전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

이 프로토콜의 전반적인 목표는 중수소 운동 동위원소 효과의 검출을 통해 박테리아 세포 외 전자 수송 속도에 대한 양성자 수송의 기여도를 관찰하는 것입니다. 우리의 방법은 외막 c형 사이토크롬을 통해 박테리아에서 전극으로 가는 EET 또는 세포외 전자 수송의 동역학에 대한 양성자 수송의 영향을 보여줍니다. 우리의 분석은 정제된 효소가 아닌 살아있는 박테리아를 사용했기 때문에 EET의 천연 양성자 관리를 반영합니다.

그러나 우리의 과제는 다른 세포 과정에서 발생하는 소음을 제거하는 것이었습니다. KIE라고 하는 중수소 운동 동위원소 효과는 관련 전자 수송 과정에 대한 양성자 수송의 기여도를 조사하는 가장 좋은 기술 중 하나입니다. Shewanella MR-1 세포를 성장시키려면 한천 플레이트에서 자란 세포의 한 콜로니를 15ml의 LB 배지로 옮깁니다.

섭씨 30도에서 24시간 동안 호기성 조건에서 160rpm으로 진탕하면서 세포를 성장시킵니다. 6, 10 분 동안 중력에 000 시간 세포 현탁액을 원심 분리하십시오. 그런 다음, 생성된 세포 펠릿을 15ml의 정의된 배지에 재현탁시키고, 탄소의 공급원으로 10밀리몰의 젖산염과 세포의 미량 원소로 리터당 0.5g의 효모 추출물을 보충합니다.

160 분당 회전수에 동요를 가진 12 시간 동안 30 섭씨 온도에 세포 현탁액을 공기역학으로 더 경작한 후에, 6에 다시 원심분리기, 10 분 동안 000배 중력. 6, 전기화학 실험의 앞에 000배 중력에 10 분 동안 원심분리에 의하여 DM 매체로 생성된 세포 펠릿을 두번 세척하십시오. 3 전극 전기 화학 반응기를 구성하려면 ITO 기판을 반응기 바닥에 작동 전극으로 놓으십시오.

그런 다음 유리 실린더와 폴리테트라플루오로에틸렌 커버를 삽입하고 백금선을 상대 전극으로 삽입합니다. 그런 다음 염화은 전극을 기준 전극으로 반응기에 삽입합니다. 다음으로, 10 밀리몰 젖산염과 리터당 0.5 그램의 효모 추출물이 보충 된 4 밀리리터의 DM을 전기 화학 반응기에 첨가합니다.

전기화학반응기에서 누출이 없음을 확인한 후 질소 가스를 전기화학반응기로 20분에 걸쳐 흘려 전기화학반응기 내부의 혐기성 상태를 유지합니다. 전기화학 반응기를 전위차에 연결하고 ITO 전극에 양의 0.4볼트를 가하여 외부 물 순환 시스템을 사용하여 전기화학 반응기의 온도를 섭씨 30도로 유지합니다. 전기화학적 배양을 수행하려면 먼저 10밀리몰 젖산염과 리터당 0.5g의 효모 추출물이 보충된 DM을 사용하여 현탁액의 세포 밀도를 600나노미터에서 1.43의 광학 밀도로 조정합니다.

주사기를 사용하여 주입 포트를 통해 0.3ml의 세포 현탁액을 전기화학 반응기에 추가합니다. 반응기의 OD 600이 0.1로 변경됩니다. 0.4시간 동안 ITO 전극에 양의 25볼트로 전위 적용을 계속합니다.

잠재적인 적용을 중지하고 전위차와 물 순환 시스템에서 전기화학 반응기를 분리하십시오. 질소 가스를 10 밀리 몰 젖산이 함유 된 DM이 들어있는 병에 20 분 동안 흘려 배지에서 산소를 제거합니다. 이제 매우 천천히 부드럽게 흐르는 질소 가스 아래에서 주사기를 사용하여 전기 화학 반응기 내부의 모든 상등액을 제거합니다.

그런 다음 주사기를 사용하여 10밀리몰의 젖산염이 함유된 4밀리리터의 신선한 DM을 추가합니다. 전기화학 반응기를 기울여 반응기 벽의 상등액을 모두 제거합니다. 이 단계를 총 세 번 반복합니다.

가스 흐름을 중지하고 전기 화학 반응기를 전위차 조절기에 다시 연결하고 0.4 Kelvin에서 ITO 전극에 양의 303 볼트를 적용합니다. Shewanella MR-1의 단층 생물막으로부터의 현재 생산량이 안정적이고 빠르게 증가하지 않는지 확인하십시오. 전류가 가파르게 증가하면 10분에 걸쳐 전류가 5% 증가로 안정화될 때까지 기다립니다.

매우 천천히 그리고 부드럽게, 반응기에서 농도가 0.5 부피 퍼센트 D2O가 되도록 주사기를 사용하여 40마이크로리터의 무산소 50 부피 퍼센트 D2O를 전기화학 반응기에 첨가합니다. D20 첨가에 의한 생물막 손상을 방지하려면 D2O를 적가하여 주입하십시오. 전류가 안정화될 때까지 기다렸다가 D2O를 최대 4.4 부피 퍼센트까지 추가하여 현재 생산량과 D2O 및 H2O의 존재 비율인 KIE 값을 얻습니다.

동일한 양의 H2O 첨가가 현재 생산량에 미치는 영향을 확인하십시오. 여기서, 실선은 D2O 첨가에 의해 유도된 미생물 전류 변화의 대표적인 결과이다. D2O를 첨가하면 10초 이내에 미생물 전류가 급격히 감소한 반면, H20은 점선에서 볼 수 있듯이 전류 감소가 거의 없었습니다.

D2O에 의해 관찰된 전류 감소가 외막 사이토크롬을 통한 전자 전달에 기인하는지 확인하기 위해 확산 전자 매개체를 사용했습니다. 여기에 100마이크로몰 알파-AQS를 추가하면 현재 생산량이 5배 이상 증가했으며 현재 생산량은 D2O 추가의 영향을 받지 않았습니다. 이러한 결과는 대사 반응의 역학이 충분히 빨라서 세포 외 전자 전달 과정이 속도를 제한한다는 것을 나타냅니다.

이를 평가하기 위한 또 다른 방법은 플라빈 분자를 전기화학 반응기에 첨가하는 것입니다. 플라빈 첨가에 의한 즉각적인 양극 전류 증가는 외막 사이토크롬을 통한 전자 수송 과정에 의한 속도 제한을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 외 전자 수송 과정에 대한 운동 동위원소 효과를 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

운동 동위원소 효과를 성공적으로 얻기 위한 가장 중요한 점은 외막 사이토크롬을 통한 전자 수송이 현재 생산 속도를 제한하는 상태를 명확히 하고 확인하는 것입니다. 이 비디오에서는 이 상태를 확인하기 위해 flavin의 첨가와 alpha-AQS와 같은 확산 추가 매개체의 첨가에 의한 전류 변화 관찰의 두 가지 방법을 소개했습니다. 속도 제한이 확인되면 이 시스템은 중수소 실험뿐만 아니라 외막 사이토크롬의 생화학적 특성화에도 사용할 수 있습니다.

또한, 이 프로토콜은 세포 외 전자 수송 과정이 속도를 제한하는 한 다른 전기 활성 미생물을 검사하는 데 적용할 수 있습니다. 당사의 방법론은 in vivo에서 외막 사이토크롬을 통한 세포 외 전자 수송 과정을 조사하기 위한 기본적이고 일반적인 기술을 제공합니다.