Name: 전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 중수소 동위원소 효과를 이용한 Shewanella oneidensis MR-1의 세포 외 전자 전송에서 양성자 수송의 역할을 전기화학적으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 살아있는 세포에서 원래의 양성자 관리를 반영하여 미생물 전자 전달 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

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이 작품 과학 진흥 (JSP) KAKENHI 보조금 번호 24000010, 17 H 04969, 일본 사회에서 특별히 추진 연구 및 JP17J02602, 미국 사무실의 해군 연구 글로벌 (N62909-17-1-2038)는 선진적인 재정적으로 지원 했다. Y.T.는 JSP 연구원 이며 프로그램을 통해 JSP에 대 한 선도 대학원 학교 (공로) 지원.

1. ITO 전극 (그림 1)에 S. oneidensis 씨-1의 단층 Biofilm의 형성
참고: 다른 미생물과 전기 화학 반응 기의 오염을 방지 하기 위해, 모든 미디어, 구현 및 전기 화학 반응 기의 구성 한다 살 균 되어야 사전에. 때 깨끗 한 벤치에 모든 절차를 지휘 한다 S. oneidensis 씨-1 셀을 사용 하 고 전기 원자로 건설.
<ol><li>S. oneidensis 씨-1 셀의 재배 참고: S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm 형성 되었다는 이토에는 조건에 따라 전극 보고 이전4.<ol>
<li>S. oneidensis 씨-1 세포 성장, S. oneidensis 씨-1 파운드 매체 (20 g/L) 160 rpm에서 떨고 호 기성 조건에서 24 시간에 30 ° C에서의 15 mL에 Luria Bertani (파운드) (20 g/L) 및 bacto agar (15 g/L)로 구성 된 한 천 배지에서 성장 한 식민지를 추가 합니다.</li>
		<li>10 분 동안 6000 × g 에서 세포 현 탁 액을 원심 및 정의 된 매체 (pH 7.8)의 15 mL에 결과 셀 펠 릿 resuspend (DM: NaHCO3 [2.5 g/L], CaCl2·2H2O [0.08 g/L], NH4Cl [1.0 g/L] MgCl2· 6 H2O [0.2 g/L], NaCl [10 g/L], 그리고 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] [HEPES; 7.2 g/L] ethanesulfonic 산), 젖 산 10 m m와 0.5 g/L 효 모 추출 물, 탄소 소스로 보충 및 S. oneidensis 씨-1에 대 한 추적 요소 각각.</li>
		<li>또한 160 rpm에서 떨고와 12 h 30 ° C에서 aerobically 세포 현 탁 액을 배양 하 고 원심 다시 10 분 세척을 위한 6000 × g 에서 DM 매체와 두 번 결과 셀 펠 릿은 화학 전에 6000 × g에서 10 분 원심 분리 하 여 실험입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3-전극 전기 화학 반응 (그림 1)의 건설<ol>
<li>반응 기의 하단에 작업 전극으로 ITO 기판을 넣어.</li>
		<li>그 후, 삽입 유리 실린더 (2 cm의 직경) 및 소계 (PTFE) 커버. 그런 다음 삽입 Ag/AgCl (포화 KCl)와 백 금 철사는 원자로에 참조 및 카운터 전극으로 각각. 참고: 공기 및 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 각 구성 요소 간의 부 틸 고무 시트를 삽입 합니다.</li>
		<li>DM의 4.0 mL 10mm 젖 산으로 보충 하 고 0.5 g/L 효 모 추출 화학 반응 기에 추가 합니다.</li>
		<li>전기 화학 반응 기에서 누설 확인, 전기 화학 반응 화학 반응 기 내부의 혐 기성 조건을 유지 하기 위해 20 분 이상으로 질소 가스 흐름. 참고: 다른 미생물 오염을 방지 하기 위해, 가스 한다 필터링 전에 그것은 전기 화학 반응으로 흐른다.</li>
		<li>전기 화학 반응 기는 potentiostat에 연결 하 고 적용 0.4 V (표준 수소 전극 대 그녀) ITO 전극에는 외부 물 순환 시스템을 사용 하 여 30 ° C에서 전기 화학 반응 기의 온도 유지. 참고: 외부 전기 분야의 영향을 방지 하기 위해, 전기 화학 반응 기는 패러데이 케이지에 배치 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>S. oneidensis 씨-1 세포 (그림 1 및 그림 2)의 전기 화학 경작<ol>
<li>1.1 600 1.43의 광학 밀도에 단계에서 얻은 서 스 펜 션의 셀 밀도 조정 10 m m 0.5 g/L 및 젖 산 효 모에 의해 보충 하는 dm nm (OD600) 추출. 참고: 올바른 세600를, 1.43 OD600 조정 전에 대 한 UV 분석기에 OD600 ≤ 0.8의 세포 현 탁 액을 적용 됩니다.</li>
		<li>세포 현 탁 액의 0.3 mL 주사기를 사용 하 여 주입 포트를 통해 전기 화학 반응 기에 추가: 원자로에서 OD600 0.1로 변경. 참고: OD600 와 0.3 mL 셀 서 스 펜 션의 추가 = 1.43 OD600 와 솔루션의 4.3 ml에서 4.0 mL 중간 결과 포함 하는 전기 원자로에 0.1 =. 다른 원자로 사용 하 여 다른 볼륨, 셀 밀도의 계산이 필요 합니다.</li>
		<li>0.4 V (그녀) 대 25 h ITO 전극에 잠재적인 응용 프로그램을 계속 합니다. 참고: ITO 전극에 단층 biofilm의 형성에 대 한 생산된 전류 전시 그림 2에서 50% 미만의 편차 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 젖 산 10 m m (그림 3)와 신선한 DM 매체와 상쾌한의 교체
<ol><li>잠재적인 응용 프로그램을 중지 하 고 전기 화학 반응 기는 potentiostat와 물 순환 시스템에서 분리 합니다.</li>
	<li>10 m m와 신선한 DM 매체와 상쾌한의 대체 젖이 나올<ol>
<li>DM를 포함 하는 매체에서 산소를 제거 하 10mm 젖 산 20 분 이상으로 병에 질소 가스 흐름.</li>
		<li>천천히 흐르는에서 주사기를 사용 하 여 전기 화학 반응 기 내부의 모든 상쾌한 제거 질소 가스 (그림 3a, b). 참고: 질소 가스에 의해 ITO 전극에는 biofilm를 위반을 피하기 위해, 가스 액체 표면 위의 흐름 해야 합니다.</li>
		<li>(그림 3c) 주사기를 사용 하 여 10mm 젖 산을 포함 하는 신선한 DM의 4.0 mL를 추가 합니다. 참고: ITO 전극에는 biofilm를 위반을 피하기 위해, 전기 화학 반응 기의 벽을 따라 중간을 주사 천천히. 유지 하기 위해 젖은 biofilm, 매체 상쾌한의 제거 후 즉시 추가 되어야 합니다. 상쾌한의 제거 후 중간까지 1 분의 주입 S. oneidensis 씨-1는 biofilm에서 현재 생산을 영향을 주지 않습니다.</li>
		<li>전기 화학 반응 기의 벽에 부착 된 상쾌한의 모두 제거를 전기 화학 반응 기 경사</li>
		<li>총에 세 번 단계 2.2.2-2.2.4를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가스 흐름을 중지 하 고 potentiostat 다시, 303 공화국에서 ITO 전극 (그녀) 대 0.4 V 적용에 전기 화학 반응 기를 연결</li>
</ol>3. 동유럽 표준시 과정 (그림 4)에 인기를 측정 하는 중수소 물 추가
<ol><li>S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm에서 현재 생산 안정적 이며 빠른 속도로 증가 하지 않습니다 확인 합니다. 현재 가파르게 증가 하는 경우 현재 5% 증가 10 분 이상에서 안정화 될 때까지 기다립니다. 참고: 다른 미생물 긴장의 오염 없이 ITO 전극에 단층 biofilm의 형성 확인 되었다 rDNA 시퀀스와 ITO 전극에 biofilm의 스캐닝 전자 현미경 이미지를 보고 이전4. 동유럽 표준시 프로세스 속도 제한의 확인에 대 한 추가 왕복 전자 중재자 100 µ M 안트라퀴논-1-된 α-AQS () 등의 효과 모니터링 합니다. 15 대 한 자세한 내용은 참조 및 대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오.</li>
	<li>농도 0.5% (v/v) D2O 원자로에 주사기를 사용 하 여 전기 화학 반응으로 무산 소 50% (v/v) D2O의 40 µ L를 추가 합니다. 참고: D2O 추가 의해는 biofilm 손상을 방지, 주사 D2O drop-wise.</li>
	<li>전류 안정화를 기다립니다 하 고 이후 추가 D2O 4.0% (v/v). 참고: KIE 값 (D2O 및 H2O의 현재 생산의 비율)를, 현재 생산에 H2O 추가의 동일한 볼륨의 효과 확인 하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리의 전체 셀 전기 화학 분석 결과 단백질 전기에 비해 몇 가지 기술적인 이점이 있다. 단백질 정화 다단계 시간이 걸리는 절차 필요, 우리의 전체 셀 메서드 자체 조직된 biofilm 형성 세포 배양 후의 어느 날 걸립니다. 톰 c간의 안정적인 상호 작용을 달성 하기 위해-대련 청 려 고 전극, 우리 필요만 살 균과 청소의 전극 표면; 톰 c를 향하는 동안, 전극에 부착 단백질4, 예를 들면, S. oneidensis 씨-1의 방향을 본질적으로 조직에 대 한 전극 수정 필요 하지 않습니다 그것은 같은 방향으로25 -대련 청 려 , 26 , 27. 대조적으로, 단백질의 전기 화학 반응을 민감하게 영향을 받는 단백질에서 산화 환 원 사이트와; 전극 사이의 거리...

직접 하는 그대로 세균 세포에서 산화 환 원 단백질 전기 기술을 최근 금속 감소 미생물 긴장, S. oneidensis 씨-1 등 Geobacter sulfurreducens PCA의 발견 이후 등장 외부 막 시 토 크롬 c 형 단지 (OM c-대련 청 려) 셀 외부1,2,3,,45에 노출 되어 있다. 톰 c-대련 청 려 호흡기 체인에서 extracellularly 있는 고체 기판에 전자 수송 중재. 이 전송 extracellular 전자 전송 (동유럽 표준시)1,6 이라고 하 고 미생물 연료 전지6등 신흥 바이오에 대 한 중요 한 과정 이다. 따라서, 기본 동유럽 표준시 속도 론 및 메커니즘 및 미생물 생리학에 그것의 연결을 이해 하 옴 c-대련 청 려 되었습니다 조사 전체 셀 전기 화학4,7, 현미경과 결합을 사용 하 여 8 , 9, 분광학10,11, 그리고 분자 생물학2,4. 반면, 동유럽 표준시 관련 된 양이온 수송, 예를 들어, 양성자, 살아있는 세포에서 동유럽 표준시 활동에 미치는 영향을 조사 하는 방법 부족 하 게 설립 되어, 세균 막 중요 한 역할을가지고 걸쳐 양성자 수송에도 불구 하 고 신호, 항상성, 및 에너지 생산12,,1314. 현재의에서 연구, 우리는 양성자 수송 필요의 속도 제한 단계 식별 전체 셀 전기 화학 측정을 사용 하 여 S. oneidensis 씨-1 셀에 동유럽 표준시 활동에의 영향을 검사 하는 기법을 설명 미생물 현재 생산15.
1 직접 연결 된 동유럽 표준시에 양성자 수송의 기여를 평가 방법은 중수소 활동적인 동위 원소 효과 (KIE)입니다. 인기의 전자 전송 속도 론16양성자 교통 영향을 나타내는 중수소 이온, 양성자의 교체 시 전자 전송 속도에서 변화 관찰입니다. KIE 자체의 이론은 잘 설립 되었습니다 정제 효소17전기 화학 측정을 사용 하 여. 그러나, S. oneidensis 씨-1에 현재 생산, 여러 다양 한, 그리고 변동 과정18에서 결과, 이후 하나 확인할 수 없습니다 단순히 동유럽 표준시 속도 제한 과정으로. 관찰 하기 위해 동유럽 표준시 함께 양성자 전송 프로세스에 인기, 우리는 미생물 현재 생산 옴 c통해 전자 전송에 의해 제한 됩니다 확인 해야-대련 청 려 전극에. 이 목적을 위해 우리 신선한 매체에서 최적 pH 및 온도 조건 KIE 측정; 전에 전자 기증자로 젖 산의 높은 농도 포함 하는 표면에 뜨는 솔루션 대체 이 교체 봉사 두 역할: (1) 동유럽 표준시에 비해 업스트림 신진 대사 과정의 속도 향상 하 고 (2) 작업 전극 (에 S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm에서 발표 하는 상쾌한 수영 셀 생략 인듐 주석 첨가 산화물 (ITO) 전극). 새로운 실무자 유지 하 고 동유럽 표준시 프로세스 속도 결정 단계는 확인을 있도록 제시 상세한 프로토콜 것입니다.

<table><tbody><tr><td>유리 실린더</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A 주문형, 전기화학 반응기로 사용</td></tr><tr><td>PTFE 커버 및 베이스</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>주문형, 전기 화학 반응</td></tr>기 <tr><td>부틸 고무</td><td>N/A</td><td>N/A</td> 주문형의 덮개 및 기초로 사용, 전기화학 반응기 Septa GL Science 3007-16101<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>의 각 구성 요소 사이에 삽입전기화학 반응</td></tr>기 <tr><td>인듐 주석 도핑된 산화물(ITO) 전극</td>의 주입구로 사용 <td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>작동 전극으로 사용, 5&Omega;/sq</td></tr><tr><td>Ag/AgCl KCl 포화 전극</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>기준 전극으로 사용, &Phi; 0.30mm</td></tr><tr><td>백금 와이어</td><td>Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>카운터 전극으로 사용</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Broth, Miller</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>244620</td><td>S. oneidensis MR-1</td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Anthraquinone-1-sulfonate (&alpha; -AQS)</td> <td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)</td><td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>정의된 매체(DM)</td></tr><tr><td>CaCl2 &middot에 사용; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>DM에 사용</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>DM</td></tr><tr><td>에 사용MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>DM</td></tr><tr><td>NaCl</td>에 사용 <td>Wako</td><td>191-01665</td><td>DM</td></tr><tr><td>2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)</td>에 사용 <td>DOJINDO</td><td>346-08235</td><td>DM</td></tr><tr><td>젖산나트륨 용액</td>에 사용 <td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>중수소산화물 (D, 99.9%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-PK</td><td>동위원소 효과 실험용 첨가제</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>precultivation</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>TAITEC</td><td>NR-3</td><td>precultivation</td></tr><tr><td>오토클레이브 기계에</td> 사용 <td>TOMY SEIKO CO., LTD.</td><td>LSX-500</td><td>전기화학 반응기 및 매체의 살균에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>클린 벤치</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>전기화학 반응기 및 매체가 다른 미생물로 오염되는 것을 방지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>분리기 Eppendorf</td><td>5430R</td><td>회전 속도가 최대 6000회; g가 필요합니다</td></tr><tr><td>질소 가스 발생기</td><td>Puequ CO., LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>질소 가스 실린더는 가스 발생기</td></tr><tr><td>UV-vis 분광계</td> 대신 사용할 수도 있습니다 <td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>세포 밀도 최적화에 사용</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>생물막 형성 및 운동 동위원소 효과 실험에 사용</td></tr><tr><td>열 물 순환기</td><td>1 개</td><td>TR-1A</td><td>전기 화학 반응기의 온도 유지 보수에 사용</td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>전기 화학 실험에 사용</td></tr></tbody></table>

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

직접 c의 전기 화학 검출-시 토 크롬 단지 세균 외부 막에 포함 된 입력 (외부 막 c-입력 시 토 크롬 복합물; 톰 c-대련 청 려)는 최근 소설 전체 셀 셀 외관 호흡기 체인에서 세균성 전자 수송 특성 분석 방법으로, 세포 외 전자 전송 (동유럽 표준시)로. 통로 동유럽 표준시 반응 동안 전자 흐름의 속도, 조사 하는 동안 전체 셀 전기 메서드 동유럽 표준시와 관련 된 양이온 수송의 영향 검토를 하지 아직 설립 되었습니다. 현재 연구에서 중수소 활동적인 동위 원소 효과 (KIE) 동유럽 표준시에 옴 c를 검사 하는 생 화 확 적인 기술의 예-대련 청 려 모델 미생물, Shewanella oneidensis 미스터-1을 사용 하 여 설명 되어 있습니다. 동유럽 표준시 프로세스에 KIE 옴 c통해 동유럽 표준시-대련 청 려 미생물 현재 생산에서 속도 제한 단계 역할을 하는 경우에 얻어질 수 있다. 끝으로, D2O의 추가 하기 전에 표면에 뜨는 솔루션 업스트림 신진 대사 반응의 속도 지원 하 고 유니폼에서 planktonic 세포를 제거 하는 전자 기증자의 충분 한 금액을 포함 하는 신선한 미디어로 대체 되었습니다. 작업 전극에 단층 biofilm입니다. 속도 제한 확인 대체 방법을 미생물 현재 생산에서 단계 옴 c통해 동유럽 표준시-대련 청 려도 설명 됩니다. 양성자 전송 속도 론 조사를 위한 전기 화학 분석 결과 전체 셀의 우리의 기술은 다른 electroactive 미생물 계통에 적용할 수 있습니다.

0.4 V (그녀) 대에서 잠재적인 응용 프로그램의 25 h, 후 단층 biofilm 이전 스캐닝 전자 현미경 검사 법 또는4confocal 현미경 검사 법 의해 확인 되었다 이토 유리의 작업 전극에 형성 되었다. 단층 biofilm의 형성 중 S. oneidensis 씨-1에서 현재 생산의 대표적인 시간 과정은 그림 2에 표시 됩니다. 비록 현재는 모든 측정에 변경, 단층 biofilm 형성 균일 하 게 되 면 생산된 전류 편차 그림 2에서 값에서 50% 이상 발생 하지 않습니다.
신진 대사 과정의 속도 극대화 하 고 단층 biofilm (그림 3</strong...

여기 선물이 전체 셀 전기 화학 실험 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 복잡 한 외부 막 한다 통해 extracellular 전자 전송의 속도를 양성자 수송의 기여를 공부 하는 프로토콜.

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 중수소 운동 동위원소 효과의 검출을 통해 박테리아 세포 외 전자 수송 속도에 대한 양성자 수송의 기여도를 관찰하는 것입니다. 우리의 방법은 외막 c형 사이토크롬을 통해 박테리아에서 전극으로 가는 EET 또는 세포외 전자 수송의 동역학에 대한 양성자 수송의 영향을 보여줍니다. 우리의 분석은 정제된 효소가 아닌 살아있는 박테리아를 사용했기 때문에 EET의 천연 양성자 관리를 반영합니다.그러나 우리의 과제는 다른 세포 과정에서 발생하는 소음을 제거하는 것이었습니다. KIE라고 하는 중수소 운동 동위원소 효과는 관련 전자 수송 과정에 대한 양성자 수송의 기여도를 조사하는 가장 좋은 기술 중 하나입니다. Shewanella MR-1 세포를 성장시키려면 한천 플레이트에서 자란 세포의 한 콜로니를 15ml의 LB 배지로 옮깁니다.섭씨 30도에서 24시간 동안 호기성 조건에서 160rpm으로 진탕하면서 세포를 성장시킵니다. 6, 10 분 동안 중력에 000 시간 세포 현탁액을 원심 분리하십시오. 그런 다음, 생성된 세포 펠릿을 15ml의 정의된 배지에 재현탁시키고, 탄소의 공급원으로 10밀리몰의 젖산염과 세포의 미량 원소로 리터당 0.5g의 효모 추출물을 보충합니다.160 분당 회전수에 동요를 가진 12 시간 동안 30 섭씨 온도에 세포 현탁액을 공기역학으로 더 경작한 후에, 6에 다시 원심분리기, 10 분 동안 000배 중력. 6, 전기화학 실험의 앞에 000배 중력에 10 분 동안 원심분리에 의하여 DM 매체로 생성된 세포 펠릿을 두번 세척하십시오. 3 전극 전기 화학 반응기를 구성하려면 ITO 기판을 반응기 바닥에 작동 전극으로 놓으십시오.그런 다음 유리 실린더와 폴리테트라플루오로에틸렌 커버를 삽입하고 백금선을 상대 전극으로 삽입합니다. 그런 다음 염화은 전극을 기준 전극으로 반응기에 삽입합니다. 다음으로, 10 밀리몰 젖산염과 리터당 0.5 그램의 효모 추출물이 보충 된 4 밀리리터의 DM을 전기 화학 반응기에 첨가합니다.전기화학반응기에서 누출이 없음을 확인한 후 질소 가스를 전기화학반응기로 20분에 걸쳐 흘려 전기화학반응기 내부의 혐기성 상태를 유지합니다. 전기화학 반응기를 전위차에 연결하고 ITO 전극에 양의 0.4볼트를 가하여 외부 물 순환 시스템을 사용하여 전기화학 반응기의 온도를 섭씨 30도로 유지합니다. 전기화학적 배양을 수행하려면 먼저 10밀리몰 젖산염과 리터당 0.5g의 효모 추출물이 보충된 DM을 사용하여 현탁액의 세포 밀도를 600나노미터에서 1.43의 광학 밀도로 조정합니다.주사기를 사용하여 주입 포트를 통해 0.3ml의 세포 현탁액을 전기화학 반응기에 추가합니다. 반응기의 OD 600이 0.1로 변경됩니다. 0.4시간 동안 ITO 전극에 양의 25볼트로 전위 적용을 계속합니다.잠재적인 적용을 중지하고 전위차와 물 순환 시스템에서 전기화학 반응기를 분리하십시오. 질소 가스를 10 밀리 몰 젖산이 함유 된 DM이 들어있는 병에 20 분 동안 흘려 배지에서 산소를 제거합니다. 이제 매우 천천히 부드럽게 흐르는 질소 가스 아래에서 주사기를 사용하여 전기 화학 반응기 내부의 모든 상등액을 제거합니다.그런 다음 주사기를 사용하여 10밀리몰의 젖산염이 함유된 4밀리리터의 신선한 DM을 추가합니다. 전기화학 반응기를 기울여 반응기 벽의 상등액을 모두 제거합니다. 이 단계를 총 세 번 반복합니다.가스 흐름을 중지하고 전기 화학 반응기를 전위차 조절기에 다시 연결하고 0.4 Kelvin에서 ITO 전극에 양의 303 볼트를 적용합니다. Shewanella MR-1의 단층 생물막으로부터의 현재 생산량이 안정적이고 빠르게 증가하지 않는지 확인하십시오. 전류가 가파르게 증가하면 10분에 걸쳐 전류가 5% 증가로 안정화될 때까지 기다립니다.매우 천천히 그리고 부드럽게, 반응기에서 농도가 0.5 부피 퍼센트 D2O가 되도록 주사기를 사용하여 40마이크로리터의 무산소 50 부피 퍼센트 D2O를 전기화학 반응기에 첨가합니다. D20 첨가에 의한 생물막 손상을 방지하려면 D2O를 적가하여 주입하십시오. 전류가 안정화될 때까지 기다렸다가 D2O를 최대 4.4 부피 퍼센트까지 추가하여 현재 생산량과 D2O 및 H2O의 존재 비율인 KIE 값을 얻습니다.동일한 양의 H2O 첨가가 현재 생산량에 미치는 영향을 확인하십시오. 여기서, 실선은 D2O 첨가에 의해 유도된 미생물 전류 변화의 대표적인 결과이다. D2O를 첨가하면 10초 이내에 미생물 전류가 급격히 감소한 반면, H20은 점선에서 볼 수 있듯이 전류 감소가 거의 없었습니다.D2O에 의해 관찰된 전류 감소가 외막 사이토크롬을 통한 전자 전달에 기인하는지 확인하기 위해 확산 전자 매개체를 사용했습니다. 여기에 100마이크로몰 알파-AQS를 추가하면 현재 생산량이 5배 이상 증가했으며 현재 생산량은 D2O 추가의 영향을 받지 않았습니다. 이러한 결과는 대사 반응의 역학이 충분히 빨라서 세포 외 전자 전달 과정이 속도를 제한한다는 것을 나타냅니다.이를 평가하기 위한 또 다른 방법은 플라빈 분자를 전기화학 반응기에 첨가하는 것입니다. 플라빈 첨가에 의한 즉각적인 양극 전류 증가는 외막 사이토크롬을 통한 전자 수송 과정에 의한 속도 제한을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 외 전자 수송 과정에 대한 운동 동위원소 효과를 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.운동 동위원소 효과를 성공적으로 얻기 위한 가장 중요한 점은 외막 사이토크롬을 통한 전자 수송이 현재 생산 속도를 제한하는 상태를 명확히 하고 확인하는 것입니다. 이 비디오에서는 이 상태를 확인하기 위해 flavin의 첨가와 alpha-AQS와 같은 확산 추가 매개체의 첨가에 의한 전류 변화 관찰의 두 가지 방법을 소개했습니다. 속도 제한이 확인되면 이 시스템은 중수소 실험뿐만 아니라 외막 사이토크롬의 생화학적 특성화에도 사용할 수 있습니다.또한, 이 프로토콜은 세포 외 전자 수송 과정이 속도를 제한하는 한 다른 전기 활성 미생물을 검사하는 데 적용할 수 있습니다. 당사의 방법론은 in vivo에서 외막 사이토크롬을 통한 세포 외 전자 수송 과정을 조사하기 위한 기본적이고 일반적인 기술을 제공합니다.

electrochemical-detection-deuterium-kinetic-isotope-effect-on

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

출처: Tokunou, Y., et al, Shewanella oneidensis MR-1의 세포외 전자 수송에 대한 중수소 동위원소 효과의 전기화학적 검출. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 양성자 전달이 전기 활성 박테리아의 세포외 전자 전달(EET)에 어떤 영향을 미치는지 평가하기 위한 전체 세포 전기화학적 방법을 보여줍니다. 이 방법은 산화중수소를 사용하여 양성자를 중수소로 대체함으로써 전류의 변화를 측정하여 운동 동위원소 효과를 밝히고 전자 흐름을 조절하는 양성자 운동의 역할을 강조합니다.

산화중수소를 이용한 미생물 전자 수송에 대한 동위원소 효과 측정

엑소좀은 생체 유체 내에서 발견되는 미세소포 구조로, 잠재적으로 중요한 질병 차별적 바이오마커를 운반할 수 있습니다. 여기에서는 비균일 전기순환 구형파를 사용하여 엑소좀이 파괴된 후 엑소좀을 특이적으로 추출하고 RNA/단백질 표적 모두에 대한 엑소좀 화물을 신속하게 테스트하기 위한 새로운 방법을 사용합니다.

전기장에 의한 해제 및 측정 (EFIRM)에 의해 Exosomal 바이오 마커의 검출

살아있는 미생물 biofilms 순수 관련 조건에서의 전기 전도도 측정 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

특성화 생활 Biofilms 통해 전자 전송

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

현장 미생물 농축 또는 제자리에서 재배 기술을 낮은 바이오 매스 geochemically 극단적인 환경에서 특히 어려운 문화 미생물 taxa의 절연 용이 하 게 수 있습니다. 여기, extracellular 전자 전송 (동유럽 표준시) 수 있는 미생물 긴장을 풍부 하 게 하는 외부 전원 공급 장치를 사용 하지 않고 전기 설정을 설명 합니다.

현장 양극 다 박테리아를 풍부 하 게 각자 서 있는 전기 설정

이 프로토콜은D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

분석 기술로서 나노 미터 규모의 전기 비활성 입자를 계산하고 특성화하는 데 점점 더 중요한 접근 방식 인 나노 충격 전기 화학은 초 미세 전극 사용으로 인해 발생하는 이질적인 전류 분포로 인해 정밀도가 떨어집니다. 여기에 요약된 것은 이러한 측정의 정밀도를 향상시키는 "전기 촉매 중단"이라고 하는 일반화된 접근 방식입니다.

개별 전기 비활성 입자의 정확한 전기화학적 크기 조정

여기에서는 3전극, 2챔버 생전기화학 시스템을 사용하여 젖산 박테리아의 매개 세포외 전자 전달(EET)을 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. Lactiplantibacillus plantarum 과 산화환원 매개체 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid를 사용하여 이 방법을 설명하고 매개 EET를 평가하는 데 사용되는 전기화학적 기술에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

여기에서는 유기 전기화학 트랜지스터(OECT)를 사용하여 Shewanella oneidensis 의 세포외 전자 전달(EET) 활성을 전기 신호로 변환하는 프로토콜을 제시합니다. 하이브리드 OECT 시스템은 향상된 견고성, 감도 및 신속한 고처리량 테스트 가능성을 제공하여 EET 측정을 위한 효과적인 도구입니다.

유기 전기화학 트랜지스터를 이용한 세포외 전자 전달 활동의 번역

배우세요 중수소 동위원소 효과를 이용한 Shewanella oneidensis MR-1의 세포 외 전자 전송에서 양성자 수송의 역할을 전기화학적으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 살아있는 세포에서 원래의 양성자 관리를 반영하여 미생물 전자 전달 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

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