균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 기반 분석 결과 인슐린 분 비의 검출에 대 한

이 절차의 전반적인 목표는 인슐린 분비 세포에서 분비되는 인슐린 수치를 유도하고 정확하게 정량화하는 것입니다. 이 방법은 췌장 베타 세포에서 포도당 자극 인슐린 분비의 주요 메커니즘과 같은 당뇨병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 포도당 자극에 대한 반응으로 인슐린 분비를 정확하고 신속하게 정량화하고 분비에 대한 잠재적인 약물 효과를 감지할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 제2형 당뇨병 치료를 위한 치료 및 약물 발견으로 확장되는데, 이는 약물 유발 대사 기능 장애의 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 불멸화된 베타 세포주에서 인슐린 분비에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 손상되지 않은 췌장도와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 여러 세포 처리 단계와 약물 준비로 인해 어려움을 겪을 것입니다.

인슐린 분비에 대한 도파민 약물의 작용을 조사하기 위한 신속한 분석을 원했을 때 이 방법에 대한 아이디어가 처음 떠올랐습니다. 세포의 섬세한 특성과 실험 간 분석의 일관성을 보장하기 위한 정밀도의 중요성으로 인해 세포 처리 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 INS-1E 셀을 성장시킵니다.

세포가 원하는 포화도에 도달하면 배지를 흡인합니다. 5ml의 인산염 완충 식염수로 세포를 씻습니다. 다음으로, 0.5ml의 025%트립신을 세포에 첨가한 다음 세포를 섭씨 37도에서 3-4분 동안 인큐베이터에 그대로 둡니다.

9ml의 완전한 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 다음으로, 세포를 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 세포를 원심 분리하여 펠릿을 형성합니다.

원심분리 후 펠릿을 5ml의 새 배지에 용해시킵니다. 튜브에서 재현탁된 세포 10마이크로리터를 피펫으로 빼내고 10마이크로리터의 트리판 블루 바이탈 염료와 혼합하여 생존력을 평가합니다. 다음으로, 혈구계를 사용하여 살아 있는 세포와 죽은 세포의 수를 세고 세포의 90%가 살아 있는지 확인합니다.

카운팅 후, 새로운 RPMI 1640 배지에 밀리리터당 100만 개의 세포를 추가한 다음 폴리-L-라이신으로 코팅된 24웰 플레이트의 각 웰에 0.5밀리리터의 500, 000 INS-1E 세포를 파종합니다. 플레이트를 인큐베이터에 하루 종일 그대로 두십시오. 다음 날, 매체를 제거하고 각 웰에 500마이크로리터의 새로운 RPMI 1640 배지를 추가합니다.

세포가 웰 표면에 퍼질 수 있도록 플레이트를 24시간 더 배양합니다. 분석을 수행하려면 먼저 KRB 완충액을 준비한 다음 각 웰에서 배지를 흡인하고 예열된 인산염 완충 식염수로 두 번 세척합니다. 다음으로, 각 웰에 포도당이 없는 소 혈청 알부민이 보충된 450마이크로리터의 KRB 완충액을 추가합니다.

배양 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 한 시간 동안 그대로 둡니다. KRB 완충액에 약물의 연속 희석액을 준비하고 200 밀리몰 포도당의 10X 최종 농도를 보충합니다. 포도당 결핍 단계 후, 각 해당 웰에 50 마이크로리터의 연속으로 희석된 약물을 피펫팅합니다.

포도당 자극을 위해 20 밀리몰 포도당이 있는 상태에서 연속적으로 희석된 약물을 각각 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 90분 동안 세포를 배양합니다. 자극이 끝나면 상층액을 수집하여 라벨이 부착된 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

수집된 각 상등액 10마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 90마이크로리터의 KRB를 첨가하여 1:10 희석 비율을 달성합니다. 균질성을 보장하기 위해 희석액을 혼합합니다.

그런 다음 HTRF 인슐린 분석에 대한 인슐린 표준 곡선을 얻습니다. 다음으로, 표준 인슐린 샘플과 희석된 분석 상등액 각각 10마이크로리터를 96웰 플레이트에 추가합니다. 검출 버퍼에서 비율을 수용하기 위해 1-2 명의 donor에서 항체 혼합물을 준비합니다.

항체 혼합물을 준비한 후 30웰 플레이트의 각 웰에 96마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 배양합니다. 2시간 동안 배양한 후 플레이트 리더에서 항체 혼합물이 있는 플레이트를 읽습니다.

판독을 위해 665 및 620 나노미터에서 적절한 HTRF 광학 모듈을 사용하고 각 웰에 대해 200번의 플래시를 사용합니다. 먼저, 인슐린 표준 곡선을 그려 분석 샘플에서 인슐린의 실제 값을 외삽합니다. 표준 곡선은 얻어진 비율계량 형광 판독값이 사전 정의된 표준 인간 인슐린 농도의 함수로 크게 증가한다는 것을 보여줍니다.

다음으로, INS-1E 세포에서 인슐린 분비의 기초 수준은 20 밀리몰 포도당의 유무에 따라 연구됩니다. 플롯에서 세포가 포도당이 있는 상태에서 밀리리터당 약 100나노그램의 인슐린을 분비한다는 것을 보여줍니다. 흥미롭게도, 인슐린 수치는 포도당이 없을 때 밀리리터당 약 15나노그램으로 거의 절반입니다.

다음으로, 세포는 20 밀리몰 포도당과 함께 도파민 농도가 증가하는 상태에서 배양됩니다. 분비된 인슐린은 각 웰에서 최대 인슐린 비율의 평균값으로 정규화됩니다. 이 그래프는 도파민이 GSIS를 억제한다는 것을 보여주며, 따라서 GSIS에서 도파민 수용체의 기능적 중요성을 나타냅니다.

이 플롯은 제2형 당뇨병 치료제인 브로모크립틴이 도파민보다 GSIS를 유도하는 데 더 강력하다는 것을 보여줍니다. 이 플롯은 퀸피롤의 농도가 증가함에 따라 D2 작용제는 브로모크립틴보다 덜 효율적이지만 GSIS를 자극하는 데 도파민과 유사한 효능을 보인다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4-5시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 신중하고 일관되게 피펫팅하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 다운스트림 신호전달에 대한 도파민 약물 효과와 같은 추가 질문에 답하기 위해 순환 AMP HDRF 분석과 같은 다른 기능 분석을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신진대사 분야의 연구자들이 불멸의 세포주와 췌장섬 모두에서 다른 내분비 분비 경로를 탐색할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 HDRF를 사용하여 세포에서 인슐린 분비를 정확하게 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.