Name: PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 배우세요 저세포 크로마틴 면역침전 시퀀싱(ChIP-seq)을 사용하여 마우스 뇌에서 급성 분리된 과립세포 전구체(OPC)에서 Olig2 전사인자의 게놈 전체 결합을 분석하는 방법을. 이 기술은 전사 조절과 후성유전학적 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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JQW, XD, RCDD, 그리고 YY는 국립 연구소의 건강 R01 NS088353;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 NIH 그랜트 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie 기금-기념 헤르만 재단; UTHealth 뇌 이니셔티브와 CTSA UL1 TR000371; 그리고 텍사스 시스템 신경 과학 대학 Neurotechnology 연구소 (부여 #362469)에서 부여.

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<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from:
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<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

포유류 유전자 조절 네트워크는 매우 복잡 합니다. 칩 seq 게놈 넓은 단백질 DNA 상호 작용을 조사 하는 강력한 방법입니다. 이 프로토콜 Olig2 칩 seq (반응 당 20 천 셀 낮은) 마우스 두뇌에서 순화 OPCs의 낮은 수를 사용 하 여 수행 하는 방법을 포함 합니다. 이 프로토콜에 대 한 첫 번째 주요 단계에서 PDGFRα 항 체와 immunopanning에 의해 마우스 두뇌 OPCs의 정화 이다. PDGFRα 코팅 접시 OPCs의 긍정적인 선택 OPCs는 PDGFRα에 수시로 약하게 바인딩 코팅 판. 여러 세척 후에 여전히 일부 비 부착 한 세포 왼쪽 있습니다. 그것은 현미경으로 세척 후 각 D-PBS는 비 부착 한 세포를 확인 하는 것이 중요입니다. 더 D-PBS 세척 비 부착 한 세포의 수를 줄이기 위해 도움이 되지 않습니다, 그것은 초과 세척 수 첨부 OPCs 꺼내 고 정화 세포의 수확량 감소 이후 선택한 셀을 수집 하는 시간. 그러나, 부족 한 세척 다른 뇌 세포 종류의 오염 될 수 있습니다. 따라서, 모든...

단백질 (또는 복잡 한 단백질)을 공부 하는 것이 중요 하다 DNA 바인딩 및 후 성적인 부호 다양 한 생물학 과정에서 포함 된 transcriptional 규제 네트워크 구축. 특히, 게놈 dna 녹음 방송 요인의 바인딩 유전자 규칙, 세포 분화와 조직 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 공부는 transcriptional 규칙 및 epigenetic 메커니즘에 대 한 강력한 도구 chromatin immunoprecipitation (칩)입니다. 차세대 시퀀싱 기술에 있는 급속 한 전진 때문 칩 (칩 seq) 연속 높 처리량 DNA와 결합 하 여 단백질-DNA 바인딩 및 epigenetic 마크1의 분석에 사용 됩니다. 그러나, 표준 칩 seq 프로토콜 셀 수는 고립 된 1 차 셀 등 희귀 세포 인구 제한 때이 기술의 응용 프로그램 어려운 반응 당 약 20 백만 셀을 필요 합니다.
Oligodendrocyte 계보 세포 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs)와 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌를 통해 널리 배포 하 고 개발 및 뇌의 기능에 필수적인. 선구자 세포의 유형으로 OPCs 자체 갱신와 차별화 할 수 있다. OPCs는 창시자 oligodendrocytes에 대 한 역할 뿐만 아니라 또한 뇌 세포2의 다른 종류와 통신 함으로써 신경 신호의 전파에 중요 한 역할. 이전 연구는 oligodendrocyte 개발 Olig2와 Sox103,4같은 계보 특정 녹음 방송 요인에 의해 통제 된다 제안 했다. 이 녹음 방송 요인 oligodendrocyte 사양과 차별화 하는 동안 그들의 표정에 영향을 몇 가지 중요 한 유전자의 발기인 또는 증강 인자 영역에 바인딩할 발견 됐다. 그러나, DNA 바인딩 단백질 (또는 복잡 한 단백질) 심하게 정화 기본 OPCs 셀의 매우 제한 된 수의 식별 하는 도전입니다.
이 프로토콜 Olig2 순화 마우스 OPCs 칩 seq 기술을 사용 하 여 게놈 넓은 규모에 의해 게놈 DNA immunoprecipitated를 체계적으로 조사 하는 방법을 설명 합니다. 마우스 두뇌에서 OPCs 심하게 immunopanning에 의해 정화 되었고 확산 체 외없이 칩 실험에 사용. 제한 된 수의 OPCs immunopanning에 의해 얻어질 수 있다 그리고 표준 칩 seq 실험에 대 한 충분 하지 않습니다. 여기, 낮은 셀 칩 seq 프로토콜은 낮은 녹음 방송 요인에 대 한 칩 반응 당 20 천 셀으로 설명 되어 있습니다. 간단히, 교차 연결 된 셀 lysed 되었고 sonicated 쥡니다 장치는 chromatin를 전단 하 여. 깎인된 chromatin Olig2 바인딩된 항 체 게놈 DNA를 침전 하는 코팅 구슬 Olig2 항 체와 단백질 incubated 했다. 단백질 A 코팅 구슬 및 역방향 cross-linking에서 차입, 후 genomic DNA Olig2 항 체에 의해 시 켰 던 페 놀-클로 프롬 적 출에 의해 순화 되었다. 결과 제품 계량은 T-미행을 복종, 뇌관 어 닐 링 템플릿 전환 및 확장, 어댑터 및 증폭, 라이브러리 크기 선택 및 정화의 추가 칩 seq 도서관 건축을 위한 단계.
시퀀싱, 후 샘플 Olig2 전사 인자 항 체와 준비와 컨트롤 샘플에서 원시 읽기의 품질 분석 했다. 낮은 품질의 기본적인 쌍 어댑터 포함 된 읽기 조각 손질 했다. 다음, 트림 읽기 마우스 참조 게놈에 정렬 했다. 컨트롤 샘플에 비해 칩 읽기 봉우리로 검색을 위한 농축 크게 했다 게놈 영역입니다. 중요 한 봉우리, 대표 하는 잠재적인 전사 인자 바인딩 사이트 필터링 되었고 게놈 브라우저에 시각.
특히,이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 모든 셀 종류 제한 된 숫자의 다른 녹음 방송 요인의 칩 seq에 광범위 하 게 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Reagent/ Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banderiaea simplicifolia lectin 1</td><td>Vector Laboratories</td><td># L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-PDGFRa 항체</td><td>BD Bioscience</td><td># 558774</td><td></td></tr><tr><td>Neural tissue dissociation Kit (P)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL technologies</td><td># 07920</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher</td><td># 15596026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 항체</td><td>Millipore</td><td># AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico 초음파 처리 장치</td><td>Diagenode</td><td># B01060001</td><td></td></tr><tr><td>True MicroChIP 키트</td><td>Diagenode</td><td># C01010130</td><td></td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (25:24:1, V/V)</td><td>Thermo Fisher</td><td># 15593031</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 젤 및 PCR 클린업 키트</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td># 740609</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>DNA SMART ChIP-Seq 키트</td><td>Clontech Laboratories</td><td># 634865</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Voulter</td><td># A63880</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Fisher</td><td># AM9516</td><td></td></tr><tr><td>피코-그린</td><td>써모 피셔</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>써모 피셔</td><td># 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 그린 마스터 믹스</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td># 1725124</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td># 11-320-033</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(P/S)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>Fisher Scientific</td><td># 17502048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Fisher Scientific</td><td># 17504044</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td># I6634</td><td>5 mg 인슐린을 10 ml의 물과 50 &mu에 용해시켜 0.5 mg/ml 인슐린 용액을 준비합니다. 1 N HCl의 l.</td></tr><tr><td>세포 배양에 적합한 소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td># A4161</td><td>100ml D-PBS에 BSA 4g을 용해하여 4% BSA 용액을 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다.</td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자 염기성 단백질, 인간 재조합(bFGF)</td><td>EMD Millipore</td><td># GF003</td><td></td></tr><tr><td>HUMAN PDGF-AA</td><td>VWR</td><td># 102061-188</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신</td><td>VWR</td><td># IC15017510</td><td>물 10ml에 폴리-D-라이신 10mg을 녹여 1mg/ml 폴리-D-라이신 용액을 준비하고 사용 시 100회 희석합니다.</td></tr><tr><td>Falcon 일회용 페트리 접시, 멸균, 코닝, 100x15mm</td><td>VWR</td><td># 25373-100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 일회용 페트리 접시, 멸균, 코닝, 150x15mm</td><td>VWR</td><td># 25373-187</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 10X, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 없음 Red</td><td>Fisher Scientific</td><td># 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Stemcell Technologies</td><td># 07050</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma</td><td># 11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC</td><td>[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td> <td>원시 및 트리밍 판독의 품질 관리 메트릭 획득</td></tr><tr><td>Trimmomatic 0.33</td><td>[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td><td>원시 판독</td></tr> <tr><td>트리밍 및 필터링GENCODE mm10</td><td>ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz</td><td></td><td>마우스 참조 게놈</td></tr><tr><td>Bowtie2 2.2.4</td><td>[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td><td>참조 게놈</td></tr><tr><td>SAMTools 1.5</td>에 읽기를 정렬[<td>13] http://samtools.sourceforge.net/</td><td></td> <td>SAM 파일을 BAM 형식으로 변환</td></tr><tr><td>HOMER 4.9.1</td><td>[14] http://homer.ucsd.edu/homer/</td><td></td> <td>태그 디렉토리 생성 및 유전자 기호로 농축된 게놈 영역 주석</td></tr><tr><td>R 3.2.2</td><td>[15] https://www.R-project.org/</td><td></td> <td>프로그래밍 스크립트 및 함수 실행</td></tr><tr><td>SPP 1.13</td><td>[16] https://github.com/hms-dbmi/spp</td><td></td><td>가닥 교차 상관 플롯 생성</td></tr><tr><td>MACS2 2.2.4</td><td>[17] https://github.com/taoliu/MACS</td><td></td><td>대조군</td></tr><tr><td>BEDTools 2.25</td><td>[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td><td></td> <td>게놈 산술</td></tr><tr><td>bedGraphToBigWig</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</td><td></td> <td>베드그래프 파일을 bigwig</td></tr><tr><td>IGV 브라우저 2.3.58</td>로 변환 [<td>19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td><td></td> <td>시각화 및 브라우징 유의미한 ChIP-seq 피크</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Spreasheet 프로그램</td></tr><tr><td>ENCODE의 블랙리스트</td><td>https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists</td><td></td><td>필터링 피크</td></tr><tr><td>mm10.chrom.sizes</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.</td><td></td><td>bedGraph 파일을 bigwig</td></tr><tr><td>ENCODE의 모티프 데이터베이스</td><td>[25]로 변환 http://compbio.mit.edu/encode-motifs/</td><td></td> <td>모티프 농축</td></tr><tr><td>MEME-ChIP</td>에 필요한 종합 모티프 데이터베이스<td>[20] http://meme-suite.org/index.html</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>qPCR</strong에 사용되는 모티프 발견Primer 이름></td><td></td><td></td><td>qPCR></td></tr><tr><td>Mbp-F:</td><td></td><td></td><td>CTATAAATCGGCTCACAAGG</td></tr><tr><td>Mbp-R:</td><td></td><td></td><td>AGGCGGTTATATTAAGAAGC</td></tr><tr><td>Iba1-F:</td><td></td><td></td><td>ACTGCCAGCCTAAGACAACC</td></tr><tr><td>Iba1-R:</td><td></td><td></td><td>GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC</td></tr><tr><td>Mog-F:</td><td></td><td></td><td>GGCTTCTTGGAGGGAC</td></tr><tr><td>Mog-R에</td> <td>사용되는 <strongPrimer 시퀀스:</td><td></td><td>TGAATTGTCCTGCATAGCTGC</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td></td><td></td><td>ATGACATCAAGAAGGTGGTG</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td></td><td></td><td>CATACCAGGAAATGAGCTTG</td></tr><tr><td>Tuj1-F</td><td></td><td></td><td>TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG</td></tr><tr><td>Tuj1-R</td><td></td><td></td><td>GATGACCTCCCAGAACTTGGC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-F</td><td></td><td></td><td>AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-R</td><td></td><td></td><td>GTCCCTCCACG전술</td></tr></tbody></table>

pdgfrα + 셀 낮은 셀 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

포유류 세포에서 유전자 전사 genomic dna transcriptional 요인의 상호 작용에 의해 세포 유형 특정 방식으로 통제 된다. 계보 특정 녹음 방송 요인은 셀 사양 및 분화 개발 과정에 필수적인 역할을 간주 됩니다. 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq)와 결합 하는 칩은 genomic dna 녹음 방송 요인 (또는 그것의 관련 된 복잡 한)의 게놈 넓은 바인딩 사이트를 분석 하 널리 이용 된다. 그러나, 많은 세포는 하나의 표준 칩 반응, 어려운 고립 된 1 차 셀 또는 희귀 세포 인구 제한 수를 공부 하는 필요 합니다. Oligodendrocyte 계보 관련 전사의 규제 메커니즘을 이해 하기 위해서는 요소 Olig2 심하게 순화 마우스 OPCs Olig2 (또는 Olig2 복잡 한)의 게놈 넓은 바인딩 사이트 식별 칩 seq를 사용 하 여 상세한 방법에에서 표시 됩니다. 프로토콜 혈소판 파생 된 성장 인자 수용 체 알파 (PDGFRα)를 정화 하는 방법을 설명 하는 첫째, 긍정적인 OPCs 마우스 두뇌에서. 다음, Olig2 항 체 칩을 중재 하 고 도서관 건설 수행 됩니다. 마지막 부분 bioinformatic 소프트웨어 및 Olig2 칩 seq 분석에 사용 되는 절차에 설명 합니다. 요약 하자면,이 종이 심하게 정화 뇌 OPCs transcriptional 요소 Olig2의 게놈 넓은 바인딩 분석 하는 방법을 보고 합니다.

낮은 셀 칩 seq 수행한 고 bioinformatic 분석 심하게 정화 뇌 OPCs genomic dna Olig2 transcriptional 요소의 잠재적인 상호 작용을 조사 했다. 그림 1 실험 및 데이터 분석 절차의 일반적인 워크플로 보여 줍니다. 이 프로토콜에서 출생 후 쥐 두뇌 했다 단일 세포 현 탁 액에 해리 했다. 조직 분리 후 immunopanning PDGFRα 항 체를 사용 하 여 OPCs 정화 수행 되었다. 그림 2 는 PDGFRα, 신경 마커 Tuj1의 작은 식의 중요 한 농축 (신경 관련 클래스 III 베타-tubulin), 사이토 마커 GFAP (폐해 fibrillary 산 성 단백질), microglia 마커 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 1 (Iba1), myelinating 성숙 oligodendrocytes 마커 myelin 기...

여기에 우리가 현재 낮은 셀 chromatin immunoprecipitation (칩)를 수행 하 여 분석 하는 게놈 넓은의 바인딩을 oligodendrocyte 녹음 방송 요인 2 (Olig2) 심하게 정화 뇌 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 하도록 설계 된 프로토콜 도서관 준비, 높은 처리량 시퀀싱 및 bioinformatic 데이터 분석.

PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

이 실험의 전반적인 목표는 면역판닝, 저세포 염색질 면역침전, 고처리량 염기서열분석 및 생물정보학 데이터 분석을 수행하여 급성으로 정제된 뇌 희소돌기아교세포 전구세포에서 희소돌기아교세포 전사 인자 2의 게놈 전체 결합을 분석하는 것입니다. 이 방법은 세포 분화 및 발달에 중요한 역할을 하는 게놈 전체의 전사 조절 및 후성유전학적 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 시험관 내 증식이 없는 급성 정제된 일차 세포를 포함하여 제한된 수의 모든 세포 유형을 가진 다른 전사 인자의 ChIP-seq에 광범위하게 적용할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Yanan You입니다. 그녀는 이 논문의 공동 저자입니다. PDGFR-알파 양성 세포를 선택하려면, 면역판닝을 위한 플레이트 하나를 준비합니다.내피 세포와 미세아교세포 고갈을 위해 또 다른 두 개의 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 10cm 페트리 접시에 30마이크로리터의 염소 항쥐 면역글로불린을 코팅합니다. 그런 다음 플레이트의 전체 표면이 코팅 용액으로 고르게 덮이도록 플레이트를 교반합니다.페트리 접시를 섭씨 4도에서 밤새 그대로 두십시오. 다음으로, 40마이크로리터의 쥐 항-PDGFR-알파 항체를 0.2% 소 혈청 알부민을 함유한 12밀리리터의 DPBS로 희석합니다. 다음으로, 면역글로불린 G-코팅 플레이트를 10mL의 1X DPBS로 3회 연속 세척합니다.그런 다음 면역글로불린 G 코팅 플레이트를 PDGFR-알파 항체 용액과 함께 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후 플레이트의 측벽을 따라 DPBS를 조심스럽게 첨가하여 랫드 항 PDGFR-알파 항체 코팅 플레이트를 세 번 세척합니다. 플레이트의 코팅된 표면을 방해하지 마십시오.다음으로, BSL-1 밀리리터당 2.3마이크로그램과 함께 20밀리리터의 DPBS를 사용하여 15cm 페트리 플레이트 2개를 2시간 동안 코팅합니다. 배양 후 플레이트의 측벽을 따라 20ml의 DPBS를 조심스럽게 추가하여 BSL-1 플레이트를 세 번 세척합니다. 코팅된 표면을 방해하지 마십시오.세척 후 단세포 현탁액을 실온에서 300회 g으로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 세포 펠릿에 15ml의 면역판닝 완충액을 추가합니다. 그런 다음 두 개의 BSL-1 코팅된 페트리 접시에서 두 개의 마우스 뇌에서 단일 세포 현탁액을 순차적으로 배양합니다.그런 다음 접시를 실온에서 15분 동안 그대로 두십시오. 부화 중 5분마다 플레이트를 교반합니다. 그런 다음 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 세포 현탁액에서 부착되지 않은 모든 세포를 수집합니다.그런 다음 쥐 PDGFR-알파 항체 코팅 플레이트에 세포를 파종합니다. 플레이트를 실온에서 45분 동안 배양합니다. 45분이 지나면 접시를 다시 휘젓습니다.그런 다음 세포 현탁액을 폐기합니다. 다음으로, DPBS로 플레이트를 8회 헹구어 비부착성 세포를 제거합니다. 현미경으로 플레이트를 검사합니다.다음으로, rat PDGFR-alpha 항체 코팅 플레이트에 세포 분리 용액을 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 그 동안 플레이트를 흔들어 부착 세포를 제거하고 현미경으로 검사합니다.다음으로, 실온에서 300배g의 속도로 세포를 원심분리한다. 원심분리 후 세포 펠릿을 1ml의 OPC 세포 배양 배지로 재현탁합니다. 그런 다음 혈구계에서 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 세포를 계산합니다.혈구계에서 세는 후에, ChIP 반응을 위한 OPC 세포 배양 매체의 1 밀리리터에 있는 20의 순화된 OPCs를 추가하십시오. 그런 다음 27 마이크로 리터의 포름 알데히드 36.5 %를 실온에서 10 분 동안 첨가합니다. 이렇게 하면 세포가 수정됩니다.10분 후, 실온에서 5분 동안 고정된 세포에 2.5몰 글리신 50마이크로리터를 추가합니다. 글리신을 첨가하면 DNA-단백질 가교가 중단됩니다. 그런 다음 프로테아제 억제제 칵테일을 탄 HBSS 완충액 1ml로 가교 결합 세포를 세척합니다.다음으로, 예냉각된 원심분리기 기계에서 섭씨 4도에서 300배 g으로 세포를 원심분리합니다. 정제된 OPC를 가교한 후 가교된 세포를 얼음처럼 차가운 HBSS 용액을 사용하여 세척해야 하며, 나머지 ChIP 단계는 4도에서 수행해야 하며, 그렇지 않으면 항체가 게놈 DNA를 적절하게 침전시킬 수 없습니다. 그런 다음 세포 펠릿에 25마이크로리터의 완전 용해 완충액을 추가하고 얼음 위에 5분 동안 그대로 둡니다.다음으로, 75마이크로리터의 얼음처럼 차가운 HBSS 완충액을 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 피펫팅합니다. 그런 다음, 30 초 켜기 및 30 초 끄기 프로그램의 5 주기로 사전 냉각 된 초음파 처리 시스템에서 세포 용해 물의 염색질을 전단합니다. 염색질이 깎이면 14, 섭씨 4도에서 10분 동안 000배 g로 세포 용해물을 원심분리하십시오.원심분리가 끝나면 상층액을 수집합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 전단된 염색질을 프로테아제 억제제가 있는 얼음처럼 차가운 ChIP 완충액과 동일한 부피로 희석합니다. 다음으로, 180마이크로리터의 희석된 전단 염색질에 1마이크로리터의 토끼 항-Olig2 항체를 추가합니다.회전하는 바퀴에서 튜브를 섭씨 4도에서 분당 40회전으로 16시간 동안 배양합니다. 다음으로, 10마이크로리터의 사전 세척된 단백질 A 코팅 비드를 냉장실의 ChIP 반응 튜브에 추가합니다. 다시 말하지만, ChIP 튜브를 섭씨 4도에서 회전 휠에서 2시간 더 배양합니다.2시간 후 ChIP 반응 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 4개의 세척 버퍼로 100마이크로리터로 비드 펠릿을 섭씨 4도의 회전 휠에서 각각 4분 동안 세척합니다. 그런 다음 비드 펠릿에 200마이크로리터의 용출 완충액을 추가합니다.반응 튜브를 섭씨 65도에서 4시간 동안 배양합니다. 이중 가닥 DNA가 변성되면 새우 알칼리성 인산가수분해효소를 첨가하여 단일 가닥 DNA의 3-프라임 말단을 인산화합니다. 그런 다음 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소를 사용하여 단일 가닥 DNA에 poly-T 꼬리를 추가합니다.다음으로, DNA poly-dA 프라이머를 단일 가닥 DNA 주형에 어닐링합니다. 다음으로, 인덱싱을 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 ChIP 시퀀스 라이브러리를 증폭합니다. 라이브러리 준비를 위한 PCR 주기의 수는 시작 DNA의 양에 따라 다릅니다.좋은 라이브러리 준비는 입력 DNA 양의 정확한 정량화가 필요합니다. PCR 주기가 너무 많거나 너무 적으면 라이브러리 농도와 복잡성에 영향을 미쳐 PCR 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 상자성 비드를 사용하여 PCR 증폭 ChIP 염기서열 라이브러리에서 250 - 500 염기쌍 범위의 단편을 선택합니다.미세유체 칩-모세관 전기영동 장치를 사용하여 선택한 ChIP 시퀀스 라이브러리의 품질을 검사합니다. 면역판넬화된 OPC의 순도를 평가하기 위해 면역염색 연구가 수행됩니다. OPC 계통 마커 NG2 항체를 사용하면 PDGFR-알파 항체 면역 판금 세포의 대다수가 NG2 양성임을 보여줍니다.다음으로, PDGFR-alpha의 농축을 확인하기 위해 정량 PCR을 수행합니다. 얻어진 플롯은 해리된 뇌 세포와 비교하여 PDGFR-알파의 상당한 농축을 나타내는 신경 마커인 Tuj1의 발현이 거의 없음을 보여줍니다. GFAP, Mog 및 Mbp와 같은 다른 모든 마커에 대해 거의 발현되지 않는 유사한 결과가 얻어지며 이는 PDGFR-알파의 농축을 나타냅니다.그런 다음 ChIP 시퀀스 라이브러리의 품질을 분석합니다. 전기표상도는 라이브러리 PCR 산물의 크기 선택 후 250 - 500 염기쌍 범위의 Olig2 전사 인자에 대한 명확한 피크를 나타냅니다. 여기서 히스토그램은 피크 호출 전에 얻은 품질 관리 메트릭을 확인하기 위해 태그 클론성을 표시합니다.막대는 판독값의 90% 이상이 하나의 게놈 위치에만 매핑되었음을 나타냅니다. 그런 다음, 우세한 단편 길이에 해당하는 농축된 피크를 나타내는 가닥 상관 플롯을 얻습니다. 플롯에서 빨간색 선은 각각 50개의 염기쌍에서 읽기 길이를, 130개의 염기쌍에서 단편 길이를 나타내며, 따라서 고품질 데이터를 나타냅니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3일 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 일차 세포 또는 희귀 세포에서 전사 인자 및 기타 단백질의 게놈 전체 DNA 결합 부위를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 면역판닝을 통해 마우스 뇌에서 1차 OPC를 정제하는 방법과 적은 수의 세포를 사용하여 ChIP-seq 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

identifying-transcription-factor-olig2-genomic-binding-sites-acutely

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

처프 긴 noncoding RNAs의 게놈에 바인딩 사이트 (lncRNAs)를 매핑하는 소설 및 신속한 기술입니다. 방법은 lncRNA 바인딩된 게놈 사이트의 열거를 허용하는 안티 센스가 원래의 oligonucleotides의 특이성을 이용합니다.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

이 동영상은 단백질-DNA 상호작용을 입증하는 고전적인 기술인 염색질 면역침전(ChIP) 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 인간 만성 림프구성 백혈병 세포에서 표적 유전자를 확인하는 데 사용됩니다.

염색질 면역침전 분석법: 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하는 기술

이 비디오에서는 단백질 결합 염색질 단편의 선택적 면역침전을 통해 희소돌기아교세포 전구체 세포의 게놈 DNA의 특정 영역에서 단백질 결합 부위를 식별하는 염색질 면역침전 기술을 보여줍니다. 이 방법은 유전자 조절에 관여하는 전사 인자를 포함한 여러 조절 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

게놈 DNA의 표적 단백질 결합 부위를 확인하기 위한 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

이 작업에서는 활성 인핸서를 식별하고 실험적으로 검증하는 방법에 대한 실험적 워크플로를 제공합니다.

예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

본질적으로 무질서한 도메인은 온코겐융합 전사 인자 기능에 중요합니다. 이러한 단백질을 치료적으로 표적으로 하기 위해서는 이러한 도메인에 의해 사용되는 규제 메커니즘에 대한 보다 상세한 이해가 필요합니다. 여기서는 전사학을 사용하여 유잉 육종에서 본질적으로 무질서한 EWS 도메인의 중요한 구조적 특징을 매핑합니다.

전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑

배우세요 저세포 크로마틴 면역침전 시퀀싱(ChIP-seq)을 사용하여 마우스 뇌에서 급성 분리된 과립세포 전구체(OPC)에서 Olig2 전사인자의 게놈 전체 결합을 분석하는 방법을. 이 기술은 전사 조절과 후성유전학적 메커니즘 연구에 활용됩니다.

PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

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