Name: Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 CRISPR을 이용한 심장 유전자 편집 방법으로, 재조합 아데노 관련 바이러스를 통해 생후 쥐 심장에서 디스트로핀 발현을 회복하는 기술입니다. 이 방법은 두셔근 영양실조증 관련 심근증 치료에 활용됩니다.

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이 프로토콜에 사용 되는 동물의 오하이오 주립 대학 실험실 동물 자원에서 동물 사용 지침에 따라 유지 되었다. 모든 동물 연구 기관 동물 관리, 사용, 및 오하이오 주립 대학의 검토 위원회에 의해 승인 했다.
1. 디자인 및 CRISPR 벡터에 gRNAs의 복제
<ol><li>SaCas9에 대 한 dystrophin intron 20과 intron 23 (i20 및 i23)를 대상으로 하는 2 gRNAs 선택: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT 및 i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM 시퀀스는 밑줄을 표시 하 고 이탤릭체). 참고: i20 i23에 대 한 대상 사이트는 약 23 킬로 기본적인 쌍 (kbp) 멀리. 코딩 유전자 중단, 두 gRNAs NNGRRT 팸 일반적인 exons를 대상으로 SaCas9에 대 한 시퀀스 (선호 NNGAAT, NNGGGT 및 NNGAGT) 및 20 kbp 이내 거리는 것이 좋습니다.</li>
	<li>버퍼를 어 닐 링 x 1에서 다음 PCR 매개 변수 anneal gRNA oligos (100 µ / L)를 사용 (버퍼 재고를 어 닐 링 x 5 0.5 mol/L K-아세테이트, 150 mmol/L HEPES 포함-코, 10 mmol/L Mg-아세테이트, pH7.4): 95 ° C 10 분 당 0.4 ° c 95 ~ 59 ° C의 90 주기 감소 20 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 59 ~ 32 ° C의 90 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 32에 26 ° C의 20 주기 s.</li>
	<li>pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA로 단련된 gRNA oligos를 위하여 BsaI와 T4 DNA 리가 한 반응에 사용 하 여 (1 µ L 50 ng / µ L pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µ L 단련 oligos, 1.5 µ L 10 x T4 DNA 리가 버퍼, 0.5 µ L T4 DNA 리가, 1 µ L BsaI, 10 µ L ddH2O ), PCR cycler에서 다음 반응 조건: 5 주기 [37 ° C 5 분 및 16 ° C 10 분]; 37 ° C 20 분; 80 ° C 5 분입니다.</li>
	<li>15 µ L 결 찰 제품을 30 µ L 유능한 세포 변환, 100 µ g/mL 암 피 실린, 한 천 판에 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화 셀 접시.</li>
	<li>5-10 식민지와 100 µ g/mL 암 피 실린 37 ° c, 250 rpm 3-4 h 흔드는 인큐베이터에 들어 있는 LB 매체 문화를 선택 합니다.</li>
	<li>PCR에 의해 식민지 화면: 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스, 8 µ L ddH2O, 1 µ L 대장균 문화, 1 µ L 10 µ / L U6-앞으로 뇌관, 1 µ L i20 또는 i23 gRNA 역 뇌관. PCR 자전거 매개 변수: 95 ° C 5 분, 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 초, 72 ° C 30 s의 35 주기.</li>
	<li>추가 4 mL 신선한 파운드 중간 containing100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 250 rpm에서 하룻밤 문화에 의해 긍정적인 클론의 5 mL 문화를 준비 합니다.</li>
	<li>적절 한 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 DNA 플라스 미드 정화 하 고 생어에 의해 플라스 미드를 확인 시퀀싱 U6-앞으로 뇌관.</li>
	<li>10 %FBS 1% 보충 DMEM C2C12 셀 문화 펜-Strep 유전자는 플라스 미드의 효능 편집 테스트용 ~ 70 %confluency 도달할 때까지.</li>
	<li>Electroporate 5 µ g 1 x 106 C2C12 셀 제조업체의 프로토콜에 따라 1:1 어 금 니 비율에서 SaCas9/gRNA 플라스 미드 혼합물의 총.</li>
	<li>48 h 후 transfection 후 C2C12 세포를 수확 하 고 게놈 DNA를 추출 합니다.</li>
	<li>사용 100 ng genomic DNA 템플릿으로 마우스 dystrophin 로커 스에 대 한 PCR 반응을 수행 하: 전달 뇌관 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ L 10 µ / L), 반전 뇌관 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ L 10 µ / L), 10 µ L 2 녹색 PCR x 마스터 믹스, 7 µ L ddH2O, 1 µ L genomic DNA ( 100 ng). PCR를 사용 하 여 순환 조건 95 ° c 5 분, [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s]의 35 주기 72 ° C 2 분.</li>
</ol>2입니다. rAAV 생산
<ol><li>셀 문화, 15 cm의 20 ~ 40에 AD293 셀 씨 고 DMEM 10 %FBS 1% 보완 유지 펜-Strep transfection 대 ~ 90 %confluency 도달할 때까지.</li>
	<li>200 µ L로 희석 3 플라스 미드 감소 (접시) 당 혈 청 매체: 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 또는 다른 serotypes) 및 3) pX601-i20, pX601 i23 혼합물 (1:1 비율)의 5 µ g의 총. 80 µ L 페이와 혼합 하 여 polyethylenimine (페이) transfection를 수행 하 고 dropwise 방식에서 10 분 추가 AD293 세포 배양에 혼합물에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	<li>AAV 바이러스 생산, 72 h 게시물 transfection 후 10 분 동안 1100 x g에서 원심 분리 하 여 미디어와 AD293 셀 알 약을 수집 하 셀 스 크레이 퍼를 사용 합니다.</li>
	<li>액체 질소와 42 ° C 물 탕에서 보육 교류 3 freeze-thaw 주기 다음 15 mL rAAV 세포의 용 해 버퍼 (50 mmol/L 트리 스 베이스, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5)에 셀 펠 릿 resuspend 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우 미래 처리를 위한-80 ° C에 세포 lysates를 저장 합니다.</li>
	<li>0.45 μ m 필터와 문화 미디어를 필터링 하 고 추가 40% PEG8000 2.5 mol/L NaCl에에서 8%의 최종 농도. 1 시간에 4 ° C에 혼합물 그리고 15 분 동안 1100 x g에서 원심 분리기를 품 어.</li>
	<li>RAAV 세포의 용 해 버퍼에 산 탄을 resuspend 하 고 단계 2.3, 뒤에 1 시간 동안 37 ° C에서 benzonase (50 U/mL) 치료에서에서 세포 lysates 결합.</li>
	<li>원심 benzonase 처리 rAAV 혼합물 1100 x g 4 ° C에서 15 분을 포함 하 고 상쾌한 (원유 rAAV 준비)를 저장 합니다.</li>
</ol>3. rAAV 정화 및 농도
<ol><li>하단에는 다음 순서에 따라 ultracentrifuge 튜브에 iodixanol 그라데이션에 원유 rAAV 준비 위에서 로드: 원유 AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15 %Iodixanol, 6 mL 25 %Iodixanol, 5 mL 40 %Iodixanol, 5 mL 58 %Iodixanol. 1 x DPBS를 사용 하 여 정상에 튜브의 나머지 빈 볼륨을 작성 합니다.</li>
	<li>230000 x g 10 ° C에서 120 분 ultracentrifuge로 터에서에 샘플 원심을 3-4 mL 18 G 바늘 rAAV 입자를 포함 하는 40% 그라데이션 분수의를 수집 합니다.</li>
	<li>1 x DPBS와 원심 분리기는 원심 필터 장치 (MWCO 100 kDa)를 사용 하 여 rAAV 입자를 희석. 대 한이 단계를 반복 3-5 시간 및 마지막으로 300-500 µ L rAAV 준비 집중.</li>
</ol>4입니다. rAAV Titering
<ol><li>2 µ L 집중 rAAV, 에탄올에 3 M NaOAc와 20 µ L ddH2O. resuspend 촉진에서 게놈 DNA를 추출</li>
	<li>PX601 플라스 미드의 직렬 희석에 의해 rAAV 정량에 대 한 표준 곡선을 얻기: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 각 10 µ L ddH2O. Dilute DNAase 치료 rAAV 1 x 105 부 샘플 1:10, 1시 50분, 1: 100, 그리고 1:1000.</li>
	<li>실시간 PCR 시스템에서 제조업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실시간 양이 많은 PCR (정량)에 의해 rAAV titer 결정: 1 µ L 10 µ / L 각 뇌관의 (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC 및 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ L PCR 마스터 믹스, 희석 1 µ L x 2 rAAV 샘플 및 2 µ L ddH2O. 자전거 매개 변수가 반응 실행: 95 ° C 3 분, 45의 주기 [95 ° C 5 초 61 ° C 20 초].</li>
</ol>5. 정 맥 및 복 rAAVrh.74-CRISPR 신생아 mdx/utrophin/- 생쥐에 주입
<ol><li>1 분 동안 얼음에 배치 하 여 mdx/utrophin+ 마우스 새끼 (3 일)를 immobilize 하 고 1 x 1012 복고풍 궤도 접근 또는 복 주사를 통해 체계적으로 마우스 당 50 µ L에서 바이러스 성 입자와 관리.</li>
	<li>복구 하 고 다시 자신의 집 새를 마우스 수 있습니다. RAAV 관리 후 10 주, 조직 컬렉션에 대 한 공동2 노출에 의해 쥐를 안락사.</li>
	<li>스냅-동결 genomic DNA와 RNA 추출 및 사용 isopentane 최적의 절삭 온도와 조직 cryosectioning 복합 동결 액체 질소에 냉각에 대 한 조직.</li>
</ol>6입니다. 결과 편집 대상 유전자의 분석
<ol><li>
게놈 DNA PCR 분석
	<ol>
<li>Mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 조직에서 게놈 DNA 치료 또는 rAAV 없이 총을 격리 합니다.</li>
		<li>1.12 단계에서에서 동일한 프로토콜을 사용 하 여 PCR 분석에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dystrophin 식의 RT-PCR 분석
	<ol>
<li>제조업체의 설명서에 따라 RNA 추출 키트와 함께 심장 조직에서 총 RNA를 추출.</li>
		<li>반전 녹음 방송을 수행 하려면 미리 RNase 무료 DNase와 총 RNA를 치료 하 고 템플릿으로 처리 RNA의 5 µ g를 사용 하 여 반전 녹음 방송 장비를 가진 첫번째 물가 cDNA 합성에 대 한.</li>
		<li>반전 녹음 방송 제품을 사용 하 여 dystrophin cDNA 뇌관으로 dystrophin 식의 RT-PCR 분석: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT 및 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정량 분석에 의해 효능을 편집 하는 유전자 예측
	<ol>
<li>양적 RT-PCR exon 22 포함 된 성적 (exon 21) 앞으로 뇌관을 사용 하 여 감소를 감지 하 여 효능을 편집 하는 유전자 예측: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, 그리고 역방향 뇌관 (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. 앞으로 뇌관 참조 유전자로 Gapdh 사용: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC 및 역방향 뇌관: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>양이 많은 실시간 PCR (정량) 실시간 PCR 시스템과 2 단계 반응 조건에서 제조 업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실행: 95 ° C 3 분, 95 ° C 5 sec와 61 ° C 30 초 45 주기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면역 형광 분석 dystrophin 식 얼룩
	<ol>
<li>잘라 냉동된 조직 두께 10 µ m. 수정에는 cryostat를 사용 하 여 15 분 동안 실 온에서 4 %paraformaldehyde 냉동된 섹션.</li>
		<li>PBS로 2 배를 세척 하 고 1 시간에 대 한 솔루션 (10% 말 혈 청) 차단으로 품 어.</li>
		<li>안티 dystrophin 기본 항 체, 4 ° C 하룻밤에 품 어.</li>
		<li>PBS와 슬라이드를 씻어 3 × 5 분 및 1 시간에 대 한 실 온에서 형광 이차 항 체 (1: 500)를 품 어.</li>
		<li>DAPI를 장착 매체를 사용 하 여 거꾸로 confocal 현미경으로 이미징 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 오프 대상 분석 T7E1 분석 결과
<ol><li>온라인 CRISPR를 사용 하 여 잠재적인 대상 오프 사이트 디자인 도구와 같은 예측 < http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>게놈 지역 취재는 상위 5-10 잠재적인 대상 오프 사이트 PCR에 의해 증폭: genomic DNA 200, 1 µ L 고 충실도 DNA 중 합 효소, 5 µ L 10 x PCR 버퍼 믹스, 1.5 µ L 10와 50 µ L 총 볼륨 조정 사이트별 정방향 및 역방향 뇌관의 µ / L ddH2o.</li>
	<li>전기 이동 법으로 PCR 제품을 실행 하 고 추출 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 광을 사용 하 여 농도 측정 합니다.</li>
	<li>변성 시키기 및 다시 사용 하 여 PCR cycler 버퍼 2.1에서 천천히 정화 amplicons 어 닐 링에 의해 heteroduplex 형성을 촉진 합니다. 동일한 자전거 상태를 사용 하 여 단계 1.2에서에서 상술 된 대로.</li>
	<li>0.5 µ L T7E1 효소, 37 ° C에서 30 분 동안 다시 단련된 제품을 소화 하 고 사용 하 여 1-2 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 반응 분석. 참고:는 amplicons 또한 타겟된 깊은 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

관심의 없습니다 충돌 존재합니다.

이 프로토콜에서 우리 vivo 심장 유전자 SaCas9 및 2 개의 gRNAs의 납품 rAAVrh.74 중재를 사용 하 여 출생 후 생쥐에서 편집을 달성 하는 데 필요한 모든 단계를 상세하게. 이전 지적,이 이렇게 dystrophic 쥐에서 dystrophin 식27의 우리의 작업 설명 된 대로 복원 사용할 수 있지만 그것은 또한 급속 한 반전 유전학 연구의 긴 과정 없이 쥐 심장 관련 유전자의 활성화 수는 생성 하 고 사육 녹아웃 마우스 모델 전통적인 녹아웃 접근.
편집 대상 조직에 효율성 높은 유전자를 달성 하기 위해 마음에 계속 몇 가지 중요 한 단계가 있다: 1) 타겟된 게놈 DNA의 삭제를 유도 하는 SaCas9/gRNA의 효능 적절 한 셀 라인;를 사용 하 여 유효성을 검사 하는 데 필요한 2) 그것은 매우 중요 한 대상 조직 및 3에 유전자 변환의 높은 레벨을 중재할 수 있는 적절 한 AAV serotype ...

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술 게놈 엔지니어링에서 가장 최근의 발전을 나타내고 세포와 유기 체 유전학의 현재 연습을 혁명을. CRISPR 관련 된 단백질 (Cas9) 9 등 CRISPR 관련 endonuclease 직접 단일 가이드 RNA (gRNA)을 이용 한다 CRISPR 기반 게놈 편집 하 고는 protospacer 시퀀스에 보완은 genomic DNA 대상에 Cpf1와 gRNA에 의해 인코딩 한 특정 protospacer 인접 한 모티브 (PAM)1,2. PAM은 Cas9 또는 Cpf1 유전자의 세균성 종에 따라 다릅니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 파생 된 가장 일반적으로 사용 되 Cas9 nuclease NGG 비 대상 가닥에 genomic DNA에서 직접 대상 시퀀스의 다운스트림 발견 되는 팸 시퀀스를 인식 합니다. 대상 사이트에 Cas9 및 Cpf1 단백질 생성 등 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 상 동 감독 수리 (HDR) 경로3내장 세포 DNA 수리 메커니즘을 통해 복구 다음, 이중 가닥 휴식 (DSB) 4. 동종 재결합에 대 한 DNA 템플렛의 부재, DSB는 주로 수리 삽입 또는 삭제 (indels)에서 발생할 수 있는 오류가 NHEJ 통로 DSB 코딩에서 만들어진 경우 frameshift 돌연변이 일으키는 뉴클레오티드의 6유전자5,지역. 따라서, CRISPR 시스템은 널리 사용 되었습니다 다양 한 휴대폰 모델 및 전체 유기 체에 있는 손실의 기능 돌연변이 하는 유전자의 기능을 조사 하기 위하여. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 및 Cpf1 transcriptionally를 개발 되었습니다 그리고 epigenetically 조절 대상 유전자7,8의 표현.
더 최근에, SpCas9 및 SaCas9 ( 황색 포도상구균에서 파생 됨)는 패키지 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 벡터 인간 질환의 동물 모델에서 출생 후 유전자 교정용으로 특히, 듀 켄 씨 근 위축 증 (DMD)9,10,11,12,13,,1415. DMD는 치명적인 X 연결 된 열성 질병 dystrophin 단백질16,17인코딩하는 DMD 유전자에 있는 돌연변이 기인한 신생아 심사18 에 따르면 약 3500에서 한 남성 출생에 영향을 미치는 , 19. 진보적인 근육 약점 그리고 낭비 특징 이다. DMD 환자는 일반적으로 20-30 년20의 나이 10 ~ 12 세 사이의 호흡기 또는 심장 실패의 다이 걸을 기능 손실. 특히, 심근에 개발 > DMD 환자와 나타냅니다 DMD 환자21,22에 죽음의 주요 원인의 90%. 비록 Deflazacort (항 염증 약물) 및 Eteplirsen (는 엑손 exon 51를 건너뛰는 데 약을 건너뛰는) 최근 승인 된 DMD에 대 한 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)23,24, 이러한 치료의 게놈 DNA 수준에서 유전적 결함을 수정 합니다. Exon 23 dystrophin 유전자의 점 돌연변이 운반, mdx 마우스 DMD 모델25로 널리 사용 되었습니다. 또한, 우리 이전 기능 dystrophin 식 취재 exons 21, 22, 23 일 근육 광고-SpCas9/gRNA 배달9 사용 하 여 mdx 쥐의 골격 근육에서 게놈 DNA의 프레임 삭제에 의해 복원 된 시연 , 그리고 정 맥 및 복 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 배달26를 사용 하 여 mdx/utrophin/- 생쥐의 심장 근육에.
이 프로토콜에서 우리가 자세히 설명 출생 후 심장 유전자 dystrophin mdx/utrophin/- 생쥐 dystrophin 분석 심장 근육 섹션에 gRNA 디자인에서 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 벡터를 사용 하 여 복원 하려면 편집 모든 단계.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 염소 안티 토끼 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Bio Safety Cabinets</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 시리즈 A2 Class II, Type A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S</td><td></td></tr><tr><td>유능 세포</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td>200314</tr><tr><td>세포 배양 접시, 150mm</td><td>Nest Scientific USA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>Dystrophin 항체</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47111</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>필터 유닛, 0.45&mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>고속 플라스미드 미니 키트</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 수조</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 열 블록</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>도립 컨포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 기기</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 기기 II</td></tr><tr><td>대용량 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td>미세 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>Nanodrop 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&trade; 2000/2000c</td></tr><tr>올리<td>고 i20-F</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>CACCgGGCGT tgaattctcattac</td></tr><tr><td>올리고 i20-R</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td></tr><tr><td>i23-F</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td>용 올리고 <td>CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC</td></tr><tr><td>i23-R</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td>용 올리고 <td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td></tr><tr><td>올리고</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 밀도 구배 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>퀵 씰 원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR 키트</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT 역전사 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>로터</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>337922</td><td>형 70Ti</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td><td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>초원심 필터 장치</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>H-1200</td><td></td>이 포함된 마운팅 배지</tr></tbody></table>

adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 crispr의

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복 (CRISPR) 시스템은 크게 배양된 세포에 다양 한 종의 생물 게놈 엔지니어링을 촉진 했다. CRISPR 기술 또한 인간의 질병의 숫자에 대 한 새로운 치료제로 탐험 되었습니다. 개념 증명 데이터는 매우 고무적인 타당성과 듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD) murine 모델을 사용 하 여에 대 한 편집 기반 치료 방법은 유전자의 효능을 설명 하는 최근 학문에 의해 exemplified입니다. 특히, 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74)의 정 맥 및 복 주사 (SaCas9) 포도 상 구 균 CRISPR 관련 단백질 9의 효율적인 심장 배달 및 2 있었습니다. exon 23 마우스 Dmd 유전자에에서 돌연변이 codon 게놈 영역을 삭제 하려면 RNAs (gRNA) 안내. 이 같은 방법은 유전자의 관심 밖으로 노크 하는 gRNA 유전자의 코딩 지구를 대상으로 설계는 출생 후 마우스에 그들의 심장 기능을 공부도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 표시 rAAVrh.74 CRISPR 벡터 하는 방법 및 신생아 쥐에 고효율 심장 납품을 달성 하는 방법.

대상 게놈 DNA 영역 삭제를 유도 하는 gRNAs의 효능 vivo에서 학문을 위한 rAAV로 포장 하기 전에 셀 문화에서 평가 되어야 한다. 이 위해, gRNAs 및 SaCas9을 표현 구문 electroporated C2C12 세포로 되었고 대상 사이트 (그림 1) 측면 뇌관으로 PCR에 의해 게놈 DNA 분석. PCR 제품 ~ 500 bp 대상 게놈 DNA 유전자 제어 세포 게놈 DNA의 큰 크기로 인해 밴드 양보 하지 해야 하는 동안 편집에서 결과의 성공적인 삭제를 나타냅니다.
일단 세포 배양에는 gRNAs의 효능 확인 되었습니다, 그들은 AAV293 셀에 3 개의 플라스 미드 공동 transfection를 사용 하 여 rAAVrh.74 또는 (예: AAV6, 8 또는 9, 모든 보여주는 강력한 심장 유...

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

이 in vivo 심장 유전자 편집 프로토콜의 전반적인 목표는 CRISPR SaCas9 및 guide RNA 벡터와 함께 재조합 아데노 관련 바이러스 rh. 74를 사용하여 영양이상증 마우스의 심장에서 dystrophin 발현을 복원하는 것입니다. 이 방법은 유전자 편집이 뒤셴 근이영양증과 관련된 심근병증의 근본 원인을 치료하기 위한 신뢰할 수 있는 치료 전략인지 여부와 같은 근이영양증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이러한 기술의 주요 장점은 교정된 디스트로핀 유전자의 발현이 내인성 조절 제어 하에 있으며 이러한 구출 효과가 영구적이라는 것입니다. 이 기술의 의미는 CRISPR Cas9 유전자 편집 기술에 의해 돌연변이 유전자를 교정할 수 있는 다른 유전 질환의 치료로 확장됩니다. 이 방법은 영양이성 심장의 디스트로핀 복원에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 역유전학 연구를 위해 관심 유전자를 제거하는 데에도 사용할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Yandi Gao가 맡을 것입니다. 가이드 RNA 또는 gRNA의 적절한 설계는 이 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. 황색포도상구균 CRISPR 관련 단백질 9에 대해 dystrophin intron 20 및 intron 23을 target하는 두 개의 gRNA를 선택합니다.각 gRNA에 대한 protospacer 인접 모티프 서열은 밑줄이 그어지고 기울임꼴로 표시됩니다. gRNA 올리고뉴클레오티드를 어닐링하려면 1x 어닐링 버퍼에 gRNA 올리고뉴클레오티드를 리터당 100마이크로몰로 포함하는 반응을 설정합니다. 뒤에 오는 PCR 모수를 사용하십시오: 10 분 동안 95 섭씨 온도, 20 초 동안 주기 당 0.4 섭씨 온도 감소를 가진 95에서 59 도의 90 주기, 20 초 동안 주기 당 0.3 섭씨 온도 감소를 가진 59 에서 32 도의 90 주기, 및 20 초 동안 주기 당 0.3 섭씨 온도 감소를 가진 32 에서 26 섭씨 온도의 20 주기.다음으로, 한 번의 반응으로 annealed gRNA oligonucleotides를 CRISP vector에 접합할 준비를 합니다. 튜브에 다음을 추가합니다: 마이크로리터 CRISPR 벡터당 50나노그램 1마이크로리터, 어닐링된 올리고뉴클레오티드 1마이크로리터, 10x T4 DNA 리가제 완충액 1.5마이크로리터, T4 DNA 리가제 0.5마이크로리터, Bsal 1마이크로

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

심장 기능에 미치는 유전자 효과 평가를 위한 마우스 심장 내 바이러스 유전자 전달

이 비디오에서는 새끼 쥐에서 재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달을 보여줍니다. 이 방법은 표적 세포의 유전자 발현을 연구하는 데 도움이 됩니다.

재조합 아데노 관련 바이러스 기반 유전자 전달: 설치류 모델에서 이식유전자 전달 및 심장 특이적 발현을 위한 기술

이 원고에서는 마우스 심장에서 유전자 발현을 조작하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 9(rAAV9) 벡터를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

이 프로토콜에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 활용하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 기술 절차를 설명합니다. 설명된 단계에는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비 및 BAT 로브에 AAV의 미세 주입이 포함됩니다.

결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용한 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스 생성

이 프로토콜은 유전자 변형 쥐 모델을 생산하기 위한 최적화된 접근 방식을 제시합니다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 DNA 복구 템플릿을 전달하는 데 사용되며, 전기천공법은 CRISPR-Cas9 시약을 전달하여 2세포 배아에서 게놈 편집 과정을 완료하는 데 사용됩니다.

아데노 관련 바이러스(AAV) 및 2세포 배아 전기천공법을 이용한 쥐 배아의 CRISPR-Cas9 게놈 편집

이 보고서는 마우스 신장으로의 효과적이고 안전한 유전자 전달을 위해 신우 를 통한 AAV 벡터의 국소 주입 방법을 자세히 설명합니다.

아데노 관련 바이러스 벡터의 느린 역행 신골 주사 를 통한 마우스 신장에 효과적이고 안전한 유전자 전달

This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

심근경색 후 리모델링 연구를 위한 CRISPR/Cas9 공학 기반 Cracd 결핍 마우스 모델의 생성 및 표현형 특성 분석

배우세요 CRISPR을 이용한 심장 유전자 편집 방법으로, 재조합 아데노 관련 바이러스를 통해 생후 쥐 심장에서 디스트로핀 발현을 회복하는 기술입니다. 이 방법은 두셔근 영양실조증 관련 심근증 치료에 활용됩니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

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