PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

이 실험의 전반적인 목표는 면역판닝, 저세포 염색질 면역침전, 고처리량 염기서열분석 및 생물정보학 데이터 분석을 수행하여 급성으로 정제된 뇌 희소돌기아교세포 전구세포에서 희소돌기아교세포 전사 인자 2의 게놈 전체 결합을 분석하는 것입니다. 이 방법은 세포 분화 및 발달에 중요한 역할을 하는 게놈 전체의 전사 조절 및 후성유전학적 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 시험관 내 증식이 없는 급성 정제된 일차 세포를 포함하여 제한된 수의 모든 세포 유형을 가진 다른 전사 인자의 ChIP-seq에 광범위하게 적용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Yanan You입니다. 그녀는 이 논문의 공동 저자입니다. PDGFR-알파 양성 세포를 선택하려면, 면역판닝을 위한 플레이트 하나를 준비합니다.

내피 세포와 미세아교세포 고갈을 위해 또 다른 두 개의 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 10cm 페트리 접시에 30마이크로리터의 염소 항쥐 면역글로불린을 코팅합니다. 그런 다음 플레이트의 전체 표면이 코팅 용액으로 고르게 덮이도록 플레이트를 교반합니다.

페트리 접시를 섭씨 4도에서 밤새 그대로 두십시오. 다음으로, 40마이크로리터의 쥐 항-PDGFR-알파 항체를 0.2% 소 혈청 알부민을 함유한 12밀리리터의 DPBS로 희석합니다. 다음으로, 면역글로불린 G-코팅 플레이트를 10mL의 1X DPBS로 3회 연속 세척합니다.

그런 다음 면역글로불린 G 코팅 플레이트를 PDGFR-알파 항체 용액과 함께 실온에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후 플레이트의 측벽을 따라 DPBS를 조심스럽게 첨가하여 랫드 항 PDGFR-알파 항체 코팅 플레이트를 세 번 세척합니다. 플레이트의 코팅된 표면을 방해하지 마십시오.

다음으로, BSL-1 밀리리터당 2.3마이크로그램과 함께 20밀리리터의 DPBS를 사용하여 15cm 페트리 플레이트 2개를 2시간 동안 코팅합니다. 배양 후 플레이트의 측벽을 따라 20ml의 DPBS를 조심스럽게 추가하여 BSL-1 플레이트를 세 번 세척합니다. 코팅된 표면을 방해하지 마십시오.

세척 후 단세포 현탁액을 실온에서 300회 g으로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 세포 펠릿에 15ml의 면역판닝 완충액을 추가합니다. 그런 다음 두 개의 BSL-1 코팅된 페트리 접시에서 두 개의 마우스 뇌에서 단일 세포 현탁액을 순차적으로 배양합니다.

그런 다음 접시를 실온에서 15분 동안 그대로 두십시오. 부화 중 5분마다 플레이트를 교반합니다. 그런 다음 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 세포 현탁액에서 부착되지 않은 모든 세포를 수집합니다.

그런 다음 쥐 PDGFR-알파 항체 코팅 플레이트에 세포를 파종합니다. 플레이트를 실온에서 45분 동안 배양합니다. 45분이 지나면 접시를 다시 휘젓습니다.

그런 다음 세포 현탁액을 폐기합니다. 다음으로, DPBS로 플레이트를 8회 헹구어 비부착성 세포를 제거합니다. 현미경으로 플레이트를 검사합니다.

다음으로, rat PDGFR-alpha 항체 코팅 플레이트에 세포 분리 용액을 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 그 동안 플레이트를 흔들어 부착 세포를 제거하고 현미경으로 검사합니다.

다음으로, 실온에서 300배g의 속도로 세포를 원심분리한다. 원심분리 후 세포 펠릿을 1ml의 OPC 세포 배양 배지로 재현탁합니다. 그런 다음 혈구계에서 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 세포를 계산합니다.

혈구계에서 세는 후에, ChIP 반응을 위한 OPC 세포 배양 매체의 1 밀리리터에 있는 20의 순화된 OPCs를 추가하십시오. 그런 다음 27 마이크로 리터의 포름 알데히드 36.5 %를 실온에서 10 분 동안 첨가합니다. 이렇게 하면 세포가 수정됩니다.

10분 후, 실온에서 5분 동안 고정된 세포에 2.5몰 글리신 50마이크로리터를 추가합니다. 글리신을 첨가하면 DNA-단백질 가교가 중단됩니다. 그런 다음 프로테아제 억제제 칵테일을 탄 HBSS 완충액 1ml로 가교 결합 세포를 세척합니다.

다음으로, 예냉각된 원심분리기 기계에서 섭씨 4도에서 300배 g으로 세포를 원심분리합니다. 정제된 OPC를 가교한 후 가교된 세포를 얼음처럼 차가운 HBSS 용액을 사용하여 세척해야 하며, 나머지 ChIP 단계는 4도에서 수행해야 하며, 그렇지 않으면 항체가 게놈 DNA를 적절하게 침전시킬 수 없습니다. 그런 다음 세포 펠릿에 25마이크로리터의 완전 용해 완충액을 추가하고 얼음 위에 5분 동안 그대로 둡니다.

다음으로, 75마이크로리터의 얼음처럼 차가운 HBSS 완충액을 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 피펫팅합니다. 그런 다음, 30 초 켜기 및 30 초 끄기 프로그램의 5 주기로 사전 냉각 된 초음파 처리 시스템에서 세포 용해 물의 염색질을 전단합니다. 염색질이 깎이면 14, 섭씨 4도에서 10분 동안 000배 g로 세포 용해물을 원심분리하십시오.

원심분리가 끝나면 상층액을 수집합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 전단된 염색질을 프로테아제 억제제가 있는 얼음처럼 차가운 ChIP 완충액과 동일한 부피로 희석합니다. 다음으로, 180마이크로리터의 희석된 전단 염색질에 1마이크로리터의 토끼 항-Olig2 항체를 추가합니다.

회전하는 바퀴에서 튜브를 섭씨 4도에서 분당 40회전으로 16시간 동안 배양합니다. 다음으로, 10마이크로리터의 사전 세척된 단백질 A 코팅 비드를 냉장실의 ChIP 반응 튜브에 추가합니다. 다시 말하지만, ChIP 튜브를 섭씨 4도에서 회전 휠에서 2시간 더 배양합니다.

2시간 후 ChIP 반응 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 4개의 세척 버퍼로 100마이크로리터로 비드 펠릿을 섭씨 4도의 회전 휠에서 각각 4분 동안 세척합니다. 그런 다음 비드 펠릿에 200마이크로리터의 용출 완충액을 추가합니다.

반응 튜브를 섭씨 65도에서 4시간 동안 배양합니다. 이중 가닥 DNA가 변성되면 새우 알칼리성 인산가수분해효소를 첨가하여 단일 가닥 DNA의 3-프라임 말단을 인산화합니다. 그런 다음 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소를 사용하여 단일 가닥 DNA에 poly-T 꼬리를 추가합니다.

다음으로, DNA poly-dA 프라이머를 단일 가닥 DNA 주형에 어닐링합니다. 다음으로, 인덱싱을 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 ChIP 시퀀스 라이브러리를 증폭합니다. 라이브러리 준비를 위한 PCR 주기의 수는 시작 DNA의 양에 따라 다릅니다.

좋은 라이브러리 준비는 입력 DNA 양의 정확한 정량화가 필요합니다. PCR 주기가 너무 많거나 너무 적으면 라이브러리 농도와 복잡성에 영향을 미쳐 PCR 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 상자성 비드를 사용하여 PCR 증폭 ChIP 염기서열 라이브러리에서 250 - 500 염기쌍 범위의 단편을 선택합니다.

미세유체 칩-모세관 전기영동 장치를 사용하여 선택한 ChIP 시퀀스 라이브러리의 품질을 검사합니다. 면역판넬화된 OPC의 순도를 평가하기 위해 면역염색 연구가 수행됩니다. OPC 계통 마커 NG2 항체를 사용하면 PDGFR-알파 항체 면역 판금 세포의 대다수가 NG2 양성임을 보여줍니다.

다음으로, PDGFR-alpha의 농축을 확인하기 위해 정량 PCR을 수행합니다. 얻어진 플롯은 해리된 뇌 세포와 비교하여 PDGFR-알파의 상당한 농축을 나타내는 신경 마커인 Tuj1의 발현이 거의 없음을 보여줍니다. GFAP, Mog 및 Mbp와 같은 다른 모든 마커에 대해 거의 발현되지 않는 유사한 결과가 얻어지며 이는 PDGFR-알파의 농축을 나타냅니다.

그런 다음 ChIP 시퀀스 라이브러리의 품질을 분석합니다. 전기표상도는 라이브러리 PCR 산물의 크기 선택 후 250 - 500 염기쌍 범위의 Olig2 전사 인자에 대한 명확한 피크를 나타냅니다. 여기서 히스토그램은 피크 호출 전에 얻은 품질 관리 메트릭을 확인하기 위해 태그 클론성을 표시합니다.

막대는 판독값의 90% 이상이 하나의 게놈 위치에만 매핑되었음을 나타냅니다. 그런 다음, 우세한 단편 길이에 해당하는 농축된 피크를 나타내는 가닥 상관 플롯을 얻습니다. 플롯에서 빨간색 선은 각각 50개의 염기쌍에서 읽기 길이를, 130개의 염기쌍에서 단편 길이를 나타내며, 따라서 고품질 데이터를 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3일 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 일차 세포 또는 희귀 세포에서 전사 인자 및 기타 단백질의 게놈 전체 DNA 결합 부위를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 면역판닝을 통해 마우스 뇌에서 1차 OPC를 정제하는 방법과 적은 수의 세포를 사용하여 ChIP-seq 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.