녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

이 방법은 뇌 영역과 자극 프로토콜이 가장 적합한지와 같은 간질 치료를 위한 신경 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 설치류 뇌 절편이 뇌 회로의 단순화되고 사실적인 모델을 나타내는 반면 미세 전극 배열은 알려진 전극 간 거리에서 여러 관찰 지점을 허용한다는 것입니다. MEA를 준비하려면 녹음 챔버의 바닥 표면에 엘라스토머 실런트를 고르게 펴고 기포가 없는지 확인합니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 기록 챔버를 MEA에 장착하고 부드러운 압력을 가합니다. 기록 챔버의 바깥쪽 테두리 주위에 실런트 층을 펴 바릅니다. 그런 다음 MEA/챔버 어셈블리를 밀폐되고 습한 환경에 놓고 실온에서 밤새 경화시킵니다.

녹음 벤치를 준비하려면 따뜻한 욕조를 섭씨 32도로 설정하십시오. 다음으로, 홀딩 ACSF를 홀딩 및 예열 챔버에 붓습니다. 95%의 산소와 5%의 이산화탄소 혼합물로 용액의 거품을 일으키고 거꾸로 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 갇힌 거품을 제거합니다.

보관실을 실온으로 유지하고 예열실을 따뜻한 욕조에 넣습니다. 표준 절차에 따라 수평 해마-피질 뇌 절편을 준비하고 실온의 보관실에서 최소 60분 동안 회복되도록 합니다. 4AP ACSF를 배양 챔버에 붓습니다.

그런 다음 95%의 산소와 5%의 이산화탄소 혼합물로 거품을 일으키고 거꾸로 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 갇힌 거품을 제거합니다. 그런 다음 챔버를 덮고 따뜻한 욕조로 옮깁니다. 사전 예열 ACSF 및 4AP ACSF 온도가 섭씨 30-32도인지 확인하십시오.

거꾸로 된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 하나의 뇌 조각을 예열 챔버로 옮기고 조직을 25-30 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 뇌 절편을 4AP ACSF 배양실로 옮기고 60분 동안 그대로 둡니다. 내부에 공기가 없을 때까지 4AP ACSF가 관류 튜브를 통해 비커로 흐르도록 합니다.

그런 다음 솔루션 흐름을 중지합니다. 드라이 MEA 칩을 MEA 내부에 놓습니다 ampliifier, 그리고 고정 amp리퍼 헤드. 그런 다음 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 4AP ACSF를 기록 챔버의 입구 및 출구 저장소로 이동합니다.

가열 캐뉼러를 마그네틱 홀더에 고정하고 팁을 기록 챔버 입구 포트 내부에 놓습니다. 그런 다음 마그네틱 홀더를 MEA 앰프 헤드의 마그네틱 스트립에 부착합니다. 관류 튜브를 캐뉼라에 연결하고 캐뉼러를 온도 조절기에 연결합니다.

그런 다음 흡입 바늘을 배출구 저장소에 넣습니다. 흡입 바늘을 ACSF에 담그어 음압이 있는지 확인하고 지속적인 저주파 흡입 소음을 확인하십시오. 다음으로, 분당 1밀리리터의 유속을 허용하도록 유량 조절기를 설정하고 관류를 시작합니다.

4AP ACSF가 캐뉼러를 통해 흐르면 온도 조절기를 켭니다. 가열 캐뉼러를 섭씨 37도로 설정하고 MEA 베이스를 섭씨 32도로 설정하여 기록 챔버 내부의 온도를 섭씨 32-34도의 온도로 설정합니다. 그런 다음 외부 기준 전극을 기록 챔버 입구 저장소에 놓습니다.

4AP ACSF 레벨과 기록 온도가 원하는 대로 안정화되면 관류와 흡입 스톱콕을 꺼짐 위치로 돌려 일시적으로 중지합니다. 인버티드 글라스 파스퇴르 피펫을 사용하여 하나의 뇌 절편을 MEA 기록 챔버로 빠르게 옮깁니다. 필요에 따라 불에 광택을 낸 컬 파스퇴르 피펫 또는 부드럽고 컴팩트한 작은 브러시를 사용하여 MEA 기록 영역의 위치를 조정합니다.

뇌 조각에 홀드다운 앵커를 놓습니다. 스톱콕을 다시 켜짐 위치로 돌려 관류와 흡입을 다시 시작하십시오. 도립 현미경 스테이지에 장착된 카메라를 사용하여 뇌 절편의 사진을 촬영합니다.

그런 다음 컴퓨터 소프트웨어에서 스크립트 mapMEA를 실행하여 전극을 매핑하는 GUI를 시작합니다. 찾아보기 버튼을 클릭하여 뇌 슬라이스의 사진을 로드합니다. 기준 전극이 MEA의 왼쪽 절반의 상단 열에 나타나는지 확인합니다.

그런 다음 포인터 활성화 버튼을 클릭합니다. 배열의 가장 왼쪽 열에서 상단 및 하단 전극을 선택하여 이미지 수평 조정 및 전극 매핑을 위한 XY 좌표를 표시합니다. slice type(슬라이스 유형) 드롭다운 메뉴에서 Horizontal(가로)을 선택합니다.

Default Structures(기본 구조) 확인란을 선택합니다. brain slice 그림 아래에 있는 번호가 매겨진 푸시 버튼을 사용하여 ROI에 해당하는 전극을 선택하고 구조 패널에서 해당 푸시 버튼을 클릭하여 할당합니다. 각 ROI에 대해 이 단계를 반복합니다.

그런 다음 저장 버튼을 누릅니다. 소프트웨어는 선택한 전극 및 ROI를 보고하는 테이블이 포함된 결과 폴더를 생성합니다. 전기생리학 연구의 경우 자극 프로토콜 최소 10분 전에 자극 장치를 켜서 자체 보정 및 안정화를 허용합니다.

그런 다음 자극 제어 소프트웨어를 시작하고 자극 제어 소프트웨어의 메인 패널에 있는 녹색 LED로 표시된 대로 자극기와 MEA 증폭기가 올바르게 연결되어 있는지 확인합니다. 바이폴라 구성에서 자극을 설정합니다. 자극 장치를 접지에 연결합니다.

그런 다음 스크립트 mapMEA로 매핑된 전극 쌍 중 CA1/근위하 세포층과 접촉하는 전극 쌍을 연결합니다. 데이터를 수집하려면 녹음 소프트웨어의 메인 패널에 있는 재생 버튼을 누르십시오. 최소 4개의 ictal 방전을 기록합니다.

다음으로, 빠른 입력/출력 테스트를 실행하여 최상의 자극 강도를 식별합니다. 이를 위해 메인 패널을 사용하여 위상당 100마이크로초의 지속 시간을 가진 정사각형 biphasic positive-negative current pulse를 설계합니다. Pulse amplitude(펄스 진폭) 탭에서 위상당 100마이크로암페어의 초기 펄스 진폭을 입력합니다.

5초 이상의 인터펄스 간격을 추가하여 자극 펄스를 0.2Hz 이하로 설정합니다. 자극이 해마 주위 피질에서 간극과 같은 사건을 안정적으로 불러일으킬 수 있을 때까지 각 시도에서 자극 진폭을 50-100마이크로암페어 단계씩 증가시킵니다. 변연계 ictogenesis의 전기 변조를 위해 관심 있는 자극 프로토콜을 전달하도록 자극 장치를 프로그래밍하고 입력/출력 테스트 중에 식별된 자극 진폭을 사용합니다.

자극이 멈춘 후, 최소 4회의 ictal 방전을 기록하여 네트워크가 자극 전 상태로 회복되었는지 확인합니다. 이 그림은 제어 조건, 1헤르츠의 주기적 페이싱 동안, 그리고 자극 철회 시 회복 기간 동안 내후각 피질과 주위 피질에서 4AP 유도 ictal 활성의 기록을 보여줍니다. 이 그래프는 1헤르츠에서 주기적 페이싱의 효과를 정량화한 것을 보여주며, 이는 자극 중 총 발작 시간이 크게 감소함을 나타냅니다.

이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 3-4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 뇌 절편을 MEA에 빠르고 정확하게 배치해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 간질 활성에 대한 신경 전달 물질 또는 이온 채널의 기여 및 신경 조절 효과에 대한 추가 질문에 답하기 위해 약리학적 조작과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 뇌 절편뿐만 아니라 배양된 뉴런에서 건강 및 질병의 뉴런 네트워크 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 MEA에 연결된 설치류 뇌 절편에서 4-아미노피리딘에 의해 유도된 간질 활동을 기록하고 전기적으로 조절하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.