Name: Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 CRISPR을 이용한 심장 유전자 편집 방법으로, 재조합 아데노 관련 바이러스를 통해 생후 쥐 심장에서 디스트로핀 발현을 회복하는 기술입니다. 이 방법은 두셔근 영양실조증 관련 심근증 치료에 활용됩니다.

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상대습도 미국 (R01HL116546 및 R01 AR064241) 건강의 국가 학회에 의해 지원 됩니다.

이 프로토콜에 사용 되는 동물의 오하이오 주립 대학 실험실 동물 자원에서 동물 사용 지침에 따라 유지 되었다. 모든 동물 연구 기관 동물 관리, 사용, 및 오하이오 주립 대학의 검토 위원회에 의해 승인 했다.
1. 디자인 및 CRISPR 벡터에 gRNAs의 복제
<ol><li>SaCas9에 대 한 dystrophin intron 20과 intron 23 (i20 및 i23)를 대상으로 하는 2 gRNAs 선택: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT 및 i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM 시퀀스는 밑줄을 표시 하 고 이탤릭체). 참고: i20 i23에 대 한 대상 사이트는 약 23 킬로 기본적인 쌍 (kbp) 멀리. 코딩 유전자 중단, 두 gRNAs NNGRRT 팸 일반적인 exons를 대상으로 SaCas9에 대 한 시퀀스 (선호 NNGAAT, NNGGGT 및 NNGAGT) 및 20 kbp 이내 거리는 것이 좋습니다.</li>
	<li>버퍼를 어 닐 링 x 1에서 다음 PCR 매개 변수 anneal gRNA oligos (100 µ / L)를 사용 (버퍼 재고를 어 닐 링 x 5 0.5 mol/L K-아세테이트, 150 mmol/L HEPES 포함-코, 10 mmol/L Mg-아세테이트, pH7.4): 95 ° C 10 분 당 0.4 ° c 95 ~ 59 ° C의 90 주기 감소 20 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 59 ~ 32 ° C의 90 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 32에 26 ° C의 20 주기 s.</li>
	<li>pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA로 단련된 gRNA oligos를 위하여 BsaI와 T4 DNA 리가 한 반응에 사용 하 여 (1 µ L 50 ng / µ L pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µ L 단련 oligos, 1.5 µ L 10 x T4 DNA 리가 버퍼, 0.5 µ L T4 DNA 리가, 1 µ L BsaI, 10 µ L ddH2O ), PCR cycler에서 다음 반응 조건: 5 주기 [37 ° C 5 분 및 16 ° C 10 분]; 37 ° C 20 분; 80 ° C 5 분입니다.</li>
	<li>15 µ L 결 찰 제품을 30 µ L 유능한 세포 변환, 100 µ g/mL 암 피 실린, 한 천 판에 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화 셀 접시.</li>
	<li>5-10 식민지와 100 µ g/mL 암 피 실린 37 ° c, 250 rpm 3-4 h 흔드는 인큐베이터에 들어 있는 LB 매체 문화를 선택 합니다.</li>
	<li>PCR에 의해 식민지 화면: 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스, 8 µ L ddH2O, 1 µ L 대장균 문화, 1 µ L 10 µ / L U6-앞으로 뇌관, 1 µ L i20 또는 i23 gRNA 역 뇌관. PCR 자전거 매개 변수: 95 ° C 5 분, 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 초, 72 ° C 30 s의 35 주기.</li>
	<li>추가 4 mL 신선한 파운드 중간 containing100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 250 rpm에서 하룻밤 문화에 의해 긍정적인 클론의 5 mL 문화를 준비 합니다.</li>
	<li>적절 한 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 DNA 플라스 미드 정화 하 고 생어에 의해 플라스 미드를 확인 시퀀싱 U6-앞으로 뇌관.</li>
	<li>10 %FBS 1% 보충 DMEM C2C12 셀 문화 펜-Strep 유전자는 플라스 미드의 효능 편집 테스트용 ~ 70 %confluency 도달할 때까지.</li>
	<li>Electroporate 5 µ g 1 x 106 C2C12 셀 제조업체의 프로토콜에 따라 1:1 어 금 니 비율에서 SaCas9/gRNA 플라스 미드 혼합물의 총.</li>
	<li>48 h 후 transfection 후 C2C12 세포를 수확 하 고 게놈 DNA를 추출 합니다.</li>
	<li>사용 100 ng genomic DNA 템플릿으로 마우스 dystrophin 로커 스에 대 한 PCR 반응을 수행 하: 전달 뇌관 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ L 10 µ / L), 반전 뇌관 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ L 10 µ / L), 10 µ L 2 녹색 PCR x 마스터 믹스, 7 µ L ddH2O, 1 µ L genomic DNA ( 100 ng). PCR를 사용 하 여 순환 조건 95 ° c 5 분, [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s]의 35 주기 72 ° C 2 분.</li>
</ol>2입니다. rAAV 생산
<ol><li>셀 문화, 15 cm의 20 ~ 40에 AD293 셀 씨 고 DMEM 10 %FBS 1% 보완 유지 펜-Strep transfection 대 ~ 90 %confluency 도달할 때까지.</li>
	<li>200 µ L로 희석 3 플라스 미드 감소 (접시) 당 혈 청 매체: 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 또는 다른 serotypes) 및 3) pX601-i20, pX601 i23 혼합물 (1:1 비율)의 5 µ g의 총. 80 µ L 페이와 혼합 하 여 polyethylenimine (페이) transfection를 수행 하 고 dropwise 방식에서 10 분 추가 AD293 세포 배양에 혼합물에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	<li>AAV 바이러스 생산, 72 h 게시물 transfection 후 10 분 동안 1100 x g에서 원심 분리 하 여 미디어와 AD293 셀 알 약을 수집 하 셀 스 크레이 퍼를 사용 합니다.</li>
	<li>액체 질소와 42 ° C 물 탕에서 보육 교류 3 freeze-thaw 주기 다음 15 mL rAAV 세포의 용 해 버퍼 (50 mmol/L 트리 스 베이스, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5)에 셀 펠 릿 resuspend 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우 미래 처리를 위한-80 ° C에 세포 lysates를 저장 합니다.</li>
	<li>0.45 μ m 필터와 문화 미디어를 필터링 하 고 추가 40% PEG8000 2.5 mol/L NaCl에에서 8%의 최종 농도. 1 시간에 4 ° C에 혼합물 그리고 15 분 동안 1100 x g에서 원심 분리기를 품 어.</li>
	<li>RAAV 세포의 용 해 버퍼에 산 탄을 resuspend 하 고 단계 2.3, 뒤에 1 시간 동안 37 ° C에서 benzonase (50 U/mL) 치료에서에서 세포 lysates 결합.</li>
	<li>원심 benzonase 처리 rAAV 혼합물 1100 x g 4 ° C에서 15 분을 포함 하 고 상쾌한 (원유 rAAV 준비)를 저장 합니다.</li>
</ol>3. rAAV 정화 및 농도
<ol><li>하단에는 다음 순서에 따라 ultracentrifuge 튜브에 iodixanol 그라데이션에 원유 rAAV 준비 위에서 로드: 원유 AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15 %Iodixanol, 6 mL 25 %Iodixanol, 5 mL 40 %Iodixanol, 5 mL 58 %Iodixanol. 1 x DPBS를 사용 하 여 정상에 튜브의 나머지 빈 볼륨을 작성 합니다.</li>
	<li>230000 x g 10 ° C에서 120 분 ultracentrifuge로 터에서에 샘플 원심을 3-4 mL 18 G 바늘 rAAV 입자를 포함 하는 40% 그라데이션 분수의를 수집 합니다.</li>
	<li>1 x DPBS와 원심 분리기는 원심 필터 장치 (MWCO 100 kDa)를 사용 하 여 rAAV 입자를 희석. 대 한이 단계를 반복 3-5 시간 및 마지막으로 300-500 µ L rAAV 준비 집중.</li>
</ol>4입니다. rAAV Titering
<ol><li>2 µ L 집중 rAAV, 에탄올에 3 M NaOAc와 20 µ L ddH2O. resuspend 촉진에서 게놈 DNA를 추출</li>
	<li>PX601 플라스 미드의 직렬 희석에 의해 rAAV 정량에 대 한 표준 곡선을 얻기: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 각 10 µ L ddH2O. Dilute DNAase 치료 rAAV 1 x 105 부 샘플 1:10, 1시 50분, 1: 100, 그리고 1:1000.</li>
	<li>실시간 PCR 시스템에서 제조업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실시간 양이 많은 PCR (정량)에 의해 rAAV titer 결정: 1 µ L 10 µ / L 각 뇌관의 (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC 및 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ L PCR 마스터 믹스, 희석 1 µ L x 2 rAAV 샘플 및 2 µ L ddH2O. 자전거 매개 변수가 반응 실행: 95 ° C 3 분, 45의 주기 [95 ° C 5 초 61 ° C 20 초].</li>
</ol>5. 정 맥 및 복 rAAVrh.74-CRISPR 신생아 mdx/utrophin/- 생쥐에 주입
<ol><li>1 분 동안 얼음에 배치 하 여 mdx/utrophin+ 마우스 새끼 (3 일)를 immobilize 하 고 1 x 1012 복고풍 궤도 접근 또는 복 주사를 통해 체계적으로 마우스 당 50 µ L에서 바이러스 성 입자와 관리.</li>
	<li>복구 하 고 다시 자신의 집 새를 마우스 수 있습니다. RAAV 관리 후 10 주, 조직 컬렉션에 대 한 공동2 노출에 의해 쥐를 안락사.</li>
	<li>스냅-동결 genomic DNA와 RNA 추출 및 사용 isopentane 최적의 절삭 온도와 조직 cryosectioning 복합 동결 액체 질소에 냉각에 대 한 조직.</li>
</ol>6입니다. 결과 편집 대상 유전자의 분석
<ol><li>
게놈 DNA PCR 분석
	<ol>
<li>Mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 조직에서 게놈 DNA 치료 또는 rAAV 없이 총을 격리 합니다.</li>
		<li>1.12 단계에서에서 동일한 프로토콜을 사용 하 여 PCR 분석에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dystrophin 식의 RT-PCR 분석
	<ol>
<li>제조업체의 설명서에 따라 RNA 추출 키트와 함께 심장 조직에서 총 RNA를 추출.</li>
		<li>반전 녹음 방송을 수행 하려면 미리 RNase 무료 DNase와 총 RNA를 치료 하 고 템플릿으로 처리 RNA의 5 µ g를 사용 하 여 반전 녹음 방송 장비를 가진 첫번째 물가 cDNA 합성에 대 한.</li>
		<li>반전 녹음 방송 제품을 사용 하 여 dystrophin cDNA 뇌관으로 dystrophin 식의 RT-PCR 분석: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT 및 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정량 분석에 의해 효능을 편집 하는 유전자 예측
	<ol>
<li>양적 RT-PCR exon 22 포함 된 성적 (exon 21) 앞으로 뇌관을 사용 하 여 감소를 감지 하 여 효능을 편집 하는 유전자 예측: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, 그리고 역방향 뇌관 (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. 앞으로 뇌관 참조 유전자로 Gapdh 사용: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC 및 역방향 뇌관: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>양이 많은 실시간 PCR (정량) 실시간 PCR 시스템과 2 단계 반응 조건에서 제조 업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실행: 95 ° C 3 분, 95 ° C 5 sec와 61 ° C 30 초 45 주기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면역 형광 분석 dystrophin 식 얼룩
	<ol>
<li>잘라 냉동된 조직 두께 10 µ m. 수정에는 cryostat를 사용 하 여 15 분 동안 실 온에서 4 %paraformaldehyde 냉동된 섹션.</li>
		<li>PBS로 2 배를 세척 하 고 1 시간에 대 한 솔루션 (10% 말 혈 청) 차단으로 품 어.</li>
		<li>안티 dystrophin 기본 항 체, 4 ° C 하룻밤에 품 어.</li>
		<li>PBS와 슬라이드를 씻어 3 × 5 분 및 1 시간에 대 한 실 온에서 형광 이차 항 체 (1: 500)를 품 어.</li>
		<li>DAPI를 장착 매체를 사용 하 여 거꾸로 confocal 현미경으로 이미징 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 오프 대상 분석 T7E1 분석 결과
<ol><li>온라인 CRISPR를 사용 하 여 잠재적인 대상 오프 사이트 디자인 도구와 같은 예측 < http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>게놈 지역 취재는 상위 5-10 잠재적인 대상 오프 사이트 PCR에 의해 증폭: genomic DNA 200, 1 µ L 고 충실도 DNA 중 합 효소, 5 µ L 10 x PCR 버퍼 믹스, 1.5 µ L 10와 50 µ L 총 볼륨 조정 사이트별 정방향 및 역방향 뇌관의 µ / L ddH2o.</li>
	<li>전기 이동 법으로 PCR 제품을 실행 하 고 추출 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 광을 사용 하 여 농도 측정 합니다.</li>
	<li>변성 시키기 및 다시 사용 하 여 PCR cycler 버퍼 2.1에서 천천히 정화 amplicons 어 닐 링에 의해 heteroduplex 형성을 촉진 합니다. 동일한 자전거 상태를 사용 하 여 단계 1.2에서에서 상술 된 대로.</li>
	<li>0.5 µ L T7E1 효소, 37 ° C에서 30 분 동안 다시 단련된 제품을 소화 하 고 사용 하 여 1-2 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 반응 분석. 참고:는 amplicons 또한 타겟된 깊은 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

관심의 없습니다 충돌 존재합니다.

이 프로토콜에서 우리 vivo 심장 유전자 SaCas9 및 2 개의 gRNAs의 납품 rAAVrh.74 중재를 사용 하 여 출생 후 생쥐에서 편집을 달성 하는 데 필요한 모든 단계를 상세하게. 이전 지적,이 이렇게 dystrophic 쥐에서 dystrophin 식27의 우리의 작업 설명 된 대로 복원 사용할 수 있지만 그것은 또한 급속 한 반전 유전학 연구의 긴 과정 없이 쥐 심장 관련 유전자의 활성화 수는 생성 하 고 사육 녹아웃 마우스 모델 전통적인 녹아웃 접근.
편집 대상 조직에 효율성 높은 유전자를 달성 하기 위해 마음에 계속 몇 가지 중요 한 단계가 있다: 1) 타겟된 게놈 DNA의 삭제를 유도 하는 SaCas9/gRNA의 효능 적절 한 셀 라인;를 사용 하 여 유효성을 검사 하는 데 필요한 2) 그것은 매우 중요 한 대상 조직 및 3에 유전자 변환의 높은 레벨을 중재할 수 있는 적절 한 AAV serotype ...

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술 게놈 엔지니어링에서 가장 최근의 발전을 나타내고 세포와 유기 체 유전학의 현재 연습을 혁명을. CRISPR 관련 된 단백질 (Cas9) 9 등 CRISPR 관련 endonuclease 직접 단일 가이드 RNA (gRNA)을 이용 한다 CRISPR 기반 게놈 편집 하 고는 protospacer 시퀀스에 보완은 genomic DNA 대상에 Cpf1와 gRNA에 의해 인코딩 한 특정 protospacer 인접 한 모티브 (PAM)1,2. PAM은 Cas9 또는 Cpf1 유전자의 세균성 종에 따라 다릅니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 파생 된 가장 일반적으로 사용 되 Cas9 nuclease NGG 비 대상 가닥에 genomic DNA에서 직접 대상 시퀀스의 다운스트림 발견 되는 팸 시퀀스를 인식 합니다. 대상 사이트에 Cas9 및 Cpf1 단백질 생성 등 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 상 동 감독 수리 (HDR) 경로3내장 세포 DNA 수리 메커니즘을 통해 복구 다음, 이중 가닥 휴식 (DSB) 4. 동종 재결합에 대 한 DNA 템플렛의 부재, DSB는 주로 수리 삽입 또는 삭제 (indels)에서 발생할 수 있는 오류가 NHEJ 통로 DSB 코딩에서 만들어진 경우 frameshift 돌연변이 일으키는 뉴클레오티드의 6유전자5,지역. 따라서, CRISPR 시스템은 널리 사용 되었습니다 다양 한 휴대폰 모델 및 전체 유기 체에 있는 손실의 기능 돌연변이 하는 유전자의 기능을 조사 하기 위하여. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 및 Cpf1 transcriptionally를 개발 되었습니다 그리고 epigenetically 조절 대상 유전자7,8의 표현.
더 최근에, SpCas9 및 SaCas9 ( 황색 포도상구균에서 파생 됨)는 패키지 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 벡터 인간 질환의 동물 모델에서 출생 후 유전자 교정용으로 특히, 듀 켄 씨 근 위축 증 (DMD)9,10,11,12,13,,1415. DMD는 치명적인 X 연결 된 열성 질병 dystrophin 단백질16,17인코딩하는 DMD 유전자에 있는 돌연변이 기인한 신생아 심사18 에 따르면 약 3500에서 한 남성 출생에 영향을 미치는 , 19. 진보적인 근육 약점 그리고 낭비 특징 이다. DMD 환자는 일반적으로 20-30 년20의 나이 10 ~ 12 세 사이의 호흡기 또는 심장 실패의 다이 걸을 기능 손실. 특히, 심근에 개발 > DMD 환자와 나타냅니다 DMD 환자21,22에 죽음의 주요 원인의 90%. 비록 Deflazacort (항 염증 약물) 및 Eteplirsen (는 엑손 exon 51를 건너뛰는 데 약을 건너뛰는) 최근 승인 된 DMD에 대 한 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)23,24, 이러한 치료의 게놈 DNA 수준에서 유전적 결함을 수정 합니다. Exon 23 dystrophin 유전자의 점 돌연변이 운반, mdx 마우스 DMD 모델25로 널리 사용 되었습니다. 또한, 우리 이전 기능 dystrophin 식 취재 exons 21, 22, 23 일 근육 광고-SpCas9/gRNA 배달9 사용 하 여 mdx 쥐의 골격 근육에서 게놈 DNA의 프레임 삭제에 의해 복원 된 시연 , 그리고 정 맥 및 복 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 배달26를 사용 하 여 mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 근육에.
이 프로토콜에서 우리가 자세히 설명 출생 후 심장 유전자 dystrophin mdx/utrophin/- 생쥐 dystrophin 분석 심장 근육 섹션에 gRNA 디자인에서 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 벡터를 사용 하 여 복원 하려면 편집 모든 단계.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 염소 안티 토끼 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Bio Safety Cabinets</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 시리즈 A2 Class II, Type A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S</td><td></td></tr><tr><td>유능 세포</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td>200314</tr><tr><td>세포 배양 접시, 150mm</td><td>Nest Scientific USA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>Dystrophin 항체</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47111</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>필터 유닛, 0.45&mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>고속 플라스미드 미니 키트</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 수조</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 열 블록</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>도립 컨포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 기기</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 기기 II</td></tr><tr><td>대용량 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td>미세 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>Nanodrop 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&trade; 2000/2000c</td></tr><tr>올리<td>고 i20-F</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>CACCgGGCGT tgaattctcattac</td></tr><tr><td>올리고 i20-R</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td></tr><tr><td>i23-F</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td>용 올리고 <td>CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC</td></tr><tr><td>i23-R</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td>용 올리고 <td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td></tr><tr><td>올리고</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 밀도 구배 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>퀵 씰 원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR 키트</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT 역전사 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>로터</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>337922</td><td>형 70Ti</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td><td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>초원심 필터 장치</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>H-1200</td><td></td>이 포함된 마운팅 배지</tr></tbody></table>

adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 crispr의

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복 (CRISPR) 시스템은 크게 배양된 세포에 다양 한 종의 생물 게놈 엔지니어링을 촉진 했다. CRISPR 기술 또한 인간의 질병의 숫자에 대 한 새로운 치료제로 탐험 되었습니다. 개념 증명 데이터는 매우 고무적인 타당성과 듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD) murine 모델을 사용 하 여에 대 한 편집 기반 치료 방법은 유전자의 효능을 설명 하는 최근 학문에 의해 exemplified입니다. 특히, 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74)의 정 맥 및 복 주사 (SaCas9) 포도 상 구 균 CRISPR 관련 단백질 9의 효율적인 심장 배달 및 2 있었습니다. exon 23 마우스 Dmd 유전자에에서 돌연변이 codon 게놈 영역을 삭제 하려면 RNAs (gRNA) 안내. 이 같은 방법은 유전자의 관심 밖으로 노크 하는 gRNA 유전자의 코딩 지구를 대상으로 설계는 출생 후 마우스에 그들의 심장 기능을 공부도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 표시 rAAVrh.74 CRISPR 벡터 하는 방법 및 신생아 쥐에 고효율 심장 납품을 달성 하는 방법.

대상 게놈 DNA 영역 삭제를 유도 하는 gRNAs의 효능 vivo에서 학문을 위한 rAAV로 포장 하기 전에 셀 문화에서 평가 되어야 한다. 이 위해, gRNAs 및 SaCas9을 표현 구문 electroporated C2C12 세포로 되었고 대상 사이트 (그림 1) 측면 뇌관으로 PCR에 의해 게놈 DNA 분석. PCR 제품 ~ 500 bp 대상 게놈 DNA 유전자 제어 세포 게놈 DNA의 큰 크기로 인해 밴드 양보 하지 해야 하는 동안 편집에서 결과의 성공적인 삭제를 나타냅니다.
일단 세포 배양에는 gRNAs의 효능 확인 되었습니다, 그들은 AAV293 셀에 3 개의 플라스 미드 공동 transfection를 사용 하 여 rAAVrh.74 또는 (예: AAV6, 8 또는 9, 모든 보여주는 강력한 심장 유...

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

이 in vivo 심장 유전자 편집 프로토콜의 전반적인 목표는 CRISPR SaCas9 및 guide RNA 벡터와 함께 재조합 아데노 관련 바이러스 rh. 74를 사용하여 영양이상증 마우스의 심장에서 dystrophin 발현을 복원하는 것입니다. 이 방법은 유전자 편집이 뒤셴 근이영양증과 관련된 심근병증의 근본 원인을 치료하기 위한 신뢰할 수 있는 치료 전략인지 여부와 같은 근이영양증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이러한 기술의 주요 장점은 교정된 디스트로핀 유전자의 발현이 내인성 조절 제어 하에 있으며 이러한 구출 효과가 영구적이라는 것입니다. 이 기술의 의미는 CRISPR Cas9 유전자 편집 기술에 의해 돌연변이 유전자를 교정할 수 있는 다른 유전 질환의 치료로 확장됩니다. 이 방법은 영양이성 심장의 디스트로핀 복원에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 역유전학 연구를 위해 관심 유전자를 제거하는 데에도 사용할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Yandi Gao가 맡을 것입니다. 가이드 RNA 또는 gRNA의 적절한 설계는 이 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. 황색포도상구균 CRISPR 관련 단백질 9에 대해 dystrophin intron 20 및 intron 23을 target하는 두 개의 gRNA를 선택합니다.각 gRNA에 대한 protospacer 인접 모티프 서열은 밑줄이 그어지고 기울임꼴로 표시됩니다. gRNA 올리고뉴클레오티드를 어닐링하려면 1x 어닐링 버퍼에 gRNA 올리고뉴클레오티드를 리터당 100마이크로몰로 포함하는 반응을 설정합니다. 뒤에 오는 PCR 모수를 사용하십시오: 10 분 동안 95 섭씨 온도, 20 초 동안 주기 당 0.4 섭씨 온도 감소를 가진 95에서 59 도의 90 주기, 20 초 동안 주기 당 0.3 섭씨 온도 감소를 가진 59 에서 32 도의 90 주기, 및 20 초 동안 주기 당 0.3 섭씨 온도 감소를 가진 32 에서 26 섭씨 온도의 20 주기.다음으로, 한 번의 반응으로 annealed gRNA oligonucleotides를 CRISP vector에 접합할 준비를 합니다. 튜브에 다음을 추가합니다: 마이크로리터 CRISPR 벡터당 50나노그램 1마이크로리터, 어닐링된 올리고뉴클레오티드 1마이크로리터, 10x T4 DNA 리가제 완충액 1.5마이크로리터, T4 DNA 리가제 0.5마이크로리터, Bsal 1마이크로리터 및 이중 증류수 10마이크로리터. thermocycler에 있는 뒤에 오는 반응을 실행하십시오: 37 섭씨 온도에서 5 분, 16 섭씨 10 분, 37 섭씨 온도 20 분, 그리고 80 섭씨 온도 5 분 동안 5 주기.15마이크로리터 결찰 산물을 30마이크로리터의 수용 세포로 전환하고, 암피실린(ampicillin) 1밀리리터당 100마이크로그램을 함유한 한천 플레이트에 세포를 플레이트화합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 한천 플레이트에서 5-10개의 콜로니를 선택하고 섭씨 37도 및 250rpm에서 3-4시간 동안 밀리리터당 100마이크로그램의 암피실린을 함유한 LB 배지에서 배양합니다.PCR로 콜로니를 스크리닝하려면 각각 PCR 마스터 믹스 10마이크로리터, 이중 증류수 8마이크로리터, 대장균 배양 1마이크로리터, U6-forward 프라이머 1마이크로리터, i20 또는 i23 gRNA 리버스 프라이머 1마이크로리터를 포함하는 반응을 준비합니다. 다음 PCR 사이클링 매개 변수를 사용하십시오 : 5 분 동안 섭씨 95도, 30 초 동안 섭씨 95도, 30 초 동안 섭씨 61도, 30 초 동안 섭씨 72도의 35 사이클을 따릅니다. 양성 클론이 확인되면 밀리리터 암피실린당 100마이크로그램을 포함하는 4밀리리터의 새로운 LB 배지를 추가하고 하룻밤 동안 섭씨 37도 및 250rpm에서 배양하여 각 양성 클론의 5밀리리터 배양을 준비합니다.다음 날, 적절한 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제합니다. 플라스미드는 이후에 U6-forward 프라이머를 사용한 Sanger 염기서열분석에 의해 검증됩니다. 플라스미드의 유전자 편집 효능을 테스트하기 위해 세포가 약 70% confluency에 도달할 때까지 10% FBS 및 1% Pen-Strep이 보충된 DMEM에서 C2C12 세포를 배양합니다.제조업체의 프로토콜에 따라 총 5마이크로그램의 SaCas9/gRNA 플라스미드 혼합물을 1:1 몰 비율로 C2C12 세포에 전기천공합니다.transfection 후 48시간이 지나면 C2C12 세포를 수확하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 게놈 DNA를 추출합니다. 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 마우스 디스트로핀 자리에 대한 PCR을 수행합니다.정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 녹색 PCR 마스터 믹스, 이중 증류수 및 100나노그램의 게놈 DNA를 포함하는 반응을 설정합니다. 양성 클론을 스크리닝할 때와 동일한 PCR 조건을 사용합니다. 이 절차를 시작하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)를 준비합니다.3일째 mdx 마우스 새끼에게 복강 내 주사를 통해 바이러스 입자가 전신적으로 투여됩니다. 쥐가 회복할 때까지 기다렸다가 집 우리에 다시 넣습니다. rAAV 투여 후 10주가 지나면 생쥐에서 조직을 채취합니다.게놈 DNA 및 RNA 추출을 위해 조직을 스냅 동결하고, 액체 질소에 냉각된 이소펜탄을 사용하여 동결 절편을 위한 최적의 절단 온도 화합물로 조직을 동결합니다. 실온에서 5분 동안 4%파라포름알데히드로 동결된 조직 절편을 고정하여 면역형광 염색 프로토콜을 시작합니다. 15분 후 PBS로 조직 부분을 두 번 씻습니다.차단 용액으로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 항 디스트로핀 1차 항체를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, PBS로 슬라이드를 세척한 다음 실온에서 1시간 동안 형광 2차 항체로 배양합니다.DAPI가 있는 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 장착하고 도립 컨포칼 현미경으로 이미지를 만듭니다. 세포 배양에서 타겟 게놈 DNA 영역의 결실을 유도하는 gRNA의 효능은 PCR로 평가했습니다. 약 500개의 염기쌍으로 구성된 PCR 산물은 유전자 편집으로 인한 표적 게놈 DNA의 성공적인 결실을 나타내는 반면, 대조 세포는 띠를 생성해서는 안 됩니다.세포 배양에서 gRNA의 효능이 확인되면 gRNA는 rAAV로 패키징됩니다. rAAV 바이러스 입자가 정제되고 SDS-PAGE에 의해 순도가 분석됩니다. 3개의 capsid 단백질에 해당하는 3개의 밴드만 존재한다는 것은 높은 순도를 나타냅니다.AAV SaCas9 gRNA로 처리된 야생형, mdx 및 mdx 마우스의 심장 절편에 대한 이러한 대표적인 면역형광 이미지는 AAV SaCas9 gRNA가 이영양성 마우스에서 dystrophin 발현을 복원한다는 것을 전신적으로 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 rAAV rh를 사용하여 출생 후 마우스에서 생체 내 심장 유전자 편집을 달성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. SaCas9 및 gRNA의 74 매개 전달.

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는 새끼 쥐에서 재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달을 보여줍니다. 이 방법은 표적 세포의 유전자 발현을 연구하는 데 도움이 됩니다.

재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달: 설치류 모델에서 이식유전자 전달 및 심장 특이적 발현을 위한 기술

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

이 원고에서는 마우스 심장에서 유전자 발현을 조작하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 9(rAAV9) 벡터를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

두경부암 환자에서 돌연변이된 특정 유전자를 가진 뮤린 모델의 개발은 신생물의 이해를 위해 요구된다. 여기서, 우리는 특정 게놈 변경을 가진 뮤린 HNC 세포주를 생성하기 위하여 아데노 관련 바이러스 Cas9 시스템을 사용하여 1 차적인 뮤린 혀 세포의 시험관 내 형형변환을 위한 프로토콜을 제시한다.

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

이 프로토콜에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 활용하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 기술 절차를 설명합니다. 설명된 단계에는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비 및 BAT 로브에 AAV의 미세 주입이 포함됩니다.

결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용한 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스 생성

이 프로토콜은 유전자 변형 쥐 모델을 생산하기 위한 최적화된 접근 방식을 제시합니다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 DNA 복구 템플릿을 전달하는 데 사용되며, 전기천공법은 CRISPR-Cas9 시약을 전달하여 2세포 배아에서 게놈 편집 과정을 완료하는 데 사용됩니다.

아데노 관련 바이러스(AAV) 및 2세포 배아 전기천공법을 이용한 쥐 배아의 CRISPR-Cas9 게놈 편집

이 보고서는 마우스 신장으로의 효과적이고 안전한 유전자 전달을 위해 신우 를 통한 AAV 벡터의 국소 주입 방법을 자세히 설명합니다.

아데노 관련 바이러스 벡터의 느린 역행 신골 주사 를 통한 마우스 신장에 효과적이고 안전한 유전자 전달

배우세요 CRISPR을 이용한 심장 유전자 편집 방법으로, 재조합 아데노 관련 바이러스를 통해 생후 쥐 심장에서 디스트로핀 발현을 회복하는 기술입니다. 이 방법은 두셔근 영양실조증 관련 심근증 치료에 활용됩니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

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