내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

이 방법은 암을 포함한 다양한 병리학적 조건에서 내피 가소성의 메커니즘과 같은 혈관 및 암 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 TGF-in MS-1 내피 세포를 사용한 치료에 의해 시험관 내 EndMT의 강력한 유도가 이루어진다는 것입니다. 먼저 표준 배양 조건에서 MS-1 세포를 성장시키고 배양이 합류하지 않도록 합니다.

다음으로, 10cm 접시에 MS-1 세포를 1x 인산염 완충 식염수로 세척합니다. 그런 다음 플레이트에 트립신 1mL를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 트립신화된 세포에 9mL의 배양 배지를 추가하여 분리합니다.

그런 다음 트립신화된 세포 현탁액을 15mL 튜브에 수집합니다. 실온에서 300 - 400 x G에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 다음으로, 자동 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 셀의 수를 계산합니다.

그런 다음 장기 배양을 위해 코팅되지 않은 표준 배양 플레이트에 MS-1 세포를 플레이트합니다. 24시간 후, TGF-2 밀리리터당 1ng의 최종 농도로 내피 세포를 자극합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 배양 플레이트를 5% 이산화탄소로 배양합니다.

처리 48시간 후, 배지를 TGF-2를 함유한 신선하고 예열된 배양 배지로 교체하십시오.다운스트림 분석을 위해 젤라틴으로 사전 코팅된 8웰 배양 챔버 슬라이드에 MS-1 세포를 플레이트화합니다. 24시간 후, 10M의 ROCK 억제제를 세포 배양액에 첨가합니다. 한 시간 후, TGF-2 밀리리터당 1ng의 최종 농도로 내피 세포를 자극합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 72시간 동안 배양하려면 48시간 후에 기존 배지를 새로운 TGF-2 함유 배지로 교체하십시오. 하루 종일 TGF 치료 후 배지를 제거하십시오.

그런 다음 실온에서 20분 동안 4%파라포름알데히드와 인산염 완충 식염수로 세포를 고정합니다. 고정 기간이 끝나면 인산염 완충 식염수로 세포를 헹굽니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 0.2%Triton X-100으로 세포를 배양합니다.

5분 후, 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 다시 3회 헹굽니다. 3회 세척 후 차단 완충액을 함유한 희석된 형광 팔로톡신으로 세포를 실온에서 한 시간 동안 배양합니다. 배양 후, 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 세척합니다.

그런 다음 실온에서 5분 동안 시아닌 핵산 결합 염료를 사용하여 세포핵을 염색합니다. 5분 후 슬라이드를 헹구고 슬라이드 장착 미디어를 사용하여 슬라이드 커버 슬립을 장착합니다. 컨포칼 현미경으로 세포를 관찰합니다.

세포는 TGF-2 처리 시 두꺼운 응력 섬유의 재편성을 보여줍니다. 이는 내피 세포에서 EndMT를 유도하는 TGF-2의 효능을 나타냅니다. TGF-2 처리 72 시간 후, 배지를 버리고 50 % 차가운 메탄올 0.5-1ml와 50 % 아세톤으로 세포를 5 분 동안 고정한다.

그런 다음 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 헹굽니다. 세 번의 세척이 완료된 후, 차단 완충액에 있는 기본 항체가 있는 세포를 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 다시 세 번 세척합니다.

그런 다음 어둠 속에서 1시간 동안 차단 완충액에서 VE-cadherin에 녹색 염료로 접합된 2차 항체를 사용하여 세포를 배양합니다. 다시 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 세 번 씻습니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 시아닌 핵산 결합 염료를 사용하여 세포핵을 염색합니다.

5분 후 슬라이드를 헹구고 슬라이드 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포는 VE-cadherin의 감소된 발현을 보여주고, 48 내지 72 시간 동안 TGF-2 처리에 의해 증가된 평활근 액틴 발현을 보인다.

콜라겐 겔 수축 분석 전에 72시간 동안 TGF-2의 유무에서 MS-1 세포를 배양합니다. 그런 다음 얼음에 1형 콜라겐 젤을 준비합니다. 그런 다음 콜라겐 겔 용액 800l를 대조군 또는 TGF-2 처리된 내피 세포 200mL와 혼합합니다.

다음으로, 이 혼합물 1mL를 12웰 배양 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 젤을 섭씨 37도에서 30-60분 동안 굳히십시오. 젤의 응고 후에, 젤을 뜨기 위하여 10%fetal 송아지 혈청, 페니실린의 밀리리터 당 50 단위, 및 스트렙토마이신의 밀리리터 당 50 g를 포함하는 MEM 알파의 1개 mL를, 추가하십시오.

그런 다음 우물 벽에서 젤을 분리하고 섭씨 37도에서 48시간 동안 플로팅 젤을 배양합니다. 48시간의 배양 후 스캐너를 사용하여 플레이트 바닥에서 겔 이미지를 스캔합니다. 뚜렷한 형태학적 변화가 눈에 띄며, 72시간 동안 TGF-2 처리에 노출되어 조약돌에서 중간엽 방추체 모양의 구조로 세포가 변형됩니다.

흥미롭게도, 48-72시간 동안 TGF 베타 2 처리는 MS-1 세포에서 평활근 액틴의 mRNA와 단백질 발현 수준이 모두 증가했음을 보여줍니다. 겔 수축 분석법은 또한 TGF-2 처리 시 콜라겐 유형 1 겔이 크게 수축하는 것을 보여줍니다. 흥미롭게도, TGF-2가 결핍되면 평활근 액틴이 기저 수준으로 감소하고 세포가 조약돌 형태를 재개하는데, 이는 EndMT가 역동적인 과정임을 나타냅니다.

실제로, MS-1 세포를 사용하여 LNA microRNA 억제제에 의해 microRNA 31을 억제하면 중간엽 마커의 유도가 약화됩니다. 그러나 억제제는 Fibronectin 1, PAI-1 및 Smad 7과 같은 TGF 표적 유전자의 유도에 영향을 미치지 않습니다. 유전자 발현, 녹다운(knockdown) 또는 마이크로어레이 조절(microarray modulation)과 같은 방법으로 이 절차를 수행하면 EndMT의 특정 유전자 및 microRNA 기능과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.