Name: 평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 척수성 근위축증 환자 섬유아세포에서 SMN2 유전자 엑손 포함을 유도하는 리포트랜스펙션 방법을. 이 기술은 다양한 화학 구조의 항센스 올리고뉴클레오티드 효능을 빠르게 평가할 수 있습니다.

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저자는 실험에 대 한 니콜 McRorie 감사합니다. 이 작품은 의학 및 치과, Slipchuk SMA 연구 재단 연구 그랜트, 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 친구의 개렛 Cumming 연구 자금, HM Toupin Neurological의 앨버타의 대학 교수에 의해 지원 되었다 과학 연구 자금, 근 위축 증 캐나다, 혁신, 앨버타 기업 및 고급 교육 및 여 성과 어린이 건강 연구소 (WCHRI)를 위한 캐나다 기초.

1. 세포 배양
<ol><li>37 ° c.에 CO2 배양 기에 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간 1: 【-12 (햄) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 0.5% 페니실린/스)에서 문화 SMA 환자의 섬유 아 세포</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 하 고 세포에서 성장 매체, 다음 적절 한 판에 씨앗 1 x 105 셀/mL를 희석. RT-PCR 또는 정량에 대 한 12-잘 접시 (우물 당 1 mL)을 사용 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 CO2 배양 기에서 24 h에 대 한 번호판을 품 어</li>
</ol>2. LNA/DNA mixmer transfection
<ol><li>최적의 transfection 효율 약 65-80%의 셀 confluency를 확인 하십시오.</li>
	<li>10 μ M LNA/DNA mixmers 얼음에 천천히 녹여</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 최종 볼륨 도달 50 μ 혈 청을 박탈 미디어는 mixmers를 추가 하 여 20 x mixmer 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>Mixmer 솔루션 50 μ 3 %transfection 시 약 (1:1 비율)를 포함 하는 혈 청을 박탈 미디어의 혼합.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>추가 5 %900 μ 혈 청을 박탈 매체 FBS 각 관에.</li>
	<li>접시에서 오래 된 미디어를 발음 하 고 1 mL transfection 시 약을 포함 하는 LNA/DNA mixmer 솔루션으로 바꿉니다.</li>
	<li>CO2 배양 기에서 37 ° C에서 24-48 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
</ol>3. RNA 추출
<ol><li>매체를 제거 하 고 셀에 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-시 약의 1 mL를 추가 합니다. 하단의 guanidinium 안산-페 놀-클로 프롬과 잘 여러 번 세척 하 고 1.5 mL 튜브에 수집.</li>
	<li>30 s 및 1 시간 또는 밤새-80 ° C에서 저장소에 대 한 높은 속도 소용돌이.</li>
	<li>실내 온도 소용돌이에서 샘플을 잘 녹여.</li>
	<li>추가 200 µ L 클로 프롬, 15에 대 한 적극적으로 악수 s, 그리고 3 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>새로운 관으로 가기 명확한 수성 단계를 수집 합니다. 위와 더 낮은 단계 사이 형성 하는 백색 interphase의 수집을 피하기 위해 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>추가 500 µ L 소 프로 파 놀과 1 µ L 8 µ g / µ L glycogen (RNA 등급). 10 소용돌이 s와 10 분 동안 실내 온도에 또는-20 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한의 모든을 제거 합니다. 흰색 펠 릿은 튜브의 맨 아래에 형성할 것 이다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 7500 x g에 1 mL 찬 75% 에탄올과 원심 분리기를 추가</li>
	<li>모든 에탄올을 제거 하 고 아무 에탄올 튜브에 남아 때까지 실내 온도에 펠 릿을 건조.</li>
	<li>30 µ L DNase/RNase 무료 물, 펠 릿을 녹이 고 60 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 농도 측정 (260에 nm), RNA 농도 50 ng / µ L를 조정.</li>
</ol>4. 1 단계 RT-PCR SMN2 의 exon 포함 속도 측정 하
<ol><li>RT-PCR 반응 버퍼 x 2의 믹스 12.5 µ L, 1.0 µ L 원스텝 RT-PCR 효소의 혼합, 각 뇌관의 0.5 µ L (SMN2 앞으로: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 역: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH 앞으로: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH 역: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µ L 총 RNA의 (50 ng / µ L), RNase/DNase 무료의 8.5 µ L의 증류수와.</li>
	<li>15 분 동안 50 ° C에서 cDNA를 합성 후 PCR 반응을 시작 합니다. 증폭 30 PCR 사이클 SMN2 exon 6-8 (15 94 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 25 ° C 68 s). 20 PCR 사이클 GAPDH 증폭 (15 94 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 20 ° C 68 s).</li>
	<li>PCR 제품에 염료를 로드 x 5 μ 6 추가 및 2 %agarose 젤에 혼합물의 5 µ L을 로드 하 고 40 분 동안 100 V에서 실행.</li>
	<li>젤 이미지 및 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석.</li>
	<li>전체 길이 밴드와 Δ7 밴드의 강도 측정 합니다. (전체 길이)의 강도 값의 exon 7 포함 계산 / (전체 길이 + Δ7 SMN2).</li>
</ol>5. 정량 PCR (정량) SMN2 의 exon 포함 속도 측정 하
<ol><li>1 µ L 10 mM dNTPs, 및 11 µ L 총 RNA, cDNA 합성, 혼합 1 µ L 올리고 dT (50 ng / µ L). 5 분 동안 65 ° C에서 품 어.</li>
	<li>얼음에 샘플을 놓고 각 샘플 버퍼, 1 µ L 0.1 M DTT, 1 µ L RNase 억제제, 역전사 1 µ L x 4 µ L 5를 추가 합니다.</li>
	<li>60 분, 50 ° C에서 품 어 그리고 반응을 중지를 10 분 동안 80 ° C까지가 열. -20 ° c.에는 cDNA는 저장 될 수 있다</li>
	<li>RNase 무료 물 (1:5 희석) cDNAs를 희석. SYBR 녹색 정량 Pcr 효소 믹스 엑스 믹스 10 µ L 2, 0.8 µ L 10 µ M 뇌관 (전장 SMN2 앞으로: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3, 전체 길이 SMN2 반전: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3, Δ7 SMN2 앞으로: 5 '- TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 역: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3, GAPDH 앞으로: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3, GAPDH 역: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3), 3 µ L 희석 cDNA 및 5.4 µ L RNase 무료 물.</li>
	<li>정량 Pcr 반응을 시작 합니다. 사용 조건: 95 ° C 30에 대 한 s, 다음 40 주기 반복 95 ° C에서 5 s 및 20 60 ° C에 대 한 s.</li>
	<li>GAPDH 에 전체 길이 SMN2 또는 Δ7 SMN2의 상대 식을 계산 하 고 ΔΔCt 알고리즘으로 처리 되지 않은 셀에 정상화.</li>
</ol>6. 서 부 럽
<ol><li>셀에서 transfection 매체를 제거 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 한 번 씻어.</li>
	<li>프로 테아 제 억제제를 100 µ L 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>살 균 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 각의 아래에서 세포를 분리 하 고 1.5 mL 튜브에 수집. 30 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.</li>
	<li>통과 세포 lysate 21 G 바늘 10 번 셀 호감.</li>
	<li>4 ° C에서 15 분 동안 20,800 x g에서 centrifuge 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다. 샘플-80 ° C 깊은 냉동 실에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>BCA 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 단백질 농도 결정 하 고 1.0 µ g / µ L를 농도 조정 합니다.</li>
	<li>믹스 5 µ L 샘플 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 샘플 버퍼 x 5 µ L 2 (10 %SDS; 14 %0.5 M Tris HCl 용액, pH 6.7; 1 %0.5 M EDTA 2Na 재고 솔루션, pH 8.0; 20% 글리세롤; 0.004 %bromophenol 파랑 염료, 5% β-mercaptoethanol)와 10 분 동안 70 ° C에서 열.</li>
	<li>두번째-트리 스 단백질 젤 4-12%에 샘플을 로드 하 고 150 V에 1 시간에 대 한 실행.</li>
	<li>각 버퍼에 두꺼운 필터 종이 담근 다: (집중된 양극 버퍼: 0.3 M Tris HCl, 20% 메탄올; 양극 버퍼: 0.03 M Tris HCl, 20% 메탄올; 음극 버퍼: 25mm Tris, 20% 메탄올, 40mm 6-아미노-n-hexanoic 산, 0.01 %SDS).</li>
	<li>Polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 20 메탄올에 담가 s, 양극 버퍼에 그것을 전송.</li>
	<li>동요에서 5-10 분 동안 음극 버퍼를 가진 SDS-PAGE 후 젤 equilibrate.</li>
	<li>다음과 같이 필터 종이, PVDF 막과 젤 세미 드라이 더 럽 히 기계에 배치: 집중 양극 버퍼 종이/양극 버퍼 종이/PVDF 막/단백질 젤/음극 버퍼 종이 (그림 2).</li>
	<li>스택을 커버 하 고 30 분 동안 20 V에서 시작.</li>
	<li>송금 후 린스 PBST와 PVDF 막 (0.05%와 PBS 트윈 20) 일단.</li>
	<li>차단 막 5% 탈지 분유 PBST에서 해산에 30 분 동안 실내 온도에 또는 하룻밤에 4 ° C에서.</li>
	<li>순화 마우스 안티 SMN 항 체와 5% 탈지 분유 PBST에 있는 1:10,000에 토끼 안티-Cofilin 항 체 희석. 하룻밤 실 온에서 또는 4 ° C에서 1 시간을 위해 그것에 막 품 어.</li>
	<li>PBST 3 시간 10 분 동안 씻어.</li>
	<li>2 차 항 체 (HRP 활용 된 염소 반대로 마우스와 반대로 토끼 IgG (H + L)) 1:10,000에 PBST에 5% 탈지 분유를 희석. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 품 어.</li>
	<li>3 시간 10 분 동안 PBST와 막 씻으십시오.</li>
	<li>화학 서 부 더 럽 히 감지 키트를 사용 하 여 밴드 신호를 감지 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+muscular+atrophy%3A+from+tissue+specificity+to+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies.</a> F1000Prime Rep. 7, 4(2015).</li>
<li>Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+exon+skipping+and+splice+modulation+therapies+for+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases.</a> Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).</li>
<li>Lefebvre, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7813012">Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene.</a> Cell. 80 (1), 155-165 (1995).</li>
<li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).</li>
<li>Monani, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+difference+that+alters+splicing+patterns+distinguishes+the+SMA+gene+SMN1+from+the+copy+gene+SMN2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2.</a> Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).</li>
<li>Lee, J. J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+therapy+in+neurology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Antisense therapy in neurology.</a> J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).</li>
<li>Aartsma-Rus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval+of+Nusinersen+for+Spinal+Muscular+Atrophy+Makes+2016+the+Year+of+Splice+Modulating+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides.</a> Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).</li>
<li>Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+SMN2+exon+7+inclusion+by+antisense+oligonucleotides+targeting+the+exon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon.</a> PLoS Biol. 5 (4), 73(2007).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotides+delivered+to+the+mouse+CNS+ameliorate+symptoms+of+severe+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy.</a> Sci Transl Med. 3 (72), (2011).</li>
<li>Hammond, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+peptide-mediated+oligonucleotide+therapy+improves+long-term+survival+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).</li>
<li>Porensky, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+administration+of+morpholino+antisense+oligomer+rescues+spinal+muscular+atrophy+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse.</a> Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).</li>
<li>Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LNA%2FDNA+mixmer-based+antisense+oligonucleotides+correct+alternative+splicing+of+the+SMN2+gene+and+restore+SMN+protein+expression+in+type+1+SMA+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts.</a> Sci Rep. 7 (1), 3672(2017).</li>
<li>Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).</li>
<li>Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/1998/cc/a708608c#!divAbstract">LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition.</a> Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).</li>
<li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25451956">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li>
<li>Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+Detection+by+in+Situ+Hybridization+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods.</a> Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).</li>
<li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+nontoxic+antisense+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+therapeutics%3A+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).</li>
<li>Lanford, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+silencing+of+microRNA-122+in+primates+with+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection.</a> Science. 327 (5962), 198-201 (2010).</li>
<li>Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+Effective+Antisense+Oligonucleotides+for+Exon+Skipping%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping.</a> Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).</li>
<li>Shimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+locked+nucleic+acid-based+splice-switching+oligonucleotides+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).</li>
<li>Nguyen, Q., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+Muscle+Cell+Model+to+Test+the+Exon+Skipping+Efficacy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pers.+Med%22%5BJournal%5D)">Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Pers. Med. 7 (4), 13(2017).</li>
<li>Echigoya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Antisense+Screening+and+Optimization+for+Exon+51+Skipping+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Mol Ther. , (2017).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+PMO+found+in+dystrophic+dog+model+was+effective+in+cells+from+exon+7-deleted+DMD+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient.</a> PLoS One. 5 (8), 12239(2010).</li>
<li>Donnelly, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+model+of+SMA%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine model of SMA.</a> Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).</li>
<li>Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28280301">Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).</li>
<li>Paton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nusinersen%3A+antisense+oligonucleotide+to+increase+SMN+protein+production+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs+Today+%28Barc%29%22%5BJournal%5D)">Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy.</a> Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).</li>
<li>Prakash, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+in+vitro+and+in+vivo+activity+of+2%27-O-%5B2-%28methylamino%29-2-oxoethyl%5D-+and+2%27-O-methoxyethyl-modified+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides.</a> J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bodywide+skipping+of+exons+45-55+in+dystrophic+mdx52+mice+by+systemic+antisense+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

생체 외에서 평가 여기 설명 된 방법은 빠르고, 쉽고, 충분히 다양 한 AONs의 테스트에 대 한 민감한입니다. 이 프로토콜은 엑손 스키 핑 및 다른 유전자와 다양 한 셀 형식에 널리 적용 됩니다. 또한, 대부분 이온 화학 (PMOs)를 제외 하 고이 메서드를 사용 하 여 페 수 있습니다. AONs 타겟된 유전자를 운반 하는 플라스 미드 벡터와 공동 transfected 수 그리고 사전-mRNA에서 생 하 고 인위적으로 도입 유전자의 접합 하는 것을 통제할 수 있다.
이 방법의 중요 한 단계는 셀 confluency 해야 약 65-80% AONs fibroblasts에 페는 때입니다. 이 조건은 다른 세포 유형 대 한 수 있습니다. Transfection에 대 한 최고의 AONs 농도 다른도 수 (0.5-100 nM), 대상된 시퀀스 및 셀 형식에 따라 다릅니다.
이 방법은 잠재적인 함정 없이 아니다. 예를 들어 ...

척수 근육 위축 증 (SMA) 상 염색체 열성 패턴에서 상속 치명적인 신경 근육 학 질환 이다. 그것은 모터 신경 및 진보적인 간선 및 사지 근육 마비1,2의 저하에 의해 특징입니다. SMA 발생의 대부분은 생존 모터 신경 1 (SMN1) 유전자3에서 homozygous 돌연변이 때문. 2 모터 뉴런의 생존 (SMN2) 유전자 SMN1의 역 중복 이며 단지 5 개의 기지4,5다른 거의 동일한 시퀀스 있다. Exon 7에에서 있는 SMN2 에서 C-T 전환 돌연변이 리드 필수 exon 7 SMN2 증명서 (그림 1a)의 거의 90%에서 제외 되 고 하기 때문에 유전자를 거의 작동으로 만든다. 단백질 제품의 불안정 하 고 급속 하 게 저하 하기 때문에 SMN2 mRNAs exon 7 누락 SMN1 함수에 대 한 보상 수 없습니다.
센스 치료는 최근 SMA6치료에 대 한 매우 유망한 전략으로 등장. 미국 식품의 약 청 (FDA)에 의해 nusinersen의 최근 승인이 했다 첫 번째 약물을 치료 SMA7에 사용할 수 있습니다. Nusinersen 2-O-methoxyethyl 수정 (모)와 phosphorothioate 등뼈는 18-메 르 센스 oligonucleotide (AON) 이다. 약물 표적 intronic 접합 소음 기 N1 (ISS-N1) intron SMN2 유전자의 7에에서 있는. ISS-N1에 nusinersen의 바인딩 exon 7 포함 (그림 1a)8,9,10 유도 기능 전체 길이 SMN 단백질 식 생 SMN2 유전자의 복구를 촉진 . 현재, SMA를 위한 이온 치료를 포함 하는 많은 연구 조사 nusinersen 보다 더 효과적이 고 덜 독성 수 있습니다 새로운 이온 화학에 초점. 그것은 다른 화학 물질과 AONs 또한 효율적으로 SMN2 exon 7에에서 exon 포함 유도 입증 되었습니다 생체 외에서 그리고 vivo에서11,,1213.
잠긴된 핵 산 (Lna) 화학적 수정된 RNA 아날로그 연결 4-탄소 2-산소 furanose 구조 (그림 1b)14,15내 methylene 다리를 포함 하는. DNAs 또는 RNAs에 비해, Lna 바인딩 보완 RNA 시퀀스에 대 한 증가 선호도 있고 생 nucleases에 저항력의 추가 이득이 있다. LNA 화학 형광에 제자리 교 잡 (물고기) 및 정량16,17조사로 사용 하기 위해 적용 되었습니다. 또한, 그것은 유전자 발현 조절에 활용 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. GapmeR AONs 단일 가닥 DNA 분자 5 '과 3 ' 끝에 몇 가지 Lna에 의해 형벌의 조합입니다. 그들은 그들 활성화 RNase H18에 의해 타락을 일으키는 표적된 mRNAs를 보완 유전자 발현 바인딩에 의해 아래로 노크. LNA/DNA mixmers AONs DNA 뉴클레오티드 Lna 사이 통합의 구성입니다. 이 방향에 그들은 그것의 기능 (LNA-antimiR)19를 억제 하는 miRNA를 바인딩할 수 있습니다. 일부 LNA antimiRs 임상 개발에 도달 했습니다. 예를 들어, miravirsen (AntimiR-122) 억제 미르-122 C 형 간염 감염을 치료 하는 LNA antimiR 이며 여러 단계 II 임상 시험에는 현재 진행 중인19,20. 최근에, mixmers LNA/DNA RNA 접합21변조 또한 수 있습니다 입증 되었습니다. MRNA의 특정 시퀀스에 바인딩할 수 있고 SMN2 mRNA 생체 외에서13,22. dystrophin mRNA와 exon 포함에 건너뛰는 exon 유도
이 문서에서는, 우리는 엑손 포함 AONs 및 효능 평가 사용 하 여 RNA와 단백질 수준에서의 유도 대 한 방법론 개요. 이 방법을 예증 하 우리는 LNA/DNA mixmers SMN2의 intron 7에서에서 ISS N1을 대상으로 사용 합니다. Lipotransfection에 의해 SMA 환자의 세포로 페 AONs exon 7 포함 최종 SMN2 사본 및 SMN 단백질 생산의 upregulation에 유도. LNA/DNA mixmers를 사용 하 여 유도 exon 포함 하의 장점 중 하나는 transfection에 대 한 효과적인 농도 다른 화학13보다 훨씬 낮은입니다. 이 메서드는 phosphorodiamidate morpholino 올리고 (PMOs), 때문에 그들의 중립 책임, 엔도-포터 공동 transfection 시 약에 의해 유도 된 endocytosis 셀 입력 필요가 있는 제외한 다른 많은 AONs 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>SMA 섬유아세포</td><td>Coriell NIGMS 인간 유전자 세포 저장소</td><td>GM03813</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>혈청 결핍 매체</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfection 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR Primers</td><td></td><td></td><td>Sequence 5' to 3'SMN2</td></tr> <tr><td>forward:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>CTGCCTCCATTTCCTTCTG</td></tr><tr><td>SMN2 반전:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC</td></tr><tr><td>GAPDH 포워드:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>TCCCTGAGCTGAACGGGAAG</td></tr><tr><td>GAPDH 리버스:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>GGAGGAGTTTGGTCGCTGT</td></tr><tr><td>qPCR 프라이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전체 길이 SMN2 앞으로:</td><td></td><td></td><td>GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT</td></tr><tr><td>전체 길이 SMN2 반전:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT</td></tr><tr><td>GAPDH 포워드:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>GCAAATTCCATGGCACCGT</td></tr><tr><td>GAPDH 반전:</td><td></td><td></td><td>AGGGATCTCGCTCCTGGAA</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐, RNA 등급</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 칵테일 억제제&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>음극 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.025 M 트리스 베이스 + 40&nbsp; mM 6-aminocaproic acid + 20% 메탄올</td></tr><tr><td>양극 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.03 M Tris 베이스 + 20% 메탄올</td></tr><tr><td>중심 양극 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.3 M Tris 베이스 + 20% 메탄올</td></tr><tr><td>베타 메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인&nbsp;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅용 로딩/샘플 버퍼</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>원스텝 RT-PCR 키트&nbsp;</td><td>키아겐&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>클론텍</td><td>3040</td><td></td></tr></tbody></table>

평가 의해 유도 된 exon 포함의 결합 스위칭 센스 oligonucleotides sma 환자의 섬유 아 세포에서

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

척수 근육 위축 증 (SMA), SMN1의 손실에 의해 발생 하는 치명적인 신경 질환 선물 센스 oligonucleotide (이온)의 분야에서 독특한 케이스-치료 중재. SMN1 돌연변이 질병에 대 한 책임, AONs SMN2에 intronic 스플라이스 소음 (ISS) 사이트를 대상으로 FDA 승인 nusinersen를 포함 하 여 보였다 SMN 식 복원 하 고 증상을 개선 하. 현재, SMA를 위한 이온 치료를 포함 하는 많은 연구 조사 SMN2 nusinersen 보다 더 효과적이 고 덜 독성 수 있는 대상으로 하는 소설 이온 화학에 초점. 여기, 우리는 exon 포함 AONs 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR), 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 및 서쪽에 게 더 럽 히기의 lipotransfection를 사용 하 여 체 외에서 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 다양 한 이온 화학에 대 한 사용할 수 있습니다. 우리 AONs 번갈아 잠긴된 핵 산 (Lna)의 구성 및 DNA 뉴클레오티드 (LNA/DNA mixmers) 효율적인 SMN2 exon 포함 및 매우 낮은 농도, 그리고 그러므로, LNA에서 SMN 단백질의 복원으로 이어질 입증이 메서드를 사용 하 여 / DNA mixmer 기반 센스 oligonucleotides 유전자 질병으로 인 한 접합 결함을 치료 하는 매력적인 치료 전략을 수 있습니다. 생체 외에서 평가 여기 설명 된 방법은 빠르고, 쉽고, 충분히 다양 한 소설 AONs의 테스트에 대 한 민감한입니다.

우리 7 8 다른 센스 LNA/DNA mixmers 5 nM 농도 (그림 3)에서 페 했다를 가진 SMN2 유전자의 intron에서 ISS N1 소음 지역 대상 SMA 환자의 섬유 아 세포를 사용 하 여. mixmers의 각 포함 수정된 phosphorothioated 백본 nuclease 저하를 저항 하는 그들을 활성화. Mixmers, SMN2 exon의 속도의 효능을 평가 하기 위해 7 포함 RT-PCR 및 SMN2에 뇌관을 사용 하 여 정량 정량 했다. Exon transfection 동일한 복용량에서 mixmers #6-8을 이용 하는 동안 mixmers 환자 세포 (그림 4a, b)에 #1-5와 페 때 78-98%에서 배열 했다 7의 포함 효율에 비해 상당한 차이 발생 하지 않...

다양 한 센스 oligonucleotides (AONs) exon 포함 (스플라이스 변조) 유도 및 SMN 식 척수 근육 위축 증 (SMA)에 대 한 구조를 보였다. 여기, 우리는 SMN2 유전자와 SMA 환자의 섬유 아 세포에서 효능을 결정 하는 평가 방법에 exon 포함 유도 하 이온 lipotransfection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

이 lipotransfection 프로토콜의 전반적인 목표는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입하고 SMA 세포에 엑손 함유에 대한 이러한 약물의 효능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 안티센스 요법 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 환자에게 치료를 제공하기 위한 새로운 안티센스 올리고의 효능.이 기술의 주요 장점은 다양한 안티센스 올리고뉴클레오티드 화학 물질을 테스트할 수 있을 만큼 빠르고 쉬우며 민감하다는 것입니다. 이 방법은 안티센스 올리고를 섬유아세포로 형질주입하는 데 사용할 수 있지만, 1차 근아세포 및 기타 다양한 세포주와 같은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Aleks입니다.먼저 LNA/DNA 혼합체의 10마이크로몰 용액을 얼음에서 해동합니다. 혈청이 결핍된 매체의 혼합체 용액을 1.5ml 튜브에서 필요한 농도로 희석합니다. 다음으로, transfection 시약을 희석하고 희석된 transfection 시약을 1:1 비율로 mixmer에 첨가합니다.transfection을 수행하는 동안 세포 밀도가 약 65-80%가 되는 것이 중요합니다. 포화도가 80% 이상이면 형질주입 효율이 감소합니다. 그런 다음 형질주입 시약 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.10분 후, 5% 소 태아 혈청이 함유된 혈청이 결핍된 배지 900마이크로리터를 튜브에 피펫으로 주입합니다. transfection 시약 및 LNA/DNA mixmers와 함께 배양하기 전에 FBS를 추가하면 transfection 효율에도 영향을 미치므로 FBS를 추가하지 마십시오. 그런 다음 배양 플레이트에서 오래된 배지를 흡인합니다.이제 LNA/DNA 혼합체가 포함된 배지 1ml를 배양 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 24-48시간 동안 그대로 두십시오. 배양 후 배양 플레이트에서 배지를 흡입합니다.그런 다음 GPC 시약 1ml를 세포에 피펫팅합니다. 다음으로, GPC 시약으로 웰을 여러 번 세척합니다. 여러 번 세척한 후 1.5ml 튜브에 세포를 수집하고 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.다음으로, 30초 동안 튜브를 고속으로 와류시킵니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 영하 80도에서 한 시간 동안 보관하십시오. 이제 샘플을 실온에서 해동하고 빠르게 와류로 만듭니다.다음으로, 샘플에 클로로포름 200마이크로리터를 넣고 15초 동안 세게 흔듭니다. 그런 다음 실온에서 3분 동안 튜브를 배양합니다. 3 분 후에, 12, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 g에 표본을 원심 분리하십시오.원심분리가 끝나면 원심분리기 튜브 상단에서 수성상을 수집합니다. 그런 다음 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 500마이크로리터의 이소프로판올과 1마이크로리터의 RNA 등급 글리코겐을 마이크로리터당 8마이크로그램으로 수성상에 추가합니다.10초 동안 샘플을 빠르게 소용돌이치고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 외피 후에, 12, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 g에 표본을 분리기. 실행이 끝난 후 상층액을 디캔팅합니다.차가운 75% 에탄올 1ml를 넣고 잠시 와류를 일으켜 얻은 펠릿을 세척합니다. 다시 7500g의 시료를 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 모든 에탄올을 배출하고 펠릿을 실온에서 건조시킵니다.펠릿이 건조된 후 30마이크로리터의 DNAse/RNAse 자유수에 용해시킵니다. 그런 다음 섭씨 60도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 분광 광도계에서 260 나노 미터에서 RNA의 농도를 읽고 마이크로 리터당 15 나노 그램으로 조정합니다.RT-PCR 마스터 믹스를 구성하기 위해 2개의 X RT-PCR 반응 완충액, 1단계 RT-PCR 효소 혼합물, 정방향 및 역방향 프라이머, RNAse/DNAse 무함유 증류수를 추가합니다. 마스터 믹스를 0.2mm PCR 튜브에 분배하고 각 샘플에 대한 총 RNA를 추가합니다. 그런 다음 PCR 반응을 시작합니다.RT-PCR이 완료된 후 증폭된 산물에 5마이크로리터의 6X 로딩 염료를 추가합니다. 그런 다음 2% 아가로스 젤에 혼합물 5마이크로리터를 로드합니다. 전기영동 장치를 100볼트에서 40분 동안 시작합니다.먼저 다양한 믹싱머의 효율성을 연구합니다. 이를 위해 믹스머로 transfection된 SMA 섬유아세포에 SMN2, 엑손 7 및 GAPDH 수준의 포함을 분석합니다. 겔 이미지는 엑손 7의 포함을 보여주며, 상단 및 하단 밴드는 SMN2 RNA가 포함되거나 제외된 엑손 7을 나타냅니다.함유 효율은 또한 1 - 5 mixmers로 transfection될 때 78 - 98%로 정량화됩니다. 반면에, 환자 SMA 섬유아세포를 형질주입하기 위해 mixmer 6 내지 8을 사용하는 경우 대조군과 비교하여 유의한 결과를 얻지 못했습니다. 실험에서는 GAPDH가 대조군으로 사용됩니다.다음으로, GAPDH와 비교하여 전장 SMN2의 상대적 발현을 분석하기 위해 정량적 PCR을 수행합니다. SMN2 전사체 수준의 급격한 증가는 대조군과 비교하여 1-3 및 5번 혼합체로 transfection할 때 관찰됩니다. SMN 단백질 발현 수준도 연구되었는데, 이는 1번부터 5번까지의 믹스머로 transfection된 환자 섬유아세포에서 SMN 단백질 발현 수준의 증가를 보여줍니다.SMN 단백질 수치가 1.5배에서 1.9배까지 급격히 증가하는 것이 관찰됩니다. 여기서 사용되는 컨트롤은 코필린입니다. 반대로, 6 내지 8 믹스머는 SMN 단백질 발현 수준을 변화시키지 않습니다.이 동영상을 시청한 후에는 안티센스 올리고를 섬유아세포에 transfection하고 in vitro에서 효능을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

evaluation-exon-inclusion-induced-splice-switching-antisense

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

탠덤 접합 이벤트는 뉴클레오티드가 12개 미만으로 떨어져 있는 부위에서 발생합니다. 이러한 스플라이스 변형체의 비율을 정량화하는 것은 절대 정량적 PCR 접근법을 사용하여 가능합니다. 이 원고는 두 개의 스플라이싱 이벤트로 인해 Serine-701 포함/배제 및 α/β C-말단이 발생하는 STAT3 유전자의 스플라이스 변이체를 정량화할 수 있는 방법을 설명합니다.

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

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인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

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ACT1-CUP1 분석은 신진 효모에서 스플라이세오솜 돌연변이체의 기질 특이적 민감도를 결정합니다.

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평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서

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