Name: 루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 탐색하세요 토양, 뿌리주변대 및 뿌리내부 미생물 군집을 16S rRNA 유전자 프로파일링으로 분석하는 방법을 배우세요. 이 표준화된 프로토콜은 식물 관련 미생물 다양성 연구에 필수적입니다.

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이 작업은 농 무부-ARS (CRI 2030-21430-008-00D)에 의해 투자 되었다. TS는 NSF 대학원 연구 친교 프로그램에 의해 지원 됩니다.

1. 수집 및 루트 Endosphere, Rhizosphere, 및 토양 샘플의 분리
<ol><li>이전에 소독을 필드, 압력솥 초순 (샘플 당 물 90 mL 이상)를 입력 합니다. KH2포46.75 g, 8.75 g의 K2HPO4, 살 균 물 1 l 트라이 톤 X-100의 1 mL를 추가 하 여 epiphyte 제거 버퍼 (샘플 당 적어도 25 mL)를 준비 합니다. 0.2 µ m 기 공 크기와 진공 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독.<ol>
<li>1.2 ~ 1.5 단계, 모든 에탄올 소독 깨끗 한 장갑을 착용 시간 하 고 오염을 방지 하기 위해 각 샘플 사이의 장갑 바꿉니다. 70% 에탄올과 모든 장비를 소독 하 고 깨끗 하 게 닦아 샘플 사이의 모든 장비. 샘플링, 전에 실험에 대 한 최적의 샘플링 깊이 결정 하 고 모든 토양 및 루트 컬렉션와 일치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대량 토양 샘플을 수집 하기를 사용 하 여 에탄올 소독 토양 코어 수집기는 코어를 수집 하 여 식물의 뿌리는 토양 식물의 기지에서 약 23 ~ 30 cm.</li>
	<li>비닐 봉지에 토양을 전송 하 고 부드러운 떨고 하 여 토양을 균질 한 2 mL 튜브를 채우기 위해 토양 샘플 (약 600 밀리 그램)의 약 수를 전송. 바로 드라이 아이스에 2 mL 튜브 또는 플래시 DNA 추출 (2 단계)와 진행 준비까지 액체 N2 에 튜브를 고정 합니다.<ol>
<li>일부 환경에서는 주위 토양 식물 재료를 포함할 수 있습니다. 이 경우 멸 균된 2 mm 체를 사용 하 여 비닐 봉투에서 그것을 배치 하기 전에 토양에서 식물 파편을 분리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>루트 및 rhizosphere 수집, 많은 가능한 루트를 돌보는 공장을 발굴 하는 에탄올 소독 삽을 사용 합니다. 깊이 식물에 따라 달라 집니다. 반면 밀 등 작은 식물 사탕수수 30 cm 이상 필요할 수 있습니다와 같은 몇몇 센티미터, 더 큰 식물을 파고에 의해 제거할 수 있습니다. 루트 표면에 고착 하는 토양의 약 2 m m까지 부드럽게 뿌리에서 과잉 토양을 흔들어. 참고: 작은 식물, 연약한 뿌리, 또는 건조 하 고, 높은 점토 콘텐츠 토양에서 작업할 때는 주의 합니다. 이상적으로,만 동요 후에 뿌리에 남아 있는 흙의 얇은 층 이어야 한다. 토양의 큰 집계 남아 있으면 부드럽게 촬영의 기지를 타격 하 여 토양을 꺼내 려 고무 망치를 사용할 수 있습니다. 경우 토양이이 과정 후 남은 금액을 초과 하거나 2 mm의 짧은 폭포, 대략 두께 지적 한다.</li>
	<li>큰 식물에 대 한 뿌리의 대표적인 하위 섹션을 잘라 하 고 루트 조직의 500 밀리 그램의 최소 50 mL 원뿔 유리병을 소독가 위 또는 위를 사용 합니다. 작은 잔디에 대 한 유리병에 전체 루트 시스템을 배치. 플래시 동결 액체 N2샘플 또는 뿌리를 커버 다음 즉시 샘플 드라이 아이스에 충분 한 epiphyte 제거 버퍼를 추가 합니다. 참고: 주의 하지 연극 50 mL 원뿔 유리병 세척 단계를 어렵게 만들 것입니다 그것으로. Epiphyte 버퍼가 바닥에 흐름, 유리병, 내내 뿌리를 둘러싸고 상단 커버 하는 충분 한 빈 공간이 이어야 한다. 일부 잔디 때문에 50 mL 원뿔 유리병에 맞는 것 보다 더 많은 루트 바이오 매스, 뿌리의 일부를 수집 해야 합니다. 그러나, 그것은 주목 해야한다 endophytic 박테리아 rhizosphere 분수에 밖으로 세척 되 고 이어질 수 뿌리 절단, 그래서 뿌리를 파괴를 최소화 한다. 샘플 랩 귀국 후 즉시 처리 되지 않습니다, 그들은 수 저장-80 ° c.에</li>
	<li>뿌리에는 rhizosphere 구분, 얼음, 루트 샘플을 녹여 다음 160 W 30의 펄스와 10 분 동안 4 ° C에서 루트 샘플 sonicate 냉장된 (4 ° C)에 뿌리 30 미 전송으로 구분 s, 소독 집게를 사용 하 여 50 mL 튜브 청소. 버퍼와 토양, rhizosphere 분수 (그림 1)은 원래 튜브를 폐기 하지 마십시오.</li>
	<li>포함 하는 버퍼 튜브 원심 및 rhizosphere 4000 x g. Decant 상쾌한, 4 ° C에서 10 분 플래시 동결 튜브 액체 N2에서 rhizosphere 분수를 포함 하 고 DNA와 진행 준비까지-80 ° C에서 rhizosphere 분수를 저장 추출 (2 단계)입니다.</li>
	<li>뿌리를 씻어, 루트 분수를 냉장된 (4 ° C) 살 균 물의 약 20 mL를 추가 합니다. 적극적으로 (또는 의해 핸드 믹서, 15-30 s), 떨고 하 여 루트를 세척 하 고 물을 배수.</li>
	<li>아무 토양도 루트 표면에 남아 때까지이 단계를 두 번 이상 반복 합니다. DNA 추출 (2 단계)는 즉시 수행 되지 않습니다, 뿌리 소독 알루미늄 호 일에 포장, 플래시 동결 액체 N2, 그리고 저장소-80 ° c까지 샘플 DNA 추출 진행 준비에 뿌리.</li>
</ol>2. DNA 추출
참고: 단계 2와 3 단계를 통해 에탄올으로 소독 하는 깨끗 한 장갑 착용 한다 항상 고 에탄올으로 소독 하는 표면에 모든 작업을 수행 해야 합니다.
<ol><li>토양 및 rhizosphere 샘플에서 DNA를 추출 합니다.<ol>
<li>사용 하 여 신속 하 게 별도 컬렉션 튜브로 1.3, 1.7 단계에서 토양 및 rhizosphere의 250 밀리 그램을 전송 하는 메 마른 주걱 상업 DNA 분리 키트에 제공 된 토양에서 추출 설계 다음 DNA 절연 키트 공급 업체를 사용 하 여 진행 프로토콜입니다.</li>
		<li>방출 후 DNA 분리 kit에서 제공 하는 차입 버퍼에서 DNA 준비 3 단계 진행까지-20 ° C에서 DNA를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>루트 샘플에서 DNA를 추출 합니다.<ol>
<li>진정 소독된 박격포와 유 봉 액체 N2를 사용 하 여. 루트 조직의 600 700 mg에 밖으로 측정 하 고 박격포 조직을 넣습니다. 조심 스럽게 뿌리를 충당 하기 위해 충분 한 액체 N2 를 추가 합니다.</li>
		<li>작은 조각으로 뿌리를 갈아. 액체 N2 를 추가 하 고 연 삭 과정을 계속 (적어도 두 번 샘플 사이 일관 되), 뿌리는 좋은 분말까지. 루트 조직이이 단계 동안 재개 하지 않습니다 확인 합니다. 주의: 적절 한 개인 보호 장비 (연구실 코트와 극저온 장갑, 보호 안경,) 때 사용 액체 N2를 사용. 참고: 낮은-품질 DNA 추출에 대 한 도움이 될 수 초과 뿌리 분말으로 갈아 분말-80 ° c.에 저장 하</li>
		<li>신속 하 게, 루트 전에 분말 동, 메 마른 주걱을 사용 하 여 얼음에 미리 무게 1.5 mL 튜브에 루트 파우더를 전송 하기 시작 합니다. 튜브와 파우더의 무게를 기록 합니다. 일반적으로 300-400 mg 분말의 전송 됩니다.</li>
		<li>신속 하 게 상용 DNA 분리 키트에 제공 된 컬렉션 튜브를 루트 파우더의 150 밀리 그램을 전송 하는 메 마른 주걱을 사용 하 여 토양에서 추출 설계 다음 DNA 절연 키트 공급 업체의 프로토콜을 사용 하 여 진행 합니다. 참고: 일부 루트 샘플에 대 한 있을 수 있습니다 유기 물이 PCR, 특히 때 다른 DNA 추출 프로토콜 중 DNA의 확대를 방지 DNA 펠 릿에 남아의 높은 농도 (예., CTAB 추출) 사용 됩니다. 필요한 경우 환경 DNA 정리 키트에 제공 된 지침에 따라 DNA를 청소.</li>
	</ol>
</li>
	<li>고감도 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여 모든 DNA 샘플의 농도 측정 합니다.<ol>
<li>튜브 dsDNA 높은 민감도 분석 결과 키트에 제공 된 각 eluted DNA 샘플의 1-20 µ L를 추가 합니다. 200 µ L까지 fluorometer 작업 솔루션 (1: 200 염료: 버퍼)를 추가 합니다.</li>
		<li>표준 2 (100 ng / µ L)의 DNA 표준 1 (0 기 / µ L DNA) 또는 10 µ L의 10 µ L을 포함 하는 두 개의 추가 튜브를 준비 하 고 각 표준 fluorometer 작업 솔루션의 190 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>표준 및 각 샘플의 농도 측정 합니다. 자동으로 수행 하지, DNA 농도 흡 광도 출력에서 두 개의 표준 선형 회귀 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Amplicon 라이브러리 준비 및 제출
<ol><li>증폭 반응에 대 한 자료를 설정 합니다.<ol>
<li>4 ° C에서 DNA 샘플을 해 동 하 고 3 단계에 걸쳐 얼음에 그들을 유지. PCR (표 2)에 위치 편견을 최소화 하기 위해 DNA 샘플의 순서를 임의화</li>
		<li>96-잘 PCR 접시에 희석 DNA 분자 급 물에 각 샘플에서 20 µ L. 추가 20 µ L 분자 급 물 4 코너 웰 스의 총 볼륨에서 5 ng / µ L에 확대 (공백) (표 2)에 대 한 부정적인 컨트롤.</li>
		<li>다중 채널 피 펫 (그림 2)와 함께 추가할 수 있습니다 그런 바코드 뇌관 (10 µ M) PCR 스트립 튜브 또는 96 잘 접시에 배열.</li>
		<li>3 중에서 각 DNA 샘플을 증폭 하는 충분 한 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. BSA (20 mg/mL)의 1.5 µ L, 미리 만든 2 마스터 믹스 (PCR 버퍼, MgCl2, dNTPs, Taq DNA 중 합 효소의 구성된) x 37.5 µ L, 엽록체 PNA의 0.57 µ L를 준비 (100 µ M), 미토 콘 드 리아 PNA의 0.57 µ L (100 µ M), 그리고 분자 학년 물 25.86 µ L.</li>
		<li>멀티 채널 피 펫 저수지의 메 마른 25 mL로 마스터 믹스와 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 새로운 96-잘 PCR 플레이트의 각 음에 마스터 믹스의 66 µ L를 배포. 참고: 마스터 믹스에 대 한 시 볼륨을 계산할 때 또한 접시 당 4 빈 우물을 포함 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>다중 채널 피 펫을 사용 하 여 5 ng / µ L 마스터 믹스 플레이트 (표준화 된 DNA 접시)에서 DNA의 6 µ L를 추가 합니다. 각 열에 다른 앞으로 바코드 및 1.5 µ L 10 µ M의 각 행에는 다른 역방향 바코드 (그림 2)는 뇌관을 반대는 10 µ M 앞으로 뇌관의 마스터 플레이트 1.5 µ L에 추가 합니다. 참고: 프라이 머를 추가 하기 전에 무작위로 접시와 마스터 혼합 사용 될 수 다른 뇌관 추가 된 경우 ITS 또는 ITS2 곰 팡이 유전자를 증폭 하는. 이 경우 유사한 뇌관 디자인을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>3000 x g.에서 짧게 접시 아래로 회전 부드럽게, 혼합 후 반응 혼합물의 25 µ L 3 접시로 분할 다중 채널 피 펫을 사용 합니다. 참고: 세 개의 복제는 엄격 하 게 필요 하지 않습니다, 비록 그것은 기술 변화의 영향 감소.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Thermocycler 다음과 설정을 사용 하 여 각 접시에서 DNA를 증폭: 180 s 98 ° C에, 30의 주기: 45 98 ° C s (변성 시키기), 78 ° C 10 s (PNA 어 닐 링), 55 ° C 60 s (뇌관 어 닐 링), 그리고 72 ° C 90에 대 한 s (확장) 다음 600 72 ° c에서 4 ° c s 보유 단계. 증폭, 후 한 단일 96 잘 접시에 세 가지 복제 판 풀.</li>
	<li>96 잘 접시 리더에서 고감도 fluorometer 시 약을 사용 하 여 DNA를 계량.<ol>
<li>Fluorometer 작업 솔루션 (1: 200 염료: 버퍼)의 98 µ L 함께 96-잘 microplate에 각 PCR 제품의 2 µ L를 추가 합니다. 표준으로 4 우물을 포함: 5 µ L의 DNA 표준 1 (0 기 / µ L DNA), 표준 2 (10 ng / µ L)의 1 µ L, 2 µ L의 표준 2 (20 ng / µ L), 및 표준 2 (50 ng / µ L)의 5 µ L. Fluorometer 100 µ L의 최종 볼륨에 대 한 작업 솔루션을 추가 합니다. 참고: 각 샘플 수 측정 단계에서 설명한 2.3 플레이트 리더를 사용할 수 없는 경우에 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여.</li>
		<li>4 개의 표준 선형 회귀 하 여 흡 광도 출력에서 DNA 농도 계산 합니다.</li>
		<li>성공적으로 증폭 된 바코드에 대 한 제품 (그 농도 15 ng / µ L 보다 큰), 수영장 100 단일 1.5 mL 튜브 (표 2)에 각 샘플의 ng.</li>
		<li>스프레드시트 프로그램에서 =AVERAGE() 함수를 사용 하 여 풀에 추가 하는 샘플의 평균 볼륨을 계산 합니다. 풀링된 샘플에 "빈" PCR 제품의 볼륨을 추가 합니다. 참고: "공백" PCR 제품 그들의 자신의 고유한 바코드 조합 때문에, 그들은 수 수 시퀀싱 어떤 실험실 오염 물질에 대 한 확인.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA의 단계, 2.3과 걸릴 600에 설명 된 대로 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여 풀링된 제품의 농도 측정 하 고 1.5 mL 튜브에 100 µ L의 최종 볼륨을 분자 수준의 물에 희석. -20 ° c.에 나머지 풀링된 제품 저장</li>
	<li>몇 가지 예외와 함께 96-잘 형태로 상자성 정화 구슬과 설립된 PCR 정화 과정에 따라 600 ng DNA aliquot 세척.<ol>
<li>신선한 600 µ L 70% 에탄올의 aliquot 확인 합니다. 다시 바닥에 침전 하는 구슬 중단 자석 구슬의 병을 흔들어.</li>
		<li>DNA의 600 ng 약 수를 구슬 솔루션의 1 x 볼륨 (100 µ L)를 추가 합니다. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>마그네틱 스탠드 2 분 (또는 때까지 솔루션은 분명 하다)에 튜브를 놓고 비즈 솔루션에서 분리. 여전히 마그네틱 스탠드에서에서 튜브를 실행 하는 동안 자석 구슬, 건드리지 않고 맑은 상쾌한을 신중 하 게 발음 하 고 맑은 상쾌한 삭제. 참고:이 시점에서, amplicon 제품에 바인딩됩니다 자석 구슬. 방해 또는 동안 포부는 어떤 구슬 DNA의 손실이 발생 합니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 두고 관;에 70% 에탄올의 300 µ L를 추가 에탄올 및 삭제 30 s. Aspirate에 대 한 실 온에서 품 어. 이 과정을 반복 하 고 두 번째 세척 후 모든 에탄올을 제거 합니다. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거 하 고 5 분 동안 건조 한 공기.</li>
		<li>말린된 구슬에 분자 급 물 30 µ L을 추가 하 고 10 번 pipetting으로 혼합. 비즈 솔루션에서 분리 하는 2 분 1 분 마그네틱 스탠드에 반환 튜브에 대 한 실 온에서 품 어. 새로운 튜브는 eluate 전송. 참고: 자석 구슬 다운스트림 반응 영향을 주지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>청소, 2.3 단계에서 설명한 대로 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여 풀링된 DNA의 최종 농도 측정 합니다. 10 약 수를 희석 농도에 또는 30 µ L의 최종 볼륨 및 볼륨 시퀀싱 시설 선호 nM.</li>
	<li>NGS 플랫폼, 300 bp 쌍-엔드 시퀀싱 x 2에 DNA 시퀀싱 하는 시퀀싱의 서비스를 활용 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서는 루트 endosphere, rhizosphere, 및 샘플 처리 및 다운스트림 시퀀싱 필드 샘플링에서 토양 미생물 지역 사회 구성에 대 한 설립된 파이프라인을 보여 줍니다. 공부 루트 관련 microbiomes 선물 독특한 도전, 인해 일부 샘플링에서 고유한 어려움에 토양에서. 토양은 매우 변수 육체 및 화학 재산의 점에서 그리고 다른 토양 조건 만큼 약간 몇 밀리미터28,29에 의해 분리 될 수 있다. 이 상당히 다른 미생물 커뮤니티 구성 및 활동30,31인접 한 샘플링 사이트에서 수집 되는 샘플 발생할 수 있습니다. 따라서, 사용 하 여 토양 코어 수집과 삽 유지 일관 된 샘플링 깊이 이전 DNA 추출 균질 루트 미생물 연구에서 재현성에 필수적입니다. 그것은 또한 rhizosphere 및 루트 분수;...

역동적이 고 복잡 한 미생물 지역 사회 박테리아, archaea, 바이러스, 곰 팡이, 그리고 다른 진 핵 미생물의 구성 식물 관련 된 microbiomes에 의하여 이루어져 있다. 식물 질병의 원인에 그들의 잘 공부 역할, 식물 관련 미생물도 긍정적인 영향을 미칠 수 식물 건강 biotic 및 abiotic 스트레스에 내성 개선 하 고, 양분 가용성, 홍보 강화 통해 식물 성장 여 phytohormones의 생산입니다. 이러한 이유로, 특정 관심 taxa 식물 루트 endospheres, rhizospheres, 및 주위 토양 연관 특성화에 존재 합니다. 일부 미생물 실험실 생성 된 미디어에 고립에서 경작 될 수 있다, 하는 동안 많은 수 없습니다, 그들은 다른 미생물과 공생 관계에 따라 달라질 수 있기 때문에 일부 매우 느리게 성장 또는 랩 환경에서 복제 될 수 없는 조건을 요구. 때문에 재배에 대 한 필요를 circumvents 상대적으로 저렴 하 고 높은 처리량, 되었다 환경 및 호스트 관련 미생물 샘플 프로 파일링 계통 발생 시퀀스 기반 미생물 커뮤니티 시 금 선호 하는 방법 구성입니다.
차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼1 다양 한에서 제공 하는 적절 한 시퀀싱 기술의 선택은 사용자의 요구에 따라 포함 하는 중요 한 요소: 원하는 범위, amplicon 길이, 예상 커뮤니티 다양성, 뿐만 아니라 오류 속도, 읽기-길이, 그리고는 비용-당-실행/megabase 시퀀싱. Amplicon 기반 시퀀싱 실험에서 고려 되어야 또 다른 변수 어떤 유전자 증폭 될 것 이며 어떤 뇌관을 사용 됩니다. 때 설계 또는 뇌관을 선택, 연구 결과 amplicons에서 달성 증폭의 보편성과 분류학 해상도 간의 절충이 종종 밖에 없습니다. 이러한 이유로 이러한 유형의 연구는 자주 뇌관 및 마커는 미생물의 특정 하위 집합을 대상으로 선택적으로 선택 했다. 세균성 지역 사회 구성 평가 연속 하나 이상의 세균의 16S rRNA 유전자2,3의 하이퍼 지역 일반적으로 수행 됩니다. 이 연구에서 설명 하는 기반 하는 amplicon 시퀀싱 프로토콜 NGS 플랫폼에 대 한 충분 한 다양성을 제공 하는 동안 세균 taxa의 넓은 확대를 위한 수 있는 세균의 16S rRNA 유전자의 그 대상 500 bp V3-V4 지역 개발 다른 taxa 사이 구별. 또한,이 프로토콜을 쉽게 다른 뇌관 집합, 버섯의 ITS2 마커 나 진핵생물의 18S rRNA 소 단위를 대상으로 함께 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.
다른 접근 같은 샷건 metagenomics, metatranscriptomics, 및 단일 셀 시퀀싱, 이점이 다른 해결된 미생물 게놈 및 커뮤니티 기능의 더 직접적인 측정을 포함 하 여, 이러한 기술은 일반적으로 더는 비싸고 계통 발생 프로 파일링 보다 계산 집중4여기 설명합니다. 또한, 루트 샘플에 샷건 metagenomics 및 metatranscriptomics을 수행 호스트 식물 게놈에 속하는 읽기의 큰 비율 수 있고이 한계를 극복 하는 방법을 여전히 개발된5,6되 고 있습니다.
어떤 실험 플랫폼와 마찬가지로 amplicon 기반 프로 파일링 하는 것은 실험적인 디자인 및 데이터 분석 하는 동안 고려 되어야 하는 잠재적인 편견의 수를 발생할 수 있습니다. 샘플 수집, DNA 추출, PCR 뇌관의 선택 및 라이브러리 준비를 수행 하는 방법을 방법을 포함 됩니다. 다른 방법을 생성 하 고, 사용 가능한 데이터의 양을 크게 영향을 미칠 수 고 또한 연구 사이 결과 비교 하는 노력을 방해 수 있습니다. 예를 들어 rhizosphere 박테리아7 와 다른 추출 기술의 사용 또는 DNA 추출 키트8,9 의 선택 제거 하는 방법 표시 되었습니다 크게 영향을 다운스트림 분석에 이르게 이 관한 미생물은 현재와 그들의 상대 나타났는데 되는 다른 결론 프로 파일링 amplicon 기반 사용자 지정할 수 있습니다, 이후 연구에서 비교를 만드는 전하실 수 있습니다. 지구 Microbiome 프로젝트 공장 관련 미생물 같은 복잡 한 시스템을 공부 하는 연구자의 응용 프로그램에 의해 발생 하는 변화를 최소화 하는 수단으로 표준화 된 프로토콜의 개발에서 도움이 될 것 이라고 제안 했다 연구10,11사이 다른 방법. 여기, 우리가 위의 주제의 대부분을 토론 하 고 어디 유용한 제안을 제공 적절 한.
프로토콜 색 사탕수수 에서 추출 DNA 기초가 DNA 분리 키트11를 사용 하 여 수집, rhizosphere, 토양과 루트 샘플 과정을 보여 줍니다. 또한, 우리의 프로토콜 세균성 지역 사회12,,1314의 구조를 결정 하는 일반적으로 이용한 NGS 플랫폼을 사용 하 여 자세한 amplicon 시퀀싱 워크플로 포함 합니다. 이 프로토콜 식물 뿌리, rhizosphere, 및 사탕수수 색, 지 시 메이 스, 그리고 Triticum aestivum15를 포함 하 여 18 monocot 종의 관련 된 토양의 최근 출판된 연구에 호스트의 넓은 범위에서 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 메서드는 또한 검증 된 다른 마커 유전자와 함께 사용 하기 위해 agave 미생물16,17 및 딸기 미생물 의 연구에 곰 팡이 ITS2 마커 유전자를 공부 하 고 그것의 성공적인 응용 프로그램에서와 같이 18.

<table><tbody><tr><td>0.1-10/20 &마이크로; L 여과 마이크로 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>10 & 마이크로; L 멀티 채널 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3122000027</td><td>다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>10 & 마이크로; L, 100 &마이크로; L 및 1000 &micro; L 마이크로피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3120000909</td><td>다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>100 &마이크로; L 멀티 채널 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td>다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>1000 &마이크로; L 여과된 마이크로피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>2 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td>다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>2mm 토양 체</td><td>임업 공급 업체</td><td>60141009</td><td>다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 여과 마이크로 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>25 mL 저장용기</td><td>VWR International LLC</td><td>89094-664</td><td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 바이알</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>500mL 진공 필터(0.2 &마이크로; m pore size)</td><td>VWR International LLC</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplates</td><td>USA Scientific</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plates</td><td>BioRad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9933872</td><td>사용 설명서: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Boardwalk</td><td>7124</td><td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>0.001g 해상도의 분석 저울</td><td>Ohaus Pioneer</td><td>PA323</td>은 <td>다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Bioruptor Plus 초음파 발생기</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA) 20 mg/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5811000908</td><td>50mL 및 96웰 플레이트 버킷 어댑터 포함</td></tr><tr><td>극저온 장갑</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z183490</td><td>다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DNeasy PowerClean 키트(옵션)</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12877-50</td><td>이전 MoBio</td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil 키트</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12888-100</td><td>이전 MoBio</td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td> 에탄올<td>로 대체하지 마십시오</td></tr><tr><td></td><td>VWR International LLC</td><td>89125-188</td><td>다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>갤런 크기의 냉동 백</td><td>Ziploc</td><td>NA</td>는 <td>다른 공급 업체의 동급으로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Gemini EM 마이크로플레이트 리더</td><td>Molecular Devices</td><td>EM</td><td>상단에서 96웰 플레이트를 판독하는 다른 형광계를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>Workrite</td><td>J1367</td><td>다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Liquid N2</td><td>Any</td><td>NA</td><td>는 다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>액체 N2 듀어</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4150-9000</td><td>다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Milli-Q 초순수 정화 시스템</td>, <td>Millipore Sigma</td><td>SYNS0R0WW</td><td></td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>분자 등급 정제수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4387937</td><td>다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Mortars</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-150</td><td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19167032B</td><td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>VWR International LLC</td><td>BWK6212</td><td>다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PCR 플레이트 밀봉 필름</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9684493</td><td></td></tr><tr><td>PCR 스트립 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>유봉</td>, <td>VWR International LLC</td><td>89038-166</td><td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>플라스틱 주걱</td><td>LevGo, Inc.</td><td>17211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13000014</td><td></td></tr><tr><td>PNA - 엽록체 및 미토콘드리아</td><td>PNA Bio</td><td>NA</td><td>생물정보학</td></tr><tr><td>보호 안경</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z759015</td><td>다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광측정기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>고무 망치(옵션)</td><td>Ace 하드웨어</td><td>2258622</td><td>다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>가위 또는 가위</td><td>VWR International LLC</td><td>89259-936</td><td>다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Shovel</td><td>Home Depot</td><td>2597400</td><td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>토양 코어 수집기 (소경 : < 1 인치)</td> <td>Ben Meadows</td><td>221700</td><td>다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>스프레이 병</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-395278</td><td>다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>표준 탈염 바코드 프라이머(10 &micro; M) (표 1)</td><td>IDT</td><td>NA</td><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo, 표준 탈염. NGS 어댑터 및 염기서열분석 프라이머(표 1)는 v3 화학을 사용하여 Illumina MiSeq와 함께 사용하도록 설계되었습니다.</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E950040015</td><td>다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td>은 <td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>계량 보트</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>B6001W</td>는 <td>다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

루트 미생물 탐색: 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

공장 호스트와 관련 된 미생물의 친밀 한 상호작용 공장 피트 니스, 결정에 중요 한 이며 abiotic 스트레스와 질병을 향상 된 공차를 육성 하실 수 있습니다. 매우 복잡 한, 낮은-비용 식물 미생물 수, 16S rRNA 유전자의 amplicon 기반 시퀀싱 등 높은 처리량 방법의 미생물 조성과 다양성 특성화에 대 한 선호 많습니다. 그러나, 이러한 실험을 실시 하는 경우 적절 한 방법론의 선택이 어려운 분석 및 샘플 연구 사이의 비교를 만들 수 있는 편견을 감소 시키기를 위해 중요 합니다. 이 프로토콜 수집 및 토양, rhizosphere, 및 루트 샘플에서 DNA 추출에 대 한 표준화 된 방법론을 세부 사항에 설명합니다. 또한, 우리이 샘플에서 세균성 지역 사회 구성의 탐사를 허용 하는 기초가 튼튼한 16S rRNA amplicon 시퀀싱 파이프라인을 선택 하 고 다른 마커 유전자에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 파이프라인 식물 종, 사탕수수, 옥수수, 밀, 딸기, 그리고 용 설 란, 등의 다양 한 검증 되었습니다 그리고 식물 세포에서 오염과 관련 된 문제를 극복 하는 것을 도울 수 있다.

일치 하는 각 샘플을 다시 하 고 어느 박테리아에 할당 될 수 있는 인덱싱된 쌍 간 읽기의 데이터 집합에서 발생 해야 권장된 프로토콜을 수행 조작 상 분류학 단위 (OTU) 또는 정확한 시퀀스 변종 (ESV, amplicon 라고도 시퀀스 변종 (ASV) 및 sub-operational 분류학 단위 (sOTU)), 다운스트림 분석에 따라. 높은-품질 시퀀스 데이터를 얻으려면 해야 합니다 주의 샘플 간에 일관성을 유지 샘플 처리 또는 라이브러리 준비 하는 동안 어떤 잠재적인 편견의 도입을 최소화 하 고 각 단계에서. 수집, 처리, 및 (1 단계와 2 단계), 샘플에서 DNA를 추출 결과 eluate 표시 명확 하 고 증폭을 억제 하는 생명체의 무료 됩니다. Microvolume 분 광 광도 계를 통해 각 DNA 샘플을 측정 하 여 순도 확인할 수 있습니다, 하는 동안 우리 토양 DNA 추출 키트 안정적으로 모든 오염 물질을 제거 하는 것이 나타났습니다. 예측 가능한 DNA...

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

이 실험의 전반적인 목표는 16S 리보솜 RNA 유전자의 군집 프로파일링을 사용하여 뿌리 마이크로바이옴, 토양, 뿌리 줄기 및 뿌리 내구의 세 구획을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 미생물 생태계의 주요 동인인 생물 및 비생물적 요인과 같은 미생물 생태학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 뿌리와 뿌리 줄기의 분리에서 DNA 추출, 시퀀싱 라이브러리 준비에 이르기까지 각 단계를 표준화한다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 Coleman-Derr Laboratory의 대학원생인 Tuesday Simmons입니다. 프로토콜을 시작하려면 에탄올 멸균 토양 코어 수집기로 대량 토양 샘플을 수집하여 식물 뿌리가 없는 토양을 얻습니다. 식물 바닥에서 약 23-30cm 떨어진 곳에 코어를 모으십시오.다음으로, 흙을 비닐 봉지에 옮기고, 봉지를 부드럽게 흔들어 토양을 균질화하고, 토양 샘플의 600mg 부분 표본을 하나의 2 밀리리터 튜브에 옮기고, DNA가 추출 될 때까지 즉시 2 밀리리터 튜브를 드라이 아이스에 놓습니다. 뿌리와 뿌리 줄기를 수집하려면 에탄올 살균 삽을 사용하여 식물을 파내고 가능한 한 많은 뿌리를 얻도록주의하십시오. 뿌리 표면에 약 2mm의 흙이 붙을 때까지 뿌리에서 과도한 흙을 부드럽게 털어냅니다.큰 식물의 경우 멸균 가위를 사용하여 뿌리의 대표적인 부분을 자르고 최소 500mg의 뿌리 조직을 50ml 원뿔형 바이알에 넣습니다. 뿌리를 덮을 수 있을 만큼 충분한 착생식물 제거 완충액을 추가한 다음 즉시 샘플을 드라이아이스에 놓습니다. 뿌리 줄기를 뿌리에서 분리하려면 뿌리 샘플을 얼음 위에서 해동한 다음 뿌리 샘플을 초음파 처리합니다.멸균 집게를 사용하여 뿌리를 차갑고 깨끗한 50ml 튜브에 옮깁니다. 원래 튜브를 완충액과 흙과 함께 버리지 마십시오. 여기에는 근권 분획이 포함됩니다.다음으로, 완충액과 근권이 포함된 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅하고 뿌리 줄기 분획을 드라이 아이스에 넣습니다. 뿌리를 씻으려면 뿌리 분획에 섭씨 4도의 멸균수 약 20ml를 첨가하십시오.15-30초 동안 세게 흔들어 뿌리를 씻은 다음 물을 빼냅니다. 멸균 주걱을 사용하여 토양 추출을 위해 상용 DNA 분리 키트에 제공된 별도의 수집 튜브로 250mg의 토양과 뿌리구를 신속하게 옮긴 다음 키트 공급업체의 프로토콜에 따라 진행합니다. 용리 후 앰플리콘 라이브러리 준비를 진행할

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.

감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:

필드에서 식물 뿌리의 발굴 뿐만 아니라 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플의 처리는 DNA 추출 및 데이터 분석 방법 등 자세하게에서 설명 되어 있습니다. 이 문서는 토양, endosphere, rhizosphere microbiomes의 연구에 대 한 이러한 기법을 사용 하 여 다른 실험실을 사용 하도록 설계 되었습니다.

절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

시각화 및 루트 성장에서 제자리에 매우 도전 이다. 우리는 루트 개발 및 영양 농축에 대 한 응답에서 시간이 지남에 확산을 추적 하는 사용자 정의 rhizobox 방법을 제시. 이 메서드는 루트 소성 유기 질소 소스에 대 한 응답에서에 옥수수 genotypic 차이 분석 하는 데 사용 됩니다.

루트 성장 및 지역화 된 양분에 응답을 시각화 하는 최적화 된 Rhizobox 프로토콜

여기에서 우리는 종의 존재를 정량화하고 식물 뿌리의 초기 식민지 동안 다른 성장 환경으로의 전송 후 박테리아의 공간 분포를 시각화하는 수경 식물 성장 분석방법을 설명합니다.

부동 수경 시스템에서 애기장대 뿌리에 세균 식민지화 및 유지 보수 모니터링

네트워크 분석은 토양, 물 및 뿌리 부와 같은 다양한 생태 미생물 공동체의 연관성을 평가하기 위해 적용되었다. 여기에 제시된 WGCNA 알고리즘을 사용하여 다양한 생태 환경으로 인해 미생물 커뮤니티에서 발생할 수 있는 상이한 동발생 네트워크를 분석하는 방법에 대한 프로토콜이 제시된다.

가중 상관 관계 네트워크에 따라 다른 서식지에서 루트 미생물의 발산

퇴비 소우주는 자연에서 발견되는 미생물 다양성을 실험실로 가져와 Caenorhabditis elegans의 미생물 군집 연구를 용이하게합니다. 여기에는 소우주 실험을 설정하기위한 프로토콜이 제공되며, 실험은 환경 미생물 다양성과 벌레 장내 미생물 구성 간의 관계를 탐구하기 위해 환경 미생물 다양성을 조절하는 능력을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화

우리는 미생물이 있든 없든 계통발생학적으로 구별되는 다양한 식물의 성장을 지원하는 유리 기반의 반수경재배 실험 시스템에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 성장 배지와 호환되며 다운스트림 분석을 위한 비파괴 뿌리 삼출물 샘플링을 허용합니다.

Semihydroponic Root 삼출물 프로파일링을 위한 다용도 Glass Jar 시스템

이 프로토콜은 Populus trichocarpa의 껍질에 존재하는 내생식물 및 착생식물 박테리아 마이크로바이옴을 프로파일링하기 위한 샘플 수집에서 데이터 분석에 이르기까지 신뢰할 수 있고 효율적인 워크플로우를 제공합니다.

A workflow for the quantitative assessment of the endophytic and epiphytic bacterial microbiomes of the Bark of Populus trichocarpa(Populus trichocarpa 껍질의 내생식물 및 착생식물 세균 마이크로바이옴의 정량적 평가를 위한 워크플로우)

다양한 rhizosphere 토양에서 시너지 효과가 있는 다종 생물막 군집을 구축하기 위한 빠르고 표준화된 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 이는 복잡한 rhizosphere 토양 미생물군을 조사하고 시뮬레이션하도록 설계된 고유한 프로토콜입니다.

Rhizosphere 토양에서 Multispecies Biofilm Communities를 구축하는 접근 방식

여기에서는 플라스미드 접합에 관여하는 관심 유전자를 knockout하고 나중에 짝짓기 분석을 사용하여 그 부재의 영향을 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자의 기능은 결실 또는 점 돌연변이를 사용하여 염기서열의 특정 영역까지 더 탐구됩니다.

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

탐색하세요 토양, 뿌리주변대 및 뿌리내부 미생물 군집을 16S rRNA 유전자 프로파일링으로 분석하는 방법을 배우세요. 이 표준화된 프로토콜은 식물 관련 미생물 다양성 연구에 필수적입니다.

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