Name: C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 배우세요 C2C12 근관세포를 이용한 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 분석법입니다. 분광광도계 실시간 측정으로 세포 산화환원 균형 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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우리는 그들의 기술 지원에 대 한 토마스 벨, 린 Mattathil, 마크 Mannino, 및 Neej 파 텔에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 조나단 피셔 국립 연구소의 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 (NIDDK)에서 미국 공중 보건 봉사 상 R15DK102122에 의해 지원 되었다. 원고 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시는 NIDDK 또는 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

참고:에 대 한 주요 단계 도식 개요 그림 1 을 참조 하십시오.
1. 서 부 표준시-1 감소 분석 결과
<ol><li>성장 하 고 96 잘 접시 행 A-f.를 활용 하 여 표준 셀 문화 절차7 을 사용 하 여 C2C12 부착 세포 분화<ol>
<li>구성 된 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 2% 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린과 0.1 mg/mL 스 보충 차별화 매체를 사용 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
		<li>TPMET에서 하는데 참여 모니터링, 100 µ M ascorbic 산 차별화 미디어 보충. 셀 ~ 24-48 대 한 차별화 미디어에는 알을 품을 수 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>재고 서 부 표준시-1 및 PMS 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>서 부 표준시-1의 10 밀리미터 주식을 하려면 분해 서 부 표준시-1의 0.033 g (수식 무게 (FW): 651.34 g/mol) 5 ml의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 4 ° c.에 게</li>
		<li>PMS의 5 밀리미터 주식을 하려면 0.0023 g PMS의 분해 (FW: 306.34 g/mol) 이온된 H2O의 1.5 ml (diH2O). -20 ° C에서 저장 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>11.4 ml PBS 또는 HEPES 5mm의 최종 농도 식 염 수 버퍼 0.0108 g 포도 당의 추가 (HBS; 20 mM HEPES 나트륨 소금, 140 m NaCl, KCl, 2.5 m m MgSO4, 5mm 1 m CaCl2m m). 10 m m 400 µ M의 최종 농도를 48 µ L 5mm 20 µ M의 최종 농도 대 한 PMS의 서 부 표준시-1의 480 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>TPMET에서 하는데 참여, 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수에 diH2O 6 µ L을 추가 하 고 다른 약 수 2 구/mL AO 2 U/mL의 최종 농도 6 µ L 추가 합니다.</li>
	<li>TPMET에 superoxide 참여 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수를 0.1 M KPO4 버퍼의 55 µ L을 추가 하 고 다른 약 수를 60 U/mL의 최종 농도 대 한 6.5 구/mL 잔디의 55 µ L을 추가 합니다.</li>
	<li>PBS로 세포 세척. 미디어를 발음 하 고 150 µ L PBS를 추가 합니다. 다음에 PBS 발음. 참고: 분석 결과 도금, 연결 된 셀과 함께 이루어집니다. 따라서, 원심 분리 또는 세척 과정에서 trypsin의 사용 이다.</li>
	<li>서 부 표준시-1 솔루션 (-)의 100 µ L를 추가 잔디 또는 (-) 아오 열 1-6를 100 µ L의 서 부 표준시-1 솔루션 (+) 잔디 또는 (+) 아오 열 7-12 96 잘 접시에 추가. 배경 컨트롤 행 G와 H를 사용 하 여 (즉, 변화를 모니터링 하는 데 셀 없이 웰 스에서 혼자 시 흡 광도에).</li>
	<li>438에서 1 시간 마다 10 분 분 광 광도 계를 사용 하 여 흡 광도 값 nm.</li>
	<li>읽기 후에, 미디어를 발음 하 고 각각을 씻어 PBS의 150 µ L로 잘. 다음에 PBS 발음.</li>
	<li>그 잘 시간 언제 든 지 흡 광도에서 잘에 대 한 초기 흡 광도 빼서 각 잘 흡 광도 변화를 계산 합니다. 흡 광도 (있을 경우) 배경 웰 스 (즉, 분석 결과 솔루션 우물만 셀)에서 관찰 된 변화에 대 한이 변경 수정.</li>
	<li>분석을 위해 60 분 제어 측정에 흡 광도 데이터 정상화 또는 PBS와 HBS 웰 스를 세척 하 고 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석을 수행.</li>
	<li>2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 기준 추가 (0.5-2에서 셀의 합류의 정도 따라 표준 곡선 µ L) 빈 우물 (행 G 및 H), 다음 추가 BCA 시 모든 우물에.</li>
	<li>단백질의 µ g 당 서 부 표준시-1 감소의 nmol 통해 데이터를 계량. 멸종 계수로 37 m m-1 c m-1 22 를 사용 하 여 감소 된 서 부 표준시-438에서 1 nm.</li>
</ol>2. DPIP 감소 분석 결과
<ol><li>성장 하 고 C2C12 단계 1.1 동일한 절차와 부착 세포를 차별화 합니다.</li>
	<li>다음과 같이 재고 10 m m DPIP 솔루션을 준비 합니다. 분해 DPIP의 0.029 g (FW: 290.08 g/mol) diH2O. 확인 600에서 흡 광도 측정 하 여 DPIP의 농도의 10 mL에 nm는 분 광 광도 계. 소 광 계수로 1 m m-1 c m-1 23 을 사용 하 여 감소 DPIP 600에 대 한 nm. 4 ° c.에 게</li>
	<li>5mm의 최종 농도 대 한 PBS의 11.880 ml 0.0108 g의 포도 당을 추가 합니다. 100 µ M의 최종 농도 대 한 10 m m DPIP의 120 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>TPMET에서 하는데 참여, 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수에 diH2O 6 µ L을 추가 하 고 다른 약 수 2 구/mL AO 2 U/mL의 최종 농도 6 µ L 추가 합니다.</li>
	<li>TPMET에 superoxide 참여 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수를 0.1 M KPO4 버퍼의 55 µ L을 추가 하 고 다른 약 수를 60 U/mL의 최종 농도 대 한 6.5 구/mL 잔디의 55 µ L을 추가 합니다.</li>
	<li>미디어를 발음 하 고 PBS의 150 µ L에서 세포를 씻어. PBS를 발음 하 고 100 µ L DPIP 솔루션 (-)의 추가 잔디 또는 (-) 아오 열 1-6를 100 µ L DPIP 솔루션 (+) 잔디의 또는 (+) 아오 열 7-12 96 잘 접시에 추가. 배경 컨트롤 행 G와 H 사용 (즉, 변화를 모니터링 하는 데 셀 없이 웰 스에서 혼자 시 흡 광도에).</li>
	<li>사용 하 여 600 nm에서 흡 광도 측정 분 광 광도 계 10 분 마다 1 헤에 대 한 계량 60 분 단계 1.9 1.13 비슷한 컨트롤에 상대적인 흡 광도 있는 변화.</li>
</ol>3. 결정 여부 감소 전자 수락자는 AO 또는 잔디에 대 한 기판의
<ol><li>PBS의 HBS 5.436 ml, 10 m m 400 µ M의 최종 농도 5mm 20 µ M의 최종 농도 대 한 PMS의 24 µ L에 대 한 서 부 표준시-1 240 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>DPIP, PBS의 HBS 5.940 mL를 100 µ M의 최종 농도 10 m m, DPIP의 60 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 셀의 부재에서 평면 아래 96 잘 접시에 잘 438에서 분 광 광도 계에서 흡 광도 측정 하는 솔루션의 100 µ L를 추가 nm, DPIP에 대 한 서 부 표준시-1, 또는 600 nm에 대 한.</li>
	<li>100 μ M의 최종 농도 대 한 웰 스의 절반의 10mm 하는데 1 µ L를 추가 합니다. 안정화 될 때까지 흡수도 모니터링 합니다.</li>
	<li>안정화, 시 각 음을 2 U/mL의 최종 농도 대 한 200 U/mL AO의 1 µ L를 추가 하거나 각 60 U/mL의 최종 농도 잘 하 고 1 시간에 대 한 흡 광도 모니터 6 구/mL 잔디의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 세포 외 전자 수락자, DPIP, 및 서 부 표준시-1 tPMET C2C12 myotubes에서 모니터링 하는 spectrophotometric 분석 실험에 활용 하는 두 가지 방법 제시. 표준 문화 절차에 셀 라인의 성장과 플레이트 리더를 분 광 광도 계 분석 결과 간단한 microplate에에서 이러한 전자 수락자와 tPMET 모니터링 가능 하다. 서 부 표준시-1 감소는 잘-투-잘 분석 결과, 내에서 재현할 수 이지만 일상적인 변화. PBS는 버퍼를 활용 하 여 편차 (CV)의 일상적인 계수는 0.18 및 버퍼는 0.23 HBS를 활용 하 여 이력서.
이전 문학 Mpm과 서 부 표준시-1을 활용 하 여에서 우리는 수정이 프로토콜 특히, PMS의 사용에 대 한. 따라서, PMS의 적절 한 농도 결정 하는 포함 된 문제 해결 및 설명 하는 서 부 표준시-1는 myotubes와 함께 사용 하기 위해. 우리 또한 (23-37 ° C의 범위)에 있는 온도 결정 하지는 분석 결...

전자 수락자를 줄이기 위해 순화 된 플라즈마 막 수 플라즈마 멤브레인 고유의 redox 용량1는 보기를 주도하 고 있다. 이전에 곰 팡이, 식물, 그리고 동물에서 본, tPMET는 여러 생물2,3,,45에 공통 프로세스입니다. 특히,이 과정은 Saccharomyces cerevisiae, 당근 세포, 적혈구, 림프 톨, 다리, 흑색 종, 대 식 세포, 골격 근육, 및 호 중구2,3, 에서 입증 되었습니다. 4 , 5 , 6 , 7. extracellular oxidants를 줄이기 위해 플라즈마 막에 걸쳐 전자를 수송 하는 과정에서 tPMET는 포함 하는 많은 세포 기능에 관여: 세포 성장5,8, 세포 생존 능력9, 철 대사10,11,,1213, 반응성 산소 종12,,1415보호를 신호 하는 세포입니다. 많은 세포질 기능에 tPMET의 개입으로 인해 tPMET의 불균형은 암16,17, 심혈 관 질환 포함 한 몇 가지 심각한 건강 상태의 발전에 기여할 가설 되었습니다 및 대사 증후군18.
원형질 막의 전자 전송을 모니터링 하는 여러 가지 하지만 가장 널리 사용 되는 기술 색도계 분석 실험을 통해 세포 외 전자 수락자의 감소를 평가 하는 것입니다. 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자 tetrazolium 소금, DPIP, FeCN, 그리고 ferricytochrome c19,20있습니다. 가장 일반적으로 사용 되는 tetrazolium 소금은 2 세대 소금 알려진 서 부 표준시-119. 이 화합물은 1 세대 tetrazolium 소금 두 된 그룹,21의 물 가용성 증가 하는 때문에 비해 색도계 분석 실험에 활용 하기가 쉽습니다. 중간 전자 수락자 1-methoxy-phenazine methosulfate (Mpm)와 함께에서 서 부 표준시-1, 2 단 전자 전송 이벤트에서 감소 된다. 이 감소는 더 강렬한, 노란색 formazan20,22에 약하게 색 산화 형태의 서 부 표준시-1을 변경합니다. 서 부 표준시-1 높은 분석 결과 감도21,22로 이어지는 37 x 103 M-1c m-1의 높은 어 금 니 소 광 계수가 있다. DPIP는 또한 tPMET를 모니터링 하는 extracellular 전자 수락자로 이용 된다. 그것은 그 DPIP 감소 될 수 있다 extracellularly 중간 전자 수락자23,24의 도움 없이 tPMET에 의해 표시 되었습니다. 중간 전자 수락자의 부족, DPIP 픽업 전자를 서 부 표준시-124달리 플라즈마 막에서 직접 수 있습니다. DPIP와 마찬가지로 FeCN 줄어들 extracellularly ferrocyanide 중간 전자 수락자19,24의 도움 없이 tPMET에 의해에 표시 되었습니다. 서 부 표준시-1, DPIP와 달리 FeCN 낮은 분석 결과 감도9로 이어지는 낮은 어 금 니 소멸 계수가 있다. TPMET 모니터를 또 다른 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자는 ferricytochrome c. 서 부 표준시-1, ferricytochrome c 감소 증가 중간 전자 수락자, Mpm22의 사용과 비슷합니다. 서 부 표준시-1과는 달리, ferricytochrome c 방법은 높은 배경 및 낮은 분자량 소멸 계수22덜 민감한.
여기 우리 spectrophotometric 분석 실험을 통해 tPMET의 실시간 분석을 위한 방법 제시. 메서드 활용 서 부 표준시-1 및 DPIP, extracellular 전자 수락자로 그들은 둘 다 높은 어 금 니 소멸 계수 되 고 일반적으로 다른에 비해 덜 비싼 사용 ferricytochrome c 등 세포 외 전자 수락자. 우리는 phenazine methosulfate (PMS) 활용 Mpm 대신 그들은 유사한 화학 메이크업 및 PMS 있다 훨씬 덜 비싼. Mpm은 photochemically 안정 긴 수명이 필요로 하는 상용 키트에 대 한 중요 한 특성입니다. 그러나, 우리가 있도록 PMS 신선한 각 분석 결과 대 한 안정성 문제 해서는 안됩니다. 우리는 또한 가능한 효소 사이 상호 작용 ( 그림 1참조) extracellular 전자 수락자와 더 tPMET의 과정을 특성화 하기 위해 활용 될 수 있습니다 효소를 평가 하는 방법을 제시. 특히, 효소 AO와 잔디를 사용할 수 있습니다 어떤의 tPMET 부분은 하는데 전송 또는 extracellular superoxide 릴리스, 원형질 막에 걸쳐 수송 될 전자에 대 한 두 가지 일반적인 방법 결정 합니다.

<table><tbody><tr><td>C2C12 근아세포</td><td>미국식 문화 컬렉션&nbsp;</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형된 독수리의 매체 - 저포도</td>당 <td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Plex 동물 세럼 복합체</td><td>Gemini Bio-Products&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>말 혈청</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>시그마</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>시그마</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>15cm 배양 접시</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 배양 플레이트</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸륨 나트륨 염 (WST-1)</td><td>Accela ChemBio&nbsp; Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>페나진 메토설페이트&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르빈산</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산 산화효소&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼옥사이드 디스뮤타제&nbsp;</td><td>시그마</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>2,6-디클로로인도페놀 나트륨 염&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 나트륨 염</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>시그마</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드 디하이드레이트</td><td>시그마</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>인산칼</td>륨 <td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Powerwave X-I 분광광도계</td><td>Biotek Insturments</td><td>단종&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5 분광광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>336001</td><td></td></tr><tr><td>PureGrade 96웰 마이크로플레이트, F-bottom, 투명, 처리되지 않은, 비멸균</td><td>MidSci</td><td>781602</td><td></td></tr><tr><td>사수철(II) 염화물 사수화물</td><td>시그마</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>철(II) 황산염 헵타하이드레이트</td><td>시그마</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>하이포잔틴</td><td>시그마</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>xanthine oxidase</td><td>Sigma</td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td></tr> <tr><td>KC4</td><td>Biotek Insturments</td><td>단종&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

c2c12 myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans 플라스마 막 전자 전송 (tPMET) extracellular oxidants에 의해 세포내 감소 스트레스 로부터 세포의 보호 뿐만 아니라 손상 으로부터 보호 역할을 하고있다. Extracellular oxidants 세포내 reductants에서 전자 수송의이 과정은 잘 정의 된. 여기 우리 C2C12 myotubes tPMET 세포 외 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 여 spectrophotometric 분석 실험을 제시: 수용 성 tetrazolium 소금-1 (서 부 표준시-1)과 2, 6-dichlorophenolindophenol DPIP (DCIP). 이러한 전자 수락자의 감소, 통해 우리는 실시간 분석에이 과정을 모니터 할 수 있습니다. 효소 superoxide dismutase (SOD)는 분석 실험을 하는데 산화 효소 (AO) 등의 추가 함께 우리 tPMET의 부분 각각 하는데 수출 또는 초과 생산 때문입니다 확인할 수 있습니다. 서 부 표준시-1 낮은 배경 가진 안정적인 결과를 표시 했다, 그러나 DPIP AO와 spectrophotometric 분석 시연 했다 잔디의 추가 후 다시 산화 될 수 있었다. 이 메서드는 실시간, 빠른 멀티 잘 spectrophotometric 분석 결과 tPMET, ferricyanide (FeCN) ferricytochrome c 감소 등을 모니터링 하는 데 사용 하는 다른 방법을 통해 장점 보여 줍니다.

통계는 RStudio 통계 소프트웨어25를 사용 하 여 반복된 측정 ANOVA와 수행 했다. 샘플 크기는 그림 범례에 표시 됩니다.
모니터 tPMET, C2C12 myotubes extracellular 전자 수락자, 서 부 표준시-1 및 DPIP 함께 활용 했다. AO는 서 부 표준시-1의 부분을 결정 하는 데 사용 되었다, DPIP 감소 하는데 경과 예정 이었습니다 그리고 잔디 extracellular superoxide 출시로 인해 서 부 표준시-1 감소의 부분을 결정 하 사용 되었다. 그림 2에서 같이, C2C12 myotubes tPMET 서 부 표준시-1의 감소에 의해 볼 수 있다. AO의 추가 함께 서 부 표준시-1 감소 하는데 (<strong class=...

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

이 절차의 전반적인 목표는 분광광도계 분석을 통해 실시간으로 트랜스 플라즈마 멤브레인 전자 수송 과정을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 트랜스 플라즈마 막 전자 수송의 메커니즘과 세포의 산화 환원 환경이 어떻게 유지되는지에 관한 radox 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분석이 실시간, 다중 웰, 빠른 분광 광도계 분석이라는 것입니다.먼저 C2C-12 부착 셀을 96 웰 플레이트의 A부터 F열까지 평방 센티미터당 4번째 셀의 두 배에 앉힌 다음 성장 배지로 세포를 덮습니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다. 배양에서 24시간 후, 성장 배지를 흡인하고, 150마이크로리터의 PBS로 세척하고, 분화 배지로 교체하고, 추가로 24-48시간 동안 세포를 배양합니다.다음으로 재고 WST-1 및 PMS 솔루션을 준비합니다. 033g의 WST-1을 5ml의 PBS에 용해시켜 WST-1의 10밀리몰 스톡 용액을 만듭니다. 그런 다음 솔루션을 소용돌이치십시오.그런 다음 0023g의 PMS를 이온수 1.5ml에 용해시켜 PMS의 원액을 준비합니다. Vortex가 해결책입니다. 작업 용액을 준비하려면 PBS에 포도당을 첨가하여 11.4ml의 5밀리몰 포도당 용액을 만듭니다.이 용액에 400마이크로몰의 최종 농도를 위해 480마이크로리터의 WST-1 원액을 추가하고 20마이크로몰 PMS의 최종 농도를 위해 48마이크로리터의 PMS 원액을 추가합니다. Vortex는 혼합할 솔루션을 제공합니다. 그런 다음 용액을 6ml 분취량 2개로 나눕니다.분석에 따라 여기에 설명된 관련 성분을 추가합니다. 이제 용액이 준비되면 세포의 분화 배지를 흡인하고 150마이크로리터의 PBS로 한 번 세척합니다. PBS를 제거하고 부분 표본 1에서 1열까지 100마이크로리터를 1열에서 6열까지 추가합니다.그리고 부분 표본 2에서 96웰 플레이트의 7열에서 12열까지 100마이크로리터를 추가합니다. 96웰 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 438나노미터에서 1시간 동안 10분마다 흡광도 값을 측정합니다. 최종 판독 후 매체를 흡인하고 150마이크로리터의 PBS로 각 웰을 세척합니다.그런 다음 PBS를 흡인합니다. 분석을 위해 동일한 우물에 대한 이후 시점의 흡광도에서 우물에 대한 초기 흡광도를 빼서 각 우물에 대한 흡광도의 변화를 계산합니다. 배경 웰에서 관찰되는 흡광도의 변화를 기반으로 이 변경 사항을 수정합니다.배경 조사가 완료되면 흡광도 데이터를 60분 제어 측정값으로 정규화합니다. 또는 표준 BCA 단백질 분석을 사용하여 각 웰의 단백질 함량으로 정규화합니다. 마지막으로, 데이터를 정량화하여 단백질 마이크로그램 단위의 WST-1 감소량을 구합니다.DPIP 감소 분석을 시작하려면 WST-1 감소 분석에서 볼 수 있듯이 C2C-12 준수 세포를 성장시키고 분화합니다. 다음으로, 029g의 DPIP를 10ml의 이온수에 용해시켜 10밀리몰 DPIP를 포함하는 원액을 준비합니다. 그런 다음 솔루션을 소용돌이치십시오.분광 광도계를 사용하여 600나노미터에서 용액의 흡광도를 측정하여 농도를 확인합니다. 작업 용액을 만들려면 120마이크로리터의 10밀리몰 DPIP 원액을 11.88밀리리터의 포도당과 PBS가 함유된 5밀리몰 용액에 추가하여 100마이크로몰의 최종 DPIP 작업 농도를 얻습니다. 그런 다음 솔루션을 소용돌이치십시오.그런 다음 용액을 6ml 분취량 2개로 나눕니다. 분석에 따라 여기에 설명된 관련 성분을 추가합니다. 이제 용액이 준비되면 세포의 분화 배지를 흡인하고 150마이크로리터의 PBS로 한 번 세척합니다.PBS를 제거하고 부분 표본 1에서 1열부터 6열까지 100마이크로리터를 추가하고, 부분 표본 2에서 96웰 플레이트의 7열에서 12열까지 100마이크로리터를 추가합니다. 96웰 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 600나노미터에서 1시간 동안 10분마다 흡광도 값을 측정하고 WST-1 환원 분석 분석에 설명된 대로 결과 값을 분석합니다. 시작하려면 두 가지 솔루션을 준비합니다.먼저 PBS에서 6밀리리터의 400마이크로몰 WST-1 및 20마이크로몰 PMS를 준비합니다. 그런 다음 DPIP 및 PBS의 100마이크로몰 용액 6ml를 준비합니다. 세포가 없는 경우 평평한 바닥 플레이트의 A-D열에 100마이크로리터의 WST-1/PMS 용액을 추가하여 처음 96웰 플레이트를 준비하고 438나노미터의 분광 광도계에서 흡광도를 측정합니다.그런 다음 세포가 없는 경우 평평한 바닥 플레이트의 A-D열에 100마이크로리터의 DPIP 용액을 추가하여 두 번째 96웰 플레이트를 준비하고 600나노미터에서 분광 광도계의 흡광도를 측정합니다. 다음으로, 100마이크로몰의 최종 농도를 위해 100마이크로몰의 웰 절반에 1마이크로리터의 아스코르브산염을 추가합니다. 플레이트가 안정화될 때까지 플레이트의 흡광도를 모니터링합니다.그런 다음 DPIP로 반복합니다. 안정화 시 생성된 전자 수용체가 기질인지 여부를 결정합니다. 슈퍼 옥사이드 디스돌연변이트에 대한 아스코르브산 산화효소의 경우, 아스코르브산 산화효소 또는 슈퍼 산화물 디스돌연변이화물을 각 웰에 추가하고 1시간 동안 흡광도 변화를 모니터링합니다.트랜스플라즈마 막 전자 수송을 모니터링하기 위해 아스코르브산 매개물 환원의 효과를 차단하기 위해 아스코르브산 산화효소를 사용하였고, 과산화물 디스뮤타제를 사용하여 과산화물 매개 환원을 차단하여 WST-1 환원의 어느 부분이 각 성분에 기인하는지 확인했습니다. 아스코르브산 산화효소의 첨가로 WST-1 감소가 약 30% 억제되었는데, 이는 트랜스플라즈마 막 전자 수송의 약 30%가 아스코르브산염의 수출에 기인함을 나타냅니다. 과산화물 디스뮤타제의 첨가로 WST-1 감소는 약 70% 억제되었으며, 이는 트랜스플라즈마 막 전자 수송의 약 70%가 세포 외 과산화물 방출로 인한 것임을 나타냅니다.감소된 DPIP가 아스코르브산 산화효소 또는 슈퍼 산화물 디스뮤타제의 기질인지 확인하기 위해 아스코르브산으로 DPIP 수준을 감소시켰습니다. 20분 후, 아스코르브산 산화효소를 첨가하고 흡광도를 모니터링했습니다. 회수 결과는 감소된 DPIP가 아스코르브산 산화효소의 기질임을 보여줍니다.슈퍼 산화물 디스뮤타아제가 추가되었을 때, DPIP도 비록 더 느린 속도이기는 하지만 재산화되었습니다. 따라서 감소된 DPIP는 이러한 효소의 기질이며 이러한 효소와 함께 활용될 수 있는 적절한 세포외 전자 수용체가 아닙니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 시약을 매일 신선하게 만들어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.개발 후 이 기술은 산화 환원 생물학 분야의 연구자들이 다양한 세포 유형에서 형질강 관통 막 전자 수송을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포외 전자 수용체를 사용하여 형질횡질막 전자 수송을 측정하는 방법과 전자 수용체가 분석에 사용되는 효소의 기질일 수 있는지 확인하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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