Name: 녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 학습하세요 설치류 뇌 조각에서 마이크로전극 배열을 이용한 간질형 활동의 전기적 변조 방법을. 4-아미노피리딘으로 유도된 발작 활동을 기록하고 자극 프로토콜로 조절하는 이 기술은 뇌 회로 연구와 간질 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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저자는 공개 없다.

MEAs 신경 생리학 조사에 대 한 귀중 한 도구 이며, 수십 년간의 탐사 및 개발 덕분에 최근 몇 년 동안에 성숙에 도달 했습니다. 기존의 필드 잠재적인 녹음에 비해 MEAs 관찰 포인트와 알려진된 전극 간 거리는 정확 하 게 신경 네트워크 상호 작용을 정확 하 게 중요 한의 높은 숫자의 큰 이점을 제공 합니다.
MEA 녹음 기술 또한 패치 클램프 기록15, 단일 신경 세포와 신경 네트워크 활동 사이의 관계를 조사 등 다른 전기 생리학 방법에 결합 될 수 있습니다. 또한, 필드 전위와 멀티 유닛 활동을 동시에 시각화의 가능성의 작은 신경 앙상블 활동 및 집단 신경 네트워크 간의 상관 관계에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 전압에 민감한 염료, 칼슘 이미징, 및 optogenetics29 함께 신경 생리학 현상 다면체 접근을 사용 하 여 추론 수 있습니다. 약리 연구 뿐만 아니라 녹화와 같은 시스템 자극의 가능성은 MEA 녹음 기술은 매우 강력 하 고 다재 다능 한: 예, 그것은에 시 냅 스가 소성 현상을 공부 하는 코어 메모리 형성30, 여기, neuromodulation 프로토콜을 사용 하 여 간 질 및 다양 한 뇌 질환을 치료 하는 DBS와 관련 있는. MEA 녹음 기술을 적용할 수 있는 성공적으로 인간의 간 질 뇌 조직16 최근 증거 보여 둘이 치명적인 질병을 기본 기본 메커니즘을 이해 하는 간 질 연구에 귀중 한 유용성 그리고 그것을 개량 하는 DBS 알고리즘을 미세 조정 합니다.
그러나 MEAs 뇌 조각, 침수 녹음 챔버의 요구와 뇌의 필요성에 대 한 '제한' 조건 하에서 전기 생리학 실험의 추구를 강제 하는, 고체 기판에 나머지 부분을 슬라이스 어디 마이크로 전극 통합 되어 있다. 따라서, 뇌 조직에 충분 한 산소 공급, 차례로 녹음의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다 받을 수 없습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 수 안정적으로 기록 하 고 MEAs 급성 체 외 4AP 모델을 사용 하 여 결합 하는 설치류 변 네트워크에 ictogenesis 연구 및 평가 대 한 관련 정보를 제공 하는 전기 자극의 장시간된 신 기원 추구 하 DBS 정책의.
기존의 필드 잠재적인 기록의 사용에 따라 간 질 변 네트워크의 전기 neuromodulation에 이전 연구 비슷한 결과24,25; 마우스 또는 쥐 뇌 조각 사용 그러나 쥐 뇌 조직을 사용 하 여 더 많은 도전, 합리적으로 마우스7에서 얻은 뇌 조직에 비해 약한 연결 때문. MEA 기술 관련 마우스 뇌 조각 그들의 더 작은 크기의 덕택으로 가장 적합 하다. 또한, 쥐 뇌 조직 대 마우스 ictal 같은 방전의 발생의 더 높은 속도 감안할 때, 그것은 차례로 데이터 수집 빠르고 효율적이 게, 하나의 실험 하루 동안 훨씬 더 많은 두뇌 분할 영역을 테스트 하 여 수 있습니다. 사용 하는 동물의 수를 줄일 수 있습니다.
기존의 방법에 관하여 의미:
여기 설명 하는 사용자 지정 챔버를 사용 하 여 기록 ictal 출력 기간 및 기존의 MEA 반지 챔버와 동일한 MEA 형식 (평면 마이크로 전극, cf. 17)를 사용 하 여 관찰 하는 그 발생의 비율에 유사한 것 처럼. 그러나, 그것은 인해 실험 neuromodulation의 성공적인 추구를 방해 수 있습니다 낮은 관류 속도 (1 mL/min)와 함께 기존의 라운드 기록 챔버를 사용 하 여 때 뇌 슬라이스 두께 현저 하 게 감소 되어야 한다 강조 될 필요가 하 불 쌍 한 연결입니다.
이 프로토콜에는 낮은 볼륨 사용자 지정 녹음 실 패치 클램프 기록 챔버 디자인에 의해 영감된는 MEA 녹음;의 성공적인 추구에 대 한 중요 안정적이 고 신뢰할 수 있는 층 흐름을 제공 합니다. 그것은 또한 조직 생존 능력 및 기본 연결 사이 공정한 교환을 달성 하기 위하여 400 µ m 두뇌 슬라이스 두께 증가 수 있습니다. 그것은 참으로 인식 챔버 내에 기록 솔루션의 층 류 흐름은 온도, 산소에 의해 영향을 받지 않습니다 원형 흐름에서 관찰 된다 pH 기온 변화도 라운드 기록 때문에 뇌 조각 전기 생리학에 대 한 매우 바람직한 (사람)과 같은 상용 MEA 제공19,,2031 실 이러한 그라디언트 실험적인 바이어스를 소개 하 고 또한 뇌 조각에 해로운. 높은 관류 속도 (5-6 mL/min)16,31 함께 상대적으로 작은 볼륨 (~1.5 mL)의 녹음 실 관류 매체의 적절 한 교환에 대 한 허용 (≥3 시간 / 분). 사용자 지정 챔버 쉽게 될 수 있는 저렴 한 가격에 상용 소스에서 얻은 또는 3D 인쇄 기술을 사용 하 여 자체 생산. 다른 연구는 저 잡음 연동 펌프의 도움으로 MEA 녹음 400 µ m 두께 인간의 두뇌, 조각16 1 mL에 실제 볼륨을 유지 하 고 높은 관류 속도 (5-6 mL/min)를 시행 하면서 기존의 MEA 반지 챔버를 사용 하 여를 보고 있다. 그러나, 저자는 모델을 사용 다른 ictogenesis, 즉, 낮은 마그네슘2 +, 어떤은 더 적은 4AP 모델 보다 extracellular K+ 농도에 상당한 증가 포함 하는 ephaptic 메커니즘에 의해 영향을 가능성이 11 , 22. 우리 높은 관류 속도 크게 녹음 실제16에 증가 될 필요가 있을 수도 축적 된 세포 외 K+의 밖으로 빠른 세척으로 인해 4AP 모델에 없습니다 것으로 나타났습니다. 사실, ictal 이벤트 등장 더 '청크' ASCF 관류 속도 2-3 mL/min로 증가 하 고 뇌 슬라이스 두꺼운 실제 층에 의해 가라앉아 있었고 반면 강력한 강장제 clonic 구성 요소를 전시 하는 본격적인 방전을 반환 시 복원할 수 있습니다. 낮은 관류 속도 (1 mL/min)와 얇은 실제 계층 조직 표면 수준 (데이터 표시 되지 않음)에서 권리. 이 프로토콜에서 설명 하는 사용자 지정 녹음 챔버 수 교환 관류 매체 3-5 시간 / 1 mL/min의 유량에 분. 따라서, 전체 산소 공급 뇌 조각을 여전히 안정 온도 및 높은 신호 대 잡음 비율을 보장 하면서도 상대적으로 낮은 관류 속도에서 향상 강하게 됩니다. 가장 중요 한 것은, 생리 적인 가치에 extracellular K+ 농도 유지 가능 하다.
Ictogenesis의 4AP 모델 낮추는 Mg2 + 또는 증가 K+, 같은 실제 이온 구성의 중요 한 수정 필요 하지 않습니다 그리고 흥분 성의 억제 전송을 그대로 유지의 독특한 장점을 제공 합니다. 12, 높은 glutamatergic 및 epileptiform 동기화 (cf. 7)에 GABAergic 네트워크의 중요 한 역할에 비추어 간 질 연구에 관련 된 부분입니다. 4AP-실제가이 프로토콜에 사용 되는 생리 적 K+ 농도 (3.25 m m)와 지주 실제 (1.3 m m와 1 m m) 보다 약간 낮은 Mg2 + 농도 포함 되어 있습니다. 이 농도 아직도 쥐 CSF에에서 Mg2 + 농도의 보고 생리 적인 값에 폭포와 많은 실험실 (예17,18참조)에 사용 됩니다. 설명된 프로토콜의 목적에 우리는이 약간 감소 4AP의 효과에 도움을 선호 발견.
이전 작업에서는 4AP 적용 되었습니다 뇌 조각에 때 그것은 이미 녹음 실17,18안으로 배치 했다. 4AP 응용 프로그램 epileptiform 패턴의 시작 간의 시간 대기 시간을 관찰 하는 실험 필요 하지 않는 한 우리가 찾을이 방법은 오히려 시간이 많이 걸리는 이며 장시간된 녹화 및 자극 세션을 추구 하는 적합 하지 않습니다. 이 프로토콜에서 설명합니다. 사전 부 화 뇌 조각 4AP 32 ° C에서의 뇌 조각을 다른 조직 단면도 사용 하 여 실험을 추구 하면서 시리즈에서 사전 처리 될 수 있으므로 많은 실험 시간을 살려주는 수 있습니다.
뇌 조각의 장기 생존 능력 장기에 네트워크 기능을 분석 유용할 수 있습니다. 또한, 반복적인 전기 자극에 그들의 향상 된 복구 큰 장점은 실험 통계 견고성에 대 한 동일한 두뇌 조각에서 수행 해야 하는 여러 자극 프로토콜을 비교 하고자 하는 경우입니다. 우리의 손에서 3 자극 프로토콜을 테스트 하는 경우 각 컨트롤 단계 앞 하 고 복구 단계 이어서, 실험 3-5 시간 지속 될 수 있습니다. 이러한 맥락에서 라이브 MEA 매핑 올바른 경로 활성화 하 고 억제 보다는 전기 자극을 통해 ictogenesis를 부탁 하기 위해 결정적 이다. 우리의 사용자 친화적인 GUI 매핑할 다른 뇌 구조의 전극 신속, 간단 하 고 유연한 도구를 나타냅니다. 상용 소프트웨어에 반대 그것은 기본적인 프로그래밍 기술도 함께 MEA 레이아웃 사용자 지정을 추가할 수입니다. 이미지는 밝은 분야에서 취득 될 수 있다 따라서, 범용 카메라 어떤 좋은 해상도 현미경에 적당 하다. 거꾸로 한 현미경 똑바로 현미경을 사용 하는 경우이 조직 아래 숨겨져 있을 것 이라고 이후 뇌 슬라이스는 microelectrodes 위치를 시각화 하는 필수적 이다. 그러나, 스테레오 현미경 좋습니다 거꾸로 종류는 실험 수행 칼-인하 특정 신경 경로 방해 하는 경우.
마지막으로,는 더 제안 된 방식의 장점은 대부분의 필요한 도구는 비용이 많이 드는의 불필요 한 사용 뿐만 아니라 사용자 지정 녹음 실 및 지주 챔버, 따뜻한 목욕과 슬라이스 앵커 같은 저렴 하 고 상대적으로 쉬운 조립 저소음 연동 펌프입니다.
기술의 한계:
MEA 녹음 매우 느린 파도, 즉시각화를 허용 하지 않습니다, 그리고 DC 신호에 있는 이동. 이러한 초기 심한 ictal 출력 기간의 점근 측정을 도움이 될 수 있으며, 가장 중요 한, 그들은 근본적인 외피 퍼지는 불경기 (현상 간 질32 에서 갑자기 예기치 않은 죽음에 관한 공유 하를 공부 하는 사이 간 질과 편두통33).
전기 neuromodulation 관련 여기에 설명 된 프로토콜 뇌 조각 생존 능력을 영향을 주지 않고 여러 자극 세션을 수행할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 20-45 분, 어떤 이전 작품25에 보고 유사한의 3 자극 세션을 수행할 수 있습니다. 뇌 조각 아마 자극 세션 또는 더 이상 자극 프로토콜의 높은 수를 견딜 수 있습니다, 비록 우리가 않았다 테스트 하지 뇌 조각 이와. 3 자극 프로토콜 수를 제한 하 고 피하 자극 철수 시 회복의 부족까지 이러한 제한 조건에서 유지 하는 뇌 조직 스트레스 크게 수 있습니다 (≥60 분) 자극 세션 연장 하는 것이 좋습니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계:
몇 가지 중요 한 요소는 녹음의 성공적인 추격과 뇌 조각 MEA에 결합 된 epileptiform 활동의 방해 수 있습니다. 게다가 사용 설치류 종 뇌 조각, 기록 하는 동안 관류 속도의 품질과 실제 흐름의 역학 (즉,., 층 류 원형 대) 챔버 내에 기록, 우리는 발견 복구의 조건 및 4AP 응용 프로그램의 모드 뿐만 아니라 뇌 조각의 장기적인 유지 관리에서 가장 중요 한 단계가 있습니다.
침수 지주 챔버를 사용 하 여 때 뇌 조직 네트워크 활동을 보존 4AP 응용 프로그램에 의해 ictal 같은 방전의 유도 부탁을 실 온에서 두뇌 분할 영역을 저장 하는 데 결정적 이다. 우리의 손에서 복구 및 32 ° C에서 유지 보수 조각화의 3-4 h 이내 뇌 조직의 악화.
그러나 4AP-실제 실내 온도에에서 부 화 뇌의 조각와 32 ° C에서 녹음은,, 아닙니다 바람직한. 우리는이 조건에서 강력한 재발 ictal 출력을 관찰에서 많은 어려움을 발견 했다. 사실, 20-24 ° C 범위에서 낮은 온도 저해할 또는 심지어 방지 4AP 유도 ictogenesis 모두 에 체 외34 그리고 vivo에서35보고 되었습니다. 따라서, 4AP 인큐베이션 및 기록 온도 30-34 ° C에 속하는 해야 합니다와 일치 해야 합니다. 않도록 하기 위해 hyperexcitability의 동시 유도 인해 너무 많은 스트레스를 받고 뇌 조직의 4AP 및 뇌 조각의 갑자기 노출에 의해 실내 온도에서 따뜻한 (32 ° C) 4AP-실제에, 그것은 수행 하는 중간 사전 온난화 기본적 이다 단계 및 하자 뇌 조각 길 들 32 ° C에서 실제 지주에 대 한 20-30 분이이 단계를 건너뛰는 4AP로 ictogenesis 유도 영향을 미칠 수 있습니다.
언급 하는 또 다른 측면은 슬 라이 싱 후에 실제 D-포도 당 농도의 중요성. 25 mM 농도 뇌 조각 많은 실험실에서 사용 하는 10mm 농도 보다 더 보존 하 고 또한 빠릅니다 2-fold ictal 활동의 발생의 속도 향상 (따라서, 쉽게 실험의 긴 시리즈를 추구 하 여러 뇌 조각 매일 프로토콜).
마지막으로, 조각화 절차 동안 몇 가지 중요 한 세부 묘사가 언급 될 필요가 있다. 첫째, 허용 하지 않습니다는 그대로 뇌와 뇌 조각 절단 실제 추위에 얼어. 재미를 위한 두뇌 < 2 분은 충분 한 마우스 뇌의 작은 크기를 주어진. 조직 섹션 해야 전송 즉시 버퍼 용지함에서 실내 온도에 헹 구는 비 커. 절단을 rinsing 실제 그렇지 않으면 높은 자당 농도 뇌 조각 지주 챔버의 나일론 메쉬에 충실 할 것입니다 매우 중요 하다. 효과적으로 조직 린스, 그것이 지나치게 지주 실제를 오염 하지 있도록 전송 피 펫 내에서 절단 실제 콘텐츠를 최소화 하기 위해 중요 합니다. 2 단계 rinsing 오염 최소화에 에이즈. 완료 되 면 잘리는 절차, 조직 섹션 해야 전송 즉시 헹 구는 비 커에서 지주 챔버, 어디 부드러운 나일론 메쉬 정지 도중 실제 양쪽 모두에 조직의 산소 수 지주에. 조각화 절차에 따라 모든 단계에서 동일한 원리를 적용 한다: 두뇌 분할 한다 결코 비 커의 하단에, 그들은 지주 챔버의 측면 접촉 해서는 안 앉아서 그들은 결코 서로 접촉 해야도 오버랩.
수정 및 문제 해결:
실제 구성 실험의 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 예를 들어 약물의 특정 신경 전달 물질 또는 이온 채널 전기 neuromodulation의 효능에 기여를 해 부를 추가할 수 있습니다. 또한, pyruvic 및 의약품 (cf. 표 2) 생략할 수 있습니다, 비록 우리가 그들은 강력한 신경 역할 발휘 찾을. 우리 보고 표 3 이 프로토콜에 그들과 함께 처리 하는 방법을 발생할 수 있는 가장 일반적인 문제.
결론:
MEA 녹음은 의심할 여 지 없이 건강 및 질병에 신경 네트워크의 상호 작용을 해결 하기 위해 귀중 한 기술입니다. 약리 연구 이외에 간 질 및 다른 신경 성 질환에 적용 하는 DBS와 관련 된 전기 neuromodulation 프로토콜 평가 가능 하다. 이 프로토콜에서 우리는 그것이 기존의 extracellular 필드 잠재적인 녹음으로 얻은 그 비슷한 결과 함께 전형적인 정기적인 자극 실험을 재현 가능 하 고 외부 전극을 자극 것으로 나타났습니다. 상업 사용자 친화적인 장비 및 고급 소프트웨어 툴의 증가 가용성 MEA 녹음 기술 또한 폐쇄 루프 자극 실험, 뇌 조직 하 고 임시 자극을 제공 하기에 적합 하 게 신경 네트워크 응답을 피드백 메커니즘의 기여를 조사 합니다.

간 질은 뇌1;의 통제 활동을 일으키는 생명이 진보적인 장애 그것은 질병 및 중요 한 사회적인 낙인2,3의 가장 높은 부담 중 수행합니다. TLE은 가장 빈번한 증후군 (40%)와 가장 자주 (~ 30%)4항 간 질 약물 저항. Epileptogenic 직물의 외과 제거는 환자의 상태를 개량 수 있습니다, 그러나 그것은 모든 환자에서 가능 하지 않습니다 하 고 완전히 발작-무료 생활5하지 못할 수 있습니다. 전기 DBS에 의해 간 질 변 네트워크의 유망한 접근 때 약리 치료 또는 신경외과 적합 하지 않습니다.
그들은 보존, 적어도 부분, 원래 건축과 뇌의 연결 설치류 뇌 조각 전기 생리학 기술 시험관에 의해 건강과 질병6 어떻게 신경 네트워크 기능을 공부 하는 유용한 도구는 관심 (ROI)의 지구. 특히, 수평 결합 된 해 마 entorhinal 외피 (해 마-EC) 조각 TLE에 관련 된 필수적인 신경 네트워크를 구성 하 고는 따라서 정기적으로 TLE 연구7 체 외에서 .
발작 같은 활동 수 있습니다 심하게 유도 될 두뇌 조각에서 마그네슘 칼륨8,,910, 증가 하면서 감소 하는 등 인조 척수 (실제)의 이온 구성을 변경 하 여 또는 금지 GABAergic 활동을 차단 하는 등 약리 조작에 의하여 (종합적인 검토에 대 한11 참조). 그러나, 이러한 모델 기반 흥분 및 억제;의 불균형된 변경 따라서, 그들은 상호 작용 및 흥분 성의 억제 네트워크 ictogenesis의 공동된 기여를 공부 하 고 허용 하지 않습니다. 뇌 조각 convulsant 마약 4AP로 지속적인 관류 강화 흥분 성의 억제 neurotransmission, 그대로 유지 하면서 시 냅 스 활동이 전반적으로 급성 ictogenesis 공부 하 되므로12.
MEAs 기존의 extracellular 필드 잠재적인 녹음, 공간 제한 될 수 있는 전극의 수를 제한 하는 어디에 비교 하 여 관찰 포인트의 큰 숫자에서 신경 네트워크에 의해 생성 된 전기 활동을 기록 허용 뇌 조각 표면에 수용. 또한, MEA 칩 추적 전파를 매우 유용 하는 알려진된 전극 간 거리의 추가 된 이점을 제공 하 고 기록 된 신호의 이동 속도 평가. 처음 경작된 뉴런13,14에서 기록에 대 한 잉태, 비록 MEAs 지금 또한 사용 된다 설치류15 와 인간16에서 얻은 급성 뇌 조각의 electrophysiological 기능 하. 따라서, 간 질 연구의 맥락에서 MEAs ictogenesis16,,1718의 핵심에 신경 네트워크의 상호 작용을 정확 하 게 유용한 도구를 나타냅니다.
그러나, MEA 녹음 본질적으로 오랫동안 (몇 시간) 실험 프로토콜에 걸쳐 안정적인 epileptiform 패턴을 유지 하거나 기술 과제를 수행 합니다. 첫째, 조직의 산소 하지 큰 내에서 적절 한 및 수 불 쌍 한 신호 대 잡음 비율 및 온도 불안정성에 영향을 하는 동안 침수 형 녹음 실19,20 상용 MEAs의 전형적인 라운드 때 높은 관류 속도 (6-10 mL/min) 녹음의 품질 (난방 및 관류 장비21예 기술 노트를 참조) 뇌 조각에 산소 공급을 향상 하는 데 사용 됩니다. Epileptiform 방전 등의 높은 주파수 구성 요소를 갖춘 두 번째, 재발 성 방전은 거의 침수 형 녹음 실19;를 사용 하 여 관찰 이것은 특히 사건 때 급성 epileptiform 패턴 화학적으로 유도 된 ephaptic 메커니즘을 포함 4AP 모델22 의 경우 처럼 (11 에 대 한 포괄적인 개요 참조). 이러한 한계를 극복 하기 위해 몇 가지 전략 연구원에 의해 제안 되었습니다. 예를 들어 조직에 적절 한 산소 공급을 달성 하는 데 중요 한 요소는 두뇌 슬라이스 두께 (≤300 µ M) 및 지역17,18 줄이면서 관류 속도19,20 증가. 또한, 향상 된 뇌 조각 생존 모두 양쪽18에서 뇌 조직 perfusing 수 있도록 천공된 MEAs (pMEAs)를 사용 하 여 또한 수행할 수 있습니다.
설명된 방법을 크게 두뇌 조각에서 MEA 녹음의 가능성 향상, 반면 그들은 테스트 되지 않았습니다에 대 한 연장 (몇 시간)는 후자를 나타내는 중요 한 기록 및 전기 자극 세션 뇌 조직에 대 한 스트레스입니다. 장시간된 녹음 세션 단기 측정에 의해 정체 수 없습니다 epileptiform 패턴의 특정 기능의 시간에 진화를 연구 하 필요할 수 있습니다. DBS 연구의 맥락에서 장기간된 실험 프로토콜 평가 하 고 동일한 뇌 조각에 여러 자극 패러다임의 효과 비교 하 여 필요할 수 있습니다.
필요가 있을 때만 자발적인 전기 활동 기록, 투자 수익에 관하여 전극의 매핑 일반적으로 이루어집니다 귀납적은, 즉, 데이터 분석; 중 대신, 갖는 응답 또는 전기 neuromodulation 패러다임의 연구는 실험 기간 동안 신속 하 고 쉽게 라이브 전극 매핑 필요 지시 된 특정 ROI(s)에 자극 전달는 필요 합니다.
여기, 우리는 유도 및 설치류 뇌 조각에 안정적인 4AP 유도 epileptiform 패턴의 유지 보수에 대 한 허용 하는 간단한 실험 프로토콜을 설명 합니다. 기존의 세포 외 전기 생리학 기술을 사용 하 여 특징 관찰된 활동 충실 하 게이 모델의 electrophysiological 기능을 재생산 한다. 그것은 몇 시간 동안 지속 되 고 반복된 장시간된 신 기원에 대 한 지속적인된 전기 자극을 outlasts. 유지 하 고 품 어 뇌 조각 하는 데 사용 하는 챔버 조립 될 수 있다 쉽게 표준 실험실 공급 (그림 1A)를 사용 하 여 있지만 최적 환율 및 층 류 흐름 (그림 1B)에 대 한 허용 하는 사용자 지정 녹음 실 상업적인 소스에서 얻을 수 또는 저렴 한 가격에 3D 인쇄 기술을 사용 하 여. 실시간 모니터링 및 자극 전극의 선택에 대 한 ROI(s)의 빠른 매핑 가능한 mapMEA, 요청에 따라 자유롭게 사용할 수 있는 명명 된 사용자 지정 사용자 친화적인 GUI에 의해 이루어집니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57548/57548fig1.jpg"> 그림 1:이 프로토콜 사용 하는 사용자 정의 장비. (A) 복구, 미리 데우고는, 및 4AP 사전 보육에 대 한 실 비 커, 페 트리 접시를 사용 하 여 조립 하는 지주. 페 트리 접시 지름에서 보다 작아야 차단기 고 주사기 플런저에 의해 장소에서 개최 됩니다. 페 트리 접시의 바닥은 나일론 메쉬 (부드러운 스타킹)에서 페 트리 접시의 가장자리에 cyanoacrylate와 붙어으로 바뀝니다. 산소는 구부러진된 척추 바늘 (22 세대), 페 트리 접시의 벽과 비 커 사이 삽입을 통해 제공 됩니다. 거품 비 커와 결코 도달 뇌 조각 변위를 피하기 위해 나일론 메시의 측면에서 등장 한다. 페 트리 접시 위에 실제 증발을 방지 하 고 산소 포화를 유지 하는 뚜껑으로 사용할 수 있습니다. (B) 사용자 지정 녹화 챔버입니다. : 난방 정 및 참조 전극에 맞게 입구 저수지. 개: 흡입 바늘에 맞게 콘센트 저수지. rec: 녹화 챔버입니다. (C) 유리 파스퇴르 피 펫, 화재 연마 하 여 웅크리고 조직 처리 기록 챔버 내에서 위치를 조정 하는 데 사용. (D) 사용자 정의 슬라이스 고정 앵커. (E) 최종 조립 녹음 실의 MEA 칩에 장착. 뇌 조각 앵커에 의해 장소에서 개최 하는 하단에 달려있다. 빨간색 화살표는 반면 빨간색 원 참조 전극, 포화 KCl 펠 릿 실제 입구 저수지에 의해 잠긴 나타냅니다 난방 정 취재 PTFE 튜빙을 나타냅니다. 파란색 화살표는 콘센트 저수지에서 흡입 바늘을 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/57548/57548fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>폴리-D-라이신&nbsp;</td><td>MEA 코팅에 필요한</td> <td>Sigma-Adrich</td><td>P7886</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S9888</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P9541</td><td>화학</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Adrich</td><td>795488</td><td>화학</td></tr><tr><td>CaCl2*2 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>C3306</td><td>화학</td></tr> D<tr><td>-포도</td>당 <td>Sigma-Adrich</td><td>RDD016</td><td>화학</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S5761</td><td>화학</td></tr><tr><td>MgCl2*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M2670</td><td>화학</td></tr><tr><td>MgSO4*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M5921</td><td>화학</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-애드리치</td><td>RDD023</td><td>화학</td></tr><tr><td>피루브산, 98%&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>107360</td><td>화학</td></tr><tr><td>4-아미노피리딘</td><td>Sigma-Adrich</td><td>A78403</td><td>경련제</td></tr><tr><td>STG-2004</td><td>다채널 시스템</td><td>STG4004-1.6mA</td><td>4채널 자극 발생기 전압 (&plusmn; 8 V) 및 전류 출력(&plusmn; 1.6mA)</td></tr><tr><td>MEA1060</td><td>멀티채널 시스템</td><td>N/A</td><td>MEA 앰프</td></tr><tr><td>평면 MEA</td><td>멀티채널 시스템</td><td>60MEA500/30iR-Ti(링 없음</td>) <td>맞춤형 녹음실을 사용하려면 링이 없어야 합니다.</td></tr><tr><td>McRack</td><td>멀티채널 시스템</td><td></td><td>녹음 소프트웨어</td></tr><tr><td>McStimulus II</td><td>멀티채널 시스템</td><td></td><td>STG4004 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>TC02</td><td>다채널 시스템</td><td>TC02</td><td>2-채널 온도조절기</td></tr><tr><td>PH01</td><td>다채널 시스템</td><td>PH01</td><td>가열 관류 캐뉼라</td></tr><tr><td>MPH&nbsp;</td><td>멀티채널 시스템</td><td>MPH&nbsp;</td><td>PH01 및 흡입 바늘용 마그네틱 홀더</td></tr><tr><td>Elastostil E43</td><td>Wacker</td><td>E43</td><td>엘라스토머 실란트는 MEA</td></tr><tr><td>MEA 맞춤형 챔버</td><td>Crisel Instrument</td><td>SKE-챔버 MEA</td><td>맞춤형 녹음 챔버</td></tr><tr><td>Ag/AgCl 전극, 펠릿, 1.0 mm&nbsp;</td><td>Crisel Instrument</td><td>64-1309</td><td>커스텀 레코딩 챔버용 기준 전극</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>효소 세척기</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The Mathworks</td><td></td><td>전극 매핑을 위한 프로그래밍 환경</td></tr><tr><td>VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td>Ag-AgCl 전극 펠릿 1.0mm(E205). 참조 전극.</td></tr></tbody></table>

녹음 및 microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 epileptiform 활동의 변조

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

측 두 엽 간 질 (TLE)은 가장 일반적인 부분 복잡 한 간 질 증후군 및 약물 이상 반응. 깊은 두뇌 자극 (DBS) 때 유망한 접근 약물 치료 실패 또는 신경외과 권장 하지 않습니다. 급성 뇌 조각 microelectrode 배열 (MEAs)에 결합 된 전기 자극에 의해 신경 네트워크 상호 작용 및 그들의 변조를 공부 하는 유용한 도구를 나타냅니다. 기존의 세포 외 기록 하는 기술을, 비교 관찰 포인트와 알려진된 전극 간 거리, 전파 경로 속도 electrophysiological의 공부 수 있도록 더 많은 수의 추가 장점 제공 신호입니다. 그러나, 조직의 산소 MEA 기록, 감소 신호 대 잡음 비율 고 실험 온도에 높은 진동 오는 높은 관류 속도 요구 하는 동안에 크게 장애가 있을 수 있습니다. 전기 자극 더 장시간된 녹음/자극 신기를 추구 하 고 어려운 뇌 조직을 강조 한다. 또한, 뇌 조각 활동의 전기 변조 전극 매핑 쉽고 신속 하 게 수행 함을 라이브 실험 기간 동안 필요한 뇌 조각 내 특정 구조/경로 대상으로 해야 합니다. 여기, 우리는 4-aminopyridine (4AP)의 녹음 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 설명-설치류 뇌 조각 사용 하 여 평면 MEAs에에서 epileptiform 활동을 유도. 우리 쥐에서 얻은 뇌 조직의 능가 쥐 뇌 조직 및 MEA 실험에 대 한 더 적합 따라서 보여줍니다. 이 프로토콜 생성 및 유지 보수의 안정적인 epileptiform 패턴을 충실 하 게 재현 기존의 필드 잠재적인 기록 관찰 electrophysiological 기능, 몇 시간 동안 지속 하 고 outlasts 지속 보장 장시간된 신 기원에 대 한 전기 자극입니다. 실험을 통해 조직 생존 관류 속도 층 류 및 낮은 (1 mL/min) 에서도 빠른 해결책 교환을 위한 수 있도록 작은 볼륨 사용자 지정 녹음 챔버의 사용 덕분에 이루어집니다. 실시간 모니터링 및 자극 전극의 선택에 대 한 빠른 MEA 매핑은 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)에 의해 수행 됩니다.

우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

이 방법은 뇌 영역과 자극 프로토콜이 가장 적합한지와 같은 간질 치료를 위한 신경 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 설치류 뇌 절편이 뇌 회로의 단순화되고 사실적인 모델을 나타내는 반면 미세 전극 배열은 알려진 전극 간 거리에서 여러 관찰 지점을 허용한다는 것입니다. MEA를 준비하려면 녹음 챔버의 바닥 표면에 엘라스토머 실런트를 고르게 펴고 기포가 없는지 확인합니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 기록 챔버를 MEA에 장착하고 부드러운 압력을 가합니다. 기록 챔버의 바깥쪽 테두리 주위에 실런트 층을 펴 바릅니다. 그런 다음 MEA/챔버 어셈블리를 밀폐되고 습한 환경에 놓고 실온에서 밤새 경화시킵니다.녹음 벤치를 준비하려면 따뜻한 욕조를 섭씨 32도로 설정하십시오. 다음으로, 홀딩 ACSF를 홀딩 및 예열 챔버에 붓습니다. 95%의 산소와 5%의 이산화탄소 혼합물로 용액의 거품을 일으키고 거꾸로 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 갇힌 거품을 제거합니다.보관실을 실온으로 유지하고 예열실을 따뜻한 욕조에 넣습니다. 표준 절차에 따라 수평 해마-피질 뇌 절편을 준비하고 실온의 보관실에서 최소 60분 동안 회복되도록 합니다. 4AP ACSF를 배양 챔버에 붓습니다.그런 다음 95%의 산소와 5%의 이산화탄소 혼합물로 거품을 일으키고 거꾸로 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 갇힌 거품을 제거합니다. 그런 다음 챔버를 덮고 따뜻한 욕조로 옮깁니다. 사전 예열 ACSF 및 4AP ACSF 온도가 섭씨 30-32도인지 확인하십시오.거꾸로 된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 하나의 뇌 조각을 예열 챔버로 옮기고 조직을 25-30 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 뇌 절편을 4AP ACSF 배양실로 옮기고 60분 동안 그대로 둡니다. 내부에 공기가 없을 때까지 4AP ACSF가 관류 튜브를 통해 비커로 흐르도록 합니다.그런 다음 솔루션 흐름을 중지합니다. 드라이 MEA 칩을 MEA 내부에 놓습니다 ampliifier, 그리고 고정 amp리퍼 헤드. 그런 다음 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 4AP ACSF를 기록 챔버의 입구 및 출구 저장소로 이동합니다.가열 캐뉼러를 마그네틱 홀더에 고정하고 팁을 기록 챔버 입구 포트 내부에 놓습니다. 그런 다음 마그네틱 홀더를 MEA 앰프 헤드의 마그네틱 스트립에 부착합니다. 관류 튜브를 캐뉼라에 연결하고 캐뉼러를 온도 조절기에 연결합니다.그런 다음 흡입 바늘을 배출구 저장소에 넣습니다. 흡입 바늘을 ACSF에 담그어 음압이 있는지 확인하고 지속적인 저주파 흡입 소음을 확인하십시오. 다음으로, 분당 1밀리리터의 유속을 허용하도록 유량 조절기를 설정하고 관류를 시작합니다.4AP ACSF가 캐뉼러를 통해 흐르면 온도 조절기를 켭니다. 가열 캐뉼러를 섭씨 37도로 설정하고 MEA 베이스를 섭씨 32도로 설정하여 기록 챔버 내부의 온도를 섭씨 32-34도의 온도로 설정합니다. 그런 다음 외부 기준 전극을 기록 챔버 입구 저장소에 놓습니다.4AP ACSF 레벨과 기록 온도가 원하는 대로 안정화되면 관류와 흡입 스톱콕을 꺼짐 위치로 돌려 일시적으로 중지합니다. 인버티드 글라스 파스퇴르 피펫을 사용하여 하나의 뇌 절편을 MEA 기록 챔버로 빠르게 옮깁니다. 필요에 따라 불에 광택을 낸 컬 파스퇴르 피펫 또는 부드럽고 컴팩트한 작은 브러시를 사용하여 MEA 기록 영역의 위치를 조정합니다.뇌 조각에 홀드다운 앵커를 놓습니다. 스톱콕을 다시 켜짐 위치로 돌려 관류와 흡입을 다시 시작하십시오. 도립 현미경 스테이지에 장착된 카메라를 사용하여 뇌 절편의 사진을 촬영합니다.그런 다음 컴퓨터 소프트웨어에서 스크립트 mapMEA를 실행하여 전극을 매핑하는 GUI를 시작합니다. 찾아보기 버튼을 클릭하여 뇌 슬라이스의 사진을 로드합니다. 기준 전극이 MEA의 왼쪽 절반의 상단 열에 나타나는지 확인합니다.그런 다음 포인터 활성화 버튼을 클릭합니다. 배열의 가장 왼쪽 열에서 상단 및 하단 전극을 선택하여 이미지 수평 조정 및 전극 매핑을 위한 XY 좌표를 표시합니다. slice type(슬라이스 유형) 드롭다운 메뉴에서 Horizontal(가로)을 선택합니다.Default Structures(기본 구조) 확인란을 선택합니다. brain slice 그림 아래에 있는 번호가 매겨진 푸시 버튼을 사용하여 ROI에 해당하는 전극을 선택하고 구조 패널에서 해당 푸시 버튼을 클릭하여 할당합니다. 각 ROI에 대해 이 단계를 반복합니다.그런 다음 저장 버튼을 누릅니다. 소프트웨어는 선택한 전극 및 ROI를 보고하는 테이블이 포함된 결과 폴더를 생성합니다. 전기생리학 연구의 경우 자극 프로토콜 최소 10분 전에 자극 장치를 켜서 자체 보정 및 안정화를 허용합니다.그런 다음 자극 제어 소프트웨어를 시작하고 자극 제어 소프트웨어의 메인 패널에 있는 녹색 LED로 표시된 대로 자극기와 MEA 증폭기가 올바르게 연결되어 있는지 확인합니다. 바이폴라 구성에서 자극을 설정합니다. 자극 장치를 접지에 연결합니다.그런 다음 스크립트 mapMEA로 매핑된 전극 쌍 중 CA1/근위하 세포층과 접촉하는 전극 쌍을 연결합니다. 데이터를 수집하려면 녹음 소프트웨어의 메인 패널에 있는 재생 버튼을 누르십시오. 최소 4개의 ictal 방전을 기록합니다.다음으로, 빠른 입력/출력 테스트를 실행하여 최상의 자극 강도를 식별합니다. 이를 위해 메인 패널을 사용하여 위상당 100마이크로초의 지속 시간을 가진 정사각형 biphasic positive-negative current pulse를 설계합니다. Pulse amplitude(펄스 진폭) 탭에서 위상당 100마이크로암페어의 초기 펄스 진폭을 입력합니다.5초 이상의 인터펄스 간격을 추가하여 자극 펄스를 0.2Hz 이하로 설정합니다. 자극이 해마 주위 피질에서 간극과 같은 사건을 안정적으로 불러일으킬 수 있을 때까지 각 시도에서 자극 진폭을 50-100마이크로암페어 단계씩 증가시킵니다. 변연계 ictogenesis의 전기 변조를 위해 관심 있는 자극 프로토콜을 전달하도록 자극 장치를 프로그래밍하고 입력/출력 테스트 중에 식별된 자극 진폭을 사용합니다.자극이 멈춘 후, 최소 4회의 ictal 방전을 기록하여 네트워크가 자극 전 상태로 회복되었는지 확인합니다. 이 그림은 제어 조건, 1헤르츠의 주기적 페이싱 동안, 그리고 자극 철회 시 회복 기간 동안 내후각 피질과 주위 피질에서 4AP 유도 ictal 활성의 기록을 보여줍니다. 이 그래프는 1헤르츠에서 주기적 페이싱의 효과를 정량화한 것을 보여주며, 이는 자극 중 총 발작 시간이 크게 감소함을 나타냅니다.이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행한다면 3-4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 뇌 절편을 MEA에 빠르고 정확하게 배치해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 간질 활성에 대한 신경 전달 물질 또는 이온 채널의 기여 및 신경 조절 효과에 대한 추가 질문에 답하기 위해 약리학적 조작과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 뇌 절편뿐만 아니라 배양된 뉴런에서 건강 및 질병의 뉴런 네트워크 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 MEA에 연결된 설치류 뇌 절편에서 4-아미노피리딘에 의해 유도된 간질 활동을 기록하고 전기적으로 조절하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

recording-modulation-epileptiform-activity-rodent-brain-slices

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 전기생리학 또는 EEG 설정을 사용하여 rhinal cortex-hippocampus organotypic slice의 간질 활성을 생체 외 기록하는 기술을 설명합니다. 이는 간질 형성의 역학과 진행을 연구하고 간질을 치료하기 위한 잠재적인 치료 표적을 선별하는 데 도움이 됩니다.

간질 활동을 기록하기 위한 뇌파검사 기반 기록 기술

이 프로토콜은 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 발작 유도 약물에 노출된 뇌 절편의 전기 활동을 기록하는 것을 포함합니다. 이 절차에는 MEA 기록 챔버에 뇌 절편을 배치하고, 인공 발작을 유도하기 위해 전기 자극을 가하고, 결과 신호를 분석하는 것이 포함됩니다.

Monitoring Seizure-Induced Neural Electrical Activity in Brain Slices Using Microelectrode Arrays(미세 전극 어레이를 사용한 뇌 절편에서 발작 유도 신경 전기 활동 모니터링)

이 비디오는 국소 간질의 쥐 모델에서 고해상도 EEG 기록 방법을 보여줍니다. 쥐를 준비하고, 다채널 EEG 미니 캡을 쥐의 두피에 연결하고, 간질 모델의 특징적인 발작 관련 사건을 식별하기 위해 EEG를 기록하는 단계를 간략하게 설명합니다.

국소 간질의 쥐 모델에서 기록하는 뇌파 검사

이 비디오는 간질에 의한 쥐의 간질 발작에 대한 뇌파 (EEG) 기록을 보여줍니다. 복부 해마에 전극을 이식한 쥐를 EEG 기록 시스템에 연결하고 플렉시글라스 챔버에 넣습니다. 쥐는 발작 발생을 모니터링하기 위해 뇌 활동이 기록되는 동안 자유롭게 움직일 수 있습니다.

간질에 의한 쥐의 간질 발작에 대한 뇌파 기록

이 비디오는 피질 흥분성 피라미드 뉴런에서 광 활성화 양이온 채널을 발현하는 형질전환 마우스의 관상 피질 절편에서 ictal events의 유도를 보여줍니다. 절편은 기록실에 놓이고, 기록전극은 표재성 피질층에 삽입된다. 칼륨 채널을 차단하는 발작 유도 약물을 관류하면 뉴런은 과흥분 상태가 되고 자발적인 ictal 이벤트를 생성합니다. 온디맨드 ictal 이벤트를 생성하기 위해 짧은 광 펄스를 사용하여 피라미드 뉴런의 양이온 채널을 활성화하여 흥분성 신경 전달 물질의 방출을 트리거하여 시냅스 후 뉴런이 짧은 기간 동안 ictal 이벤트를 생성하도록 유도합니다.

생쥐의 뇌 피질 절편에서 자발적이고 온디맨드(on-demand) 익탈 사건의 발생(Generation of Spontaneous and On-Demand Ictal Events in Mouse Brain Cortical Slices)

우리는 여기서 인간의 간질 대뇌 피질 조직의 다중 전극 배열 녹음을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 간기 및 발작 사건의 간질 조직 절제술, 슬라이스 준비 및 다중 전극 배열 기록은 구체적으로 입증된다.

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

연구에 따르면 음극 경두개 직류 자극은 약물 내성 발작을 억제하는 효과를 낼 수 있습니다. 본 연구에서는 생쥐의 뇌 절편 제제에서 직류 자극 및 발작과 같은 활동의 다전극 어레이 기록을 평가하는 시험관 실험 설정을 고안했습니다. 직류 자극 매개변수를 평가했습니다.

마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록

이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 의식이 있는 마우스의 세포외 전기생리학적 특성을 밝히기 위해 운동 피질(MC)에서 세포외 기록 방법론을 설명하고, 관심 행동의 기저에 있는 네트워크 신경 활동을 평가하는 데 유용한 국소전위(LFP) 및 스파이크의 데이터 분석을 설명합니다.

자유롭게 움직이는 마우스의 다채널 세포외 기록

여기에서는 상보적 금속 산화물 반도체 고밀도 미세전극 어레이 시스템(CMOS-HD-MEAs)을 사용하여 생체 외 뇌 절편에서 발작과 같은 활동을 기록하는 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

Complementary Metal-Oxide-Semiconductor High-Density Microelectrode Array System을 사용한 급성 뇌 절편에서 고품질 발작 유사 활동

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 설치류 EEG를 기록하기 위한 안정적이고 쉽게 접근할 수 있는 시스템을 만들기 위해 개발되었습니다.

자유롭게 움직이는 마우스의 만성 다중 사이트 뇌파 기록을 위한 비용 효율적이고 최소 침습적 프로토콜

학습하세요 설치류 뇌 조각에서 마이크로전극 배열을 이용한 간질형 활동의 전기적 변조 방법을. 4-아미노피리딘으로 유도된 발작 활동을 기록하고 자극 프로토콜로 조절하는 이 기술은 뇌 회로 연구와 간질 치료 전략 개발에 활용됩니다.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

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