루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

이 실험의 전반적인 목표는 16S 리보솜 RNA 유전자의 군집 프로파일링을 사용하여 뿌리 마이크로바이옴, 토양, 뿌리 줄기 및 뿌리 내구의 세 구획을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 미생물 생태계의 주요 동인인 생물 및 비생물적 요인과 같은 미생물 생태학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 뿌리와 뿌리 줄기의 분리에서 DNA 추출, 시퀀싱 라이브러리 준비에 이르기까지 각 단계를 표준화한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Coleman-Derr Laboratory의 대학원생인 Tuesday Simmons입니다. 프로토콜을 시작하려면 에탄올 멸균 토양 코어 수집기로 대량 토양 샘플을 수집하여 식물 뿌리가 없는 토양을 얻습니다. 식물 바닥에서 약 23-30cm 떨어진 곳에 코어를 모으십시오.

다음으로, 흙을 비닐 봉지에 옮기고, 봉지를 부드럽게 흔들어 토양을 균질화하고, 토양 샘플의 600mg 부분 표본을 하나의 2 밀리리터 튜브에 옮기고, DNA가 추출 될 때까지 즉시 2 밀리리터 튜브를 드라이 아이스에 놓습니다. 뿌리와 뿌리 줄기를 수집하려면 에탄올 살균 삽을 사용하여 식물을 파내고 가능한 한 많은 뿌리를 얻도록주의하십시오. 뿌리 표면에 약 2mm의 흙이 붙을 때까지 뿌리에서 과도한 흙을 부드럽게 털어냅니다.

큰 식물의 경우 멸균 가위를 사용하여 뿌리의 대표적인 부분을 자르고 최소 500mg의 뿌리 조직을 50ml 원뿔형 바이알에 넣습니다. 뿌리를 덮을 수 있을 만큼 충분한 착생식물 제거 완충액을 추가한 다음 즉시 샘플을 드라이아이스에 놓습니다. 뿌리 줄기를 뿌리에서 분리하려면 뿌리 샘플을 얼음 위에서 해동한 다음 뿌리 샘플을 초음파 처리합니다.

멸균 집게를 사용하여 뿌리를 차갑고 깨끗한 50ml 튜브에 옮깁니다. 원래 튜브를 완충액과 흙과 함께 버리지 마십시오. 여기에는 근권 분획이 포함됩니다.

다음으로, 완충액과 근권이 포함된 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅하고 뿌리 줄기 분획을 드라이 아이스에 넣습니다. 뿌리를 씻으려면 뿌리 분획에 섭씨 4도의 멸균수 약 20ml를 첨가하십시오.

15-30초 동안 세게 흔들어 뿌리를 씻은 다음 물을 빼냅니다. 멸균 주걱을 사용하여 토양 추출을 위해 상용 DNA 분리 키트에 제공된 별도의 수집 튜브로 250mg의 토양과 뿌리구를 신속하게 옮긴 다음 키트 공급업체의 프로토콜에 따라 진행합니다. 용리 후 앰플리콘 라이브러리 준비를 진행할 준비가 될 때까지 DNA를 섭씨 영하 20도에서 보관한 다음 뿌리 샘플에서 DNA를 추출합니다.

멸균된 절구와 절굿공이를 액체 질소를 사용하여 식히십시오. 600-700밀리그램의 뿌리 조직을 측정하고 조직을 모르타르에 넣고 뿌리를 덮을 만큼 충분한 액체 질소를 조심스럽게 첨가합니다. 뿌리를 작은 조각으로 갈아냅니다.

뿌리가 미세한 가루가 될 때까지 액체 질소를 추가하고 최소 두 번 분쇄하는 과정을 계속하십시오.amples 간에 일관성을 유지하십시오. 뿌리 가루가 해동되기 시작하기 전에 빠르게 멸균 주걱을 사용하여 뿌리 가루를 얼음 위의 미리 계량된 1.5ml 튜브에 옮깁니다. 튜브와 분말의 무게를 기록하십시오.

멸균 주걱을 사용하여 토양에서 추출하도록 설계된 상용 DNA 분리 키트에 제공된 수집 튜브로 150mg의 뿌리 분말을 신속하게 옮긴 다음 키트 공급업체의 프로토콜에 따라 DNA 분리를 진행합니다. 각 DNA 샘플을 3회에 걸쳐 증폭할 수 있도록 충분한 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스를 멸균 25ml 멀티채널 피펫 저장조에 붓고 66마이크로리터의 마스터 믹스를 새로운 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분배합니다.

다음으로, 정규화된 DNA 플레이트에서 마이크로리터 DNA당 5나노그램의 6마이크로리터를 마스터 믹스 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 각 열에 다른 순방향 바코드가 있도록 마스터 플레이트에 1.5마이크로리터의 10마이크로몰 전방 프라이머를 추가하고 각 열에 다른 역 바코드가 있도록 1.5마이크로리터의 10마이크로몰 역방향 프라이머를 추가합니다. 필름으로 플레이트를 덮고 3, 000 RCF에서 플레이트를 잠시 회전시킵니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 내용물을 부드럽게 혼합한 다음 25마이크로리터의 반응 혼합물이 있는 3개의 플레이트로 나누고 PCR 필름으로 플레이트를 덮습니다. thermocycler를 사용하여 각 플레이트의 DNA를 증폭합니다. 증폭 후 3개의 복제 플레이트를 단일 96웰 플레이트에 풀링합니다.

컴퓨터 스프레드시트를 사용하여 각 샘플의 100나노그램 부피와 모든 샘플의 평균 부피를 계산합니다. 각 blank PCR 산물에 대해 계산된 평균 부피를 단일 1.5ml 튜브에 추가합니다. 성공적으로 증폭된 샘플의 경우, 각 샘플의 100나노그램을 동일한 튜브에 풀링한 다음 벤치탑 형광계를 사용하여 풀링된 산물의 농도를 측정하고, 600나노그램의 DNA를 분자 등급의 물에 넣어 1.5밀리리터 튜브에서 100마이크로리터의 최종 부피로 용리시킵니다.

풀링된 나머지 제품은 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 600나노그램 DNA 분취액을 정제하기 전에 600마이크로리터의 신선한 70% 에탄올을 준비합니다. 상자성 비드를 사용하여 확립된 PCR 정제 과정을 따릅니다.

마그네틱 비드 튜브를 흔들어 바닥에 가라앉은 비드를 다시 매달아 놓습니다. 1배의 부피(100마이크로리터)의 비드 용액을 600나노그램의 DNA 분취액에 추가합니다. 용액과 비드를 10회 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.

철저히 혼합한 후 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 2분 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 용액에서 비드를 분리합니다. 튜브를 스탠드에 보관하고 마그네틱 비드를 건드리지 않도록 투명 상층액을 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오.

튜브를 스탠드에 그대로 두고 튜브에 70% 에탄올 300마이크로리터를 첨가하고 비드를 실온에서 30초 동안 배양합니다. 에탄올을 흡입하여 버리십시오. 이 과정을 반복하고 두 번째 세척 후 모든 에탄올을 제거하십시오.

마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 내용물을 5분 동안 자연 건조합니다. 건조된 비드에 30마이크로리터의 분자 등급 물을 넣고 10회 피펫팅하여 혼합합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다.

튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 다시 넣어 용액에서 비드를 분리합니다. 용리액을 새 튜브로 옮깁니다. 탁상용 형광계를 사용하여 세척되고 풀링된 DNA의 최종 농도를 측정합니다.

분취액을 30마이크로리터의 최종 부피에서 10나노몰로 희석하거나 염기서열분석 시설에서 선호하는 농도 및 부피로 희석합니다. 증폭 단계에 이어, 각 샘플의 박테리아 군집 구성을 결정하기 위해 염기서열분석을 수행했습니다. 조사된 식물 숙주에 대한 각 엽록체 및 미토콘드리아 16S 리보솜 RNA 유전자에 대한 PNA 염기서열의 정렬은 어떠한 불일치도 나타내지 않아야 합니다.

13 염기쌍 PNA 서열에 대한 단일 불일치는 제공된 엽록체 PNA 서열 및 Lactuca sativa 또는 양상추의 엽록체 16S 리보솜 RNA 유전자의 경우와 같이 효과를 크게 감소시킬 수 있습니다. 샘플당 동일한 양의 증폭된 DNA가 풀링되었기 때문에 염기서열분석 후 샘플당 박테리아 분류군과 일치하는 짝수 개의 판독을 얻어 바코드 인덱스를 기준으로 정렬했습니다. 이 기술을 완전히 익히면 약 8시간 안에 8개의 식물을 만들 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 실험 간에 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. DNA 추출 방법 및 PCR 마스터 믹스의 변경과 같은 작은 세부 사항으로 인해 바이어스가 발생할 수 있습니다. 이 절차에 따라 메타전사체학(metatranscriptomics)과 같은 다른 방법을 사용하여 어떤 미생물이 활동적인지, 어떤 유전자를 발현하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

액체 질소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 PPE 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.