 고 셀에 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-시 약의 1 mL를 추가 합니다. 하단의 guanidinium 안산-페 놀-클로 프롬과 잘 여러 번 세척 하 고 1.5 mL 튜브에 수집.</li>
	<li>30 s 및 1 시간 또는 밤새-80 ° C에서 저장소에 대 한 높은 속도 소용돌이.</li>
	<li>실내 온도 소용돌이에서 샘플을 잘 녹여.</li>
	<li>추가 200 µ L 클로 프롬, 15에 대 한 적극적으로 악수 s, 그리고 3 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>새로운 관으로 가기 명확한 수성 단계를 수집 합니다. 위와 더 낮은 단계 사이 형성 하는 백색 interphase의 수집을 피하기 위해 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>추가 500 µ L 소 프로 파 놀과 1 µ L 8 µ g / µ L glycogen (RNA 등급). 10 소용돌이 s와 10 분 동안 실내 온도에 또는-20 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한의 모든을 제거 합니다. 흰색 펠 릿은 튜브의 맨 아래에 형성할 것 이다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 7500 x g에 1 mL 찬 75% 에탄올과 원심 분리기를 추가</li>
	<li>모든 에탄올을 제거 하 고 아무 에탄올 튜브에 남아 때까지 실내 온도에 펠 릿을 건조.</li>
	<li>30 µ L DNase/RNase 무료 물, 펠 릿을 녹이 고 60 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 농도 측정 (260에 nm), RNA 농도 50 ng / µ L를 조정.</li>
</ol>4. 1 단계 RT-PCR SMN2 의 exon 포함 속도 측정 하
<ol><li>RT-PCR 반응 버퍼 x 2의 믹스 12.5 µ L, 1.0 µ L 원스텝 RT-PCR 효소의 혼합, 각 뇌관의 0.5 µ L (SMN2 앞으로: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 역: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH 앞으로: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH 역: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µ L 총 RNA의 (50 ng / µ L), RNase/DNase 무료의 8.5 µ L의 증류수와.</li>
	<li>15 분 동안 50 ° C에서 cDNA를 합성 후 PCR 반응을 시작 합니다. 증폭 30 PCR 사이클 SMN2 exon 6-8 (15 94 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 25 ° C 68 s). 20 PCR 사이클 GAPDH 증폭 (15 94 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 20 ° C 68 s).</li>
	<li>PCR 제품에 염료를 로드 x 5 μ 6 추가 및 2 %agarose 젤에 혼합물의 5 µ L을 로드 하 고 40 분 동안 100 V에서 실행.</li>
	<li>젤 이미지 및 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석.</li>
	<li>전체 길이 밴드와 Δ7 밴드의 강도 측정 합니다. (전체 길이)의 강도 값의 exon 7 포함 계산 / (전체 길이 + Δ7 SMN2).</li>
</ol>5. 정량 PCR (정량) SMN2 의 exon 포함 속도 측정 하
<ol><li>1 µ L 10 mM dNTPs, 및 11 µ L 총 RNA, cDNA 합성, 혼합 1 µ L 올리고 dT (50 ng / µ L). 5 분 동안 65 ° C에서 품 어.</li>
	<li>얼음에 샘플을 놓고 각 샘플 버퍼, 1 µ L 0.1 M DTT, 1 µ L RNase 억제제, 역전사 1 µ L x 4 µ L 5를 추가 합니다.</li>
	<li>60 분, 50 ° C에서 품 어 그리고 반응을 중지를 10 분 동안 80 ° C까지가 열. -20 ° c.에는 cDNA는 저장 될 수 있다</li>
	<li>RNase 무료 물 (1:5 희석) cDNAs를 희석. SYBR 녹색 정량 Pcr 효소 믹스 엑스 믹스 10 µ L 2, 0.8 µ L 10 µ M 뇌관 (전장 SMN2 앞으로: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3, 전체 길이 SMN2 반전: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3, Δ7 SMN2 앞으로: 5 '- TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 역: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3, GAPDH 앞으로: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3, GAPDH 역: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3), 3 µ L 희석 cDNA 및 5.4 µ L RNase 무료 물.</li>
	<li>정량 Pcr 반응을 시작 합니다. 사용 조건: 95 ° C 30에 대 한 s, 다음 40 주기 반복 95 ° C에서 5 s 및 20 60 ° C에 대 한 s.</li>
	<li>GAPDH 에 전체 길이 SMN2 또는 Δ7 SMN2의 상대 식을 계산 하 고 ΔΔCt 알고리즘으로 처리 되지 않은 셀에 정상화.</li>
</ol>6. 서 부 럽
<ol><li>셀에서 transfection 매체를 제거 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 한 번 씻어.</li>
	<li>프로 테아 제 억제제를 100 µ L 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>살 균 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 각의 아래에서 세포를 분리 하 고 1.5 mL 튜브에 수집. 30 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.</li>
	<li>통과 세포 lysate 21 G 바늘 10 번 셀 호감.</li>
	<li>4 ° C에서 15 분 동안 20,800 x g에서 centrifuge 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다. 샘플-80 ° C 깊은 냉동 실에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>BCA 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 단백질 농도 결정 하 고 1.0 µ g / µ L를 농도 조정 합니다.</li>
	<li>믹스 5 µ L 샘플 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 샘플 버퍼 x 5 µ L 2 (10 %SDS; 14 %0.5 M Tris HCl 용액, pH 6.7; 1 %0.5 M EDTA 2Na 재고 솔루션, pH 8.0; 20% 글리세롤; 0.004 %bromophenol 파랑 염료, 5% β-mercaptoethanol)와 10 분 동안 70 ° C에서 열.</li>
	<li>두번째-트리 스 단백질 젤 4-12%에 샘플을 로드 하 고 150 V에 1 시간에 대 한 실행.</li>
	<li>각 버퍼에 두꺼운 필터 종이 담근 다: (집중된 양극 버퍼: 0.3 M Tris HCl, 20% 메탄올; 양극 버퍼: 0.03 M Tris HCl, 20% 메탄올; 음극 버퍼: 25mm Tris, 20% 메탄올, 40mm 6-아미노-n-hexanoic 산, 0.01 %SDS).</li>
	<li>Polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 20 메탄올에 담가 s, 양극 버퍼에 그것을 전송.</li>
	<li>동요에서 5-10 분 동안 음극 버퍼를 가진 SDS-PAGE 후 젤 equilibrate.</li>
	<li>다음과 같이 필터 종이, PVDF 막과 젤 세미 드라이 더 럽 히 기계에 배치: 집중 양극 버퍼 종이/양극 버퍼 종이/PVDF 막/단백질 젤/음극 버퍼 종이 (그림 2).</li>
	<li>스택을 커버 하 고 30 분 동안 20 V에서 시작.</li>
	<li>송금 후 린스 PBST와 PVDF 막 (0.05%와 PBS 트윈 20) 일단.</li>
	<li>차단 막 5% 탈지 분유 PBST에서 해산에 30 분 동안 실내 온도에 또는 하룻밤에 4 ° C에서.</li>
	<li>순화 마우스 안티 SMN 항 체와 5% 탈지 분유 PBST에 있는 1:10,000에 토끼 안티-Cofilin 항 체 희석. 하룻밤 실 온에서 또는 4 ° C에서 1 시간을 위해 그것에 막 품 어.</li>
	<li>PBST 3 시간 10 분 동안 씻어.</li>
	<li>2 차 항 체 (HRP 활용 된 염소 반대로 마우스와 반대로 토끼 IgG (H + L)) 1:10,000에 PBST에 5% 탈지 분유를 희석. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>3 시간 10 분 동안 PBST와 막 씻으십시오.</li>
	<li>화학 서 부 더 럽 히 감지 키트를 사용 하 여 밴드 신호를 감지 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+muscular+atrophy%3A+from+tissue+specificity+to+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies.</a> F1000Prime Rep. 7, 4(2015).</li>
<li>Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+exon+skipping+and+splice+modulation+therapies+for+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases.</a> Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).</li>
<li>Lefebvre, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7813012">Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene.</a> Cell. 80 (1), 155-165 (1995).</li>
<li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).</li>
<li>Monani, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+difference+that+alters+splicing+patterns+distinguishes+the+SMA+gene+SMN1+from+the+copy+gene+SMN2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2.</a> Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).</li>
<li>Lee, J. J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+therapy+in+neurology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Antisense therapy in neurology.</a> J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).</li>
<li>Aartsma-Rus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval+of+Nusinersen+for+Spinal+Muscular+Atrophy+Makes+2016+the+Year+of+Splice+Modulating+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides.</a> Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).</li>
<li>Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+SMN2+exon+7+inclusion+by+antisense+oligonucleotides+targeting+the+exon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon.</a> PLoS Biol. 5 (4), 73(2007).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotides+delivered+to+the+mouse+CNS+ameliorate+symptoms+of+severe+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy.</a> Sci Transl Med. 3 (72), (2011).</li>
<li>Hammond, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+peptide-mediated+oligonucleotide+therapy+improves+long-term+survival+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).</li>
<li>Porensky, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+administration+of+morpholino+antisense+oligomer+rescues+spinal+muscular+atrophy+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse.</a> Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).</li>
<li>Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LNA%2FDNA+mixmer-based+antisense+oligonucleotides+correct+alternative+splicing+of+the+SMN2+gene+and+restore+SMN+protein+expression+in+type+1+SMA+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts.</a> Sci Rep. 7 (1), 3672(2017).</li>
<li>Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).</li>
<li>Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/1998/cc/a708608c#!divAbstract">LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition.</a> Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).</li>
<li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25451956">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li>
<li>Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+Detection+by+in+Situ+Hybridization+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods.</a> Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).</li>
<li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+nontoxic+antisense+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+therapeutics%3A+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).</li>
<li>Lanford, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+silencing+of+microRNA-122+in+primates+with+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection.</a> Science. 327 (5962), 198-201 (2010).</li>
<li>Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+Effective+Antisense+Oligonucleotides+for+Exon+Skipping%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping.</a> Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).</li>
<li>Shimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+locked+nucleic+acid-based+splice-switching+oligonucleotides+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).</li>
<li>Nguyen, Q., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+Muscle+Cell+Model+to+Test+the+Exon+Skipping+Efficacy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pers.+Med%22%5BJournal%5D)">Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Pers. Med. 7 (4), 13(2017).</li>
<li>Echigoya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Antisense+Screening+and+Optimization+for+Exon+51+Skipping+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Mol Ther. , (2017).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+PMO+found+in+dystrophic+dog+model+was+effective+in+cells+from+exon+7-deleted+DMD+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient.</a> PLoS One. 5 (8), 12239(2010).</li>
<li>Donnelly, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+model+of+SMA%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine model of SMA.</a> Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).</li>
<li>Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28280301">Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).</li>
<li>Paton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nusinersen%3A+antisense+oligonucleotide+to+increase+SMN+protein+production+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs+Today+%28Barc%29%22%5BJournal%5D)">Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy.</a> Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).</li>
<li>Prakash, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+in+vitro+and+in+vivo+activity+of+2%27-O-%5B2-%28methylamino%29-2-oxoethyl%5D-+and+2%27-O-methoxyethyl-modified+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides.</a> J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bodywide+skipping+of+exons+45-55+in+dystrophic+mdx52+mice+by+systemic+antisense+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

생체 외에서 평가 여기 설명 된 방법은 빠르고, 쉽고, 충분히 다양 한 AONs의 테스트에 대 한 민감한입니다. 이 프로토콜은 엑손 스키 핑 및 다른 유전자와 다양 한 셀 형식에 널리 적용 됩니다. 또한, 대부분 이온 화학 (PMOs)를 제외 하 고이 메서드를 사용 하 여 페 수 있습니다. AONs 타겟된 유전자를 운반 하는 플라스 미드 벡터와 공동 transfected 수 그리고 사전-mRNA에서 생 하 고 인위적으로 도입 유전자의 접합 하는 것을 통제할 수 있다.
이 방법의 중요 한 단계는 셀 confluency 해야 약 65-80% AONs fibroblasts에 페는 때입니다. 이 조건은 다른 세포 유형 대 한 수 있습니다. Transfection에 대 한 최고의 AONs 농도 다른도 수 (0.5-100 nM), 대상된 시퀀스 및 셀 형식에 따라 다릅니다.
이 방법은 잠재적인 함정 없이 아니다. 예를 들어 ...

척수 근육 위축 증 (SMA) 상 염색체 열성 패턴에서 상속 치명적인 신경 근육 학 질환 이다. 그것은 모터 신경 및 진보적인 간선 및 사지 근육 마비1,2의 저하에 의해 특징입니다. SMA 발생의 대부분은 생존 모터 신경 1 (SMN1) 유전자3에서 homozygous 돌연변이 때문. 2 모터 뉴런의 생존 (SMN2) 유전자 SMN1의 역 중복 이며 단지 5 개의 기지4,5다른 거의 동일한 시퀀스 있다. Exon 7에에서 있는 SMN2 에서 C-T 전환 돌연변이 리드 필수 exon 7 SMN2 증명서 (그림 1a)의 거의 90%에서 제외 되 고 하기 때문에 유전자를 거의 작동으로 만든다. 단백질 제품의 불안정 하 고 급속 하 게 저하 하기 때문에 SMN2 mRNAs exon 7 누락 SMN1 함수에 대 한 보상 수 없습니다.
센스 치료는 최근 SMA6치료에 대 한 매우 유망한 전략으로 등장. 미국 식품의 약 청 (FDA)에 의해 nusinersen의 최근 승인이 했다 첫 번째 약물을 치료 SMA7에 사용할 수 있습니다. Nusinersen 2-O-methoxyethyl 수정 (모)와 phosphorothioate 등뼈는 18-메 르 센스 oligonucleotide (AON) 이다. 약물 표적 intronic 접합 소음 기 N1 (ISS-N1) intron SMN2 유전자의 7에에서 있는. ISS-N1에 nusinersen의 바인딩 exon 7 포함 (그림 1a)8,9,10 유도 기능 전체 길이 SMN 단백질 식 생 SMN2 유전자의 복구를 촉진 . 현재, SMA를 위한 이온 치료를 포함 하는 많은 연구 조사 nusinersen 보다 더 효과적이 고 덜 독성 수 있습니다 새로운 이온 화학에 초점. 그것은 다른 화학 물질과 AONs 또한 효율적으로 SMN2 exon 7에에서 exon 포함 유도 입증 되었습니다 생체 외에서 그리고 vivo에서11,,1213.
잠긴된 핵 산 (Lna) 화학적 수정된 RNA 아날로그 연결 4-탄소 2-산소 furanose 구조 (그림 1b)14,15내 methylene 다리를 포함 하는. DNAs 또는 RNAs에 비해, Lna 바인딩 보완 RNA 시퀀스에 대 한 증가 선호도 있고 생 nucleases에 저항력의 추가 이득이 있다. LNA 화학 형광에 제자리 교 잡 (물고기) 및 정량16,17조사로 사용 하기 위해 적용 되었습니다. 또한, 그것은 유전자 발현 조절에 활용 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. GapmeR AONs 단일 가닥 DNA 분자 5 '과 3 ' 끝에 몇 가지 Lna에 의해 형벌의 조합입니다. 그들은 그들 활성화 RNase H18에 의해 타락을 일으키는 표적된 mRNAs를 보완 유전자 발현 바인딩에 의해 아래로 노크. LNA/DNA mixmers AONs DNA 뉴클레오티드 Lna 사이 통합의 구성입니다. 이 방향에 그들은 그것의 기능 (LNA-antimiR)19를 억제 하는 miRNA를 바인딩할 수 있습니다. 일부 LNA antimiRs 임상 개발에 도달 했습니다. 예를 들어, miravirsen (AntimiR-122) 억제 미르-122 C 형 간염 감염을 치료 하는 LNA antimiR 이며 여러 단계 II 임상 시험에는 현재 진행 중인19,20. 최근에, mixmers LNA/DNA RNA 접합21변조 또한 수 있습니다 입증 되었습니다. MRNA의 특정 시퀀스에 바인딩할 수 있고 SMN2 mRNA 생체 외에서13,22. dystrophin mRNA와 exon 포함에 건너뛰는 exon 유도
이 문서에서는, 우리는 엑손 포함 AONs 및 효능 평가 사용 하 여 RNA와 단백질 수준에서의 유도 대 한 방법론 개요. 이 방법을 예증 하 우리는 LNA/DNA mixmers SMN2의 intron 7에서에서 ISS N1을 대상으로 사용 합니다. Lipotransfection에 의해 SMA 환자의 세포로 페 AONs exon 7 포함 최종 SMN2 사본 및 SMN 단백질 생산의 upregulation에 유도. LNA/DNA mixmers를 사용 하 여 유도 exon 포함 하의 장점 중 하나는 transfection에 대 한 효과적인 농도 다른 화학13보다 훨씬 낮은입니다. 이 메서드는 phosphorodiamidate morpholino 올리고 (PMOs), 때문에 그들의 중립 책임, 엔도-포터 공동 transfection 시 약에 의해 유도 된 endocytosis 셀 입력 필요가 있는 제외한 다른 많은 AONs 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>SMA 섬유아세포</td><td>Coriell NIGMS 인간 유전자 세포 저장소</td><td>GM03813</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>혈청 결핍 매체</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfection 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR Primers</td><td></td><td></td><td>Sequence 5' to 3'SMN2</td></tr> <tr><td>forward:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>CTGCCTCCATTTCCTTCTG</td></tr><tr><td>SMN2 반전:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC</td></tr><tr><td>GAPDH 포워드:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>TCCCTGAGCTGAACGGGAAG</td></tr><tr><td>GAPDH 리버스:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>GGAGGAGTTTGGTCGCTGT</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전체 길이 SMN2 앞으로:</td><td></td><td></td><td>GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT</td></tr><tr><td>전체 길이 SMN2 반전:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT</td></tr><tr><td>GAPDH 포워드:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>GCAAATTCCATGGCACCGT</td></tr><tr><td>GAPDH 반전:</td><td></td><td></td><td>AGGGATCTCGCTCCTGGAA</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐, RNA 등급</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 칵테일 억제제&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>음극 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.025 M 트리스 베이스 + 40&nbsp; mM 6-aminocaproic acid + 20% 메탄올</td></tr><tr><td>양극 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.03 M Tris 베이스 + 20% 메탄올</td></tr><tr><td>중심 양극 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.3 M Tris 베이스 + 20% 메탄올</td></tr><tr><td>베타 메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인&nbsp;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅용 로딩/샘플 버퍼</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>원스텝 RT-PCR 키트&nbsp;</td><td>키아겐&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>클론텍</td><td>3040</td><td></td></tr></tbody></table>

평가 의해 유도 된 exon 포함의 결합 스위칭 센스 oligonucleotides sma 환자의 섬유 아 세포에서

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

척수 근육 위축 증 (SMA), SMN1의 손실에 의해 발생 하는 치명적인 신경 질환 선물 센스 oligonucleotide (이온)의 분야에서 독특한 케이스-치료 중재. SMN1 돌연변이 질병에 대 한 책임, AONs SMN2에 intronic 스플라이스 소음 (ISS) 사이트를 대상으로 FDA 승인 nusinersen를 포함 하 여 보였다 SMN 식 복원 하 고 증상을 개선 하. 현재, SMA를 위한 이온 치료를 포함 하는 많은 연구 조사 SMN2 nusinersen 보다 더 효과적이 고 덜 독성 수 있는 대상으로 하는 소설 이온 화학에 초점. 여기, 우리는 exon 포함 AONs 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR), 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 및 서쪽에 게 더 럽 히기의 lipotransfection를 사용 하 여 체 외에서 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 다양 한 이온 화학에 대 한 사용할 수 있습니다. 우리 AONs 번갈아 잠긴된 핵 산 (Lna)의 구성 및 DNA 뉴클레오티드 (LNA/DNA mixmers) 효율적인 SMN2 exon 포함 및 매우 낮은 농도, 그리고 그러므로, LNA에서 SMN 단백질의 복원으로 이어질 입증이 메서드를 사용 하 여 / DNA mixmer 기반 센스 oligonucleotides 유전자 질병으로 인 한 접합 결함을 치료 하는 매력적인 치료 전략을 수 있습니다. 생체 외에서 평가 여기 설명 된 방법은 빠르고, 쉽고, 충분히 다양 한 소설 AONs의 테스트에 대 한 민감한입니다.

우리 7 8 다른 센스 LNA/DNA mixmers 5 nM 농도 (그림 3)에서 페 했다를 가진 SMN2 유전자의 intron에서 ISS N1 소음 지역 대상 SMA 환자의 섬유 아 세포를 사용 하 여. mixmers의 각 포함 수정된 phosphorothioated 백본 nuclease 저하를 저항 하는 그들을 활성화. Mixmers, SMN2 exon의 속도의 효능을 평가 하기 위해 7 포함 RT-PCR 및 SMN2에 뇌관을 사용 하 여 정량 정량 했다. Exon transfection 동일한 복용량에서 mixmers #6-8을 이용 하는 동안 mixmers 환자 세포 (그림 4a, b)에 #1-5와 페 때 78-98%에서 배열 했다 7의 포함 효율에 비해 상당한 차이 발생 하지 않...

다양 한 센스 oligonucleotides (AONs) exon 포함 (스플라이스 변조) 유도 및 SMN 식 척수 근육 위축 증 (SMA)에 대 한 구조를 보였다. 여기, 우리는 SMN2 유전자와 SMA 환자의 섬유 아 세포에서 효능을 결정 하는 평가 방법에 exon 포함 유도 하 이온 lipotransfection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

이 lipotransfection 프로토콜의 전반적인 목표는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입하고 SMA 세포에 엑손 함유에 대한 이러한 약물의 효능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 안티센스 요법 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 환자에게 치료를 제공하기 위한 새로운 안티센스 올리고의 효능.이 기술의 주요 장점은 다양한 안티센스 올리고뉴클레오티드 화학 물질을 테스트할 수 있을 만큼 빠르고 쉬우며 민감하다는 것입니다. 이 방법은 안티센스 올리고를 섬유아세포로 형질주입하는 데 사용할 수 있지만, 1차 근아세포 및 기타 다양한 세포주와 같은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Aleks입니다.먼저 LNA/DNA 혼합체의 10마이크로몰 용액을 얼음에서 해동합니다. 혈청이 결핍된 매체의 혼합체 용액을 1.5ml 튜브에서 필요한 농도로 희석합니다. 다음으로, transfection 시약을 희석하고 희석된 transfection 시약을 1:1 비율로 mixmer에 첨가합니다.transfection을 수행하는 동안 세포 밀도가 약 65-80%가 되는 것이 중요합니다. 포화도가 80% 이상이면 형질주입 효율이 감소합니다. 그런 다음 형질주입 시약 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.10분 후, 5% 소 태아 혈청이 함유된 혈청이 결핍된 배지 900마이크로리터를 튜브에 피펫으로 주입합니다. transfection 시약 및 LNA/DNA mixmers와 함께 배양하기 전에 FBS를 추가하면 transfection 효율에도 영향을 미치므로 FBS를 추가하지 마십시오. 그런 다음 배양 플레이트에서 오래된 배지를 흡인합니다.이제 LNA/DNA 혼합체가 포함된 배지 1ml를 배양 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 24-48시간 동안 그대로 두십시오. 배양 후 배양 플레이트에서 배지를 흡입합니다.그런 다음 GPC 시약 1ml를 세포에 피펫팅합니다. 다음으로, GPC 시약으로 웰을 여러 번 세척합니다. 여러 번 세척한 후 1.5ml 튜브에 세포를 수집하고 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.다음으로, 30초 동안 튜브를 고속으로 와류시킵니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 영하 80도에서 한 시간 동안 보관하십시오. 이제 샘플을 실온에서 해동하고 빠르게 와류로 만듭니다.다음으로, 샘플에 클로로포름 200마이크로리터를 넣고

evaluation-exon-inclusion-induced-splice-switching-antisense

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

탠덤 접합 이벤트는 뉴클레오티드가 12개 미만으로 떨어져 있는 부위에서 발생합니다. 이러한 스플라이스 변형체의 비율을 정량화하는 것은 절대 정량적 PCR 접근법을 사용하여 가능합니다. 이 원고는 두 개의 스플라이싱 이벤트로 인해 Serine-701 포함/배제 및 α/β C-말단이 발생하는 STAT3 유전자의 스플라이스 변이체를 정량화할 수 있는 방법을 설명합니다.

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

이 보고서는 특히 포유 동물 세포에서 표적 유전자의 스 플라이 싱을 조절하는 신규 한 인공 접합 인자 (ASFs)를 설계하고 구성하는 생명 공학 방법을 설명한다. 이 방법은 RNA 대사의 다른 측면을 조작하는 다양한 인공 요소를 엔지니어에게 확장 할 수 있습니다.

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

둘 다 생체 외에서 그리고 세포에서 선택적 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양) 실험 사전 mRNA 시퀀스는 RNA를 대상으로 작은 분자의 존재의 2 차 구조를 결정 하 여 분석에 대 한 자세한 프로토콜은 이 문서에서 제시 하는.

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

여기서, 우리는 임상 시험에서 Sanger 시퀀싱, RT-PCR 및 서부 블로팅을 사용하여 dystrophin 38 발현의 분자 특성화를 제시합니다.

안티센스 올리고뉴클레오티드 임상 시험에서 DMD 환자 샘플에서 엑슨 건너뛰기 효율 특징

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

이 프로토콜은 화학 요법 치료 후 대체 접합 조절에서 특징이 없는 기능을 가진 단백질의 역할을 평가하기 위한 신속하고 유용한 도구를 제공합니다.

E1A 미니진 도구를 사용하여 mRNA 접합 변화를 연구합니다.

대체 스플라이싱(AS) 및 대체 폴리아데닐화(APA)는 전사체 이소형과 그 생성물의 다양성을 확장합니다. 여기에서는 실험 조건에 따라 다양한 AS 및 APA를 검출하고 시각화하기 위해 벌크 RNA-seq 및 3' 말단 시퀀싱 분석을 분석하는 생물정보학 프로토콜을 설명합니다.

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

이 프로토콜은 5'splice 사이트 돌연변이가 접합에 미치는 영향을 모니터링하기 위한 미니유전자 기자 분석체를 설명하고 돌연변이 유발 접합 억제를 위한 억제기 U1 snRNA를 개발한다. 리포터 및 억제기 U1 snRNA 구조는 HeLa 세포에서 발현되고, 접합은 프라이머 확장 또는 RT-PCR에 의해 분석된다.

접합 효율 모니터링을 위한 기자 기반 셀룰러 분석

구리 성장 분석인 ACT1-CUP1 분석은 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA) 스플라이싱과 돌연변이 스플라이싱 인자가 스플라이세오솜 기능에 미치는 영향에 대한 빠른 판독을 제공합니다. 이 연구는 프로토콜을 제공하고 관심 있는 접합 문제를 해결하기 위해 가능한 사용자 정의를 강조합니다.

ACT1-CUP1 분석은 신진 효모에서 스플라이세오솜 돌연변이체의 기질 특이적 민감도를 결정합니다.

배우세요 척수성 근위축증 환자 섬유아세포에서 SMN2 유전자 엑손 포함을 유도하는 리포트랜스펙션 방법을. 이 기술은 다양한 화학 구조의 항센스 올리고뉴클레오티드 효능을 빠르게 평가할 수 있습니다.

평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서

더 많은 동영상 탐색