레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

이 레이저 현미해부 절차의 전반적인 목표는 후속 RNA 분리 및 다운스트림 발현 분석을 위해 레이저 캡처 현미경을 사용하여 마우스 눈에서 고도로 농축된 섬유주 그물망을 분리하기 위한 강력하고 재현 가능한 방법을 개발하는 것입니다. 이 방법은 잘못 조절될 경우 안구 질환으로 이어질 수 있는 중요한 유전자 및 신호 전달 경로가 무엇인지와 같은 안과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 발현 분석을 위해 마우스 눈의 섬유주 그물망에서 고품질 RNA를 재현성 있게 분리할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 레이저 현미해부는 전체 프로토콜에 걸쳐 다양한 문제 해결 단계를 포함하는 강력한 기술이기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 레이저 현미해부를 위한 최적의 조직 채취로 이 절차를 시작합니다. RNase 오염 제거 용액을 브러시, 집게, 커플링 용기 및 장착 척에 분사합니다.

철저히 닦은 후 뉴클레아제가 없는 물로 기기를 헹구고 건조시킵니다. 교차 오염을 방지하기 위해 100% 에탄올로 저온 유지 장치를 닦아냅니다. 마운팅 척에 소량의 OCT를 짜낸 다음 금형에서 조직 블록을 제거하고 블록을 마운팅 척에 조심스럽게 놓습니다.

장착 척의 조직 블록이 단단히 얼면 저온 유지 장치의 표본 홀더에 삽입합니다. 다음으로, 저온 유지 장치를 조정하여 8미크론 절편을 절단하고 O.C.T. 블록을 통해 조심스럽게 절편하여 조직 샘플에 도달합니다. 조직이 관찰되면 절편을 중지하십시오.

깨끗한 면도날을 사용하여 모든 면의 얼어붙은 블록을 다듬고 티슈 주위에 3-4mm의 OCT를 남겨 두어 페인트 브러시로 다룰 수 있도록 합니다. 눈을 통해 절단하고 빠르게 작업합니다. 60초 동안 빠른 원스텝 H&E 스테인으로 슬라이드를 가득 채워 세 번째 섹션마다 얼룩을 더럽힙니다.

수돗물로 섹션을 헹구고 자연 건조하십시오. 투명화제로 섹션을 청소한 후 커버 슬립으로 충전된 유리 슬라이드에 섹션을 장착하고 현미경으로 검토합니다. 염색된 부분에서 TM이 분명해질 때까지 절편을 계속합니다.

TM이 나타나기 시작하면 두 개의 절편을 절단하고 일상적인 H&E 염색을 위해 충전된 유리 슬라이드에 장착하여 레이저 캡처 현미해부로 절단하기 위한 지도를 형성합니다. 첫 번째 H&E 맵 슬라이드 후, 저온 유지 장치에서 8미크론 두께의 직렬 섹션 6개를 절단하여 정렬한 다음 동시에 PET 멤브레인 슬라이드에 장착합니다. 장갑을 낀 엄지손가락으로 멤브레인 뒤쪽을 따라 짧게 밀어 조직을 부착합니다.

장착 후 PET 멤브레인 슬라이드를 드라이아이스의 슬라이드 상자에 즉시 넣습니다. 계속해서 눈을 절개합니다. 각각 6개의 섹션이 있는 2개의 PET 멤브레인 슬라이드마다 하전된 유리 슬라이드에서 2개의 섹션을 수집하여 H&E 염색을 위한 또 다른 맵 슬라이드를 만듭니다.

TM이 더 이상 보이지 않을 때까지 약 100개의 연속된 8미크론 두께 절편을 계속 절편화합니다. 충전된 유리 슬라이드의 한 부분을 빠르게 염색하여 TM의 부족을 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 H&E 맵 슬라이드 염색을 수행한 후 현미경을 사용하여 H&E 슬라이드를 시각적으로 검토합니다.

TM이 명확하게 보이고 절단을 위해 접근할 수 있는 지도 슬라이드를 식별합니다. LCM에 대해 이러한 맵 슬라이드 사이에 PET 멤브레인 슬라이드를 사용합니다. 영하 80도의 냉동고에서 냉동 조직 섹션이 들어 있는 슬라이드 상자를 꺼내 드라이아이스에 올려 놓습니다.

슬라이드를 한 번에 하나씩 처리합니다. RNase 억제제가 함유된 차가운 75% 에탄올에 슬라이드를 즉시 30초 동안 넣어 단면을 고정합니다. 조직 단면을 방해하지 않고 O.C.T.를 용해시키기 위해 10-15초 동안 슬라이드를 뉴클레아제가 없는 물에 부드럽게 담그십시오.

300 마이크로 리터의 1.5 % 크레실 바이올렛 아세테이트 용액을 조심스럽게 섹션에 직접 피펫하고 실온에서 45 초 동안 배양합니다. 그런 다음 75% 에탄올 수조에 30초 동안 넣어 섹션을 한 번 세척합니다. 200 마이크로 리터의 Eosin Y 용액을 섹션에 피펫팅하고 3-5 초 동안 배양합니다.

슬라이드를 75% 에탄올, 95% 에탄올, 마지막으로 100% 에탄올 욕조에 각각 30초 동안 배치하여 조직을 탈수합니다. 과도한 액체를 제거하기 위해 모든 단계 사이에 티슈 물티슈로 슬라이드 끝을 닦습니다. 후드 아래에서 슬라이드 공기를 5분 동안 완전히 건조시킵니다.

건조되면 그 직후 LCM을 수행하십시오. 마지막 세척 단계에서 자일렌을 사용하지 마십시오. 크실렌 처리는 조직 섹션이 멤브레인 슬라이드에 부적절하게 장착되도록 합니다.

크실렌은 또한 LCM에 의한 조직 포획의 효율성을 감소시킵니다. 염색된 조직 면이 아래를 향하도록 PET 멤브레인 슬라이드를 현미경 스테이지에 로드된 새 유리 슬라이드 바로 위에 놓습니다. 멤브레인과 유리 슬라이드가 현미경 스테이지에서 단단히 페어링되어 있는지 확인하십시오.

먼저 슬라이드 한계를 설정하여 LCM을 시작합니다. Objective(대물) 패널에서 가장 낮은 4X 배율을 선택한 다음 금속과 멤브레인이 만나는 왼쪽 상단 모서리가 라이브 비디오 피드에서 보일 때까지 현미경의 XY 스테이지를 이동하여 멤브레인 슬라이드의 작업 영역을 정의합니다. 이 시점에서 Limit 1 버튼을 누르면 빨간색 사각형이 도로 지도에 나타납니다.

그런 다음 XY 스테이지를 반대쪽 모서리로 이동하고 Limit 2 버튼을 누릅니다. Scan 버튼을 눌러 설정된 한계 사이의 멤브레인과 조직의 로드맵 이미지를 생성합니다. 도로 지도에 있는 눈 부분 중 하나의 TM 근처를 두 번 클릭합니다.

TM은 홍채각막각의 정점 근처에 위치할 수 있습니다. TM이 식별되면 배율을 10X로 늘리고 수동으로 TM에 초점을 맞춥니다. 20X 및 40X 대물렌즈로 반복합니다. TM이 40X 대물렌즈에 초점이 맞춰지면 빈 영역으로 이동하여 자유형 그리기 도구를 선택하고 조직의 빈 영역에 긴 선을 그립니다.

절단 속도가 34%, 초점이 58%, 출력이 70%가 되도록 레이저 매개변수를 설정한 다음 절단 버튼을 누릅니다. 명확하고 미세한 절단선이 관찰될 때까지 속도, 초점 및 출력 매개변수를 미세 레이저로 조정합니다. 정확한 절단을 위해 절단 동작이 그려진 선을 따르는지 확인하십시오.

그런 다음 분리 튜브 뚜껑을 캡 홀더에 넣고 튜브를 엽니다. 캡 홀더를 캡 리프트에 부착하고 튜브가 뒤집혀 있는지 확인합니다. 또한 접착 캡 재료가 캡 끝 너머로 돌출되어 원하는 조직이 제대로 포착되도록 합니다.

섬유주 그물망이 집어올려져 격리 캡에 부착되었는지 시각적으로 확인하는 것이 중요합니다. 소프트웨어 패널에서 수동 해부 모드를 선택합니다. TM이 분리 튜브 바로 아래에 있는지 주의 깊게 검토하십시오.

화이트 밸런스를 설정하고 밝기를 조정하여 최적의 이미지 품질을 얻습니다. 자르기를 시작하려면 수동으로 초점을 조정하고 자유형 도구를 사용하여 선을 그립니다. 수집 캡이 아직 멤브레인에 닿지 않고 위쪽 위치에 있는지 확인하십시오.

TM이 공막과 만나는 곳 근처에 부분 원을 그리고 Cut을 누릅니다. 첫 번째 절단이 완료되면 캡을 아래쪽 위치에 놓고 초점을 다시 조정한 다음 열린 공간 또는 빈 공간에 두 개의 선을 그려 두 개의 부분 원을 연결하여 TM 주위의 원을 완성합니다. 그런 다음 Cut을 누르고 섹션에서 조직을 수집합니다. TM이 현미해부 캡으로 집어들었는지 확인합니다.

캡을 다시 위쪽 위치에 놓고 나머지 섹션에서 반복합니다. 분리된 모든 샘플이 캡에 맞고 겹치지 않도록 캡 위치를 약간 조정합니다. 다음 PET 멤브레인의 경우 새 분리 튜브를 삽입하고 이 섹션을 반복합니다.

미세절부된 TM 조직의 용해를 수행하려면 10마이크로리터의 용해 완충액을 채취 튜브의 뚜껑에 조심스럽게 피펫으로 주입하여 용해 완충액이 현미절부된 TM을 완전히 덮도록 합니다. 접착 캡을 부드럽게 닫고 수집 튜브를 실온에서 10분 동안 거꾸로 배양합니다. 배양 후 800g에서 2분 동안 원심분리하고 드라이아이스에 용해물을 놓습니다. 나중에 정제 및 분석할 수 있도록 용해물을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

RNA가 빠르게 분해되면 다운스트림 RNA 분석에 영향을 미칠 수 있습니다. RNA 품질은 미세유체역학 기반 플랫폼을 사용하여 측정하고 정량화해야 합니다. 섬유주 그물망에서 정제된 고품질 total RNA의 유전자 발현 분석의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.

레이저 미세해부 후 안구 조직에서 남아 있는 총 RNA에 대한 디지털 겔은 후속 다운스트림 RNA 분석에 필요한 높은 RNA 무결성 수를 보여줍니다. 조직에서 양질의 RNA가 추출되면 micro-array, RNA-Seq 및 qPCR과 같은 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 여기에서는 LCM에서 수집된 RNA에서 섬유주 그물망 관련 유전자, 미오실린 및 ACTA2의 발현을 분석하기 위해 정량적 디지털 PCR 분석을 사용했습니다.

마이크로 어레이 분석에서 얻은 데이터에서 생성된 히트 맵은 이 기술을 사용하여 IOP 표현형이 상승한 야생형 마우스 및 녹아웃 마우스의 섬유주 그물망에서 유전자 발현 변화를 이해하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 생물학적 동물 한 마리당 하루 만에 완료할 수 있습니다. 레이저 현미해부 단계는 관심 세포의 시각화가 어렵고 이러한 고유한 샘플에 대한 표준이 없기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 필수적입니다.

숙련된 작업자에게 의존하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시도하는 동안 소량의 조직에 있는 RNA가 빠르게 분해될 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. RNase에서 장비의 오염을 제거하고, 공기 노출을 최소화하고, 조직을 차갑게 유지하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

이 방법은 안압 증가가 섬유주 그물망 특정 유전자 발현에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 안압 증가로 인한 망막의 유전자 발현 변화를 평가하는 것과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차에 따라 RNA-Seq 또는 마이크로 어레이와 같은 다른 방법을 수행하여 안압이 상승한 마우스의 섬유주 그물망에서 어떤 신호 경로가 변경되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 마우스 모델의 섬유주 그물망에서 유전자 발현 변화를 보다 효과적으로 연구할 수 있는 길을 열었습니다.