Name: GPC3 대상으로 Bispecific 항 체, GPC3-S-팹, 강력한 세포 독성을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 학습하세요 GPC3-S-Fab 이중특이성 항체를 대장균에서 생산하고 정제하는 방법을. 이 프로토콜은 GPC3 양성 간암 세포에 대한 강력한 세포독성을 평가하여 항암 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 R & D 계획의 광 동성 (중국 홍보) (2016A050503028)에 의해 재정적으로 지원 되었다.

모든 인간의 혈액 수집 절차는 Sun 야만 센 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. GPC3-S-팹 디자인 전략
<ol><li>안티-GPC3 (humanized GC3313)는 안티 CD16 VHH14 (그림 1)의 공장을 연결 하 여 GPC3-S-팹을 디자인 합니다.</li>
	<li>합성 하 고 이전에 보고 된12VH-CH1-CD16-VHH 및 VL-CL pET26b 및 pET21a 벡터에 복제.</li>
</ol>2. 변환 및 문화
<ol><li>추가 100 VH-CH1-CD16 (그림 1A) 및 100를 포함 하는 pET26b의 ng의 유능한 BL21 100 µ L에 VL-CL (그림 1A)를 포함 하는 pET21a의 ng (DE3) 세포. 잘 혼합 하 고 30 분 품 45-90 s, 전송, 42 ° C 물 목욕에 대 한 얼음에 품 어 3-5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>BL21 포함 된 튜브에 lysogeny 국물 (파운드) 매체의 500 µ L를 추가 (DE3) 세포와 다음 37 ° C, 45-60 분에 대 한 150 rpm에서 확산 100 µ L BL21의 품 어 파운드-한 천 (DE3) 셀 플레이트 포함 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린 그리고 다음 37 ° C 12-16 h에서 품 어.<ol>
<li>Lysogeny 국물 (파운드) 매체를 준비: 1 %wt / 집 tryptone, 0.5 %wt / 권 효 모 추출 물, 1 %wt / 권 NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하룻밤 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 220 rpm에서 문화를 포함 하는 슈퍼 국물 (SB) 매체의 5 mL로 단일 식민지에서 세포를 접종. 다음, 대 의 50 µ g/mL와 100 µ g/mL 암 피 실린 , 37 ° C, 4 h 220 rpm에서 문화를 포함 하는 SB 매체의 100 mL으로 문화의 1 mL를 접종. 다음, 50 µ g/mL 대 와 100 µ g/mL 암 피 실린 , 37 ° C, 220 rpm에서 문화를 포함 하는 SB 매체의 1 리터에 10 mL 문화의 전송.<ol>
<li>슈퍼 국물 매체 준비: 3.2 %wt / 집 tryptone, 2 %wt / 권 효 모 추출 물, 0.5 %wt / 권 NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 에 도달 하면 0.6-0.8, 0.2 m m의 최종 농도에 이소프로필-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)를 추가 합니다. 16 ° C, periplasmic 식 36-48 h에 대 한 180 rpm에서 문화.</li>
</ol>3. GPC3-S-팹 Periplasmic 정화
<ol><li>Periplasmic 분수 준비<ol>
<li>4000 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 centrifuging 여 세포를 수집 하 고 매체, 삭제 셀 무게.</li>
		<li>Resuspend 셀 셀의 그램 당 차가운 자당 해결책 (pH 7.5 Tris HCl의 20 m m, 25% (wt/vol) 자당 및 EDTA의 1 m m)의 4 mL에 철저 하 게 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>원심 8500 x g (탁상용 원심 분리기, 고정된 각으로 터)에서 4 ° C 20 분 제거 상쾌한 (자당 분수)와 저장 얼음에.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 5mm MgCl2 의 그리고 1 밀리미터 PMSF (4 mL 당 그램 셀)의 혼합에 산 탄을 resuspend. 그램, 당 lysozyme 주식 (15 mg/mL)의 40 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>20 분 전송 상쾌한 (periplasmic 분수) 4 ° C에서 8500 x g (탁상용 원심 분리기, 고정 각으로 터), centrifuge 고 얼음에 저장 합니다.</li>
		<li>자당 분수와 periplasmic 분수, 결합 하 고 얼음에 50 mL 원뿔 튜브에 30000 x g, 4 ° C에서 30 분 제거는 상쾌한 고 저장 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni NTA 친 화력 정화<ol>
<li>균질 정지 달성, 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 Ni NTA agarose의 1 mL을 제거 하 고 10 열 볼륨 (CV) 평형 버퍼 추가를 철저 하 게 혼합 하 여 Ni NTA agarose의 1 mL를 resuspend (25mm Tris HCl, pH 7.5;의 NaCl의 1 M) equilibrate에.</li>
		<li>5 분에 대 한 400 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 신중 하 게 제거 합니다. 그런 다음, 자당 분수와 periplasmic 분수를 포함 하는 50 mL 튜브에 Ni NTA agarose를 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 바위입니다.</li>
		<li>400 x g에서 혼합물을 원심, 4 ° C 5 분에 대 한 신중 하 게 상쾌한 언바운드 분수 다른 신선한 얼음 튜브를 제거. 중력 열에 Ni NTA agarose를 전송 합니다.</li>
		<li>10 추가 버퍼 세척의 이력서 (25mm Tris HCl, pH 7.5; 1 M NaCl의; 20 m m, 30mm 또는 이미의 40 m m) 열을 수집 세척 분수 elute. 참고: 이러한 솔루션은 이미의 농도 증가의 순서에 추가 되어야 합니다.</li>
		<li>3 추가 차입의 이력서 열 (25mm Tris HCl, pH 7.5; 300 mM NaCl의, 100mm, 200mm, 300mm 또는 이미의 400 m m)를 버퍼링 하 고 차입 분수 1, 2, 3, 및 4는 elute 수집. 참고: 이러한 솔루션은 이미의 농도 증가의 순서에 추가 되어야 합니다.</li>
		<li>투 석 PBS (137 mM NaCl, 2.7 m m의 KCl, 10mm 나2HPO4, KH2포4, pH 7.4의 2 mM)의 2 L에 eluted 분수 12 %GPC3-S-팹의 존재를 확인 4 ° C에서 2 헤에 대 한 투 석 튜브 (12.4 kDa)을 사용 하 여 SDS 페이지 다음에 의해 Coomassie 파란 얼룩입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG CH1 친 화력 정화<ol>
<li>IgG CH1 선호도 수 지의 1 mL 50 mL 원뿔 튜브로 전송 하 고 PBS 가진 구슬을 먼저 씻어. 그런 다음 단계 3.2.6 후 GPC3-S-팹을 포함 된 dialyzed 솔루션을 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 바위입니다.</li>
		<li>5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기, 4 ° c. 조심 스럽게 상쾌한 다른 신선한 얼음 튜브를 제거 하 고 중력의 열 수 지를 전송.</li>
		<li>10 추가 세척의 이력서는 열 (PBS)를 버퍼링 하 고 세척 분수 차입을 수집.</li>
		<li>트리 스 pH 9.0 (각 eluted 분수의 mL 당 0.1 mL)의 1m를 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 합니다. 3 이력서 차입 버퍼 (글리신-HCl, pH 2.7의 0.1 m M)와 함께 elute 및 수집 eluted 분수; 3 회 반복 한다.</li>
		<li>투 석 4 ° C에서 2 헤에 대 한 투 석 튜브 (12.4 kDa)을 사용 하 여 PBS의 2 L에 eluted 분수를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>Ultramicrospectrophotometer에 의해 단백질 농도 결정 (어 금 니 소 광 계수: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS 페이지와 서 부 럽 분석
<ol><li>SDS 로딩 버퍼 x 5 샘플의 10 µ L를 고려 하 고 잘 섞으십시오. 5 분 동안 100 ° C에서 단백질 혼합물을 끓인 다.<ol>
<li>SDS 로딩 버퍼 x 5를 준비: Tris HCl, pH 6.8, 10 %wt / 집 SDS의 250 m m, 0.5 %wt / 집 bromophenol 블루, 50 %vol / vol 글리세롤, 5 %vol / vol 베타-mercaptoethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>앞에서 설명한26,,2728는 SDS 페이지 젤 로드 젤 (5%)와 분리 젤 (12%)를 준비 합니다.</li>
	<li>삶은 단백질 혼합물의 단백질 마커, 10 µ L을 로드 하 고 실행 SDS 페이지.</li>
	<li>젤 Coomassie 화려한 블루 솔루션, 20 분 동안 흔들어 하 여 얼룩 하 고 destaining을 수행 합니다.</li>
	<li>PVDF 막에 전송 후 서 부 럽 TBST (20 mM Tris HCl의 NaCl, 0.1 %vol / vol 트윈 20의 150 m m)와 막 차단 + 5 %wt / vol 흔들어 동안 실 온에서 1 h 동안 우유를 탈지 합니다.</li>
	<li>1 차 항 체를 막 품 어 (반대로 그의 또는 반대로 플래그) 1:2,000 TBST + 1 시간을 위한 5% 탈지 우유에 희석.</li>
	<li>TBST를 가진 실내 온도에, 5 분 동안 세척 하 고 3 번 반복.</li>
	<li>이차 항 체 (HRP 연결 방지 마우스 Fc 항 체) 희석 1:2,000 TBST + 1 시간을 위한 5% 탈지 우유에에서 막 품 어.</li>
	<li>TBST를 가진 실내 온도에, 5 분 동안 세척 하 고 3 번 반복.</li>
	<li>영화 당 HPR 기판의 1 mL을 추가 하 고 개발 이미지.</li>
</ol>5. 젤 여과 분석
<ol><li>다음 열을 사용 하 여: 열 양의 24 mL; 재래식 버퍼 PBS pH 7.4;의 온화한; 룸에서 0.5 mL/min의 유량 200 µ L의 샘플 볼륨입니다.</li>
	<li>다음 단백질의 양과 농도 사용 하 여: 1.2 mg/mL GPC3-S-팹의 500 µ L. 30 분 동안 20000 x g에서 centrifuge 그리고 200 µ L 로드.</li>
	<li>단백질 마커 볼륨 및 농도 대 한 하나의 튜브 (2 mg/mL, 12.4 kDa)는 시 토 크롬 C의 100 µ L, 탈수 (3 mg/mL, 29 kDa)의 140 µ L, 알 부 민 (10mg/mL, 66 kDa)의 140 µ L 및 알콜 효소 (5 mg/mL, 150 kDa)의 200 µ L 걸릴. 30 분 동안 20000 x g에서 centrifuge 그리고 200 µ L 로드.</li>
	<li>각 실행 하기 전에 적어도 2 씻고 증류수 0.5 mL/min 흐름 속도로 이력서.</li>
	<li>적어도 2 열 equilibrate 평형 버퍼 (PBS, pH 7.4) 0.5 mL/min 유량의 이력서.</li>
	<li>자동으로 샘플을 로드 0.5 mL/min에서 샘플을 주입.</li>
	<li>0.5 mL/min에서 재래식 버퍼 elute 고 280 그리고 215 nm에서 검출.</li>
</ol>6. 교류 Cytometry 분석
<ol><li>문화는 HepG2 (긍정적인 GPC3) Hep3B (긍정적인 GPC3), Huh7 (GPC3 양수), 및 MHCC-97 H (GPC3 제외) 셀 100 m m x 20 m m 플라스틱 요리 DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 µ g/mL), 및 37 ° C에서 스 (50 µ g/mL) 5% CO2.</li>
	<li>문화 조 (GPC3 제외) 세포와 조/GPC3 세포는 전체 길이 인간의 GPC3 cDNA (GPC3 긍정적인) 100 m m x 20 m m 플라스틱 요리와 10 %FBS, 페니실린 (100 µ g/mL), 스 (50 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2RPMI 1640 매체에에서 은닉.</li>
	<li>NK92/CD16 전체 길이 인간의 CD16 cDNA (CD16 긍정적인) 은닉 RPMI 1640 매체와 10 %FBS, 페니실린 (100 µ g/mL), 스 (50 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2를 포함 하는 25 c m2 플라스 크에 문화.</li>
	<li>셀 70-90% 합칠 때, 매체를 삭제 하 고 2 mL의 PBS로 세포를 씻어. 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 2-3 분 (또는 때까지 세포 표면에서 분리를 시작) 37 ° C에서 품 어. 중화 하는 트립 신 고 다시 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀 중단 완전 한 성장 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>Neubauer hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 Trypan 블루 세포 생존 능력을 감지.</li>
	<li>각 셀 라인 3 x 106 셀을 수집 합니다. 1 mL의 PBS + 0.2 %BSA 다시 셀을 일시 중지를 추가 합니다. 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분 두 번 반복에 대 한.</li>
	<li>0.3 mL PBS + 0.2 %BSA 다시 셀, 일시 중지를 추가 하 고 각 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브를 100 µ L (약 1 백만)를 전송. 참고: 여기에서 모든 단계는 튜브를 얼음에 차가운 유지 한다 있는지 확인 하십시오. 항 체를 세포 표면 항 원에 바인딩할 때 복잡 한 내 면화 하기 시작 합니다. 유지 함으로써 그것은 감기, 과정은 크게 둔화.</li>
	<li>모든 튜브에 1 차 항 체 (GPC3-S-팹 또는 인간 IgG1, 최종 농도 5 µ g/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>PBS의 1 mL를 추가 + 0.2 %BSA 세척, 그리고 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분을 3 번 반복.</li>
	<li>다시 PBS + 0.2 %BSA 100 µ L에서 중단 하 고 이차 항 체 (반대로 인간 IgG(H+L)-488, 최종 농도 10 µ g/mL)의 0.5 µ L을 추가 1 헤 주 ice에 품 어:이 단계에서 하십시오 빛에서 세포를 유지.</li>
	<li>PBS의 1 mL를 추가 + 0.2 %BSA 세척, 그리고 200 x g에서 원심 분리기, 4 ° C 5 분을 3 번 반복.</li>
	<li>29표준 프로토콜 따라 교류 cytometer 세포 분석. 여기 488 nm 레이저로 세포를 획득 합니다.</li>
</ol>7. 세포 독성 분석 실험
<ol><li>종양 세포를 준비 합니다.<ol>
<li>문화 HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC-97 H, 그리고 조 세포 라인 단계 6.1-6.5에에서 설명 된 대로.</li>
		<li>0.5 × 105/mL, 셀을 희석 하 고 100 µ L 셀 (5000 잘 당) 96 잘 접시에 접시. 연결할 셀 수 있도록 6-8 h 문화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 준비 합니다.<ol>
<li>50 mL 원뿔 튜브에 PBS의 동등한 양 가진 신선한 준비 된 혈액을 희석. 예를 들어 혈액의 PBS의 10 mL와 10 mL 희석.</li>
		<li>신선한 50 mL 원뿔 관으로 림프 구 분리 매체의 15 mL를 가져가 라. 천천히 희석된 혈액 튜브 측면을 따라 림프 구 분리 매체에 전송 합니다. 참고: 수직 튜브를 유지. 림프 구 분리 매체의 표면을 휴식 하지 않습니다.</li>
		<li>브레이크에서 실 온에서 35 분에 대 한 400 x g에서 원심.</li>
		<li>천천히 위 플라즈마 레이어를 제거 하 고 플라즈마-림프 구 분리 매체 인터페이스에서 PBMCs를 포함 하는 백색 혈액 레이어.</li>
		<li>PBS + 2% 더블 볼륨 PBMCs 희석 FBS. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심.</li>
		<li>씻어 PBS + 2%로 두 번 셀 FBS. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기 단계 6.5에서에서 설명한 대로 셀 번호를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK 세포를 준비 합니다.<ol>
<li>5 x 107 셀/mL PBS + 2 %FBS, 및 장소에서의 농도 PBMCs 정지 준비 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브에 그들.</li>
		<li>셀의 50 µ L/mL에서 농축 칵테일 인간 NK 세포를 추가 합니다. 잘, 그리고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>Resuspend 그들은 균일 하 게 pipetting으로 일시 중단 되도록 NK 세포 농축 키트, 잘 믹스에서 자석 입자 고 아래 5 번 보다 더 적극적으로. 세포 현 탁 액에 100 µ L/mL에서 resuspended 자석 입자를 전송. 잘, 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>PBS + 2% 추가 하 여 최대 2.5 mL의 총 볼륨 세포 현 탁 액을가지고 FBS. 부드럽게 위아래로 2-3 번 pipetting으로 튜브에 세포를 혼합. 자석으로 (모자) 없이 튜브를 놓습니다. 마그네틱 구슬 실 온에서 2.5 분에 대 한 진정 하자.</li>
		<li>자석을 제거 합니다. 한 연속 움직임에 새로운 튜브에 풍부한 세포 현 탁 액을 붓는 튜브 반전.</li>
		<li>6.5 단계에서 설명한 대로 셀 번호를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 독성 반응을 설정 합니다.<ol>
<li>5 × 105 셀/ml 해당 문화 매체를 사용 하 여 NK 세포를 희석. 96 잘 접시에 도금 하는 종양 세포를 NK 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>30 µ g/mL, 3 희석, 9 포인트 (3 복제)의 최종 농도에 높은 복용량과 함께 다른 농도에서 GPC3-S-팹 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 72 h에 품 어.</li>
		<li>외피의 72 h 후 매체, 제거 그리고 DMEM 매체 포함 하는 CCK8 시 약 96 잘 접시에 잘 각 하의 10 µ L의 100 µ L를 추가 하 고 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>450에 접시를 읽고 1, 2, 3, 및 4 h CCK8 시 약을 추가한 후에 nm.</li>
		<li>데이터를 분석 합니다. 생존 율을 계산 하는 (OD450 GPC3-S-팹 + 이펙터 + 종양 -OD450 매체) / (OD450 종양 -OD450 매체) × 100%, (OD450 GPC3-S-팹 + 종양 -OD450 매체) / (OD450 종양 - OD450 매체) × 100%. 효과 기 세포는 NK 세포 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

이 연구에서는 bsAbs의 새로운 형식을 구성 하는 전략 소개 GPC3 긍정적인 종양 세포를 대상으로 하는 NK 세포를 모집 할 수 있는 GPC3-S-팹. S-팹 자연 팹 기반 안티 CD16 VHH11,12를 추가 하 여 형식. BsAbs 포함 된 Fc 지역에 비해, GPC3-S-팹 쉽게 생산 수 있습니다 큰 규모에 박테리아의 periplasm에서.
프로토콜에 설명 된 식과 정화 전략을 사용 하 여, 우리는 가용성과 기능 GPC3-S-팹에에서 얻은. Periplasmic 식, 촉진 하기 위하여 신호 순서 pelB 대장균17는 periplasm에 분 비를 직접 N-말단에 추가 되었습니다. 세포질, 달리 더 산화 세포질 및 외부 세포 막 사이의 periplasmic 공간에 단백질 폴딩 및 어셈블리에 대 한 중요 한 단백질...

단일 클론 항 체는 이제 암 치료1광범위 하 게 사용 된다. 항 체의 유연성으로 인해 다양 한 항 체 기반 형식을 적극적으로 탐험 있다. 단일 클론 항 체와 비교, bsAbs 두 개의 다른 항 원 바인딩 모듈, 2 개의 다른 목표 동시에 고 효율적으로 방 아 쇠를 목표 하 고 종양 세포2를 죽 일 면역 효과 기 세포의 채용을 인식 하는.
현재 재조합 bsAb 형식을 일반적으로 두 개의 클래스에 할당할 수 있습니다: bsAbs 포함 하는 Fc와 Fc 지역 없이 bsAbs. 대부분 포유류 세포에서 생성 되는 Fc 포함 된 형식에 비해, bsAbs Fc 지구는 작은 크기의 장점을 하지 않고 더 쉽게 미생물 식 시스템에서 생산 되 고 보다 효율적으로 종양 조직에 침투 수 있습니다 3.
bsAbs Fc 지역 없이 일반적으로 개별 바인딩 moieties 단일 체인 변수 조각 (scFvs) 또는 팹3등을 연결 하 여 형성 된다. 안정적인 도메인 없이 bsAbs 자주 scFv 조각에 따라 열 안정성, 낮은 용 해도, 또는 집계4,5에 대 한 증가 잠재력 손상 있다. 반면, bsAbs 팹 기반 네이티브 팹 moiety4,6CH1 및 CL의 heterodimerization 때문에 안정 되어 있다.
무거운-체인 전용 항 체 (VHHs, 단일 도메인 항 체로 라고도 함)에서 변수 도메인은 자연 무거운 체인 항 체7의 활성 항 원 바인딩 조각. VHHs에 있는 높은 선호도의 특성, 기존의 IgGs8, 낮은 immunogenicity 및 높은 수익률의 특이성 세균성 식9. Fv 조각에 비해, VHHs 높은 열 안정성10있다. 팹 moieties와 비교해, VHHs는 CH1 및 CL의 부족으로 인해 작은 크기. 따라서, S-팹, 단일 도메인 항 체, VHH와 팹을 연결 하 여 얻은 bsAb 형식 설계 하 고 그것의 항 종양 효과11,12에 대 한 공부.
이 연구에서는 hGC3313 안티 CD16a VHH14 의 팹을 연결 하 여 GPC3-S-팹 건설은 설명 했다. GPC3-S-팹 periplasmic 식 대장균 (대장균)에 효율적으로 제작 될 수 있습니다. GPC3-S-팹의 기능 연구 GPC3-S-팹은 간 암 치료를 위한 유망한 전략 제안. 따라서, 쉽게 생산 및 정화, 그리고 안정 되어 있는 bsAbs는 이전 연구에 대 한 해당 참조를 대체 기술을 통해 GPC3-S-팹의 장점이 있습니다.
포유류 식 시스템 및 간결한 식 시스템 BsAbs의 다양 한 포맷을 표현 하기 위해 사용 되었습니다. 포유류 식 시스템, 대장균과 달리-기반된 단백질 식 시스템은 높은 수율, 낮은 비용과 노동 절약, 유전자 조작, 높은 변환 효율15의 용이성을 포함 하 여 많은 혜택. 대장균에서 bsAbs 식에 대 한 두 가지 기본 전략: 세포질과 세포질 사이 세포 막 외부15periplasm에 식 식. 세포질의 감소 환경에 비해는 periplasm 더 산화 환경, 올바른 접는 촉진 및 단백질16의 공동 식 이다. 올바른 접는 bsAbs의 용 해도, 안정성과 기능 생성에 주요 역할을 하고있다. 따라서, 신호 순서 pelB 대장균17는 periplasm에 분 비를 직접 S 팹의 N-말단에 추가 되었습니다. 되도록 정확한 접는, 용 해도, 열 안정성 및 구조적 안정성, 복잡성 및 항 체의 크기 감소는 자주 고용16. 한 팹과 세균성 시스템 가능성이 간단한 구조와 작은 크기 때문에 아주 잘 표현 한 VHH S 팹 형식에 의하여 이루어져 있다.
GPC3은 GPC3-S-팹 bispecific 항 체 형식으로 선정 되었다. Glypican-3 (GPC3) glycosylphosphatidylinositol (GPI)18을 통해 세포 표면에 고정 되는 헤 파 린 황산 염 (HS) proteoglycan 가족의 구성원입니다. GPC3 70%의 간세포 암 (HCC) 경우, 간 암19,20,,2122의 대부분에 대 한 어떤 계정에 overexpressed입니다. GPC3는 정상 조직에 거의 표현 된다, 때문에 GPC3 HCC에 대 한 잠재적인 대상으로 제안 하고있다. 여러 마우스 mAbs GPC3에 대 한 제작 되었습니다. 그러나,만 GC33 전시 제한 안티 종양 활동 22, 그리고 환자에서 임상 효능을 전시 하는 데 실패. 이 연구에서는 GPC3-S-팹 모집 GPC3 종양 세포14를 죽 일 NK 세포 수를 표시 했다.
NK 세포를 모집, 안티 CD16 VHH 사용 되었다. CD16a 낮은 친 화력 IgG 수용 체, T 세포의 일부 하위, monocytes, 대 식 세포, 자연 킬러 (NK) 세포에 주로 표현 이다. 그것은 항 체 의존 세포 세포 독성 (ADCC) NK 세포23에 의해 포함 된다. 인간 NK 세포 CD56 두 종류로 분류 될 수 있다-CD16 +, CD56 + CD16-. 달리 CD56 + CD16− NK 세포, CD56-CD16 + NK 세포 수 perforin와 granzyme B 놓고 따라서 강한 세포 독성24제시. Kupffer 세포 (관세), CD16a, 표현 간에서 상주 대 식 세포는. Kupffer 세포 간 암25의 억제에 중요 한 역할을 한다. 따라서, bsAbs CD16a를 대상으로 T 세포 간 암에 대 한 매력 보다는 더 유망한 전략을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>진탕 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>진탕 인큐베이터</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman 쿨터</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>자외선 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>분석 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 장치</td><td>Mini-PROTEAN&reg; Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot 장치</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>이미징 시스템</td><td>Bio-rad</td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein 액체 크로마토그램</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Beckman coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>에펜도르프</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision 플레이트 리더</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>안티 플래그 태그</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>안티 휴먼(H& L)-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP 연계 항체</td><td>세포 신호</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 친화성 수지</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>NK 세포 농축 키트</td><td>줄기세포</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>자석</td><td>스템셀</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 키트</td><td>도진도</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>시그마</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>표준 마커</td><td>시그마 알드리치</td><td>MWGF200</td><td>겔 여과</td></tr><tr><td>이소프로필-b-D-티오-갈락토피라노사이드(IPTG)</td><td>VWR 화학 물질</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>시그마 알드리치</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>크나나마이신</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>써모 피셔</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>써모 피셔</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>시그마 알드리치</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 알드리치</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>알라딘</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>알라딘</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>생명공학</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨, 일염기성 무수(KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨, 이염기성, 무수(Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>리소자임</td><td>시그마 알드리치</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>쿠마시 브릴리언트 블루 R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 20mm 플라스틱 접시</td><td>코닝</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 플라스크</td><td>코닝</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 클러스터</td><td>코닝</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>산곤 생명공학</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>중국과학원의 유형 문화 컬렉션</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>중국과학원의 유형 문화 컬렉션</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>중국과학원의 유형 문화 컬렉션</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>중국과학원의 유형 문화 컬렉션</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>중국과학원(Chinese Academy of Sciences)의 활자 문화 컬렉션(Type Culture Collection</td>) <td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

gpc3 대상으로 bispecific 항 체, gpc3-s-팹, 강력한 세포 독성을

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

이 프로토콜 건설과 bispecific 항 체 (bsAb), GPC3-S-팹의 기능 연구에 설명합니다. bsAbs는 그들의 두 개의 서로 다른 무기를 통해 두 개의 다른 epitopes를 인식할 수 있습니다. bsAbs는 직접 종양 세포를 죽 일 면역 세포를 보충 하는 그들의 기능에 대 한 적극적으로 연구 되었습니다. 현재, bsAbs의 대부분은 재조합 단백질, Fc 포함 된 bsAbs 또는 Fc 지역 없이 작은 bsAb 파생 상품의 형태로 생산 됩니다. 이 연구에서는 GPC3-S-팹, 항 체 단편 (팹) 기반된 bispecific 항 체, 안티-GPC3 항 체 GC33 안티 CD16 단일 도메인 항 체의 Fab을 연결 하 여 설계 되었다. GPC3-S-팹 대장균 에 표현 고 두 선호도 chromatographies에 의해 순화 될 수 있습니다. 순화 GPC3-S-팹 구체적으로 바인딩할 하 고 세포를 죽 일 GPC3 긍정적인 간 암 자연 킬러 세포를 모집 하 여 간 암 치료에 GPC3-S-팹의 잠재적인 응용 프로그램을 제안 수 있습니다.

GPC3-S-팹 정화
GPC3-S-팹은 정화 대장균 에서 2 단계 선호도 정화에 의해 먼저 Ni-주권-agarose, IgG CH1 친 화력 정화 다음으로. 2 단계 선호도 정화 후 GPC3-S-팹 1:1 (그림 2A)에 가까운 두 개의 체인으로 동질성을 정화 했다. VH-CH1-CD16 VHH와 VL-CL polypeptides의 존재 그들의 뚜렷한 C 터미널 태그에 의해 확인 될 수 있다 반대로 그의 VL-CL 대략 25 kDa, VH-CH1-VHH 약 38 kDa (그림 2B)에 대 한 반대로 플래그에 대 한. 2 단계 선호도 정화 후 ~1.2 mg 단백질 SB 문화 1 리터에서 얻어질 수 있다. 더 정화 ...

여기, 우리 제시에 bispecific 항 체 GPC3-S-팹 생산 프로토콜 대장균. 순화 GPC3-S-팹 GPC3 긍정적인 간 암 세포에 대 한 강력한 세포 독성을 있다.

GPC3 대상으로 Bispecific 항 체, GPC3-S-팹, 강력한 세포 독성을

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

이 방법은 박테리아에서 이중특이성 항체를 생성하고 정제된 항체의 기능을 결정하는 방법과 같은 이중특이성 항체 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 GPC3-S-Fab를 E.coli에서 쉽게 생산하고 정제할 수 있다는 것입니다. 주위 분획을 준비하려면 먼저 섭씨 4도에서 30분 동안 4, 000g에서 세포 현탁액을 원심분리합니다.그런 다음 배지를 배출하고 세포의 무게를 잰다. 원심분리 후, 세포 1g당 4ml의 얼음처럼 차가운 자당 용액에 세포 펠릿을 용해시킵니다. 세포 현탁액을 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.15분 후, 섭씨 4도에서 20분 동안 8, 500g에서 세포 현탁액을 원심분리합니다. 그런 다음 자당 분획을 포함하는 상등액을 피펫으로 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 세포 펠릿을 5밀리몰 염화마그네슘과 1밀리몰 PMSF의 얼음처럼 차가운 혼합물에 재현탁시킵니다.그런 다음 리소좀 스톡의 밀리리터당 15밀리그램 40마이크로리터를 세포 현탁액에 추가합니다. 리소좀 스톡을 첨가한 후 세포 현탁액을 얼음 위에 30분 동안 그대로 둡니다. 잠복기가 끝나면 자당과 주위 분획을 결합합니다.다음, 30, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 자당 periplasmic 분획을 원심 분리하십시오. 원심분리가 끝나면 상층액을 50ml 원추형 튜브에 넣어 얼음 위에 옮겨 놓습니다. 다음으로, 1 밀리리터의 니켈 -NTA 아가 로즈를 상층액과 혼합하고 재현탁시켜 균일 한 현탁액을 얻은 다음 1 밀리리터의 니켈 -NTA 아가 로즈를 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브에 넣는다.아가로스에 평형 완충액의 10 column volume을 추가합니다. 그런 다음 아가로스를 400g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심 분리 후, 조심스럽게 상등액을 제거하고 니켈-NTA 아가로스를 자당-주위 분획에 첨가합니다.그런 다음 자당-주위 분획 함유 튜브를 섭씨 4도에서 2시간 동안 흔듭니다. 다시 혼합물을 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 새로운 얼음처럼 차가운 튜브로 조심스럽게 제거하십시오.상등액이 이송된 후 중력 컬럼에 니켈-NTA 아가로스를 첨가합니다. 그런 다음 3개의 컬럼 부피의 용리 완충액을 컬럼에 추가합니다. 다음으로, 용리액을 각각 용리 분율 1, 2, 3, 4로 수집합니다.96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터로 5, 000개의 세포를 희석하고 시딩합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 6-8시간 동안 배양하여 부착합니다. PBMC를 준비하려면 먼저 50ml 원추형 튜브에 동일한 부피의 인산염 완충 식염수로 새로 준비된 혈액을 희석합니다.새로운 50ml 원뿔형 튜브에 15ml의 림프구 분리 배지를 피펫팅합니다. 다음으로, 튜브의 벽을 따라 희석된 혈액을 림프구 분리 배지로 조심스럽게 옮깁니다. 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 35분 동안 400g의 세포를 원심분리합니다.원심분리 후 상부 플라즈마 층을 조심스럽게 빼냅니다. 그런 다음 PBMC를 포함하는 백혈구를 피펫으로 만듭니다.인산염 완충 식염수 부피의 두 배로 얻은 이러한 PBMC를 2% 소 태아 혈청으로 희석합니다.그런 다음 PBMC 서스펜션을 원심분리합니다. 2%의 소 태아 혈청을 함유한 인산염 완충 식염수로 세포 펠릿을 세척하고 다시 원심분리합니다. 원심분리 후 세포 수를 계산합니다.자연 살해 세포를 준비하려면 인산염 완충 식염수에서 PBMC를 2% 태아 소 식염수로 재구성합니다. 그런 다음 혼합물을 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 옮깁니다. PBMC 혼합물에 밀리리터당 50마이크로리터의 자연 살해 세포 농축 칵테일을 첨가합니다.내용물을 섞고 튜브를 10분 동안 그대로 두십시오. 다음으로, 농축 칵테일에 존재하는 자성 입자를 여러 번 피펫팅하여 입자가 균일하게 부유하도록 재부유하고 혼합합니다. 그런 다음 자기 입자 100마이크로리터를 세포 현탁액에 추가합니다.세포 현탁액 자성 입자를 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 2.5ml의 인산염 완충 식염수와 2%의 소 태아 혈청을 세포 현탁액에 첨가합니다. 튜브의 세포를 혼합하기 위해 2-3회 부드럽게 피펫팅합니다.튜브를 자석에 놓고 자석 비드를 실온에서 2.5분 동안 안정시킵니다. 그런 다음 한 번의 동작으로 튜브를 뒤집고 농축된 세포 현탁액을 새 튜브에 붓습니다. 다시 셀 수를 세십시오.계수가 끝나면 배양 배지에서 자연 살해 세포를 희석합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 도금된 종양 세포에 추가합니다. 세포독성 분석을 설정하려면 다양한 농도의 GPC3-S-Fab 항체 10마이크로리터를 96웰 플레이트에 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 72시간 동안 플레이트를 배양합니다. 지정된 배양 시간이 지나면 배지를 흡인합니다. 그런 다음 96웰 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터의 CCK 시약이 포함된 100마이크로리터의 DMEM 배지를 추가합니다.다시 말하지만, 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 배양 후 CCK8 시약을 첨가한 후 4시간까지 연속 450나노미터에서 플레이트를 판독합니다. GPC3-S-Fab 항체는 2단계 친화성 정제를 사용하여 정제됩니다.여기서, 두 패널은 항체가 각각 니켈-NTA 아가로스 및 IgG-CH1 친화성 정제 컬럼을 사용하여 정제되었음을 보여줍니다. 다음으로, GPC3-S-Fab 항체의 결합 친화도는 GPC3 양성 및 음성 암 세포주를 사용하여 평가합니다. GPC3-S-Fab은 Hep3B, Huh7, Hep2G 및 CHO/GPC3와 같은 모든 GPC3 양성 세포에 결합합니다.흥미롭게도, MHCC-97H 및 CHO와 같은 GPC3 음성 세포를 사용할 때 결합이 관찰되지 않거나 최소한으로 관찰됩니다. GPC3-S-Fab의 세포 독성은 새로운 자연 살해 세포와 함께 배양된 종양 세포의 존재 하에서도 연구됩니다. 항체 GPC3-S-Fab은 자연 살해 세포가 있는 상태에서 용량 의존적 방식으로 HepG2, Hep3B 및 Huh7 7개 세포에 대해 강력한 세포 독성을 유도합니다.그러나 MHCC-97H 세포에 자연 살해 세포가 없는 경우 이러한 세포 독성은 관찰되지 않습니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 얼음 위에 단계를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 생체 내 종양 효과와 같은 추가 질문에 답하기 위해 이종 이식 모델링과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 이중특이성 항체 분야의 연구자들이 체외에서 항종양 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 종양 세포를 표적으로 하는 기능적 이중특이성 항체를 생성하는 방법, 특히 NK 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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연구

JoVE Journal

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