Name: 내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 배우세요 TGF-β2로 MS-1 내피세포에서 내피-중간엽 전이(EndMT)를 유도하는 방법을. 이 기술은 혈관생물학 및 질병에서 EndMT 메커니즘과 microRNA 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리 지 시 Borok와 고헤이 Miyazono 원고 준비에 대 한 감사. 당사와 수소 우에하라 기념 재단 연구 친교에 의해 지원 되 고 당사 해외 유학에 대 한 수정 Hayaishi 기념 장학금에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 다케다 과학 재단 (A.S.)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1입니다. EndMT의 유도
<ol><li>표준 문화 조건에 MS-1 세포를 유지 하 고 confluency을 피하기 위해. MS-1 셀의 소스 테이블의 자료에 설명 되어 있습니다. MS-1 셀에 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 50 U/mL 페니실린, 및 50 μ g/mL 스 최소 필수 매체-α (MEM-α)를 사용 합니다.</li>
	<li>10 cm에 씻어 MS-1 셀 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 접시 하 고 접시에 trypsin의 1.0 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 5 분 동안 품 어</li>
	<li>문화 미디어의 9 mL를 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 300-400 x g 에 세포 현 탁 액 원심</li>
	<li>조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 미리 데워 진된 문화 미디어에 셀 펠 릿을 중단.</li>
	<li>Trypan 블루 솔루션 및 표준 hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>긴 기간 문화에 대 한 c m2 당 103 셀 x 0.5에서 코팅된 표준 문화 접시에 접시 MS-1 셀. 예를 들어 당 6에서 잘 플레이트 5.0 x 103 셀 잘 격판덮개 문화. FCS의 동일한 농도 포함 하 여 동일한 문화 매체를 사용 합니다. MS-1 셀, TGF-β FCS의 사용으로 장기 문화 (적어도 48-72 h)에 EndMT을 유도합니다.</li>
	<li>24 시간 후 TGF-β2 (1 ng/mL의 최종 농도)와 내 피 세포를 자극.</li>
	<li>(5% CO2, 37 ° C) 습도 인큐베이터에 문화 세포. 때 형태학 변화에 초점을 맞추고 세포를 매일 모니터링 합니다.</li>
	<li>장기적인 문화에서 TGF-β와 치료의 48 h 후 TGF-β2를 포함 하는 신선한 미리 데워 진된 문화 미디어에 미디어를 바꿉니다.</li>
	<li>다운스트림 분석을 진행 합니다. 일반적으로, 말라 개편 후 치료, 24 h 관찰 하 고 내 피 마커의 downregulation 및 엽 마커의 upregulation TGF-β와 치료의 48-72 시간 후 관찰 된다.</li>
</ol>2. Immunocytochemical 분석
<ol><li>MS-1 셀 표준 문화 조건에 유지 합니다.</li>
	<li>플레이트 MS-1 셀 4에 잘 잘 (1.7 cm2) 당 103 셀 x 1.0에서 문화 챔버 슬라이드 세포. 슬라이드는 미리 젤라틴 코팅. 잘 당 문화 미디어의 사용 0.5-1.0 mL.</li>
	<li>24 시간 후 TGF-β2 (1 ng/mL의 최종 농도)와 내 피 세포를 자극. 분석할 때 EndMT에 바위의 참여, TGF-β 치료 록 억제제 Y-27632 (10 μ M) 1 시간 전에 추가 합니다. TGF-β 신호 억제의 효과 평가할 때는 TGF-β 수용 체 키 니 아 제 억제제를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>(5% CO2, 37 ° C) 습도 인큐베이터에 문화 세포. 말라 개편 TGF-β와 치료의 24 h 후 MS-1 셀에서 관찰 됩니다. 다른 변경 후 48-72 h 치료의 명백한 될. 72 h 문화에 대 한 신선한 미디어 TGF-β와 치료의 48 h 후 TGF-β를 포함 미디어를 교체 합니다.</li>
	<li>
F-말라 얼룩
	<ol>
<li>TGF-β 치료의 24 h 후 미디어를 제거 하 고 실 온에서 20 분에 대 한 1 x PBS에 4 %paraformaldehyde 셀 수정 1 x PBS 가진 세포를 씻어.</li>
		<li>실 온에서 5 분에 대 한 Triton X-100 0.2% 품 어.</li>
		<li>3 번 1 x PBS와 셀 린스.</li>
		<li>Phalloidin tetramethylrhodamine B isothiocyanate 버섯 phalloides 희석 150-fold에서 함께 품 어 실 온에서 1 h에 대 한 차단 버퍼.</li>
		<li>3 번 1 x PBS와 셀 린스.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 cyanine 핵 산 바인딩 염료와 핵 얼룩.</li>
		<li>린스 슬라이드 마운트 coverslips 미디어를 탑재 하는 슬라이드를 사용 하 여 슬라이드에 얼굴.</li>
		<li>Confocal 현미경으로 관찰 합니다. 543 nm 레이저와 560-615 nm의 방출 필터를 사용 하 여 phalloidin의 형광의 탐지를 위해. 633 nm 레이저와 650 이상 방출 필터를 사용 하 여 핵 얼룩에 대 한 nm. TGF-β와 치료, 시 두꺼운 스트레스 섬유의 형성 관찰 될 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VE cadherin와 α-SMA 얼룩
	<ol>
<li>TGF-β 치료의 72 h 후 미디어를 제거, 감기 50% 메탄올 및 50% 아세톤 셀 수정 (0.5-1.0 mL 잘 당) 5 분.</li>
		<li>3 번 1 x PBS와 셀 린스 (0.5-1.0 mL 잘 당).</li>
		<li>제조업체의 권장된 농도 따라 어둠 속에서 4 ° C에서 하룻밤 블로킹 버퍼에 1 차 항 체로 품 어. 사용 하 여 VE cadherin 단일 클론 항 체 (BV13, 1: 100 희석)와 α-SMA Cy3 활용 된 단일 클론 항 체 (1A4, 1: 200 희석)20.</li>
		<li>3 번 1 x PBS와 셀 린스.</li>
		<li>녹색 염료 활용 된 이차 항 체 제조 업체의 권장된 농도 따라 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 VE cadherin 항 체를 가진 세포를 품 어.</li>
		<li>3 번 1 x PBS와 셀 린스.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 cyanine 핵 산 바인딩 염료와 핵 얼룩.</li>
		<li>린스 슬라이드 마운트 coverslips 미디어를 탑재 하는 슬라이드를 사용 하 여 슬라이드에 얼굴.</li>
		<li>Confocal 현미경으로 관찰 합니다. 543 nm 레이저와 560-615 nm의 방출 필터를 사용 하 여 α-SMA (Cy3)의 탐지를 위해. 488 nm 레이저와 505-550 nm의 방출 필터를 사용 하 여 VE cadherin의 검출에 대 한. 일반적으로, TGF-β 치료와 치료, 따라 VE cadherin 신호 감소 하 고 α-SMA 신호에서 증가 관찰 될 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3 차원 콜라겐 젤 수축 시험
<ol><li>콜라겐 젤 수축 시험 전에 72 h에 대 한 MS-1 세포와 함께/없이 TGF-β의 문화를 수행 합니다.</li>
	<li>유형 준비 나 얼음에 콜라겐 젤. 믹스 차가운 콜라겐 솔루션, 집중 10 x 메모리 매체, 0.05 N NaOH, 2.2% NaHCO3및 8: 1에서 200 mM HEPES pH 7.4 포함 된 콜라겐 희석 버퍼: 1의 비율.</li>
	<li>혼합 제어 또는 내 피 성장 세포 TGF-β-취급 정지 (106 셀/200 μ x 1.0) 200 mL와 콜라겐 젤 솔루션의 800 μ. TGF-β에 대 한 치료 샘플 추가 TGF-β2 (1 ng/mL)는 세포 현 탁 액을.</li>
	<li>12 잘 문화 접시의 각 음에 혼합물의 1.0 mL를 추가 하 고 30-60 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 공고히 하 허용.</li>
	<li>젤라틴, 후 1.0 mL MEM-α의 10 %FCS, 50 U/mL 페니실린, 및 50 μ g/mL 스 젤을 오버레이. TGF-β에 대 한 치료 샘플 추가 TGF-β2 (1 ng/mL)는 미디어. 참고: TGF-β 처리 샘플에 대 한 젤 및 문화 미디어 TGF-β를 추가 합니다.</li>
	<li>48 h에 대 한 37 ° C에서 부동 젤 품 어.</li>
	<li>스캐너를 사용 하 여 접시의 아래쪽에서 젤의 이미지 스캔 합니다. 또는 젤은 젤 위에 고정 된 거리에서 디지털 카메라를 사용 하 여 이미지를 기록 합니다.</li>
	<li>ImageJ를 사용 하 여 픽셀 수에 따라 젤 표면적 계량. 자유형 선택 또는 관련된 선택 도구를 사용 하 여 젤을 선택 하거나 선택 하는 젤을 사용 하 여 "이미지 | 조정 | 색상 임계값"도구를, 그리고 다음의 젤을 사용 하 여 영역을 결정" 분석 | 측정"명령입니다.</li>
</ol>4. 잠겨 핵 산 기반 미르 억제제 여 miRNA 활동의 억제
<ol><li>MS-1 셀 표준 문화 조건에 유지 합니다.</li>
	<li>Transfect 잠겨 핵 산 (LNA) 미르 억제제, 합성 미르 duplexes 또는 siRNAs (20 또는 50 nM) 제조 업체의 지시에 따라 lipofection 시 약을 사용 하 여. 세부 사항 및 LNA 미르 억제제, 합성 미르 duplexes와 siRNAs의 소스 우리의 이전 보고서26,27에 설명 했다. MS-1 셀, 제조업체의 지시에 따라 표준 transfection 절차 LNA 미르 억제제, 합성 미르 duplexes 또는 siRNAs의 도입을 위해 잘 작동.</li>
	<li>16-48 h 후 TGF-β2 (1 ng/mL의 최종 농도)와 내 피 세포를 자극.</li>
	<li>RNA 식 분석 (양적 RT-PCR 및 RNA 시퀀싱 (RNA-seq) 분석), immunocytochemical 분석 및 기자 시험을 포함 하 여 다양 한 다운스트림 분석을 진행 합니다. 다운스트림 분석 우리의 이전 보고서20,,2627에 설명 되어 있다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

그것은 24 h에 대 한 활성화 된 Ras 및 TGF-β 치료에 MS-1 셀, EndMT 유도 TGF-β 혼자21이 짧은 기간 EndMT를 유도 하는 데 실패 하는 동안 보고 되었습니다. 지속적으로, 우리는 TGF-β 실질적으로 유도 EndMT 더 이상 치료 (48-72 h) 후 MS-1 셀20에 관찰. 인간의 배꼽 등 다양 한 내 피 세포에서 TGF-β (2-6 일)와 장기 치료 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 피부 microvascular 내 피 세포 (HCMEC), 인간 관상 동맥 내 피 세포 (후 EndMT 반복적으로 관찰 되었다 HCEC), 마우스 폐 내 피 세포 (MLEC), 쥐 뇌 내 피 세포 (BEC), 소 대동맥 내 피 세포 (BAEC), 불멸 하 게 소 망막 microvascular 내 피 세포 (iBREC), 그리고 양 대동맥 밸브 내 피 세포8, <s...

내 피 엽 전환 (EndMT)는 차별화 된 내 피 세포 다양 한 섬유 아 세포와 같은 mesenchymal 세포1의 결과로 분자 변화를 겪 습 하는 과정입니다. EndMT 처음 심장2,3의 개발 하는 동안 내 피 세포 변환으로 설명 했다. 초기 심장 개발, 심장 관 내부 endocardium 및 외부 심근 구성 됩니다. 이 두 개의 레이어 심장 젤리 라고 하는 세포 외 매트릭스의 계층으로 구분 됩니다. 내 피 세포 마커를 획득, 배아 endocardial 셀 중간 엽 세포로 환승, 기본 심장 젤리, 침략 및 것 밸브 및 심장에 대 한 기초를 제공 하는 심장 쿠션의 형성을 촉진 그리고 semilunar 밸브입니다. 또한, EndMT 관상 동맥 혈관, 복 부 대동맥 및 폐 동맥4,,56을 포함 하 여 다른 배아 혈관 시스템에 pericytes 및 혈관 평활 근 세포의 소스를 되도록 제안 되었습니다. 또한, EndMT7돋 아 생리 신생에 연루 이다.
증거를 축적 하는 것은 EndMT도 여러 심혈 관 질환과 다른 질병1,8에 관련 된 것을 제안 했다. EndMT 관련 된 조건이 포함 혈관 석 회화, 동맥 경화 증, 폐 동맥 고혈압, 동굴 같은 기형, 기관 섬유 증, 정 맥 이식 개장, 이식 부전 신장 이식과 암8, 9,10,11,12,13,14,15,,1617, 18. 최근 보고서 설명 여러 분자 EndMT 마커 신장 이식17에서 신장 이식 부전의 진단 및 예 후 예측에 대 한 도구가 될 수 있습니다. EndMT 관련 세포 신호 통로의 변조 표시 되었습니다 심장 섬유 증을 포함 하 여 몇몇 질병 상태를 개량 하 고8,15모델 동물에 정 맥 이식 개장. 따라서, 메커니즘을 이해 기본 EndMT는 EndMT를 대상으로 하는 진단 및 치료 전략을 개발 해야 합니다.
EndMT-셀 접합, 철새 가능성, VE cadherin 같은 내 피 관련 유전자의 downregulation α-부드러운 근육 걸 (α-SMA)를 포함 한 엽 유전자의 upregulation의 손실에 의해 특징입니다. 또한, EndMT 및 상피 엽 전환 (응급), 중간 엽 세포, 상피 세포를 변환 하는 비슷한 과정 변경 된 생산의 발전에 기여할 수 있습니다 다양 한 세포 외 매트릭스 구성 요소와 연결 된 조직의 섬유 증8,19의.
최근, 여러 생체 외에서 연구 EndMT의 EndMT15,20의 분자 메커니즘의 세부 사항을 해명 했습니다. EndMT 변형 성장 인자 (TGF) 등 다양 한 신호 통로 의해 유도-β, Wnt,1단계 고. 그 중 TGF-β 응급 및 EndMT의 유도에서 중추적인 역할을 재생합니다. EndMT에 짧은 노출 부족21나타납니다 동안 노출 EndMT 다양 한 내 피 세포에서 TGF-β에 연장 한다. 우리는 여기 EndMT 유도, 어떤 마일 스벤 1 (MS-1)에서 마우스 췌 microvascular 내 피 세포 받 다 생체 외에서 EndMT TGF-β20에 장기간된 노출 후에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 모델에서 여러 다운스트림 분석 형태 변경, 내 피 마커의 downregulation 엽 마커 및 염증 성 유전자, cytoskeletal의 upregulation 포함 하 여 EndMT의 특징 기능 조사를 수행할 수 있습니다. 재배열, 및 콜라겐 수축 젤.
MicroRNAs (miRNAs)는 22 ~ nt 다양 한 mRNA 대상22,23posttranscriptional 억압을 직접 작은 규제 RNAs. 씨앗 시퀀스 중재 대상 인식, 통해 miRNAs 대상 유전자의 수백을 억제 하 고 세포 분화, 확산, 운동 성 등 다양 한 세포 기능을 조절. 이 구급 대 및 EndMT, 규제에 대 한 경우 이며 또한 몇몇 miRNAs 응급 및 EndMT,2425의 레 귤 레이 터로 보고 되었습니다. 이 검토에서 제시 하는 EndMT 모델 EndMT에서 miRNAs의 역할을 테스트 하려면 미르 변조 절차와 쉽게 결합할 수 있습니다. 현재 검토 MS-1 세포에서 TGF-β-유도 EndMT를 조사 하기 위해 우리의 실험 절차를 요약 하 고 또한 다른 내 피 세포에서 TGF-β에 의해 EndMT 유도의 조건의 비교를 포함 한다.

<table><tbody><tr><td>MS-1 세포</td><td>미국식 배양 컬렉션</td><td>CRL-2279</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32571036</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta2</td><td>R& D</td><td>302-B2-002</td><td></td></tr><tr><td>4 웰 Lab-Tek II 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>nacalai tesque</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3 요오드화물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>VE cadherin monoclonal 항체 (BV13)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-1441-82</td><td></td></tr><tr><td>alpha-SMA Cy3 monoclonal 항체 (1A4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 용액</td><td>Nitta gelatin Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 희석 완충액</td><td>닛타 젤라틴 Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>LNA miRNA 억제제</td><td>EXIQON&nbsp;</td><td>miRCURY LNAmicroRNA 전력 억제제 (음성 대조군 B 및 타겟 miRNA)</td><td></td></tr> <tr><td>합성 miRNA 듀플렉</td>스 <td>Qiagen&nbsp;</td><td>miScript miRNA 모방</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778030</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr></tbody></table>

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

내 피 세포의 phenotypic가 소성 기초 심장 혈관 시스템 개발, 심장 혈관 질병, 및 기관 섬유 증과 관련 된 다양 한 조건. 이러한 조건에서 차별화 된 내 피 세포는 엽 같은 고기를 획득. 이 프로세스 내 피 엽 전환 (EndMT) 이라고 하 고 내 피 마커의 downregulation, 엽 마커 및 형태학 상 변화의 upregulation에 의해 특징입니다. EndMT 변형 성장 인자 (TGF)를 포함 하 여 여러 신호 통로 의해 유도-β, Wnt, 및 노치, 그리고 gastrulation, 조직 섬유 증에 대 한 비슷한 상피 엽 전환 (응급) 중요 한 분자 기계 장치에 의해 규제 및 암 전이입니다. EndMT의 메커니즘을 이해 하는 것은 EndMT를 대상으로 하는 진단 및 치료 접근을 개발 해야 합니다. 생체 외에서 EndMT의 강력한 유도 일반적인 유전자 식 서명 특성, druggable 분자 메커니즘을 식별 및 변조기 EndMT의 화면을 유용 합니다. 여기, 우리 EndMT의 유도 대 한 생체 외에서 방법을 설명합니다. MS 1 마우스 췌 microvascular 내 피 세포 TGF-β에 장기간된 노출 후 EndMT를 받아야 하 고 upregulation 엽 마커 및 형태학 적 변화 뿐만 아니라 여러 염증 성 발산 및 cytokines의 유도 보여줍니다. 예측에 관한 (미르) 변조 분석을 위한 방법 또한 포함 되어 있습니다. 이 메서드는 기본 EndMT 및 EndMT miRNAs의 기여 하는 메커니즘을 조사 하는 플랫폼을 제공 합니다.

TGF-β는 다양 한 내 피 세포에서 EndMT의 강력한 유도. 24 시간 치료 후 MS-1 세포에서 TGF-β로, F 걸 대 한 얼룩 말라 스트레스 섬유 (그림 1A)20의 개편을 보여 줍니다. Y-27632 바위 억제제와 전처리 말라 개편20의 유도 억제. MS-1 내 피 세포 클래식 조약돌 모양의 형태에서 TGF-β 치료 (그림 1B)에 따라 엽 스핀 들 모양의 형태를 변경합니다. TGF-β-치료 세포 세포 세포 접촉을 잃게됩니다. 치료 후 TGF-β와 48-72 시간, immunocytochemical 분석 VE cadherin 감소 표현과 α-SMA (그림 1C)의 증가 식 보여 줍니다. TGF-β는 크게 후 치료 (<...

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

이 방법은 암을 포함한 다양한 병리학적 조건에서 내피 가소성의 메커니즘과 같은 혈관 및 암 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 TGF-in MS-1 내피 세포를 사용한 치료에 의해 시험관 내 EndMT의 강력한 유도가 이루어진다는 것입니다. 먼저 표준 배양 조건에서 MS-1 세포를 성장시키고 배양이 합류하지 않도록 합니다.다음으로, 10cm 접시에 MS-1 세포를 1x 인산염 완충 식염수로 세척합니다. 그런 다음 플레이트에 트립신 1mL를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 트립신화된 세포에 9mL의 배양 배지를 추가하여 분리합니다.그런 다음 트립신화된 세포 현탁액을 15mL 튜브에 수집합니다. 실온에서 300 - 400 x G에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 다음으로, 자동 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 셀의 수를 계산합니다.그런 다음 장기 배양을 위해 코팅되지 않은 표준 배양 플레이트에 MS-1 세포를 플레이트합니다. 24시간 후, TGF-2 밀리리터당 1ng의 최종 농도로 내피 세포를 자극합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 배양 플레이트를 5% 이산화탄소로 배양합니다.처리 48시간 후, 배지를 TGF-2를 함유한 신선하고 예열된 배양 배지로 교체하십시오.다운스트림 분석을 위해 젤라틴으로 사전 코팅된 8웰 배양 챔버 슬라이드에 MS-1 세포를 플레이트화합니다. 24시간 후, 10M의 ROCK 억제제를 세포 배양액에 첨가합니다. 한 시간 후, TGF-2 밀리리터당 1ng의 최종 농도로 내피 세포를 자극합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 72시간 동안 배양하려면 48시간 후에 기존 배지를 새로운 TGF-2 함유 배지로 교체하십시오. 하루 종일 TGF 치료 후 배지를 제거하십시오.그런 다음 실온에서 20분 동안 4%파라포름알데히드와 인산염 완충 식염수로 세포를 고정합니다. 고정 기간이 끝나면 인산염 완충 식염수로 세포를 헹굽니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 0.2%Triton X-100으로 세포를 배양합니다.5분 후, 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 다시 3회 헹굽니다. 3회 세척 후 차단 완충액을 함유한 희석된 형광 팔로톡신으로 세포를 실온에서 한 시간 동안 배양합니다. 배양 후, 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 세척합니다.그런 다음 실온에서 5분 동안 시아닌 핵산 결합 염료를 사용하여 세포핵을 염색합니다. 5분 후 슬라이드를 헹구고 슬라이드 장착 미디어를 사용하여 슬라이드 커버 슬립을 장착합니다. 컨포칼 현미경으로 세포를 관찰합니다.세포는 TGF-2 처리 시 두꺼운 응력 섬유의 재편성을 보여줍니다. 이는 내피 세포에서 EndMT를 유도하는 TGF-2의 효능을 나타냅니다. TGF-2 처리 72 시간 후, 배지를 버리고 50 % 차가운 메탄올 0.5-1ml와 50 % 아세톤으로 세포를 5 분 동안 고정한다.그런 다음 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 헹굽니다. 세 번의 세척이 완료된 후, 차단 완충액에 있는 기본 항체가 있는 세포를 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 다시 세 번 세척합니다.그런 다음 어둠 속에서 1시간 동안 차단 완충액에서 VE-cadherin에 녹색 염료로 접합된 2차 항체를 사용하여 세포를 배양합니다. 다시 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 씻습니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 시아닌 핵산 결합 염료를 사용하여 세포핵을 염색합니다.5분 후 슬라이드를 헹구고 슬라이드 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포는 VE-cadherin의 감소된 발현을 보여주고, 48 내지 72 시간 동안 TGF-2 처리에 의해 증가된 평활근 액틴 발현을 보인다.콜라겐 겔 수축 분석 전에 72시간 동안 TGF-2의 유무에서 MS-1 세포를 배양합니다. 그런 다음 얼음에 1형 콜라겐 젤을 준비합니다. 그런 다음 콜라겐 겔 용액 800l를 대조군 또는 TGF-2 처리된 내피 세포 200mL와 혼합합니다.다음으로, 이 혼합물 1mL를 12웰 배양 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 젤을 섭씨 37도에서 30-60분 동안 굳히십시오. 젤의 응고 후에, 젤을 뜨기 위하여 10%fetal 송아지 혈청, 페니실린의 밀리리터 당 50 단위, 및 스트렙토마이신의 밀리리터 당 50 g를 포함하는 MEM 알파의 1개 mL를, 추가하십시오.그런 다음 우물 벽에서 젤을 분리하고 섭씨 37도에서 48시간 동안 플로팅 젤을 배양합니다. 48시간의 배양 후 스캐너를 사용하여 플레이트 바닥에서 겔 이미지를 스캔합니다. 뚜렷한 형태학적 변화가 눈에 띄며, 72시간 동안 TGF-2 처리에 노출되어 조약돌에서 중간엽 방추체 모양의 구조로 세포가 변형됩니다.흥미롭게도, 48-72시간 동안 TGF 베타 2 처리는 MS-1 세포에서 평활근 액틴의 mRNA와 단백질 발현 수준이 모두 증가했음을 보여줍니다. 겔 수축 분석법은 또한 TGF-2 처리 시 콜라겐 유형 1 겔이 크게 수축하는 것을 보여줍니다. 흥미롭게도, TGF-2가 결핍되면 평활근 액틴이 기저 수준으로 감소하고 세포가 조약돌 형태를 재개하는데, 이는 EndMT가 역동적인 과정임을 나타냅니다.실제로, MS-1 세포를 사용하여 LNA microRNA 억제제에 의해 microRNA 31을 억제하면 중간엽 마커의 유도가 약화됩니다. 그러나 억제제는 Fibronectin 1, PAI-1 및 Smad 7과 같은 TGF 표적 유전자의 유도에 영향을 미치지 않습니다. 유전자 발현, 녹다운(knockdown) 또는 마이크로어레이 조절(microarray modulation)과 같은 방법으로 이 절차를 수행하면 EndMT의 특정 유전자 및 microRNA 기능과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

간단한 방법은 세포 유형의 다양한 중간 엽 전이 (EMT)에 상피의 유도에 대해 설명한다. 면역 세포에 의한 EMT 상태에있는 세포의 분석 방법이 포함되어 있습니다.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

여기에서는 상피-중간엽 전이를 거친 중간엽 세포에서 수축 기능을 평가하기 위한 겔 수축 분석법의 개발 및 적용에 대해 설명합니다.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

이 원고는 통제된 환경에서 내피 세포관 형성을 사용하여 혈관 신생에 대한 주어진 화합물 또는 조건의 효과를 정량화하기 위한 튜브 형성 분석을 설명합니다.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

우리는 여기에서 마이크로 RNA-200의 가족과 같은 grainyhead 2 (GRHL2)의 결합에 기초 이소성 발현 육종 세포에서 중간 엽 상피 전환 (MET)을 유도하는 세포 배양 방법을 제시한다. 이 방법은 암의 공격성과 치료에 대한 표현형 가소성의 생물학적 영향을 이해하기 더 적합합니다.

육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도

우리는 실리콘 고무 (PDMS)로 제작 된 높은 처리량 견인력 분석방법을 제시한다. 이 새로운 분석은 다양한 생물학적 및 생물 의학 적 과정 및 질병 동안 세포 수축성의 물리적 변화를 연구하는 데 적합합니다. 우리는 상피-중간엽 전이 동안 수축성의 TGF-β 의존적 증가를 측정함으로써 이 방법의 유용성을 입증한다.

PDMS를 이용한 높은 처리량 견인력 현미경 검사법은 상피-중간엽 전이에 대한 성장 인자-β 변환의 용량 의존적 효과를 밝혀냅니다.

miRNA 치료제 암 진행을 조절에 상당한 잠재력이 있다. 여기 설명 분석 접근 사용 된다 세포 주기 및 신생 중단 조합 미르 치료의 활동의 식별을 위해.

조합 미르 세포 주기 조절 및 신생 치료의 분석

우리는 이 신호 통로에 관련시킨 단백질 및 유전자 발현을 공부해서 TGF β 신호 및 TGF-β 유도한 EMT를 조사하기 위하여 체계적인 워크플로우를 기술합니다. 방법은 서양 블로팅, 루시파라제 기자 분석, qPCR 및 면역 불피스테인링을 포함한다.

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

당사는 세포 형태 변화를 관찰하고 면역형성 염색을 이용한 발현 EndMT 관련 마커 변경을 검사함으로써 내피 세포에서 TGF-β2 유도 EndMT를 조사하는 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 유전자 편집은 TGF-β2 유도 EndMT에서의 역할을 조사하기 위해 달팽이를 코딩하는 유전자를 고갈시키기 위해 기술및 사용되었다.

TGF-β 매개 내피- 중간엽 전환(EndMT)과 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 EndMT 이펙터의 기능평가

여기서, 병리학및 생리학적 유체 전단 응력 조건에 노출된 내피 세포에서 근접 계각 분석(PLA)을 사용하여 여러 SMAD 복합체를 동시에 시각화하고 분석하는 프로토콜을 수립합니다.

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

현재 프로토콜은 영양막 세포와 같은 세포가 세포외 기저막 매트릭스 층에 걸쳐 모세관 같은 구조로 조직되는 고전적인 체외 혈관 형성 분석에서 형성된 튜브와 같은 구조를 복구할 수 있도록 합니다. 회수된 구조는 다양한 생화학 분석을 위한 RNA 및 단백질 분리에 사용됩니다.

분화 마커 발현 분석을 위한 Angiogenesis-Tube Formation Assay에서 영양막 세포 회수

배우세요 TGF-β2로 MS-1 내피세포에서 내피-중간엽 전이(EndMT)를 유도하는 방법을. 이 기술은 혈관생물학 및 질병에서 EndMT 메커니즘과 microRNA 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

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