Name: 균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 기반 분석 결과 인슐린 분 비의 검출에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 학습하세요 HTRF 기술을 활용한 췌장 베타세포에서 인슐린 분비 정량화 방법을 통해 당뇨병 연구의 핵심 메커니즘을 탐구하고 신약 개발에 활용할 수 있는 정확하고 신속한 분석 기술을 습득하세요.

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저자는 공개 없다.

1. 기능-1E 셀: 유지 보수 및 도금
<ol><li>기능-1E 셀 습도 37 ˚C/5% CO2 인큐베이터 고 RPMI 1640 매체와 교양 5% (v/v) 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 2 m m L-글루타민, 10 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 100 U/mL 페니실린/스와 보완 유지 솔루션, 50 µ M β-mercaptoethanol입니다. 80-90%의 합류를 도달할 때까지, 그들은 수 있는 trypsinized 및 passaged 또는 인슐린 분 비 분석 결과 대 한 사용 하는 경우 셀 (접시), 당 10 mL 전체 RPMI 1640 매체에 문화.</li>
	<li>
주 1: 미디어를 발음 하 고 셀 미리 따뜻하게 PBS의 5 mL로 한 번 씻어. 트립 신 (0.025%)의 0.5 mL 희석 1:1 0.5 ml PBS 셀 trypsinize 37 ˚C에서 3-4 분 동안 품 어를 추가 합니다. 추가 하 여 9 mL 전체 미디어 전송 셀 15 mL 원심 분리기 튜브를 pipetting으로 트립 신을 비활성화 합니다.</li>
	<li>원심 분리에 의해 세포를 작은 고 다시 약 5 mL 신선한 매체에서 셀 펠 릿을 일시 중단.</li>
	<li>다시 일시 중단 된 세포의 10 µ L 고 10 µ L 세포 생존 능력에 대 한 확인을 Trypan 블루 중요 한 염료 혼합. 10 µ L hemocytometer를 사용 하 여이 혼합의에 라이브 하 고 죽은 세포를 계산 합니다. 생존 수준 90% 이상 이어야 한다입니다. ML 당 1 백만 세포에 신선한 미디어에 다시 정지 셀을 희석.</li>
	<li>폴 리-L-리 신에 잘 당 종자 0.5 mL 기능-1E 셀 전 24-잘 접시, 500, 000 셀/잘의 조밀도에 코팅.</li>
	<li>
주 2: 미디어 18-24 h를 제거 후 도금 및 신선한 RPMI 1640 미디어의 500 µ L/잘 추가. 이전 passaging 단계에서 완벽 하 게 복구 하 셀 수 있도록 또 다른 24 h에 대 한 셀을 품 어. 이 추가 시간 조직 문화 접시에 확산 하기 위해 셀 수 있습니다.</li>
</ol>2. 인슐린 분 비 분석 결과 (3 일)
<ol><li>기계 버퍼 준비: 132.2 m m NaCl, 3.6 m m KCl, 5mm NaHCO3, 0.5 m m NaH2포4, 0.5 m m MgCl2, 1.5 m m CaCl2및 0.001 g/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA), pH 7.4.</li>
	<li>셀에서 미디어를 발음 하 고 미리 데워 공영으로 두 번 씻어.</li>
	<li>포도 당 기아 단계 37 ˚C/5% CO2450 µ L/잘 기계 (포함 BSA) 없이 1 시간에 대 한 포도 당을 추가 합니다.</li>
	<li>포도 당 기아 단계 동안 준비 200 m m를 포함 하는 기계에 나타나는데의 직렬 희석 포도 당 (10 배 농도).<ol>
<li>200 mM 포도 당 (또한 10 최종 분석 결과 포도 당 농도 배)으로 보충 하는 기계에 최종 농도 x 10에서 마약을 준비 합니다. 경우 약 재고 (추가 10 플러스 포도 당 x)는 DMSO, DMSO 비율 분석 결과 (이상적으로 최종 비율 0.1 %DMSO 미만)에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다 있는지 확인.</li>
		<li>치료를 위해 도파민, quinpirole, 100 100 µ M의 최종 분석 결과 약물 농도 범위를 사용 하 여 포함 하는 약 복용량 응답의 마지막 포인트 (가장 높은 것에서 낮은 농도), 오후. Bromocriptine, 마약류 통제 되는 복용량 응답의 마지막 지점으로 오후 10 시, 10 µ M의 최종 분석 결과 농도 범위를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포도 당 기아 후 마약 직렬 희석 생산 복용량 응답 분석 결과를 추가 합니다.</li>
	<li>해당 우물 (총 분석 결과 볼륨 500 µ L)를 각 직렬 희석의 50 µ L/우물을 추가 합니다.</li>
	<li>포도 당 자극 단계에 대 한 37 ˚C/5% CO에서 90 분 동안 각각 약 직렬 희석 (20 mM 포도 당)의 존재와 셀을 품 어2. 제어 우물의 세트를 포함: (1) 어떤 추가 약물 및 약물도 (이 분의 기저 속도 제공 합니다) 포도 당 자극도 (2) 세포의 부재에 혼자 20 mM 포도 당으로 자극.</li>
	<li>자극 단계 후 조심 스럽게 제거 supernatants (직접 사용 또는 저장소 4 ˚C에서). 참고: 추가 5 분 부드러운 원심 분리 단계 (600 x g, 1 분) 분석 결과 supernatants에 나머지 셀을 제거 하려면이 시점에서 소개 될 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. HTRF 측정 인슐린 분 비를
<ol><li>명확한 96 잘 접시에 선호 분석 결과 supernatants 1:10 (BSA) 없이 기계를 희석.</li>
	<li>HTRF 인슐린 분석 결과 (표 1)에 대 한 인슐린 표준 곡선을 준비 합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>표준 재고 솔루션 500 ng/ml</td>
			<td>직렬 희석</td>
			<td>[인슐린] ng/ml 일</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 7</td>
			<td>30 µ l 주식 + 140 µ l 기계</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 6</td>
			<td>30 µ l 성병 7 + 45 µ l 기계</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 5</td>
			<td>30 µ l 성병 6 + 45 µ l 기계</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 4</td>
			<td>30 µ l 성병 5 + 45 µ l 기계</td>
			<td>9.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 3</td>
			<td>30 µ l 성병 4 + 45 µ l 기계</td>
			<td>3.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 2</td>
			<td>30 µ l 성병 3 + 45 µ l 기계</td>
			<td>1.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 1</td>
			<td>30 µ l 성병 2 + 45 µ l 기계</td>
			<td>0.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 0</td>
			<td>45 µ l 기계</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">참고: 표준 재고는 500 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 인슐린 표준 곡선을 만들기 위해 직렬 희석입니다.
<ol start="3"><li>HTRF 플레이트를 표준 곡선 샘플 및 희석된 분석 결과 supernatants를 추가 합니다. HTRF에 의해 인슐린 분 비의 측정 96 잘 또는 분석 결과 볼륨을 다시 조정 해야 하는 것을 명심 384-잘 플레이트 형식 수행할 수 있습니다. 사용 10 µ L/잘 96 잘 화이트 반-지역 접시 또는 384-잘 화이트 낮은 볼륨, 라운드-하단 플레이트에서 5 µ L/잘 샘플 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>항 체 탐지 버퍼에 혼합 준비 ( 재료의 표참조) 1:2 기증자 (cryptate)에서 / 수락자 (XL-665) 비율. 참고: 추가 HTRF 분석 결과 대 한 특정 정보는 제조 업체에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>30 µ L/잘 (96 잘 접시 분석 결과 형식) 또는 15 µ L/잘 (384-잘 접시 분석 결과 형식)에 대 한 분석 결과를 항 체 믹스를 추가 합니다.</li>
	<li>접시를 봉인 하 고 실 온에서 품 어.</li>
	<li>2h, 4h, 및 야간 보육 후 플레이트 리더와 적절 한 HTRF 광섬유 모듈을 사용 하 여 항 체 판 읽기 (337 665 620 nm) ( 테이블의 재료 및 제조 업체의 지침 참조). 60 µ s에 통합 시작을 설정 하 고 통합 시간 400 μ s. 사용 200 잘 당 깜박입니다. 참고: 이러한 매개 변수는 우리의 특정 리더의 사용에 근거 했다. 620에서 판독 및 665 nm 서로 다른 악기 사이 다를 수 있습니다. 이 665/620 비율을 사용 하는 것이 좋습니다 이유 중 하나입니다. 이 비율을 계산, 리더를 리더에서 어떤 잠재적인 차이 정규화 될 것 이다 하 고 HTRF를 측정 하는 데 사용 하는 악기에 관계 없이 일관 된 값을 제공 합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석 및 정규화
<ol><li>비율의 추정을 통해 분석 결과 우물의 인슐린 농도 계산 형광 판독 (665 nm/620 nm)는 두 번째 순서 이차 다항식 곡선 (그림 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> 그림 2 : 인슐린 표준 곡선. 인간 인슐린 재고 알려진된 농도의 인슐린 표준 곡선을 생성 하기 위해 사용 되었다. 결과 HTRF 비율 (665 nm / 620 nm) 인슐린 농도 대 한 표시 했다. 데이터는 두 번째 순서 이차 다항식 곡선 적합 (R2 = 0.99996). 이것은 대표적인 표준 곡선 이다. 오차 막대 SEM. = <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"><li>인슐린 분 비의 ng/mL로 추정 데이터 % 최대 인슐린 분 비 분석 결과 우물 (20 mM 포도 당 혼자 조건)의 평균 값 (ligand 농도 증가에 대 한 응답에서 분 비 되는 인슐린)를 정상화.</li>
	<li>Intraplate 변화를 계산 하는 단일 실험에서 곡선 적합 (R2)를 사용 합니다. 실험에서 맞는 곡선에 대 한 의미의 표준 오차 계산을 수 있도록 내 실험 중복에서 개별 R2 값을 파생.</li>
	<li>Interplate 변형 결정 집단 곡선의 R2 값에 대 한 의미의 표준 오차를 계산 하기 위해 적어도 3 개의 개별 실험에서 데이터를 사용 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

우리가 아낌없이 제공 하는 기능-1E 셀에 대 한 유용한 조언을 니콜라 피에르 (Cisbio 생물 검정) 및 박사 피에르 Maechler (제네바 대학) 감사 합니다. 이 작품은 국방부 (그랜트는 Z.F. PR141292), 그리고 존 F. 낸시 A. Emmerling 기금 (Z.F.)에 피츠버그 재단에서 자금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 HTRF 인슐린 분석 결과 교양된 셀 기반 시스템에서 인슐린 분 비를 측정 하는 신속 하 고 효율적인 시스템을 제공 합니다. 그것의 가장 중요 한 장점 중이 분석 결과 높은 신호 대 잡음 비율 때문에 낮은 배경 신호를 제공합니다. 또한, 우리는 시간의 연장된 기간에 대 한 HTRF 신호는 안정 확인 했습니다 (> 24 h)7. 그럼에도 불구 하 고, 인슐린 바인딩 단일 클론 항 체 신속 하 게 분석 결과를 추가 후 바인딩 채도 도달, 이후 항 체 바인딩의 활동 수 영향을 받을 주위 온도 또는 인슐린의 분 비 수준에 있는 변이. 따라서, 우리는 여러 시간 포인트 (2h, 4h와 하룻밤) 항 체 전체 채도 도달 했습니다 HTRF 신호 이며 가장 강력한7때 정확 하 게 식별 하는 분석 결과 접시를 읽었다. 우리는 또한 최근 표시 인슐린 항 체에 크게 proinsulin 또는 c-펩 티 드, cross-react 하지 않습니다 분석 결...

에너지 대사의 규정 주요 단백 동화 호르몬, 인슐린에 의해 미세 하 게. 인슐린 합성 이며 췌 장 베타 세포 증가 세포 외 포도 당 수준에 대 한 응답에서에 의해 발표. 출시 된 인슐린 인슐린에 민감한 조직1,2포도 당 통풍 관을 트리거합니다. 생리학적으로,이 식사 후, 포도 당 통풍 관을 통제 하는 인슐린의 분 비에 의해 다음 포도 당 농도의 상승에 연결 됩니다. 포도 당 항상성 교란 인슐린 저항에 culminating 대사 장애가 발생할 고 궁극적으로 2 형 당뇨병2,,34의 발병에.
인슐린 분 비를 광범위 하 게 공부 했다, 하지만 그 규제 메커니즘 제대로 이해 남아 있습니다. 수 사의 중요 한 지역 베타 세포5,6,,78인슐린 분 비의 소설 변조기의 식별 되었습니다. 이러한 연구는 포도 당 자극 인슐린 분 비 사이의 결합 관계의 더 나은 이해 해야 합니다. 따라서, 정확 하 게 모니터링 하 고 포도 당 자극 인슐린 분 비 (GSIS)의 수준을 계량 능력 필수 되었습니다. 그러나 날짜 하려면,, 방법의 제한 된 수만 셀 라인 인슐린 분 비 췌 장 독도 이용 GSIS의 정량화를 허용 하도록 사용할 수 없었습니다. 하나는 방사성 태그 인슐린과 항 체를 이용 하는 방사 면역 검정 법 (RIA)입니다. 이 방법의 주요 제한 사항 처리 및 방사성 물질의 안전 문제가 포함 됩니다. 또한,이 방법은 노동 집약, 여러 긴 세척 및 인큐베이션 단계를 포함 합니다. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 인슐린 검출을 위한 항 체를 이용 하는 또 다른 비용과 노동 집약적인 접근 이다. 항 체 친 화력 및 인슐린 인식의 효율 변화 요인이이 방법의 제한 그리고 결과의 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다. 애 란도 리아 높은 처리량 실험을 위해 설계 되었습니다. AlphaScreen 균질 분석 결과 감지 하 고 인슐린 분 비의 수준 측정에 사용 되는. AlphaScreen 기술 화학의 세대의 결과로 chemiluminescent 종으로 대응할 수 있는 흥분된 산소 내의 상태로 주변 산소의 변환 기반으로 합니다. 분석 결과 균질 성 때문에, 많은 RIA와 ELISA 세척 단계는 제거 됩니다. 그러나, 반응의 특성상 신호의 불안정은 제한 요인 분석 결과의 판독에 영향을 미칠 수 있습니다. (TR-협공,9Heyduk와 동료 의해 개발 된 인슐린 분자에 다른 epitopes 두 개의 별도 항 체의 바인딩을에 따라 인슐린 측정에 다른 동종 접근 이다. 항 체는 짧은 상호 보완적인 단일 좌초 DNA 돌출부와 화학적으로 이중 연결 된 각 좌초 DNA. 인슐린 항 체의 바인딩 함께 그들을 제공 그리고 두 배 좌초 된 DNA 이중으로 이어집니다. 각 항 체는 또한 각 기증자 또는 수락자 fluorophore와 연결 하 고 DNA 이중의 협회 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)를 생성 하기 위해 이러한 fluorophores 함께 제공. 그러나 TR-협공의 한 가지 잠재적인 한계 자체 무서 워, 달려있다. 빠르게 무서 워 반응 동안 배경 형광을 발산 하지 못하는 배경 형광의 상대적으로 높은 수준 및 낮은 신호 대 잡음 비 분석 결과 내에서 발생할 수 있습니다. 따라서, 필요 높은 처리량 방식에서 GSIS를 측정에 대 한, 강력한, 안정적이 고 비용 효율적인 분석 결과 대 한 여전히 존재 합니다.
물리학에서 최근의 진보는 균질 시간 해결 형광 에너지 공명 전송 (HTRF) 기반으로 분석 결과의 개발에서 남 중 했다. 특히, 에너지 내에서 전송 하는 동안 분석 결과 수 있습니다 무서 워 기반으로 설명 더 정확 하 게, 발광 에너지 공명 전송 (LRET)10 은 기증자와 수락자 사이 에너지의 비 복사 전달에 의존 하는 HTRF 종11,,1213. 이 차이 이후는 형광의 타이밍 중요, 또는 냉각 하는 기반으로 무서 워 상호 작용 LRET, 보다 훨씬 다른 무서 워 및 LRET 게이팅의 동일한 종류를 사용할 수 있습니다. 또한, 유로 퓸 등 희토류 란타넘족 cryptate 사용 하 여 화합물 또는 HTRF에 븀 cryptate 생산 긴 형광 반감기12,14. 이 여기 기증자와 수락자 (즉, 시간 확인 시험)에서 방출의 측정 사이 타임 딜레이 (무색하)의 도입의 독특한 장점을 제공합니다. 이 시간 지연의 수락자 방출 형광 측정 전에 사라지고 배경 형광에 대 한 충분 한 시간을 허용 합니다. 따라서, 판독은 일반적인 형광의 자유롭고 높은 신호 대 잡음 비율 달성 하므로, (그림 1). 또한, HTRF의 동질적인 특성 분석 결과 많이 만드는 언바운드 종 ELISA 또는 RIA 기반 방법 보다 더 빠른 씻어 세척 단계에 대 한 필요가 없습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> 그림 1: HTRF 인슐린 감지 메커니즘의 도식. 두 개의 독립적으로 생성 된 단일 클론 항 체는 특히 인식 하 고 별도 사이트에서 인슐린에 바인딩합니다. 이 항 체는 유로 퓸 cryptate 기증자 또는 수락자 XL665 활용 된. 여기 620에서 방출에 337 nm 결과에 기증자의 nm. 결과 에너지 전송 하면 더 긴 파장, 665에서 방출 하는 XL665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
여기, 우리는 자세한 프로토콜 제공 기능-1E 셀에서 GSIS의 수준을 결정 하는 HTRF 기반 방식을 사용 하 여를 위한 insulinoma 셀 선15쥐는 확고 인슐린 은닉 베타 세포 파생. 또한,이 분석 결과 인슐린 분 비의 분자 레 귤 레이 터의 약리 프로필을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리이 인슐린 HTRF 기반 분석 결과 도파민 D2를 검사 하는 적용-GSIS의 수용 체 규칙 처럼. 증가 연구는 신경 전달 물질 도파민 GSIS8,,1617,18,19,20, 의 중요 한 레 귤 레이 터 밝혀졌다 21 , 22. 도파민은 도파민 D2에 대 한 작업을 통해 부정적인 autocrine/paracrine 방식에서 GSIS를에 영향을 미치는-같은 수용 체 (D2, D3D4 수용 체) 베타 췌 장 세포8 의 표면에 표현 , 16 , 19. 우리 GSIS의 부정적인 레 귤 레이 터로 서 도파민의 역할을 확인 하 고 입증 하는이 분석 결과 사용 하 여, 도파민 D2-수용 체 주 작동 근 bromocriptine와 quinpirole 또한 GSIS 감소 같은.

<table><tbody><tr><td>96-웰 화이트 반 면적 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>384-웰 화이트 저용량, 라운드 바닥 플레이트</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 하이 레인지 키트</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62IN1PEH&nbsp;</td><td>10,000 테스트 HTRF 기반 인슐린 분석 키트</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX 플레이트 리더</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>플레이트 리더는 HTRF 기반 분석 판독에 적합합니다.</td></tr><tr><td>플레이트 씰러</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>항체가 인큐베이트하는 동안 플레이트를 밀봉하기 위해</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11875-093</td><td>[+] L-글루타민</td></tr><tr><td>트립신 0.05%&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0.53 mM EDTA, (-) 나트륨 바이카보네이</td></tr>트 <tr><td>DPBS (Dulbecco의 인산염 완충 식염수)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>칼슘과 마그네슘</td></tr><tr><td>없는 태아 소 세럼</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11360070</tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 스테인 (0.4%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>도파민 염산염</td><td>시그마</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>브로모크립틴 메실레이트</td><td>토크리스</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>(-)-퀸피롤 염산염</td><td>토크리스</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (디메틸 설폭 사이드)</td> <td>시그마</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 기반 분석 결과 인슐린 분 비의 검출에 대 한

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

인슐린 분 비의 검출은 규제의 분 비 또한 연구에서 물질 대사의 elucidating 메커니즘에 대 한 중요 합니다. 비록 수많은 인슐린 분석 실험은 수십 년 동안 존재 했다, 균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 (HTRF) 기술의 최근 출현 방식이 크게이 측정을 간소화 하 게 됩니다. 이것은, 비용, 재현성, 신속 하 고 강력한 광학 분석 결과 오래 지속 방출 포스터 공명 에너지 전송 시간 해결 용이와 밝은 fluorophores에 활용 된 항 체에 의존. 또한, HTRF 인슐린 탐지 높은 처리량 검열 분석 실험의 개발에 대 한 순종입니다. 여기 우리는 기능-1E 셀, 쥐 insulinoma 파생 셀 라인에서에서 인슐린 분 비를 검색 하기 위해 HTRF를 사용 합니다. 인슐린과 포도 당 자극에 그들의 변화 기초 수준 추정 수 있습니다. 또한,이 인슐린 탐지 시스템 사용 하 여 포도 당 자극 인슐린 분 비 (GSIS)의 부정적인 레 귤 레이 터로 서 도파민의 역할을 확인 하. 비슷한 방식으로, 다른 도파민 D2-수용 체 주 작동 근, quinpirole, bromocriptine, 줄일 GSIS 농도 의존 방식에서 처럼. 우리의 결과 GSIS와 그들의 약리 프로필에 수많은 약물의 역할을 결정 HTRF 인슐린 분석 결과 형식 유틸리티를 강조 표시 합니다.

우리는 미리 정의 된 농도 (그림 2)의 순화 된 인간의 인슐린 표준을 사용 하 여 인슐린 표준 곡선을 생성 하 여 우리의 인슐린 HTRF 분석 결과 검증. 따라서 우리 비율 형광 수치를 추정 하는 것을 허용 하는 표준 곡선의 세대 하 고 다음으로 하는 약물 치료 (그림 2)에 대 한 응답 인슐린 분 비 수준을 결정. 커브 피팅 Intraplate 변형 최소화 했다 (R2 = 0.99996 ± 5.0 x 10-5) interplate 변형 했다 (R2 0.947 ± 5.5 x 10 =-5, n = 3 판).
우리는 다음 기능-1E 세포에서 인슐린 분...

여기, 우리가 현재의 균질 시간 세포에서 분 비 하는 인슐린의 신속한 검출을 위한 효율적인 방법으로 무서 워 (HTRF) 해결.

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

이 절차의 전반적인 목표는 인슐린 분비 세포에서 분비되는 인슐린 수치를 유도하고 정확하게 정량화하는 것입니다. 이 방법은 췌장 베타 세포에서 포도당 자극 인슐린 분비의 주요 메커니즘과 같은 당뇨병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 포도당 자극에 대한 반응으로 인슐린 분비를 정확하고 신속하게 정량화하고 분비에 대한 잠재적인 약물 효과를 감지할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 제2형 당뇨병 치료를 위한 치료 및 약물 발견으로 확장되는데, 이는 약물 유발 대사 기능 장애의 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 불멸화된 베타 세포주에서 인슐린 분비에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 손상되지 않은 췌장도와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 여러 세포 처리 단계와 약물 준비로 인해 어려움을 겪을 것입니다.인슐린 분비에 대한 도파민 약물의 작용을 조사하기 위한 신속한 분석을 원했을 때 이 방법에 대한 아이디어가 처음 떠올랐습니다. 세포의 섬세한 특성과 실험 간 분석의 일관성을 보장하기 위한 정밀도의 중요성으로 인해 세포 처리 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 INS-1E 셀을 성장시킵니다.세포가 원하는 포화도에 도달하면 배지를 흡인합니다. 5ml의 인산염 완충 식염수로 세포를 씻습니다. 다음으로, 0.5ml의 025%트립신을 세포에 첨가한 다음 세포를 섭씨 37도에서 3-4분 동안 인큐베이터에 그대로 둡니다.9ml의 완전한 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 다음으로, 세포를 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 세포를 원심 분리하여 펠릿을 형성합니다.원심분리 후 펠릿을 5ml의 새 배지에 용해시킵니다. 튜브에서 재현탁된 세포 10마이크로리터를 피펫으로 빼내고 10마이크로리터의 트리판 블루 바이탈 염료와 혼합하여 생존력을 평가합니다. 다음으로, 혈구계를 사용하여 살아 있는 세포와 죽은 세포의 수를 세고 세포의 90%가 살아 있는지 확인합니다.카운팅 후, 새로운 RPMI 1640 배지에 밀리리터당 100만 개의 세포를 추가한 다음 폴리-L-라이신으로 코팅된 24웰 플레이트의 각 웰에 0.5밀리리터의 500, 000 INS-1E 세포를 파종합니다. 플레이트를 인큐베이터에 하루 종일 그대로 두십시오. 다음 날, 매체를 제거하고 각 웰에 500마이크로리터의 새로운 RPMI 1640 배지를 추가합니다.세포가 웰 표면에 퍼질 수 있도록 플레이트를 24시간 더 배양합니다. 분석을 수행하려면 먼저 KRB 완충액을 준비한 다음 각 웰에서 배지를 흡인하고 예열된 인산염 완충 식염수로 두 번 세척합니다. 다음으로, 각 웰에 포도당이 없는 소 혈청 알부민이 보충된 450마이크로리터의 KRB 완충액을 추가합니다.배양 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 한 시간 동안 그대로 둡니다. KRB 완충액에 약물의 연속 희석액을 준비하고 200 밀리몰 포도당의 10X 최종 농도를 보충합니다. 포도당 결핍 단계 후, 각 해당 웰에 50 마이크로리터의 연속으로 희석된 약물을 피펫팅합니다.포도당 자극을 위해 20 밀리몰 포도당이 있는 상태에서 연속적으로 희석된 약물을 각각 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 90분 동안 세포를 배양합니다. 자극이 끝나면 상층액을 수집하여 라벨이 부착된 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.수집된 각 상등액 10마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 90마이크로리터의 KRB를 첨가하여 1:10 희석 비율을 달성합니다. 균질성을 보장하기 위해 희석액을 혼합합니다.그런 다음 HTRF 인슐린 분석에 대한 인슐린 표준 곡선을 얻습니다. 다음으로, 표준 인슐린 샘플과 희석된 분석 상등액 각각 10마이크로리터를 96웰 플레이트에 추가합니다. 검출 버퍼에서 비율을 수용하기 위해 1-2 명의 donor에서 항체 혼합물을 준비합니다.항체 혼합물을 준비한 후 30웰 플레이트의 각 웰에 96마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 배양합니다. 2시간 동안 배양한 후 플레이트 리더에서 항체 혼합물이 있는 플레이트를 읽습니다.판독을 위해 665 및 620 나노미터에서 적절한 HTRF 광학 모듈을 사용하고 각 웰에 대해 200번의 플래시를 사용합니다. 먼저, 인슐린 표준 곡선을 그려 분석 샘플에서 인슐린의 실제 값을 외삽합니다. 표준 곡선은 얻어진 비율계량 형광 판독값이 사전 정의된 표준 인간 인슐린 농도의 함수로 크게 증가한다는 것을 보여줍니다.다음으로, INS-1E 세포에서 인슐린 분비의 기초 수준은 20 밀리몰 포도당의 유무에 따라 연구됩니다. 플롯에서 세포가 포도당이 있는 상태에서 밀리리터당 약 100나노그램의 인슐린을 분비한다는 것을 보여줍니다. 흥미롭게도, 인슐린 수치는 포도당이 없을 때 밀리리터당 약 15나노그램으로 거의 절반입니다.다음으로, 세포는 20 밀리몰 포도당과 함께 도파민 농도가 증가하는 상태에서 배양됩니다. 분비된 인슐린은 각 웰에서 최대 인슐린 비율의 평균값으로 정규화됩니다. 이 그래프는 도파민이 GSIS를 억제한다는 것을 보여주며, 따라서 GSIS에서 도파민 수용체의 기능적 중요성을 나타냅니다.이 플롯은 제2형 당뇨병 치료제인 브로모크립틴이 도파민보다 GSIS를 유도하는 데 더 강력하다는 것을 보여줍니다. 이 플롯은 퀸피롤의 농도가 증가함에 따라 D2 작용제는 브로모크립틴보다 덜 효율적이지만 GSIS를 자극하는 데 도파민과 유사한 효능을 보인다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4-5시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 신중하고 일관되게 피펫팅하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 다운스트림 신호전달에 대한 도파민 약물 효과와 같은 추가 질문에 답하기 위해 순환 AMP HDRF 분석과 같은 다른 기능 분석을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신진대사 분야의 연구자들이 불멸의 세포주와 췌장섬 모두에서 다른 내분비 분비 경로를 탐색할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 HDRF를 사용하여 세포에서 인슐린 분비를 정확하게 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

homogeneous-time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-based

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

이 비디오는 테스트 단백질에 특이적인 항체에 태그된 공여체 및 수용체 형광단의 도움으로 내인성 단백질 인산화를 결정하기 위한 시간 분해 Förster 공명 에너지 전달 또는 TR-FRET 분석에 대해 설명합니다. 이 기술은 세포 용해물에서 테스트 단백질의 인산화를 측정하도록 설계되었습니다.

세포의 단백질 인산화를 모니터링하기 위한 시간 분해 Forster 공명 에너지 전달

이 비디오는 인간 혈청에서 섬 자가항체의 전기화학발광 검출을 보여줍니다. 혈청의 항체는 루테늄 접합 항원을 비오틴화 포획 항원에 연결하여 전기화학발광 측정으로 검출되는 복합체를 형성합니다.

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현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.

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이 프로토콜은 베타 세포에서 인슐린 분비를 위한 프록시로 인슐린 연결된 Gaussia luciferase를 사용하여 중간 처리량에서 급속한 저비용 luciferase 분석기를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 이 분석은 대부분의 발광 플레이트 판독기 및 다중 채널 파이펫으로 수행될 수 있습니다.

공동 분비 된 루시퍼라제 대리를 사용하여 상대 인슐린 분비 측정

시간-분해된 Förster 공명 에너지 전달 세포 기반 분석 프로토콜은 384-웰 포맷의 세포 용해물에서 내인성 인산화 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) 1/3/4/5/6 단백질의 단순하고, 특이적이며, 민감하고, 강력한 정량화를 위해 기술된다.

인간 세포에서 내인성 인산화 STAT 단백질의 측정을 위한 시간 분해된 Förster 공명 에너지 전달 분석

이 프로토콜은 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 바이오센서, cAMP 차이 검출기 in situ (cADDis) 및 미세페리퓨전 시스템의 아데노바이러스 전달을 사용하여 일차 인간 유사섬에 의한 세포 내 신호전달 이벤트의 동기 획득 및 공동 정합 및 인슐린 및 글루카곤 분비를 위한 방법을 설명합니다.

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

여기에서는 살아있는 HepG2 세포에서 Akt 활성화 및 인산화의 시공간 역학을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. Förster 공명 에너지 전달(FRET) 이미징은 암세포의 인슐린 신호 전달 경로 및 대사 조절에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 강력한 도구입니다.

HepG2 세포에서 대사적으로 조절되는 Akt 활성화 역학의 Live-Cell Förster Resonance Energy Transfer Imaging

우리는 쥐 맥락막신경총에서 인슐린 수용체 이성질체 IR-A 및 IR-B를 매핑하기 위해 Duplex in situ hybridization assay를 구축하여 기존 방법의 한계를 극복했습니다. 이 고해상도 접근법은 동형(isoform) 특이적 발현을 밝혀 뇌 인슐린 신호전달에 대한 새로운 통찰력과 신경 장애에 대한 잠재적인 동형(isoform) 표적 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

RNA In Situ Hybridization Assay를 사용한 쥐 뇌의 인슐린 수용체 A 및 B의 정확한 시각화

학습하세요 HTRF 기술을 활용한 췌장 베타세포에서 인슐린 분비 정량화 방법을 통해 당뇨병 연구의 핵심 메커니즘을 탐구하고 신약 개발에 활용할 수 있는 정확하고 신속한 분석 기술을 습득하세요.

균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 기반 분석 결과 인슐린 분 비의 검출에 대 한

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