Name: 신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 학습하세요 척추 후근신경절(DRG) 원발 배양법으로 신경전달물질 방출을 연구하는 방법입니다. 쥐의 요추 DRG에서 감각 신경원을 분리 배양하여 NPFFR2 자극에 따른 생리학적 반응을 분석할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 영어 편집 박사 M. Calkins 감사합니다. 이 작품은 장 궁 기념 병원 (CMRPD1F0482), 장 공 대학, 정상 노화 연구 센터 (EMRPD1G0171) 사역의 과학 및 기술 (105-2320-B-182-012-MY2)에 의해 지원 되었다.

실험 동물을 사용 하는 여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 장 공 대학 (13-014 곳)에 의해 승인 되었다.
1. 실험 쥐에서 요 추 DRG 수집
<ol><li>요 추 DRG 컬렉션에 대 한 3 주 된 Sprague-Dawley (SD) 쥐에 2를 사용 합니다. 참고: DRG 뉴런 쥐에서 4 주 이상 수집 여기에 설명 된 문화 조건 하에서 잘 성장 하지 않습니다.</li>
	<li>압력솥에 모든 수술 기구를 소독.</li>
	<li>Tiletamine 및 zolazepam (20 mg/kg, 복 주입 (IP))의 1:1 혼합물으로 쥐를 anesthetize 하 고 동물 발가락 꼬 집 음 시험에서는 발 철수 응답 될 때까지 기다립니다. 참고: 다른 마 취 전략이이 프로토콜에 성공적으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>상업적인 단두대로 잘린 여 쥐를 희생.</li>
	<li>단두대를 사용 하 여 격리 forelimb와 대 퇴 골 사이 쥐의 몸 트렁크. 수집 지역의 다이어그램 그림 1A 를 참조 하십시오. 참고: 꼬리 커트 라인 대 퇴 골에 그냥 rostral 이어야 한다. 요 추 L6 DRG 컷된 사이트는 척추에서 너무 높은 경우 excised 될 것입니다.</li>
	<li>흉 골을 따라 고 해 부가 위 (그림 2A-) 모든 장기/조직 제거.</li>
	<li>쥐의 등 쪽 부분을 수집 하 고 피부를 제거 하는 트렁크의 측면을 따라 자릅니다. 해 부 등 트렁크의 사진 그림 1B 를 참조 하십시오.</li>
	<li>DRG를 수집 하기 전에 얼음에 티슈를 준비 합니다. 모피와 장갑, 혈액을 청소 하 고 단계로 진행 하기 전에 75% 에탄올으로 소독.</li>
	<li>요 추 척추를 취재 하는 근육을 제거 합니다. 첫째, 척추 (왼쪽과 오른쪽)의 측면을 따라 두 개의 상처와 한 측면 허리 척추의 rostral 범위를 표시 하 게. 그런 다음, 뼈 절단 겸 자 (그림 2A-b)와 척추의 등 쪽 근육을 제거 합니다.</li>
	<li>뼈 절단 집게와 척추의 등 쪽 부분을 제거 하 고 척수를 노출.</li>
	<li>해 부가 위 (그림 2A-c) 및 집게 (그림 2A-d) 척수를 제거 합니다.</li>
	<li>마지막 갈비뼈 (흉부 척추 13)에서 척추를 계산 하 여 요 추 DRG를 식별 합니다. 그림 1C 척추 위치의 다이어그램을 참조 하십시오.</li>
	<li>2 mL 차가운 혈 청 무료 매체와 35 m m 문화 접시에 양측 허리 DRG (L1-L6) 마이크로-가 위 (그림 2A-f)를 수집 합니다. 신경 섬유 (같이 그림 1C) DRG, 연결에서 다음 문화의 순도 향상 시키기 위해 문화 접시에 그것을 전송. 참고: 수집된 DRG 1 시간 약에 대 한 얼음에 매체에 보관 수 있습니다. 한편, 여러 쥐 DRG의 더 큰 수영장을 만들려면 안락사 될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 기본 문화 쥐 목재 DRG의
참고: 다음 단계는 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 mM 나트륨 pyruvate 그리고 1에서 1 x 페니실린/스 문화 매체를 준비 DMEM F12 x.</li>
	<li>외 투 세포 배양 24-잘 접시 200 µ g/mL 폴 리-L-리 신 2 h에 대 한 다음 멸 균된 물으로 세척 처리.</li>
	<li>전 적어도 30 분 동안 사용 하기 전에 37 ° C CO2 배양 기에서 1 mL 문화 매체와 문화 접시를 품 어.</li>
	<li>층 류 후드에 DRG 포함 35 m m 접시를 전송 하 고 피 펫에 의해 혈 청 무료 매체와 DRG 3 번 씻어. 참고: 접시의 외부 청소 되어야 한다 75% 에탄올과 후드로 전송 하기 전에. 35 mm 접시 DRG (이 실험 디자인의 요구에 따라 달라 집니다) 쥐의 숫자에서를 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>이동은 DRG (단일 쥐에서 여러 쥐에서 결합 또는) 새로운 35mm 문화 요리를 멸 균 핀셋 (그림 2A-e)와 콜라 유형 IA의 2 mL (1 mg/mL 혈 청 자유로운 매체에) 포함. 참고: 콜라 솔루션은 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 그것을 전달 하 여 살 균 되어야 한다.</li>
	<li>30 분 동안 37 ° C CO2 배양 기에서 콜라 솔루션에서 DRG 다이제스트.</li>
	<li>콜라 솔루션을 제거 하 고 세척 2 ml 행 크의 DRG 3 번 균형 소금물 (HBSS). 참고: 있을 수 있습니다 잔여 섬유 또는 솔루션으로는 DRG 내려와 조직. 피 펫 세척 솔루션으로 그들을 제거 합니다.</li>
	<li>2 mL 중 DRG 포함 35 mm 접시 및 다이제스트 30 분 동안 37 ° C CO2 배양 기에서 DRG로 0.05% 트립 신-EDTA를 예 열을 추가 합니다.</li>
	<li>DRG 포함 된 솔루션의 2 개 mL를 이동 15 mL 원심 분리기 튜브 유리 피 펫에 의해. 참고:는 DRG 수에 충실 유리 피펫은 그래서 주의이 단계를 수행 해야 합니다. 유리 피 펫 (약 0.5 mL)의 테이퍼 끝에서 DRG 포함 된 솔루션을 유지 하 고 천천히 솔루션 원심 분리기 관으로 전송 하지 않고 일시 중지 DRG 손실을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>290 x g 4 ° c.에서 5 분에 솔루션을 원심 제거는 상쾌한 고 다른 2 mL 혈 청 무료 매체는 DRG resuspend를 추가 합니다.</li>
	<li>지난번에 2 회 변경 하지만 단계 2.10 미리 데워 진된 문화 매체를 혈 청 자유로운 매체를 반복 합니다.</li>
	<li>DRG 약 60 번 불꽃 연마 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 수동으로 triturate (길이 230 m m와 팁 머리 내경 1 m m). 비 광택 피 펫을 불꽃 연마 파스퇴르 피펫으로의 오리 피스를 비교 하는 사진에 대 한 그림 2B를 참조 하십시오. 참고: 내부 불꽃 연마 파스퇴르 피 펫의 직경은 약 10% 제어 피 펫 보다 작은 및 테이퍼 끝의 안쪽 부드러운 되어야 합니다. 세포를 분쇄 할 때 거품을 만들 수 없습니다 주의 해야 합니다.</li>
	<li>CO2 배양 기에서 폴 리-L-리 신-코팅 접시를 제거 합니다. 요리에서 incubated 문화 매체를 발음 하 고 코팅된 접시에 해리 셀 씨.</li>
	<li>씨앗 한 쥐 (양자 컬렉션에서 L1-L6, 12 총 DRG)에서 DRG 셀 24-잘 접시; 4 웰 스도 24-잘 접시의 한 잘에 약 5 x 104 의 세포가 있다. 참고:이 밀도 출시 CGRP 또는 SP의 검출에 적합 하 고 또한 immunostaining에 적합. 서쪽 오 점 또는 RNA 추출, 6 잘 플레이트의 한 음에 한 쥐 (양자 L1-L6)에서 DRG 셀 씨.</li>
	<li>10 µ M cytarabine (아 라-C)의 추가 함께 다음 날에 문화 매체와 100 ng/mL NGF, 교체 하 고 새로 매체 그 후 매 2 일. 참고: 흉부 DRG 또한 수 또한 될 교양이 프로토콜에 의해 흉부 척추에서 수집 된 있다.</li>
</ol>3. transfection DRG 셀에 NPFFR2 siRNA의
<ol><li>NPFFR2 siRNA의 transfection를 수행 하 고 siRNA 제조 업체의 프로토콜에 따라 제어. 참고: 프로토콜 경우 선택한 transfection 시 약은 우리가 사용 하는 한에서 다른 적응 해야 합니다 ( 테이블의 자료를 참조).</li>
	<li>셀 도금 후 3 일에 0.5 mL 전 따뜻한 혈 청 무료 매체 매체를 변경 하 고 1 시간에 대 한 37 ° C CO2 배양 기에서 DRG를 품 어.</li>
	<li>추가 50 12.5 µ L 세럼 무료 중간에 (1 µ L RNase 무료 물)에 siRNA의 nM.</li>
	<li>10 µ L 혈 청 자유로운 매체에 2.5 µ L transfection 시 약을 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 10 분을 위한 단계 3.3 및 3.4 여 플라스틱, 그리고이 혼합된 transfection를 품 어 솔루션에서 솔루션을 믹스.</li>
	<li>Transfection 솔루션 한 DRG 포함 된 24-잘 접시에 추가 하 고 부드럽게 흔들어 매체 솔루션을 혼합. 참고: 여러 transfection 솔루션 동시에 여러 우물 페 될 필요가 있는 경우 배포 한다.</li>
	<li>6 h에 대 한 37 ° C CO2 배양 기에서 DRG를 품 어.</li>
	<li>0.5 mL를 추가/문화 매체의, 포함 된 20% 태아 둔감 한 혈 청 100 밀리미터 나트륨 pyruvate, 1 x 1에서 페니실린/스 x DMEM-F12, 10 µ M 아 라-C와 100 ng/mL NGF, 24-잘 접시에 추가.</li>
	<li>또 다른 66 h (새로 고침 48 h에 매체)에 대 한 37 ° C CO2 배양 기에서 DRG를 품 어.</li>
</ol>4. 기본 DRG 세포에서 신경 전달 물질의 방출
<ol><li>하루 6 셀 (72 h siRNA transfection 후)를 도금 했다, 후 200 µ L 세럼 무료 매체, 문화 매체를 변경 하 고 30 분 동안 37 ° C CO2 배양 기에서 세포를 품 어.</li>
	<li>1 µ L 자극 chemical(s)를 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 미디어 믹스. 지정 된 시간에 대 한 37 ° C 공동2 인큐베이터에 접시를 품 어. 참고:이 문서에서는, 경작된 한 세포 했다 자극 NPFFR2 주 작동 근, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-페-NH2, 5 nmol)와 1 시간에 대 한.</li>
	<li>문화 요리와 일시 중단 된 모든 불순물을 제거 하 4 ° C에서 5 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기에서 문화 매체를 수집 합니다.</li>
	<li>원심에서는 상쾌한을 수집 하 고 필요에 따라 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께 샘플을 희석. 효소 immunoassay (EIA) 키트와 함께 신경 전달 물질의 레벨을 시험 하 고 참고: 여기는 supernatants 했다 희석된 1: 100 CGRP의 수준을 분석 하기 전에. 상쾌한 sp.의 수준을 분석 하기 전에 희석 하지는</li>
</ol>5. CGRP와 SP EIA
<ol><li>즉시 CGRP 또는 SP EIA 키트 제조 업체의 프로토콜에 따라 샘플을 분석 합니다. 참고: 프로토콜 사용 하는 장비에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>워시 버퍼 키트에서 제공 된 5 번 CGRP EIA 웰 스 린스 합니다.</li>
	<li>CGRP EIA 우물으로 100 µ L 안티 CGRP acetylcholinesterase (통증) 추적 프로그램으로 100 µ L 샘플을 추가 하 고 50 µ L 샘플 50 µ L 안티-SP 통증 추적 프로그램, 50 µ L 안티-SP 원으로 SP EIA 우물에 추가.</li>
	<li>키트 내에서 제공 되는 플라스틱 필름 CGRP와 SP 우물을 봉인.</li>
	<li>4 ° c.에 하룻밤 우물을 품 어</li>
	<li>5 번 CGRP와 웰 스 워시 또는 SP 버퍼를 세척 하 고 우물에서 모든 잔여 솔루션을 제거.</li>
	<li>해당 EIA 키트 내 공급 CGRP 또는 SP 우물에 덮어 200 µ L의 시 약을 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 CGRP 웰 스를 품 어 고 실 온에서 90 분 동안 SP 웰 스를 품 어. 두 분석 실험에 대 한 빛에서 우물을 보호 합니다.</li>
	<li>Nm 파장 414 번호판 읽기 및 해당 EIA 악기에 따라 결과 계산. 참고: 항상 손으로 우물의 바닥을 만지지 마십시오 고 Ellman의 시 약을 추가 하기 전에 물티슈를 청소 하는 렌즈에 의해 잘 아래에서 물 얼룩을 청소.</li>
</ol>

<ol><li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBear%2C+MF+%22Neuroscience%3A+exploring+the+brain%22">Neuroscience: exploring the brain</a>. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).</li>
<li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+dynamics+of+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+neural+science%22">Principles of neural science</a>. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).</li>
<li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11557989">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li>
<li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li>
<li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperalgesia+and+allodynia%3A+peripheral+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Joint+Bone+Spine%22%5BJournal%5D)">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li>
<li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+from+form+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li>
<li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li>
<li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+its+role+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Anestesiol%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain%3A+an+in+vivo+and+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126(2011).</li>
<li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Reg+Anesth+Pain+Med%22%5BJournal%5D)">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li>
<li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li>
<li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li>
<li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures%3A+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li>
<li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+A+transcriptomic+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li>
<li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li>
<li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670(2015).</li>
<li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li>
<li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li>
<li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li>
<li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현재 문서에서 수집, 효소 분리 및 쥐 요 추의 문화 시연 DRG. NGF는 科 지원, DRG 뉴런의 축 삭 셀 시드 후 3 일 이내 연장. 확장된 축 삭 후 셀 셀 소마에서 합성 되 고 축 삭 섬유 따라 전송 CGRP 단백질에 대 한 스테인드 했다 명확 하 게 관찰 했다. 위성 세포 또한 확장을 일 이내 뉴런을 둘러싸고이 나누어 glial 세포를 허용 처리 합니다. 이 프로토콜에 의해 성장 주 DRG 세포는 감각 신경 조절 세포 메커니즘에 대 한 조사에 적합 합니다. 여기, 우리는 neuropeptides, CGRP와 SP는 선택적 NPFFR2 주 작동 근, dNPA에 의해 경작된 DRG 뉴런에서의 릴리스 자극. NPFFR2는 NPFF에 대 한 동족 수용 체 이며, 고통 감각 및 규정 경로22,23에 참여할 것으로 보고 되었습니다. NPFFR2-의존 CGRP와 SP 출시의 NPFFR2 siRNA의 사용에 의해 더 확인 했습...

감각 뉴런의 셀 시체 DRG 안에 포함 되어 있습니다. 이러한 뉴런 의사 유 니 폴라 그리고 주변 조직 및 중앙 신경 시스템을 자극. 근육, 피부, 내장 기관, 뼈, 다른 조직. 중에서 발견 되는 감각 신경의 말 초 신경 엔딩 그들은 신경 척수 등 쪽 뿔과 신호에서 엔딩 다음 체세포 센 세이 션1,2의 다른 상승 통로 통해 두뇌에 전송 주변 감각 신호를 전송 합니다. 체세포 센 세이 션 (즉, 터치, 고통, 고 열 감각)을 인식 하는 움직임과 공간 방향 (고유 감각)1,3시체가 있습니다. 4가 있다 골격 근육, 피부, 몸의에 응답 하는 그룹 II (Aβ) 섬유의 proprioception 응답 그룹 III (Aδ) (Aα) 섬유 및 그룹 V (C) 고통에 응답 하는 등 기본 구심 축 삭의 서브 그룹 I 고 온도입니다. 나머지는 다른도로 myelinated만 C 섬유 myelinated, 하지 않습니다.
Nociceptors는 기본 감각 신경, 수행 조직 손상에 대 한 잠재적인 유해 자극 (기계적, 열, 및 화학 자극)에 의해 활성화 됩니다. 이러한 신경 myelinated Aδ 섬유 및 unmyelinated C 섬유1,4구성 됩니다. 신경 성장 인자 (NGF, trkA 수용 체), CGRP, 및 sp. 수용 체를 표현 하는 Aδ 섬유 C 섬유는 peptidergic 및 peptidergic가 아닌 C 섬유로 분류 됩니다. 다른 한편으로, 비 peptidergic C 섬유 glial 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF, RET, 그리고 GFR 수용 체), isolectin IB4, 및 ATP 문을 단 이온 채널 하위 (P2X3)5,,67에 대 한 수용 체를 표현 한다. Nociceptors는 이온 채널의 식에 의해 구별 될 수 있으며 neurotrophic 요인에 의해 활성화, cytokines, neuropeptides, ATP, 또는 다른 화학 화합물8. 자극, 시 신경 전달 물질, 포함 CGRP, SP, 그리고 조미료 nociceptive 신호2전송 하 등 척추 경적에 감각 신경 터미널에서 해제 될 수 있습니다. DRG는 뉴런의 구성 뿐만 아니라 그러나 또한 위성 glial 세포를 포함. 위성 세포는 감각 뉴런을 둘러싸고 고 기계 및 대사 지원9,10를 제공 합니다. 흥미롭게도, 거기에 위성 glial 세포는 DRG에 통증 감각11조절에 관련 되어있을 수 있습니다 나타내는 증거의 성장 시체가입니다.
감각 뉴런 가장 자주 사용 하는 기본 신경 세포12 고 전기 생리학, 신호 변환, 및 신경 전달 물질 방출 연구 활용 보고 되었습니다. 그들은 또한 일반적으로 신경 개발, 염증 성 통증, neuropathic 고통, (같은 가려움증), 피부 감각 및 축 삭 가지12,13,,1415의 세포 메커니즘을 탐구 하는 데 사용 됩니다. DRG 기본 문화 실험 과목에서 수행할 수 없는 연구를 수행 하는 과학자를 수 있도록 단일 또는 여러 셀에 생 화 확 적인 변화를 평가 하기 위해 해리 뉴런으로 양식 수 있습니다. 최근, DRG 변환 연구16에 크게 혜택을 받을 수 있는 인간 장기 기증자에서 성공적으로 경작 했다. 다른 한편으로, 감각 신경으로 DRG explants 교양도 수 있습니다. DRG explants Schwann 세포 등 위성 glial 세포, 신경 세포의 원래 조직 아키텍처를 유지 하 고 특히 유용17신경 및 비 신경 세포 간의 상호 작용을 공부. DRG 주 문화는 2.5 h 이내 쉽게 준비 될 수 있습니다. 셀 구성 및 속성은 소스, DRG의 반사 고 등, 특정 DRG (요 추 또는 흉부 DRG) 실험 수요에 따라 수집 될 수 있습니다. 배아 및 신생아 DRG 뉴런의 문화 필요 NGF 생존과 축 삭 파생물을 유도 하지만 성인 뉴런의 문화 미디어12,17에 neurotrophic 요인의 추가 요구 하지 않습니다. 또한 상용 DRG hybridoma 세포 라인 ND7/23, F11, 실험 동물의 사용을 필요로 하지 않는 등이 있다. 그러나, 일시적인 수용 체 잠재력 양이온의 부족 채널 인도의 V 회원 1 (TRPV1) 식 (작은 감각 nociceptive 뉴런에 대 한 중요 한 표식) 및 부적당 유전자 식 프로필 제한18그들의 응용 프로그램. 최근, 라인 쥐 (50B11)19 에서 파생 된 DRG 신경 세포를 불멸 하 게 마우스 (MED17.11)20, 위해 적당 한에서 사용 높은 처리량 스크린 연구 대상으로 하는 약물에 대 한. 그러나, 유전자 발현 프로 파일링이 셀 라인을 아직 수행할 수 있다. 따라서, 감각 신경 세포를 불멸 하 게 세포를 비교 검증 실험은 여전히 진행 중입니다.
NPFFR2는 DRG에 합성 이며 척추 등 쪽 뿔21에 감각 신경 터미널 translocated. 이 문서에서 우리는 요 추 DRG 세포를 배양 하 고 신경 전달 물질, CGRP와 sp.의 분리를 유도 하는 NPFFR2의 길 항 제와 함께 그들을 치료에 대 한 프로토콜을 제공 NPFFR2에 대 한 의존 더 NPFFR2 작은 간섭 RNA (siRNA), 교양된 DRG 셀으로 페 수를 사용 하 여 테스트 됩니다.

<table><tbody><tr><td>tiletamine과 zolazepam의 혼합물 (Zoletil)</td> <td>Virbac</td><td>Zoletil 50</td><td>마취제</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>피루브 나트륨</td><td>시그마</td><td>S8636</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신</td><td>Biological Industries</td><td>03-033-1</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>12400024</td><td>Culture Medium</td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sigma</td><td>P9011</td><td>코팅 접시</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 IA</td><td>Sigma</td><td>9001-12-1</td><td>효소 소화</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Culture</td></tr><tr><td>Medium Trypsin EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-051-5</td><td>효소 소화</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td>Cell trituration</td></tr><tr><td>Cytarabine (Ara-C)</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td>Culture Medium</td></tr><tr><td>NGF</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td>Culture Medium</td></tr><tr><td>NPFFR2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-099691-02-0005</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>Non-targeting siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-001810-10-05</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>NeuroPORTER 시약</td>, <td>Genlantis</td><td>, T400150</td><td>, 형질주입, 시약</td></tr>, <tr><td>dNPA,</td><td>Genemed Synthesis</td>, <td>N/A,</td><td>NPFFR2, 작용제</td></tr>, <tr><td>CGRP, CGRP, ELISA,</td><td>Cayman,</td><td>589001</td>, <td>EIA</td></tr>, <tr><td>SP, ELISA,</td><td>Cayman</td><td>583751</td>, <td>EIA,</td></tr><tr><td>CGRP, 항체</td>, <td>Calbiochem</td>, <td>PC205L</td>, <td>IHC, DAPI</td></tr>, <tr><td></td><td>Roche</td>, <td>10236276001</td>, <td>IHC</td></tr></tbody></table>

신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

지 루트 신경 절 (DRG) 포함 감각 뉴런의 셀 시체. 신경의이 유형은 의사는 유 니 폴라, 주변 조직, 피부, 근육, 내장 기관 뿐만 아니라 중앙 신경의 척수 등 혼을 자극 하는 두 개의 축 삭과 이다. 감각 뉴런 체세포 센 세이 션, 터치, 고통, 열, 및 고유 감각을 포함 하 여 전송 합니다. 따라서, DRG 기본 문화 nociception의 셀룰러 메커니즘, 감각 신경, 신경 발달의 생리 기능 연구에 널리 사용 됩니다. 교양된 신경 생리학, 신호 변환, 신경 전달 물질 방출, 또는 칼슘 이미징 연구에 적용할 수 있습니다. DRG 기본 문화권, 과학자 들은 단일 생 화 학적 변화를 모니터링 끊된 DRG 뉴런 문화 수 있습니다 또는 vivo에서 실험과 관련 된 많은 한계를 극복 하는 여러 셀. 에 비해 상업적으로 사용 가능한 DRG hybridoma 세포 선 또는 불멸 하 게 DRG 신경 세포 선, 구성 및 1 차 셀의 속성은 감각 신경 조직에 훨씬 더 비슷합니다. 그러나, 하나의 동물에서 격리 될 수 있는 교양된 DRG 1 차 셀의 제한 된 수의 그것은 연구 대상으로 하는 약물에 대 한 높은 처리 화면을 수행 어렵다. 현재 문서에서 DRG 컬렉션 및 문화를 위한 절차를 설명 합니다. 또한, 우리 교양된 DRG 셀 neuropeptide FF 수용 체 타입-2의 주 작동 근 유도 펩타이드 신경 전달 물질 (칼 시 토 닌 유전자 관련 펩 티 드 (CRGP)와 물질 P (SP))의 릴리스 (NPFFR2)의 처리를 보여 줍니다.

24-잘 접시에 배양 쥐 요 추 DRG 뉴런 glial 세포 증식을 억제 하기 위해 추가 아 라-C와 신경 성장을 지원 하기 위해 NGF 문화 매체에서 성장 했다. 생활의 형태 DRG 세포 관찰 되었다. 그림 3에서 같이, 단일 뉴런의 세포 체 하루 1 접시의 바닥에 연결 되었고 관찰에 대 한 선택. 축 삭 성장 하루 1-3에서에서 모니터링 했다. Glial 세포 복제 하 고 프로세스를 둘러싸고 감각 뉴런의 세포 체를 확장. 다른 문화에서 CGRP 단백질은 신경 세포의 형태를 공개 하 스테인드. 그림 4, CGRP 단백질 얼룩 세포질 및 감각 신경 세포의 축 삭에 표시 됩니다. 신경 그리고 glial 세포의 핵 형태학은 DAPI 물 들일 때 가지. 뉴런 glial 세포 보다 더 크고 더 둥근 핵을가지고. 비교 함으로써, 명과의 핵은 더 타원형 모양 (<strong ...

지 루트 중추 (DRG) 주 문화 자주 생리 기능 또는 감각 신경에서 병리학 관련 이벤트를 공부 하는 데 사용 됩니다. 여기, 허리 DRG 문화 neuropeptide FF 수용 체 선택적 길 항 제와 함께 2 자극 입력 신경 전달 물질의 릴리스를 감지를 사용 하 여를 설명 합니다.

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

이 방법은 주변 고치와 같은 감각 연구 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 대부분의 생리적 상태를 시뮬레이션 하는 모델감각 뉴런의 세포 메커니즘을 조사 하는 것입니다. 2~3주 된 쥐의 트렁크에서 요추 등 뿌리 간리아를 수집합니다.척추의 측면을 따라 두 개의 컷을 만들고 요추 척추의 장밋빛 정도를 표시하기 위해 측면 절단을 합니다. 그런 다음 뼈 절단 집게를 사용하여 척추의 등뼈 근육을 제거하십시오. 다음으로 척추의 등대 부분을 제거하고 척수를 노출시십시오.그런 다음 해부 가위와 집게를 사용하여 척수를 제거하십시오. 마지막 갈비뼈에서 척추를 계산하여 요추 DRG를 식별합니다. 이 다이어그램은 척추 위치를 보여줍니다.마이크로 가위를 사용하여 L1에서 L6까지 12개의 양자 요추 DRG를 수집합니다. 배양의 순도를 향상시키기 위해 부착 된 신경 섬유를 제거하십시오. 각 요추 DRG를 35mm 배양 접시에 얼음 냉간 세럼 프리 배지 2밀리리터가 들어 있는 접시로 옮긴다. DRG 함유 35mm 접시를 라미나르 후드로 옮기고, 피펫으로 세럼이 없는 배지로 DRG를 세척합니다.멸균 핀셋을 사용하여 DRG를 멸균 콜라게나아제 타입 1A 의 2밀리리터를 포함하는 새로운 35mm 배양 요리로 이동합니다. 콜라게나아제 용액에 37도 의 조직 배양 배양기를 30분 간 배치하여 세포의 해리를 시작합니다. 인큐베이션에 이어 콜라게나제 용액을 제거하고 행크의 균형 잡힌 소금 용액 2밀리리터로 DRG를 세 번 세척합니다.다음으로, 요리에 사전 0.05%의 트립신 EDTA의 2밀리리터를 추가하고, 이전과 같이 30분 동안 인큐베이터에서 DRG를 소화합니다. 소화 후 유리 파이펫을 사용하여 DRG 함유 용액 2밀리리터를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 전송합니다. DRG는 유리 파이펫에 충실할 수 있으므로 이 단계를 주의해서 수행해야 합니다.실제 손실은 유리 파이펫의 테이퍼 끝에 DRG 함유 솔루션을 유지하고 솔루션을 원심분리기 튜브로 천천히 전송하지만 일시 중지없이 방지 할 수 있습니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 5분간 290배 G로 용액을 원심분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 제거하고 DRG를 다시 중단하는 세럼이없는 매체의 또 다른 두 밀리리터를 추가합니다.마지막 원심 분리 후 조직을 다시 중단하기 위해 미리 따뜻해진 배양 배지의 2밀리리터를 사용하여 세척을 두 번 반복합니다. 이전에 준비된

dorsal-root-ganglia-isolation-primary-culture-to-study

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 지느러미 루트 신경의 culturing 감각 뉴런에 compartmented 회의소 준​​비 및 유지 관리의 기법을 설명합니다.

Compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

이 비디오는 쥐 배아에서 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런을 분리하고 슈반 세포 전구체와 공동 배양하여 성숙한 슈반 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다. 분리된 DRG는 뉴런과 신경교세포를 분리하기 위해 처리됩니다. 분리된 세포를 배양하여 뉴런을 정제한 다음, 공동 배양 배지에서 슈반 세포 유사 세포(SCLC)와 공동 배양합니다. DRG 뉴런과의 상호 작용은 SCLC가 슈반 세포로 성숙하도록 유도합니다.

DRG 뉴런의 분리 및 Schwann 세포 전구체와의 공동 배양을 통해 Schwann 세포 생성

이 비디오는 분리된 마우스 DRG 조직을 사용하여 등쪽 신경절 또는 DRG 외식 배양 및 DRG 해리 세포 모델을 개발하는 방법을 보여줍니다. 이러한 모델은 통제된 환경에서 뉴런-아교세포 상호 작용이 있는 다양한 메커니즘을 연구하는 데 도움이 됩니다.

등뿌리 신경절 이식 및 해리된 세포 배양 생성

이 비디오는 배측근신경절(dorsal root ganglia, DRG)에서 뉴런을 채취하는 방법을 보여줍니다. 쥐의 척추에서 채취한 DRG를 분리하고 효소로 처리한 다음 기계적으로 해리하여 단세포 현탁액을 얻습니다. 뉴런은 밀도 구배 원심분리를 사용하여 신경교세포에서 분리되고 성장 배지에서 배양됩니다.

A Techniques for Haulsal Root Ganglia for Neuronal Cultures(신경 세포 배양을 위한 등뿌리 신경절의 수확 및 해리)

이 비디오는 쥐의 척추에서 등뿌리신경절(DRG) 세포를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 척추에서 절제된 DRG는 효소로 처리되고 기계적으로 해리되어 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포는 각각 신경교세포 증식을 제한하고 신경 세포 성장을 촉진하는 억제제와 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양됩니다.

쥐의 척추 기둥에서 1차 등뿌리 신경절 세포 배양 확립

이 비디오는 형질주입된 등뿌리 신경절 세포를 사용하여 신경펩타이드 수용체 작용제로 신경전달물질 방출을 자극하여 신경전달물질 방출을 연구하는 방법을 보여줍니다.

신경 펩티드 수용체 작용제를 이용한 등쪽 뿌리 신경절 감각 뉴런의 자극

이 프로토콜은 다중 구획(MC) 장치에서 성인 Sprague Dawley 쥐에서 이식된 배근 신경절(DRG)을 수확하고 배양하는 기술을 제공합니다.

말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.

이 프로토콜은 마우스 등뿌리신경절(DRG)의 전체 마운트 및 해리 배양을 확립하는 방법과 종양-신경 상호 작용을 평가하는 데 사용하는 방법을 설명합니다.

배근 신경절 배양의 체외 모델 확립: 암-신경 누화 조사를 위한 보완적 접근 방식

등근 신경절(DRG)은 1차 감각 신경세포체를 포함하며 주변 감각 신호를 척수로 전달합니다. 이 프로토콜은 구조적으로 온전한 신경절의 표준화된 분리, 해부학적 분절 식별, 초보자를 위한 직관적 안내, 그리고 시술 조직 손상 감소를 지원하는 마우스 DRG 해리 방법을 설명합니다.

쥐 등근 신경절의 해리 및 분리

학습하세요 척추 후근신경절(DRG) 원발 배양법으로 신경전달물질 방출을 연구하는 방법입니다. 쥐의 요추 DRG에서 감각 신경원을 분리 배양하여 NPFFR2 자극에 따른 생리학적 반응을 분석할 수 있습니다.

신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

더 많은 동영상 탐색