Name: 세포 배양 및 피부 응용 프로그램에 대 한 영화 복합 실리콘 탄성 체를 얇은: 제조 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 배우세요 PDMS 박막 복합체 제조 및 접착 특성 분석 방법을 통해 세포 배양 및 피부 부착제에 활용하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 약 3시간 내에 완료할 수 있습니다.

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마틴 Danner 샘플 및 세포 문화 절차의 설립 준비에 그의 원조에 대 한 인정 이다. 저자는 베른하르트 Spezialchemie GmbH (함부르크, 독일), 지속적인 지원 및 토론에 대 한 특히 로버트 Radsziwill에 게 감사 하 고 싶습니다. 이러한 결과 연구는 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP/2007-2013) ERC 부여 계약 n. 340929 아래 유럽 연구 위원회에서 자금을 받았다.

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저자는 공개 없다.

복합 구조의 디자인에는 물질의 성질, 탄성 계수 또는 샘플의 두께 등의 간단한 조정 수 있습니다. PDMS의 영의 계수는 두 구성 요소 간의 혼합 비율을 변경 하거나 다른 실리콘 탄성 중합체30,31를 사용 하 여 혼합 제조 하 여 넓은 범위에서 효과적으로 바뀔 수 있다. 설명된 방법에 국한 되지 않습니다 PDMS의 현재 조사에 사용 하지만 특히 접착 성능 강하게 사용 특정 유형에 따라 다릅니다. 이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 복합 필름 (그림 1)의 제조 과정입니다. 그것은 그 두께 영화의 동작에 영향을 크게 접착 피부 (그림 5 및 그림 6)를 포함 하 여 다른 기판에 영화의 표시 했다. 필름 두께 뿐만 아니라 시간과 치료 과정 동안 온도 물성32을 영향을 줍니다. 따라서, 고분자 층의 두께 매개 변수 신중 하 게 적응 하 고 확인 해야 합니다.
박막의 접착 속성의 분석 직력 접착 측정 다른 표면 거칠기 Ra 최대 두 개의 유리 기판 사용 하 여 수행한 = 0.338 µ m (그림 3). 일반적으로, 거칠기에 미치는 영향 크게 표면, 특히 탄성 재료33,34의 접착. 유리의 거칠기 다른 asperity 크기, 따라서 수 있도록 높은 거칠기 값21전시 기판의 제조의 샌드 페이퍼로 연마 하 여 쉽게 변화 될 수 있다. 또한, 기타 자료, 예를 들어 에폭시 수 지 사용할 수 있습니다 기판15,35의 생산을 위해. 이 제시 프로토콜의 중요 한 수정 전략을 수 있습니다. 예를 들어 서로 다른 표면 자유 에너지를 전시 하는 기판은 필요한 또는 특정 topographies 있다면 필요. 여기, 풀에서 스트레스와 PDMS와 특수 제조 된 박막의 분리의 작품 사용자 설정 (거시적인 접착 력 측정 장치 (매드, 그림 4))으로 분석 되었다. 36 기판의 indenter 광학 정렬 측정 결과의 분석을 위한 중요 한 단계입니다. 따라서, 기울기 각도의 조정 가능한 정확한 각도 사용 하 여 수행 해야 합니다. 이 여 수동으로 필름 표면 접촉 기판 수평 접촉 달성 될 때까지 충분 한 정밀도를 얻을 수 있습니다.
현재 프로토콜에서 지속 시간 1 초 (그림 5 및 그림 7)에서 일정 유지 되었다. 거친 기판 표면에 탄력 있는 영화의 접착 성능 조사를 위해 특히 보류 시간 확장 추가 정보를 제공합니다. 예를 들어 보류 시간 증가 함께 풀 오프 스트레스 증가 보고8되었습니다. 현재 프로토콜을 다른 방법에서 수행 하는 측정 이외에 예 필 테스트 수 수행할 수, 접착 성능37의 포괄적인 조사를 허용.
복합 필름 다른 필름 소프트 스킨 접착제의 두께 결정 되었다 전시 (그림 7)의 접착 속성. 우리의 결과 게시 된 데이터, 그는 감 금, 즉, 기판 직경 및 필름 두께, 증가38,39 사이의 비율 풀에서 스트레스의 증가를 필름 두께의 감소를 보여주는 라인 . 이러한 결과 그림 7에 표시 된 데이터를 바탕으로, 우리는 결론을 약 100 µ m (약 40 μ m의 두께 가진 PDMS 영화에 적용 약 60 µ m의 특수 층의 두께)의 총 두께 가진 복합 영화 유리한 접착 p 전시 거친 표면에 roperties입니다.
다음, 깨끗 한 복합 영화에 생물 학적 특성에 관련 된 실험 수행 되었습니다 그리고 플라즈마 치료 복합 필름 (그림 8). 실리콘 탄성 체의 플라즈마 처리 표면 및 세포 부착 및 휴대40,41확산의 친수성 특성을 증가 하는 자주 적용, 다양 한 기법입니다. 실리콘 그들의 낮은 독성과 높은 biostability에 대 한 유명 하지만 잔여 단위체 또는 세포 독성42,43에 또한 지도 하는 생리 적 프로세스에 영향을 줄 수 있는 촉매를 포함 될 수 있습니다. 에 우리가 관찰 실시 실험 보다 5% 세포 독성 LDH 릴리스 표시기 및 Trypan 블루 제외 분석 결과 사용 하 여. 제시 프로토콜, 전체 세포 인구 세포 집계를 포함 한 표면 확산 분석 (그림 9B) 위해 분석 된 형태로 분리. 프로토콜의 보다 차별화 된 결과 생산할 수 있는. 각 샘플에 대 한 상쾌한 분리 된 세포 집계를 포함 하는 별도 반응 관에 전송 고 효소 폴리머 표면에서 제거 하는 세포와 결합 되지 않이 될 수 있습니다. 이 세포 표면에 부착 된의 정확한 평가 허용 하 고 결국 세포 접착 과정에는 폴리머의 영향의 더 상세한 결정을 공개 것입니다. 여기에 제시 된 immunocytochemical 방법, 이외에 셀 immunoblot 방법, 단백질 식의 구체적인된 양적 평가 수 있도록 조사에 대 한 수확 수 있습니다.
요약, 우리는 탄성 복합 박막 고급 셀 문화 연구에 응용 프로그램에 대 한 생산 제조 조건 확립. 또한, 이러한 박막 거칠음, 피부 접착제의 정교한 디자인을 사용 하면 피부에 높은 적응성을 소유한 다.

이 프로토콜에서 얇은 탄성 중합체 필름 생산을 위한 상세한 방법 제공 됩니다. 널리 의사 블레이드 기술은 복합 박막의 생산에 사용 되었습니다. 제조 방법 polyethylenterephtalate (애완 동물) 포 일, 대규모에서이 영화의 후속 생산 사용에 수행 되었습니다. 이 프로토콜의 중점은 재현성, 정확한 합성 영화의 다른 레이어와 최종 합성 패치의 생물 및 접착 속성의 결정의 제조의 평가 이다. 실리콘 엘라 스토 머 poly-(dimethylsiloxane) (PDMS)은 피부 접착제, 마이크로 응용 프로그램 및 추가 연구 분야1,2,3의 생산을 포함 하 여, 생물 의학 기술에 광범위 하 게 사용 ,4. 최근, PDMS, 부드러운 피부 접착제 (SSAs) 소위의 다른 서브 클래스 도입, 부드러운 피부 결합 및 결합 해제에 대 한 특정 있다.
실리콘 SSAs 실리 카5강화의 부재에 의해 유사한 중합체에서 서로 다른 기능성된 비닐 탄성 체입니다. 비슷한 다른 PDMS, SSA의 탄성 계수 수 적응 시킬 다양 한 변조 cross-linker 농도 또는 경화 시간6,,78. 이 실리콘 탄성 체의 탄성 계수에 크게 재료의 접착 특성에 영향을 미치는 변화와 간결한 및 진 핵 세포 표면9,10 에 교양에 깊은 결과가 또한 있다 , 11. 세포 생물학 수준에서 그것은 표시 했다, 진 핵 세포 신호 변환 수준에 매트릭스 탄성의 변조 또는 표면9,10,12의 두께에 대응 ,,1314. 따라서, 셀 문화 가변 기계적 특성을 가진 고분자의 애플 리 케이 션에 광범위 한 관심을 존재 한다. 중요 한 것은, 본질적으로 낮은 표면 에너지 기반 실리콘 탄성 체의 진 핵 세포의 세포 배양을 위한 최적의 조건을 제공 하지 않습니다. 산소 플라즈마 처리는 증가 PDMS 낮은 표면 에너지 일시적으로, 풀-오프 강도 향상을 선도 하는 널리 사용 되 기술 감소 첨부, 확산을 추진 하는 동시에 분자의 표면 흡착 하 고 진 핵 세포15,16,,1718의 확산.
재료 속성 뿐만 아니라 표면 지형을 크게 세포 접착 및 두 재료19,20,,2122사이 접착 상호 작용 영향을 줍니다. 표면 거칠기는 연락처 형성 두 표면 사이 여러 가지 효과: 접촉 지역, 높은의 감소 뿐만 아니라 균열 전파에 영향 접착 력23, 변경할 수 있는 asperities를 둘러싼 탄성 에너지 저장 24. 인간의 피부에 접착 필름의 접착은 한 신흥 응용 분야, 예를 들어, 상처 드레싱, ECG 전극의 고정 또는 다른 전자 장치를 착용 할 수 있는25,,2627, 28. 표면 지형에 관하여 자기-접착제의 접착 성능을 측정 하기 위해 거칠기의 학위를 변화와 함께 유리 기판 일반 접착 측정8,21에서 사용할 수 있습니다. 여기, 두 개의 유리 기판 고분자 필름의 접착 속성을 조사 선정 됐다. 10 1 중량 부품 PDMS 다른 혼합 비율 적용의 혼합 비율에 PDMS 백업 층으로 첫째, 복합 필름 특징 이었다. 두 번째 단계에서 접착제 특수 계층 동등한 무게 양의 두 구성 요소와 지원 PDMS 필름 위에 두께 변화를 준비 했다.

<table><tbody><tr><td>2-프로판올, 97%</td><td>Stockmeier Chemie</td><td>1000452610000</td><td>Isopropanol</td></tr><tr><td>연마 diamnod 핸드 패드</td><td>Bohle</td><td>MO 5007522</td><td>Grit: 220</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Capricorn Scientific</td><td>ACC-1B</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraktion V</td><td>Roth</td><td>0163.2</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A12379</td><td>highly 독성</td></tr><tr><td>Aquamount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td>수용성 장착 매체</td></tr><tr><td>CytoTox-ONE 균질 멤브레인 무결성 분석</td><td>Promega</td><td>G7890</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Ca2+, Mg2+</td> 제외<td>ThermoFischer Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 골드</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>A15-151</td><td>FBS</td></tr><tr><td>고니오미터 OCA35</td><td>정전기 접촉각 측정을 위한</td><td>데이터 물리학</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst Dye 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155-100MG</td><td>bisBenzimide H 33342 트리하이드로클로라이드, 고독성</td></tr><tr><td>현미경 Axiovert 25</td><td>Zeiss</td><td></td><td>세포 배양 문서화에 사용되는</td></tr><tr><td>현미경 현미경 Eclipse</td><td>LV100ND Nikon</td><td></td><td>막 두께 측정에 사용되는 현미경</td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 수용액 16%</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT 15710</td><td>전자 현미경 등급</td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Phenom XL 주사 전자 현미경(SEM)</td><td>Phenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-(비닐 알코올) 4-88, MW 31000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381-1KG</td><td>Mowiol 4-88</td></tr><tr><td>폴리-디메틸 실록산, Sylgard 184</td><td>다우코닝</td><td>(400)000108351397</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>RPMI 1640 기초 매체</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>소프트 스킨 접착제(SSA)</td><td>다우코닝</td><td>(400)000108251792</td><td>MG 7-9800 소프트 스킨 접착제(SSA)</td></tr><tr><td>스피드 믹서 DAC 600.2 VAC-P</td><td>하우스차일드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스타일러스 profilomter</td><td>Zeiss</td><td></td><td>모델: SURFCOM 1500SD3</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 pro</td><td>Tecan</td><td></td><td>형광 플레이트 리더</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Calbiochem</td><td>648466</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>고독성</td></tr><tr><td>트립신/EDTA 솔루션</td><td>PAN-Biotech</td><td>P10-023500</td><td>0.05% 트립신, 0.02% PBS의 EDTA</td></tr><tr><td>UV 접착제</td><td>Bohle</td><td>BO MV76002</td><td>중간 점도</td></tr></tbody></table>

세포 배양 및 피부 응용 프로그램에 대 한 영화 복합 실리콘 탄성 체를 얇은: 제조 및 특성

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

이 프로토콜에서 선물이 얇은 탄성 복합 필름 고급 셀 문화 응용 프로그램 및 피부 접착제의 개발에 대 한 조작 하는 방법. 두 개의 다른 폴 리-(dimethyl siloxanes) (PDMS와 소프트 스킨 접착제 (SSA)), 생물학적 효과 및 접착 특성의 깊이 조사에 대 한 사용 되었습니다. 유연한 백업 층 및 접착 최고 코팅 복합 필름에 의하여 이루어져 있다. 두 레이어 의사 블레이드 응용 프로그램 기술에 의해 제조 되어 있다. 현재 조사에 복합 필름의 접착 동작 레이어 두께의 함수 또는 상위 계층의 영의 모듈러스의 변형으로 조사 되었습니다. PDMS의 영의 계수는 crosslinker 혼합 비율에 기초를 변화 하 여 변경 되었습니다. 또한, 특수 필름의 두께 약 16 µ m에서 약 320 µ m. 스캐닝 전자 현미경 (SEM)으로 변화 되 고 광학 현미경 두께 측정을 위해 사용 되었습니다. 탄성 중합체 필름의 접착 속성 강하게 필름 두께, 중합체 및 표면 특성의 영의 계수에 따라 달라 집니다. 따라서, 부드럽고 거친 표면 전시 유리 기판에이 영화의 일반 접착 조사 되었습니다. 스트레스 풀 오프와 분리의 실리콘 탄성 체의 혼합 비율에 따라 달라 집니다.
또한, 지원 배경 레이어 위에 부드러운 피부 접착제의 두께 피부 응용 프로그램에 대 한 패치를 생성 하기 위하여 변화 되었다. 세포 독성, 확산 및 PDMS 영화 (혼합 비율 10:1)와 특수 필름 (비율 50: 50 혼합)에 L929 murine 섬유 아 세포의 세포 접착 실시 되었습니다. 우리는 여기에 표시 된, 처음으로, 두 고분자의 제조 복합 박막의 측면에서 비교 하 고 그들의 생물 학적 및 접착 속성의 조사를 제시.

다른 영의 계수 또는 두께 가진 고분자 박막 복합 구조의 제조 프로세스에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 영화는 고급 셀 문화 연구에 대 한 또는 피부 접착제로 생산 됩니다.

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

이 절차의 전반적인 목표는 고급 세포 배양 연구를 위한 고분자 박막 복합 구조를 제조하고 특성화하거나 피부 접착제로 특성화하는 것입니다. 이 방법은 엘라스토머 복합재를 사용하여 불규칙한 표면에서도 최적의 접착 작용을 달성하는 방법에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 간단하고 보편적으로 적용할 수 있다는 것입니다.이를 통해 매우 높은 정밀도로 대규모 제조가 가능합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 접착력 측정에 필요한 정밀도를 달성하기 위해 집중적인 교육과 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 세포 배양 절차와 혈장 응용을 시연하는 것은 우리 연구실의 기술자인 Angela Rutz가 맡을 것입니다.PDMS를 준비하려면 진공 상태에서 2350RPM의 스피드 믹서에서 3분 동안 프리폴리머 혼합물 1.1g을 혼합 및 탈기합니다. PDMS 백킹 레이어를 준비하려면 자동으로 제어되는 닥터 블레이드 도포 기계를 사용하십시오. 100% 이소프로판올로 세척된 PET 호일 조각 위에 닥터 블레이드를 놓고 마이크로 포지셔닝 나사를 사용하여 백킹 레이어의 두께를 조정합니다.PDMS를 일회용 10ml 주사기에 넣습니다. 닥터 블레이드의 저장소를 폴리머로 채우고 초당 약 2mm의 속도로 블레이드의 움직임을 시작합니다. PET 필름 조각이 코팅되면 필름을 섭씨 95도의 오븐에 1시간 동안 옮깁니다.복합 필름의 최상층을 준비하려면 블레이드를 사용하여 지지층의 긴 면에서 얇은 스트립을 제거합니다. 닥터 블레이드를 PET 호일에 미끄러지게 하고 앞에서 설명한 대로 PDMS의 두 번째 층을 적용합니다. 그런 다음 호일을 오븐에 넣습니다.접착력 측정을 위해 샘플을 준비하려면 면도날을 사용하여 PET 호일의 필름을 4제곱센티미터 크기로 자르고 UV 접착제를 사용하여 조각을 유리 슬라이드에 고정합니다. 3분 동안 UV 광선으로 조각을 비추고 첫 번째 고분자 샘플을 샘플 홀더에 장착합니다. 측각계를 사용하여 기판이 카메라 이미지로 시각화된 대로 두 표면의 완전히 평행한 정렬로 고분자 필름과 접촉할 때까지 기울기 각도를 조정합니다.시료에 대한 기판의 광학 정렬은 측정 결과를 해석하는 데 매우 중요합니다. 따라서 경사각 조정은 경사계를 사용하여 가능한 한 정확하게 수행해야 합니다. 13 플러스 또는 마이너스 5 킬로파스칼의 예압 응력이 달성될 때까지 정렬된 기판을 고분자 필름 표면으로 이동하고 LabView로 작성된 사용자 정의 프로그래밍 소프트웨어 패키지를 시작합니다.그런 다음 각 필름 표면의 6개의 서로 다른 위치에서 독립적으로 제조된 3개의 샘플의 접착 특성을 측정하는 데 필요한 측정 매개변수를 설정합니다. 광학 현미경 검사를 위해 필름을 준비하려면 면도날을 사용하여 고분자 샘플을 0.25제곱센티미터 조각으로 자르고 조각을 유리 슬라이드의 가장자리에 부착합니다. 그런 다음 슬라이드를 수직 방향으로 정립 현미경 아래에 놓고 필름 단면의 두께를 측정합니다.세포 배양 실험을 준비하려면 먼저 메스를 사용하여 PET 지지층에서 약 5 x 5mm 조각을 자르고 핀셋을 사용하여 조각을 개별 12mm 유리 커버 슬립에 옮깁니다. 덮개 슬립을 플라즈마 장치의 반응 챔버 내부로 옮기고 장치 덮개를 닫습니다. 1.6 곱하기 10에서 마이너스 2 밀리바 압력에 도달할 때까지 챔버를 비우고 3분 동안 플라즈마로 필름을 처리합니다.그런 다음 반응 챔버를 환기시키고 샘플을 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 다음으로, 칼슘 및 마그네슘이 없는 DPBS가 함유된 70-80% 융합 L929 세포 배양액을 층류 캐비닛에서 30초 동안 세척합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 5%CO2에서 2ml의 적절한 단백질 분해 및 콜라겐 분해 용액을 5분 동안 배양합니다.세포가 분리되면 8ml의 혈청 보충 배지를 추가하고 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 계수 후, 고분자 샘플을 포함하는 24 웰 플레이트의 웰 당 배지 밀리리터 당 60, 000 세포를 시드하고, 위상 대비 이미지 캡처 및 고정 전에 3 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 상부 필름의 두께에 따라, 기판 표면의 질감에 관계없이 필름 두께가 증가함에 따라 풀오프 응력의 감소가 관찰됩니다.그러나 분리 작업은 일반적으로 매끄러운 기판 표면에 비해 거친 기판 표면의 경우 약간 낮습니다. 분리 메커니즘이 기록될 때, 가장 얇은 필름에서는 캐비테이션이 거의 관찰되지 않는 반면, 더 두꺼운 필름에서는 손가락 모양의 균열이 관찰됩니다. 세포 배양 실험에 따르면 원시 폴리머에 파종된 세포는 부착 상태가 좋지 않고 세포 확산 거동을 보이는 반면, 플라즈마 처리된 표면에서 배양된 세포에서 융합 단층이 관찰됩니다.일반적으로 젖산 탈수소분해효소 수준은 두 고분자 물질에서 배양된 세포에 대해 비슷하며 세포 독성은 5% 미만입니다. 일단 마스터하면 고분자 필름 복합재의 생산은 약 3시간 내에 완료될 수 있습니다. 일반 점착 테스트를 사용한 후속 분석에는 교육이 필요하지만 필름의 접착 특성을 조사하기 위한 매우 강력한 도구입니다.이 동영상을 시청한 후에는 얇은 고분자 복합 필름을 제조하는 방법과 특정 접착 테스트 및 세포 생물학적 도구를 사용하여 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 화학 물질 및 생물학적 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 필수 안전 절차를 따르고, 개인 안전 보호 장비를 착용하고, 이러한 물질을 안전 캐비닛에서 취급하는 등 적절한 예방 조치를 취하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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