Name: 신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 학습하세요 척추 후근신경절(DRG) 원발 배양법으로 신경전달물질 방출을 연구하는 방법입니다. 쥐의 요추 DRG에서 감각 신경원을 분리 배양하여 NPFFR2 자극에 따른 생리학적 반응을 분석할 수 있습니다.

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우리는 영어 편집 박사 M. Calkins 감사합니다. 이 작품은 장 궁 기념 병원 (CMRPD1F0482), 장 공 대학, 정상 노화 연구 센터 (EMRPD1G0171) 사역의 과학 및 기술 (105-2320-B-182-012-MY2)에 의해 지원 되었다.

실험 동물을 사용 하는 여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 장 공 대학 (13-014 곳)에 의해 승인 되었다.
1. 실험 쥐에서 요 추 DRG 수집
<ol><li>요 추 DRG 컬렉션에 대 한 3 주 된 Sprague-Dawley (SD) 쥐에 2를 사용 합니다. 참고: DRG 뉴런 쥐에서 4 주 이상 수집 여기에 설명 된 문화 조건 하에서 잘 성장 하지 않습니다.</li>
	<li>압력솥에 모든 수술 기구를 소독.</li>
	<li>Tiletamine 및 zolazepam (20 mg/kg, 복 주입 (IP))의 1:1 혼합물으로 쥐를 anesthetize 하 고 동물 발가락 꼬 집 음 시험에서는 발 철수 응답 될 때까지 기다립니다. 참고: 다른 마 취 전략이이 프로토콜에 성공적으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>상업적인 단두대로 잘린 여 쥐를 희생.</li>
	<li>단두대를 사용 하 여 격리 forelimb와 대 퇴 골 사이 쥐의 몸 트렁크. 수집 지역의 다이어그램 그림 1A 를 참조 하십시오. 참고: 꼬리 커트 라인 대 퇴 골에 그냥 rostral 이어야 한다. 요 추 L6 DRG 컷된 사이트는 척추에서 너무 높은 경우 excised 될 것입니다.</li>
	<li>흉 골을 따라 고 해 부가 위 (그림 2A-) 모든 장기/조직 제거.</li>
	<li>쥐의 등 쪽 부분을 수집 하 고 피부를 제거 하는 트렁크의 측면을 따라 자릅니다. 해 부 등 트렁크의 사진 그림 1B 를 참조 하십시오.</li>
	<li>DRG를 수집 하기 전에 얼음에 티슈를 준비 합니다. 모피와 장갑, 혈액을 청소 하 고 단계로 진행 하기 전에 75% 에탄올으로 소독.</li>
	<li>요 추 척추를 취재 하는 근육을 제거 합니다. 첫째, 척추 (왼쪽과 오른쪽)의 측면을 따라 두 개의 상처와 한 측면 허리 척추의 rostral 범위를 표시 하 게. 그런 다음, 뼈 절단 겸 자 (그림 2A-b)와 척추의 등 쪽 근육을 제거 합니다.</li>
	<li>뼈 절단 집게와 척추의 등 쪽 부분을 제거 하 고 척수를 노출.</li>
	<li>해 부가 위 (그림 2A-c) 및 집게 (그림 2A-d) 척수를 제거 합니다.</li>
	<li>마지막 갈비뼈 (흉부 척추 13)에서 척추를 계산 하 여 요 추 DRG를 식별 합니다. 그림 1C 척추 위치의 다이어그램을 참조 하십시오.</li>
	<li>2 mL 차가운 혈 청 무료 매체와 35 m m 문화 접시에 양측 허리 DRG (L1-L6) 마이크로-가 위 (그림 2A-f)를 수집 합니다. 신경 섬유 (같이 그림 1C) DRG, 연결에서 다음 문화의 순도 향상 시키기 위해 문화 접시에 그것을 전송. 참고: 수집된 DRG 1 시간 약에 대 한 얼음에 매체에 보관 수 있습니다. 한편, 여러 쥐 DRG의 더 큰 수영장을 만들려면 안락사 될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 기본 문화 쥐 목재 DRG의
참고: 다음 단계는 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 mM 나트륨 pyruvate 그리고 1에서 1 x 페니실린/스 문화 매체를 준비 DMEM F12 x.</li>
	<li>외 투 세포 배양 24-잘 접시 200 µ g/mL 폴 리-L-리 신 2 h에 대 한 다음 멸 균된 물으로 세척 처리.</li>
	<li>전 적어도 30 분 동안 사용 하기 전에 37 ° C CO2 배양 기에서 1 mL 문화 매체와 문화 접시를 품 어.</li>
	<li>층 류 후드에 DRG 포함 35 m m 접시를 전송 하 고 피 펫에 의해 혈 청 무료 매체와 DRG 3 번 씻어. 참고: 접시의 외부 청소 되어야 한다 75% 에탄올과 후드로 전송 하기 전에. 35 mm 접시 DRG (이 실험 디자인의 요구에 따라 달라 집니다) 쥐의 숫자에서를 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>이동은 DRG (단일 쥐에서 여러 쥐에서 결합 또는) 새로운 35mm 문화 요리를 멸 균 핀셋 (그림 2A-e)와 콜라 유형 IA의 2 mL (1 mg/mL 혈 청 자유로운 매체에) 포함. 참고: 콜라 솔루션은 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 그것을 전달 하 여 살 균 되어야 한다.</li>
	<li>30 분 동안 37 ° C CO2 배양 기에서 콜라 솔루션에서 DRG 다이제스트.</li>
	<li>콜라 솔루션을 제거 하 고 세척 2 ml 행 크의 DRG 3 번 균형 소금물 (HBSS). 참고: 있을 수 있습니다 잔여 섬유 또는 솔루션으로는 DRG 내려와 조직. 피 펫 세척 솔루션으로 그들을 제거 합니다.</li>
	<li>2 mL 중 DRG 포함 35 mm 접시 및 다이제스트 30 분 동안 37 ° C CO2 배양 기에서 DRG로 0.05% 트립 신-EDTA를 예 열을 추가 합니다.</li>
	<li>DRG 포함 된 솔루션의 2 개 mL를 이동 15 mL 원심 분리기 튜브 유리 피 펫에 의해. 참고:는 DRG 수에 충실 유리 피펫은 그래서 주의이 단계를 수행 해야 합니다. 유리 피 펫 (약 0.5 mL)의 테이퍼 끝에서 DRG 포함 된 솔루션을 유지 하 고 천천히 솔루션 원심 분리기 관으로 전송 하지 않고 일시 중지 DRG 손실을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>290 x g 4 ° c.에서 5 분에 솔루션을 원심 제거는 상쾌한 고 다른 2 mL 혈 청 무료 매체는 DRG resuspend를 추가 합니다.</li>
	<li>지난번에 2 회 변경 하지만 단계 2.10 미리 데워 진된 문화 매체를 혈 청 자유로운 매체를 반복 합니다.</li>
	<li>DRG 약 60 번 불꽃 연마 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 수동으로 triturate (길이 230 m m와 팁 머리 내경 1 m m). 비 광택 피 펫을 불꽃 연마 파스퇴르 피펫으로의 오리 피스를 비교 하는 사진에 대 한 그림 2B를 참조 하십시오. 참고: 내부 불꽃 연마 파스퇴르 피 펫의 직경은 약 10% 제어 피 펫 보다 작은 및 테이퍼 끝의 안쪽 부드러운 되어야 합니다. 세포를 분쇄 할 때 거품을 만들 수 없습니다 주의 해야 합니다.</li>
	<li>CO2 배양 기에서 폴 리-L-리 신-코팅 접시를 제거 합니다. 요리에서 incubated 문화 매체를 발음 하 고 코팅된 접시에 해리 셀 씨.</li>
	<li>씨앗 한 쥐 (양자 컬렉션에서 L1-L6, 12 총 DRG)에서 DRG 셀 24-잘 접시; 4 웰 스도 24-잘 접시의 한 잘에 약 5 x 104 의 세포가 있다. 참고:이 밀도 출시 CGRP 또는 SP의 검출에 적합 하 고 또한 immunostaining에 적합. 서쪽 오 점 또는 RNA 추출, 6 잘 플레이트의 한 음에 한 쥐 (양자 L1-L6)에서 DRG 셀 씨.</li>
	<li>10 µ M cytarabine (아 라-C)의 추가 함께 다음 날에 문화 매체와 100 ng/mL NGF, 교체 하 고 새로 매체 그 후 매 2 일. 참고: 흉부 DRG 또한 수 또한 될 교양이 프로토콜에 의해 흉부 척추에서 수집 된 있다.</li>
</ol>3. transfection DRG 셀에 NPFFR2 siRNA의
<ol><li>NPFFR2 siRNA의 transfection를 수행 하 고 siRNA 제조 업체의 프로토콜에 따라 제어. 참고: 프로토콜 경우 선택한 transfection 시 약은 우리가 사용 하는 한에서 다른 적응 해야 합니다 ( 테이블의 자료를 참조).</li>
	<li>셀 도금 후 3 일에 0.5 mL 전 따뜻한 혈 청 무료 매체 매체를 변경 하 고 1 시간에 대 한 37 ° C CO2 배양 기에서 DRG를 품 어.</li>
	<li>추가 50 12.5 µ L 세럼 무료 중간에 (1 µ L RNase 무료 물)에 siRNA의 nM.</li>
	<li>10 µ L 혈 청 자유로운 매체에 2.5 µ L transfection 시 약을 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 10 분을 위한 단계 3.3 및 3.4 여 플라스틱, 그리고이 혼합된 transfection를 품 어 솔루션에서 솔루션을 믹스.</li>
	<li>Transfection 솔루션 한 DRG 포함 된 24-잘 접시에 추가 하 고 부드럽게 흔들어 매체 솔루션을 혼합. 참고: 여러 transfection 솔루션 동시에 여러 우물 페 될 필요가 있는 경우 배포 한다.</li>
	<li>6 h에 대 한 37 ° C CO2 배양 기에서 DRG를 품 어.</li>
	<li>0.5 mL를 추가/문화 매체의, 포함 된 20% 태아 둔감 한 혈 청 100 밀리미터 나트륨 pyruvate, 1 x 1에서 페니실린/스 x DMEM-F12, 10 µ M 아 라-C와 100 ng/mL NGF, 24-잘 접시에 추가.</li>
	<li>또 다른 66 h (새로 고침 48 h에 매체)에 대 한 37 ° C CO2 배양 기에서 DRG를 품 어.</li>
</ol>4. 기본 DRG 세포에서 신경 전달 물질의 방출
<ol><li>하루 6 셀 (72 h siRNA transfection 후)를 도금 했다, 후 200 µ L 세럼 무료 매체, 문화 매체를 변경 하 고 30 분 동안 37 ° C CO2 배양 기에서 세포를 품 어.</li>
	<li>1 µ L 자극 chemical(s)를 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 미디어 믹스. 지정 된 시간에 대 한 37 ° C 공동2 인큐베이터에 접시를 품 어. 참고:이 문서에서는, 경작된 한 세포 했다 자극 NPFFR2 주 작동 근, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-페-NH2, 5 nmol)와 1 시간에 대 한.</li>
	<li>문화 요리와 일시 중단 된 모든 불순물을 제거 하 4 ° C에서 5 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기에서 문화 매체를 수집 합니다.</li>
	<li>원심에서는 상쾌한을 수집 하 고 필요에 따라 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께 샘플을 희석. 효소 immunoassay (EIA) 키트와 함께 신경 전달 물질의 레벨을 시험 하 고 참고: 여기는 supernatants 했다 희석된 1: 100 CGRP의 수준을 분석 하기 전에. 상쾌한 sp.의 수준을 분석 하기 전에 희석 하지는</li>
</ol>5. CGRP와 SP EIA
<ol><li>즉시 CGRP 또는 SP EIA 키트 제조 업체의 프로토콜에 따라 샘플을 분석 합니다. 참고: 프로토콜 사용 하는 장비에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>워시 버퍼 키트에서 제공 된 5 번 CGRP EIA 웰 스 린스 합니다.</li>
	<li>CGRP EIA 우물으로 100 µ L 안티 CGRP acetylcholinesterase (통증) 추적 프로그램으로 100 µ L 샘플을 추가 하 고 50 µ L 샘플 50 µ L 안티-SP 통증 추적 프로그램, 50 µ L 안티-SP 원으로 SP EIA 우물에 추가.</li>
	<li>키트 내에서 제공 되는 플라스틱 필름 CGRP와 SP 우물을 봉인.</li>
	<li>4 ° c.에 하룻밤 우물을 품 어</li>
	<li>5 번 CGRP와 웰 스 워시 또는 SP 버퍼를 세척 하 고 우물에서 모든 잔여 솔루션을 제거.</li>
	<li>해당 EIA 키트 내 공급 CGRP 또는 SP 우물에 덮어 200 µ L의 시 약을 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 CGRP 웰 스를 품 어 고 실 온에서 90 분 동안 SP 웰 스를 품 어. 두 분석 실험에 대 한 빛에서 우물을 보호 합니다.</li>
	<li>Nm 파장 414 번호판 읽기 및 해당 EIA 악기에 따라 결과 계산. 참고: 항상 손으로 우물의 바닥을 만지지 마십시오 고 Ellman의 시 약을 추가 하기 전에 물티슈를 청소 하는 렌즈에 의해 잘 아래에서 물 얼룩을 청소.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

현재 문서에서 수집, 효소 분리 및 쥐 요 추의 문화 시연 DRG. NGF는 科 지원, DRG 뉴런의 축 삭 셀 시드 후 3 일 이내 연장. 확장된 축 삭 후 셀 셀 소마에서 합성 되 고 축 삭 섬유 따라 전송 CGRP 단백질에 대 한 스테인드 했다 명확 하 게 관찰 했다. 위성 세포 또한 확장을 일 이내 뉴런을 둘러싸고이 나누어 glial 세포를 허용 처리 합니다. 이 프로토콜에 의해 성장 주 DRG 세포는 감각 신경 조절 세포 메커니즘에 대 한 조사에 적합 합니다. 여기, 우리는 neuropeptides, CGRP와 SP는 선택적 NPFFR2 주 작동 근, dNPA에 의해 경작된 DRG 뉴런에서의 릴리스 자극. NPFFR2는 NPFF에 대 한 동족 수용 체 이며, 고통 감각 및 규정 경로22,23에 참여할 것으로 보고 되었습니다. NPFFR2-의존 CGRP와 SP 출시의 NPFFR2 siRNA의 사용에 의해 더 확인 했습...

감각 뉴런의 셀 시체 DRG 안에 포함 되어 있습니다. 이러한 뉴런 의사 유 니 폴라 그리고 주변 조직 및 중앙 신경 시스템을 자극. 근육, 피부, 내장 기관, 뼈, 다른 조직. 중에서 발견 되는 감각 신경의 말 초 신경 엔딩 그들은 신경 척수 등 쪽 뿔과 신호에서 엔딩 다음 체세포 센 세이 션1,2의 다른 상승 통로 통해 두뇌에 전송 주변 감각 신호를 전송 합니다. 체세포 센 세이 션 (즉, 터치, 고통, 고 열 감각)을 인식 하는 움직임과 공간 방향 (고유 감각)1,3시체가 있습니다. 4가 있다 골격 근육, 피부, 몸의에 응답 하는 그룹 II (Aβ) 섬유의 proprioception 응답 그룹 III (Aδ) (Aα) 섬유 및 그룹 V (C) 고통에 응답 하는 등 기본 구심 축 삭의 서브 그룹 I 고 온도입니다. 나머지는 다른도로 myelinated만 C 섬유 myelinated, 하지 않습니다.
Nociceptors는 기본 감각 신경, 수행 조직 손상에 대 한 잠재적인 유해 자극 (기계적, 열, 및 화학 자극)에 의해 활성화 됩니다. 이러한 신경 myelinated Aδ 섬유 및 unmyelinated C 섬유1,4구성 됩니다. 신경 성장 인자 (NGF, trkA 수용 체), CGRP, 및 sp. 수용 체를 표현 하는 Aδ 섬유 C 섬유는 peptidergic 및 peptidergic가 아닌 C 섬유로 분류 됩니다. 다른 한편으로, 비 peptidergic C 섬유 glial 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF, RET, 그리고 GFR 수용 체), isolectin IB4, 및 ATP 문을 단 이온 채널 하위 (P2X3)5,,67에 대 한 수용 체를 표현 한다. Nociceptors는 이온 채널의 식에 의해 구별 될 수 있으며 neurotrophic 요인에 의해 활성화, cytokines, neuropeptides, ATP, 또는 다른 화학 화합물8. 자극, 시 신경 전달 물질, 포함 CGRP, SP, 그리고 조미료 nociceptive 신호2전송 하 등 척추 경적에 감각 신경 터미널에서 해제 될 수 있습니다. DRG는 뉴런의 구성 뿐만 아니라 그러나 또한 위성 glial 세포를 포함. 위성 세포는 감각 뉴런을 둘러싸고 고 기계 및 대사 지원9,10를 제공 합니다. 흥미롭게도, 거기에 위성 glial 세포는 DRG에 통증 감각11조절에 관련 되어있을 수 있습니다 나타내는 증거의 성장 시체가입니다.
감각 뉴런 가장 자주 사용 하는 기본 신경 세포12 고 전기 생리학, 신호 변환, 및 신경 전달 물질 방출 연구 활용 보고 되었습니다. 그들은 또한 일반적으로 신경 개발, 염증 성 통증, neuropathic 고통, (같은 가려움증), 피부 감각 및 축 삭 가지12,13,,1415의 세포 메커니즘을 탐구 하는 데 사용 됩니다. DRG 기본 문화 실험 과목에서 수행할 수 없는 연구를 수행 하는 과학자를 수 있도록 단일 또는 여러 셀에 생 화 확 적인 변화를 평가 하기 위해 해리 뉴런으로 양식 수 있습니다. 최근, DRG 변환 연구16에 크게 혜택을 받을 수 있는 인간 장기 기증자에서 성공적으로 경작 했다. 다른 한편으로, 감각 신경으로 DRG explants 교양도 수 있습니다. DRG explants Schwann 세포 등 위성 glial 세포, 신경 세포의 원래 조직 아키텍처를 유지 하 고 특히 유용17신경 및 비 신경 세포 간의 상호 작용을 공부. DRG 주 문화는 2.5 h 이내 쉽게 준비 될 수 있습니다. 셀 구성 및 속성은 소스, DRG의 반사 고 등, 특정 DRG (요 추 또는 흉부 DRG) 실험 수요에 따라 수집 될 수 있습니다. 배아 및 신생아 DRG 뉴런의 문화 필요 NGF 생존과 축 삭 파생물을 유도 하지만 성인 뉴런의 문화 미디어12,17에 neurotrophic 요인의 추가 요구 하지 않습니다. 또한 상용 DRG hybridoma 세포 라인 ND7/23, F11, 실험 동물의 사용을 필요로 하지 않는 등이 있다. 그러나, 일시적인 수용 체 잠재력 양이온의 부족 채널 인도의 V 회원 1 (TRPV1) 식 (작은 감각 nociceptive 뉴런에 대 한 중요 한 표식) 및 부적당 유전자 식 프로필 제한18그들의 응용 프로그램. 최근, 라인 쥐 (50B11)19 에서 파생 된 DRG 신경 세포를 불멸 하 게 마우스 (MED17.11)20, 위해 적당 한에서 사용 높은 처리량 스크린 연구 대상으로 하는 약물에 대 한. 그러나, 유전자 발현 프로 파일링이 셀 라인을 아직 수행할 수 있다. 따라서, 감각 신경 세포를 불멸 하 게 세포를 비교 검증 실험은 여전히 진행 중입니다.
NPFFR2는 DRG에 합성 이며 척추 등 쪽 뿔21에 감각 신경 터미널 translocated. 이 문서에서 우리는 요 추 DRG 세포를 배양 하 고 신경 전달 물질, CGRP와 sp.의 분리를 유도 하는 NPFFR2의 길 항 제와 함께 그들을 치료에 대 한 프로토콜을 제공 NPFFR2에 대 한 의존 더 NPFFR2 작은 간섭 RNA (siRNA), 교양된 DRG 셀으로 페 수를 사용 하 여 테스트 됩니다.

<table><tbody><tr><td>tiletamine과 zolazepam의 혼합물 (Zoletil)</td> <td>Virbac</td><td>Zoletil 50</td><td>마취제</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>피루브 나트륨</td><td>시그마</td><td>S8636</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신</td><td>Biological Industries</td><td>03-033-1</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>12400024</td><td>Culture Medium</td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sigma</td><td>P9011</td><td>코팅 접시</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 IA</td><td>Sigma</td><td>9001-12-1</td><td>효소 소화</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Culture</td></tr><tr><td>Medium Trypsin EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-051-5</td><td>효소 소화</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td>Cell trituration</td></tr><tr><td>Cytarabine (Ara-C)</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td>Culture Medium</td></tr><tr><td>NGF</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td>Culture Medium</td></tr><tr><td>NPFFR2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-099691-02-0005</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>Non-targeting siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-001810-10-05</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>NeuroPORTER 시약</td>, <td>Genlantis</td><td>, T400150</td><td>, 형질주입, 시약</td></tr>, <tr><td>dNPA,</td><td>Genemed Synthesis</td>, <td>N/A,</td><td>NPFFR2, 작용제</td></tr>, <tr><td>CGRP, CGRP, ELISA,</td><td>Cayman,</td><td>589001</td>, <td>EIA</td></tr>, <tr><td>SP, ELISA,</td><td>Cayman</td><td>583751</td>, <td>EIA,</td></tr><tr><td>CGRP, 항체</td>, <td>Calbiochem</td>, <td>PC205L</td>, <td>IHC, DAPI</td></tr>, <tr><td></td><td>Roche</td>, <td>10236276001</td>, <td>IHC</td></tr></tbody></table>

신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

지 루트 신경 절 (DRG) 포함 감각 뉴런의 셀 시체. 신경의이 유형은 의사는 유 니 폴라, 주변 조직, 피부, 근육, 내장 기관 뿐만 아니라 중앙 신경의 척수 등 혼을 자극 하는 두 개의 축 삭과 이다. 감각 뉴런 체세포 센 세이 션, 터치, 고통, 열, 및 고유 감각을 포함 하 여 전송 합니다. 따라서, DRG 기본 문화 nociception의 셀룰러 메커니즘, 감각 신경, 신경 발달의 생리 기능 연구에 널리 사용 됩니다. 교양된 신경 생리학, 신호 변환, 신경 전달 물질 방출, 또는 칼슘 이미징 연구에 적용할 수 있습니다. DRG 기본 문화권, 과학자 들은 단일 생 화 학적 변화를 모니터링 끊된 DRG 뉴런 문화 수 있습니다 또는 vivo에서 실험과 관련 된 많은 한계를 극복 하는 여러 셀. 에 비해 상업적으로 사용 가능한 DRG hybridoma 세포 선 또는 불멸 하 게 DRG 신경 세포 선, 구성 및 1 차 셀의 속성은 감각 신경 조직에 훨씬 더 비슷합니다. 그러나, 하나의 동물에서 격리 될 수 있는 교양된 DRG 1 차 셀의 제한 된 수의 그것은 연구 대상으로 하는 약물에 대 한 높은 처리 화면을 수행 어렵다. 현재 문서에서 DRG 컬렉션 및 문화를 위한 절차를 설명 합니다. 또한, 우리 교양된 DRG 셀 neuropeptide FF 수용 체 타입-2의 주 작동 근 유도 펩타이드 신경 전달 물질 (칼 시 토 닌 유전자 관련 펩 티 드 (CRGP)와 물질 P (SP))의 릴리스 (NPFFR2)의 처리를 보여 줍니다.

24-잘 접시에 배양 쥐 요 추 DRG 뉴런 glial 세포 증식을 억제 하기 위해 추가 아 라-C와 신경 성장을 지원 하기 위해 NGF 문화 매체에서 성장 했다. 생활의 형태 DRG 세포 관찰 되었다. 그림 3에서 같이, 단일 뉴런의 세포 체 하루 1 접시의 바닥에 연결 되었고 관찰에 대 한 선택. 축 삭 성장 하루 1-3에서에서 모니터링 했다. Glial 세포 복제 하 고 프로세스를 둘러싸고 감각 뉴런의 세포 체를 확장. 다른 문화에서 CGRP 단백질은 신경 세포의 형태를 공개 하 스테인드. 그림 4, CGRP 단백질 얼룩 세포질 및 감각 신경 세포의 축 삭에 표시 됩니다. 신경 그리고 glial 세포의 핵 형태학은 DAPI 물 들일 때 가지. 뉴런 glial 세포 보다 더 크고 더 둥근 핵을가지고. 비교 함으로써, 명과의 핵은 더 타원형 모양 (<strong ...

지 루트 중추 (DRG) 주 문화 자주 생리 기능 또는 감각 신경에서 병리학 관련 이벤트를 공부 하는 데 사용 됩니다. 여기, 허리 DRG 문화 neuropeptide FF 수용 체 선택적 길 항 제와 함께 2 자극 입력 신경 전달 물질의 릴리스를 감지를 사용 하 여를 설명 합니다.

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

이 방법은 주변 고치와 같은 감각 연구 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 대부분의 생리적 상태를 시뮬레이션 하는 모델감각 뉴런의 세포 메커니즘을 조사 하는 것입니다. 2~3주 된 쥐의 트렁크에서 요추 등 뿌리 간리아를 수집합니다.척추의 측면을 따라 두 개의 컷을 만들고 요추 척추의 장밋빛 정도를 표시하기 위해 측면 절단을 합니다. 그런 다음 뼈 절단 집게를 사용하여 척추의 등뼈 근육을 제거하십시오. 다음으로 척추의 등대 부분을 제거하고 척수를 노출시십시오.그런 다음 해부 가위와 집게를 사용하여 척수를 제거하십시오. 마지막 갈비뼈에서 척추를 계산하여 요추 DRG를 식별합니다. 이 다이어그램은 척추 위치를 보여줍니다.마이크로 가위를 사용하여 L1에서 L6까지 12개의 양자 요추 DRG를 수집합니다. 배양의 순도를 향상시키기 위해 부착 된 신경 섬유를 제거하십시오. 각 요추 DRG를 35mm 배양 접시에 얼음 냉간 세럼 프리 배지 2밀리리터가 들어 있는 접시로 옮긴다. DRG 함유 35mm 접시를 라미나르 후드로 옮기고, 피펫으로 세럼이 없는 배지로 DRG를 세척합니다.멸균 핀셋을 사용하여 DRG를 멸균 콜라게나아제 타입 1A 의 2밀리리터를 포함하는 새로운 35mm 배양 요리로 이동합니다. 콜라게나아제 용액에 37도 의 조직 배양 배양기를 30분 간 배치하여 세포의 해리를 시작합니다. 인큐베이션에 이어 콜라게나제 용액을 제거하고 행크의 균형 잡힌 소금 용액 2밀리리터로 DRG를 세 번 세척합니다.다음으로, 요리에 사전 0.05%의 트립신 EDTA의 2밀리리터를 추가하고, 이전과 같이 30분 동안 인큐베이터에서 DRG를 소화합니다. 소화 후 유리 파이펫을 사용하여 DRG 함유 용액 2밀리리터를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 전송합니다. DRG는 유리 파이펫에 충실할 수 있으므로 이 단계를 주의해서 수행해야 합니다.실제 손실은 유리 파이펫의 테이퍼 끝에 DRG 함유 솔루션을 유지하고 솔루션을 원심분리기 튜브로 천천히 전송하지만 일시 중지없이 방지 할 수 있습니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 5분간 290배 G로 용액을 원심분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 제거하고 DRG를 다시 중단하는 세럼이없는 매체의 또 다른 두 밀리리터를 추가합니다.마지막 원심 분리 후 조직을 다시 중단하기 위해 미리 따뜻해진 배양 배지의 2밀리리터를 사용하여 세척을 두 번 반복합니다. 이전에 준비된 멸균 화염 연마 파이펫을 사용하여 DRG를 약 60회 수동으로 세배로 삼화합니다. 다음으로, CO2 인큐베이터로부터 양배지 1밀리리터를 함유한 폴리 L-리신 코팅 24웰 플레이트를 제거한다.요리에서 배양 된 문화 매체를 흡인. 하나의 쥐에서 DRG 세포를 4 개의 우물로 시드하십시오. 이것은 약 500, 000 세포의 파종 밀도를 잘 당 제공합니다.다음 날, 배양 배지를 10 마이크로몰라 AraC, 밀리리터 NGF당 100 나노그램으로 보충된 배지로 대체한다. 세포 도금 후 3일째에, 미리 따뜻진 혈청 없는 배지의 0.5 밀리리터로 배지를 변경하고 1시간 동안 배양한다. 인큐베이션 동안, RNase 가 없는 물의 한 마이크로리터에 50 밀리몰러 siRNA를 트랜스펙트당 혈청 이없는 배지 12.5 마이크로리터에 추가합니다.그런 다음 각 배회에 대해 혈청이없는 매체 의 10 마이크로 리터로 트랜스페트 시약의 파이펫 2.5 마이크로 리터. 파이펫으로 두 솔루션을 혼합하고 실온에서 10 분 동안이 혼합 형질 전환 솔루션을 인큐베이션하십시오. 10분 후, DRG 함유 24웰 플레이트의 우물에 경질 용액을 넣고 부드럽게 흔들어 섞습니다.6 시간 인큐베이션에 따라, 세포의 각 우물에 20 %의 FBS, 10 마이크로 몰라 아라C, 100 나노 그램배의 배양 배지의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 마지막으로, DRG를 섭씨 37도 CO2 인큐베이터에서 66시간 동안 배양합니다. 도금 후 6일째, siRNA 경질 후 72시간 후, 배양 배지를 혈청 이없는 배지의 200마이크로리터로 변경한다.30분 분량의 인큐베이션을 마친 후 자극 화학 물질의 마이크로리터 1개를 추가하고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. NPFFR2 고뇌스트, dNPA 및 해당 차량이 여기에 사용됩니다. 필요한 기간 동안 배양 후, 배양 접시로부터 배양 배지를 수집하고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 5000회 G로 수집하여 중단된 불순물을 제거한다.원심분리에서 상체를 수집하고 필요에 따라 인산염 완충식식물로 희석하십시오. 분석 시사용 가능한 효소 면역 분석 키트를 가진 신경 전달 물질의 수준을 말합니다. 첫날, 화살로 표시된 단일 뉴런의 세포 본체가 접시 의 바닥에 부착되었다.화살촉에 의해 표시된 신경교 세포도 존재한다. 신경교 세포는 둘째 날에 감각 뉴런의 세포 체를 둘러싸고 중복 및 확장 된 과정, 셋째 날에 더욱 눈에 띄는 과정. 또 다른 배양에서, CGRP 단백질은 뉴런의 모양을 밝히기 위하여 얼룩이 있었습니다.CGRP 단백질 염색은 감각 신경의 세포질 및 축삭에 나타납니다. 신경 세포와 신경교 세포의 핵 형태는 DAPI로 얼룩질 때 구별됩니다. 뉴런은 신경교 세포보다 더 크고 둥근 핵을 가지고 있습니다.비교하여, 신경교의 핵은 모양에 더 타원형입니다. 일단 마스터되면, 제대로 수행되는 경우이 기술은 2 시간 반에서 수행 할 수 있습니다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 동구 대 신경절을 해부하고 배양하는 방법에 대한 좋은 이해를 가지고, 기본 생리 적 기능을 조사하는 도구로 사용해야합니다.1 차 적인 세포와 함께 작업 하는 것이 일반 세포주와 함께 작업 하는 것 보다 훨씬 더 어려울 수 있습니다 잊지 마세요, 그리고 부드러운 되 고 항상 이러한 절차를 수행 하는 경우 가장 좋은 방법입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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