Name: A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 학습하세요 Aβ 올리고머 제조 및 도트 블로팅 분석을 통해 신경약리학 연구에서 올리고머 농도를 정량화하는 간단하고 재현성 높은 방법을. 이 기술은 알츠하이머병 치료제 개발에 필수적입니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (U1503223, 81673407, 21475131), 비영리 기술의 강성 (2016 C 37110), 닝 보 국제 과학 및 기술에 적용 하는 연구 프로젝트에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다 협력 프로젝트 (2014 D 10019), 생명 과학 및 의료 (2015 C 110026)의 닝 보 시 혁신 팀, 닝 보 과학 및 일반적인 부 (2017 C 50042)에 대 한 기술 프로젝트, 리 투 합 입 어 턱 케네스 리 해양 의약품 개발 기금, 그리고 닝 보 대학에서 K. C. 웡 마그나 기금.

1. 솔루션 준비
주: 시 소스에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오.
<ol><li>이중 증 류 물 100 mL에 BSA의 5 g을 추가 하 여 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티-Aβ 항 체 6E10 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티 원 올리고 머 항 체 OC 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>이중 증 류 물 1000 mL에 트리 스 베이스의와 NaCl의 88 g 24 g을 추가 하 여 Tris 버퍼 염 분 (TBS) 재고 솔루션을 준비 합니다. PH 7.4에 조정 합니다. 최대 3 개월까지 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>준비는 Tris 버퍼 식 염 수와 트윈-20 (TBST) 솔루션 TBS의 100 mL에 트윈-20의 1 mL을 추가 하 여 재고 솔루션 및 900 mL 이중 증 류 물.</li>
	<li>과산화 효소 (HRP) 염소-토끼 IgG (H + L) TBST 용액 10 ml와 사비의 추가 10 µ L에 의해 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>3.68 g 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 10 mM curcumin 재고 솔루션의 1 mL에 curcumin의 분해.</li>
	<li>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-프로 판 올 (HFIP) 2.5 mg/mL Aβ 모노 머 솔루션의 2 mL에 합성 Aβ1-42 의 5 mg을 디졸브. 그것은 실내 온도 (25 ° C)에서 20 분 하 게 100 µ L aliquots에 대 한 놓고-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장 합니다. 참고:이 절차를 가능한 한 빨리 실행 되어야 합니다. 피 펫 팁 정확한 pipetting 되도록 차단 한다.</li>
	<li>1: 1의 볼륨 비율 ECL 액체 A와 B를 혼합 하 여 electrochemiluminescence (ECL) 액체를 준비 합니다. 이 솔루션은 그냥 사용 하기 전에 준비 되어야 한다.</li>
</ol>2. 샘플 준비
참고: 분석 blotting 점 전에 2 일 샘플 준비를 수행 합니다.
<ol><li>Aβ1-42 단위체 솔루션;의 튜브에 이중 증 류 물 900 µ L를 추가 Aβ1-42 의 농도 0.25 mg/mL를 될 것입니다. 20 분 동안 실내 온도에 있는 혼합물을 놓습니다.</li>
	<li>볼륨은 약 850 µ L까지 고 순도 질소 가스와 함께 솔루션을 증발. Aβ1-42 솔루션의 농도 0.29 mg/mL에 대 한 것입니다. 참고: 솔루션 HFIP는 완전히 증발 되도록 때때로 동요 되어야 한다. 일반적으로, 증발의 30 분 후 잔여 솔루션의 볼륨은 약 850 µ L.</li>
	<li>Curcumin 재고 솔루션 curcumin 작업 솔루션 (0.2와 2 µ M)을 두 번 증 류 물으로 희석. 믹스 Aβ1-42솔루션, curcumin 볼륨 비율 1: 1의 솔루션을 작동. Curcumin의 최종 농도 0.1 1 µ M를 될 것입니다. 참고: 잠재적인 올리고 머 저 해제는 Aβ1-42 솔루션 필요한 경우 어떤 비율에서 섞일 수 있다.</li>
	<li>마그네틱 교 반기에 솔루션을 지속적으로 흔들어 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>자석 교 반기에 플라스틱 분배기 상자를 수정 합니다. 장소 2 자석 막대 상자 2 코너에서 저 어 고 상자 중심에서 샘플 튜브를 배치.</li>
		<li>48 h에 대 한 실 온 (25 ° C)에서 상자를 흔들어. 참고: 자석 교 반기 속도 약 60 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C에서 15 분 동안 튜브 원심 및 18000 x g.는 상쾌한을 수집 합니다.</li>
</ol>3. 점 Blotting 분석
참고: 모든 외피 수평 통에서 수행 됩니다.
<ol><li>니트로 막 1 cm 넓은 스트립으로 잘라. 참고: 니트로 막의 폭 실험 필요에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>2 지구 (지구 1와 2) 0.5 cm에서 각 포인트 간격에 균등 하 게 2 µ L 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>밴드에 물방울이 건조 될 때까지 5 분 동안 실내 온도에 스트립을 놓습니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 5 %BSA 솔루션 스트립을 품 어.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 TBST 솔루션 스트립을 씻어.</li>
	<li>TBST 솔루션 발음 실 온에서 1 h, 스트립 1 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션을 품 어 및 안티-Aβ 항 체 6E10 솔루션 2 스트립.</li>
	<li>씻어 TBST 솔루션 스트립 3 시간, 실 온에서 5 분 동안 각 시간.</li>
	<li>TBST 솔루션 발음 실 온에서 40 분 이차 항 체 솔루션 스트립을 품 어.</li>
	<li>씻어 TBST 솔루션 스트립 3 시간, 실 온에서 5 분 동안 각 시간.</li>
	<li>스트립의 표면에 혼합된 ECL 액체를 균등 하 게 적용 됩니다. 이미징 시스템 자동 화학에 스트립 노출 ( 재료의 표참조). 참고: 일반적으로, ECL 액체의 300 µ L 충분 한 막 이다. 막 노출 동안 축축한 유지 되어야 한다. 노출 시간 이미징 시스템에 의해 자동으로 계산 됩니다.</li>
	<li>반 정량적 결과 얻기 위해 ImageJ (국립 보건원) 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 회색 음영 분석을 할.</li>
</ol>

<ol><li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li>
<li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/biophysj/comments/S0006-3495(16)33411-7">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).</li>
<li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Alzheimer%27s+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol%3A+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li>
<li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis%28heptyl%29-cognitin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256(2015).</li>
<li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li>
<li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer%27s+A+beta-%281-42%29+peptide+in+aqueous+media+is+reversible%3A+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li>
<li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1%2C1%2C1%2C3%2C3%2C3-hexafluoro-2-propanol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li>
<li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxycyclopenicillone%2C+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).</li>
<li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 우리 Aβ1-42 올리고 머를 포함 하는 샘플을 준비 하 고 분석 blotting 점이 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 방법을 보고 있다. Aβ1-42 올리고 머 풍부한 샘플의 준비에 대 한 우리의 방법을 아주 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현할 수 있지만, 지금도 발견 될 몇 가지 포인트. 첫째, HFIP는 합성 Aβ1-42 펩 티 드를 분해 하는 데 사용 됩니다. 집계 Aβ1-42 펩 티 드 HFIP 솔루션에 단위체로 분해 수 있습니다. 그러나, HFIP volatilize, 쉽게 이며 HFIP의 점도 매우 낮습니다. 따라서, Aβ1-42 펩 티 드 HFIP으로 해산 한다 고 HFIP 솔루션 aliquoted 작업 중 HFIP의 잠재적인 손실을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 해야 합니다. 또한,이 절차에서 정확한 pipetting 되도록 피 펫 팁 잘라 되어야 합니다....

Alzheimer의 질병 (광고) 노인 전세계1에 영향을 미치는 가장 중요 한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 그것은 널리 β 아 밀 로이드 (Aβ)의 비정상적인 집계 광고의 주요 병 적인 요인이 될 수 있습니다 허용 됩니다. Aβ 집계 광고 환자의 두뇌에서 생물 학적 마커 중 치 패의 주요 구성 요소는. 또한, Aβ 집계, 특히 올리고 포함 하 여 광고 진행으로 신경 죽음의 원인이 될 수 있습니다 강력한 neurotoxicity 생산. 따라서, Aβ 올리고 머 형성의 저해 되지 않도록 neurodegeneration, 그리고 Aβ 올리고 머 저 해제 수정 하는 질병으로 발전 될 수 있는 광고의 치료. 많은 연구 올리고 시험관을 형성, 형태학 및 인공 Aβ 올리고의 구조를 탐구 하 고 생체 외에서 모델2,3 를 사용 하 여 Aβ 올리고 머의 억제제를 조사 하는 합성 Aβ 펩 티 드를 사용 , 그러나 4., Aβ 올리고 머의 형성 프로토콜 다른 시험관에 다른 연구 그룹 사이에서 비교할 수 없는 결과가 발생할 수 있습니다 다른 형태학 상 특성을 가진 올리고 머를 발생할 수 있습니다. 따라서, Aβ 올리고 머에 대 한 표준 형성 프로토콜 절실히 필요 합니다.
지금까지 많은 방법은 직접 검색 Aβ 올리고 보고 되었습니다. 전송 전자 현미경 (TEM), 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 및 점 분석 blotting 사용할 수 있습니다 금액 또는 Aβ 올리고 머 생체 외에서5, 의 형태를 검사 하 6. 예를 들어 Aβ 올리고 머의 구조와 형태 TEM에서 관찰 될 수 있다. Aβ 집계의 분자 크기 및 상대 금액 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법에 의해 측정 될 수 있는. ELISA 혈 청, 플라스마, 및 뇌 조직에서 추출 물에서 Aβ 올리고 머를 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 마지막으로, 분석, 검색, 사용 되는 기술 blotting 점 분석 및 단백질, 식별 사용할 수 올리고 머 및 Aβ 관련 항 체의 도움으로 다른 샘플 올리고 머 Aβ의 상대 농도 평가 하. 또한, 분석 결과 더 럽 히는 점이 젤 전기 이동 법 및 젤에 대 한 더 럽 히 절차 필요 하지 않습니다 상당한 시간 절약을 제공 합니다. 따라서,이 분석 결과 화면 잠재적인 Aβ 올리고 머 억제제를 일반적으로 사용 됩니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표 분석, blotting 점으로 화면 Aβ 올리고 머를 Aβ1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 Aβ1-42 올리고 머 풍부한 샘플 준비 하 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현성 메서드를 설명 하는 억제제 반 정량적 실험 결과 사용 하 여입니다.

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb에서 아밀로이드 올리고머로)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (베타-아밀로이드 토끼 Ab)</td><td>세포&nbsp; 신호 기술</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC (Anti-Amyloid Fibrils OC 항체)</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP) 마커 염소 안티 토끼 IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&베타; 1-42</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td><td>Aladdin</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Bovine V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 디메틸 설폭사이드</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5&times; 비변성 젤 PAGE 단백질 마커</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>순수 니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>초저 범위&nbsp; 단백질 마커</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>전사 멤브레인</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue 고속 염색 용액</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>모두 자동 화학발광 이미징 시스템</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National 건강</td><td></td><td></td>연구소</tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>자기 교반기</td><td>Shanghai Huxi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 blotting 도트를 사용 하 여

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Β-아 밀 로이드 (Aβ)은 자체 집계로 조립 하는 본질적인 추세를 가진 소수 성 펩 티 드 이다. 다양 한 집계 중 Aβ 올리고 머 최고의 neurotoxin Alzheimer의 질병 (광고)의 진행으로 널리 인정 하 고 광고의 병 인에 중요 한 이벤트로 간주 됩니다. 따라서, Aβ 올리고 머 저 해제 수 neurodegeneration을 방지 하 고 수정 하는 질병으로 발전 될 가능성이 광고의 치료. 그러나, 다른 대형 프로토콜 Aβ 올리고 머의 다른 특성을 가진 올리고 발생할 수 있습니다. 또한, 효과적으로 화면 Aβ1-42 올리고 머 억제제를 많은 방법이 되지 있다. A11 항 체는 항 병렬 β 장 구조와 독성 Aβ1-42 올리고 머의 하위 집합으로 반응 수 있습니다. 이 프로토콜에는 합성 Aβ1-42 펩 티 드에서 에 체 외에서 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머-풍부한 예제를 준비 하 고 도트 blotting에 의해 상대적 양의 샘플에서 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머를 평가 하는 방법 설명 A11 Aβ1-42를 사용 하 여 분석-특정 6E10 항 체. 이 프로토콜을 사용 하 여, 억제제 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머의 수 또한 상영 반 정량적 실험 결과에서.

Aβ1-42 단위체 준비 후 Aβ1-42 올리고 머를 형성할 수 있습니다 여부를 조사 하기 가장 분석 사용 되었다. 아니 볼 수 집계는 HFIP 해산 Aβ1-42 단위체 샘플 (그림 1A)에서 관찰 되었다. 또한, 주위의 직경을 가진 주로 구형 집계 10-80 nm에서에서 관찰 되었다 Aβ1-42 샘플 떨고, 48 h 후 Aβ1-42 준비 (그림 1B) 후 올리고 형성 제안.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57592/57592f...

이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

이 방법은 신경 약리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 베타 아밀로이드 올리고머를 형성하는 것이 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현성이 있다는 것입니다. 베타 올리고머를 준비하는 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시연이 중요하다는 것을 보여줍니다.먼저 튜브에 900마이크로리터의 이중 증류수를 첨가하여 A-베타 단량체 용액의 농도를 밀리리터당 0.25mg으로 조정합니다. 그런 다음 부피가 밀리리터당 약 0.29밀리그램의 농도로 약 850마이크로리터에 도달할 때까지 고순도 질소 가스로 단량체 용액을 계속 증발시킵니다. HR5P의 존재는 A-베타 올리고머의 형성에 영향을 미칩니다.따라서 가능한 한 많이 증발하는 것이 이 절차의 중요한 단계입니다. 다음으로, 이중 증류수를 사용하여 커큐민 스톡 용액을 희석하여 0.2 및 2 마이크로 몰의 작업 용액을 준비합니다. 1:1의 비율을 유지하고 A-베타 용액과 커큐민을 혼합하여 0.1 및 1마이크로몰에서 커큐민의 최종 농도를 달성합니다.그런 다음 용액을 자기 교반기에 두십시오. 플라스틱 칸막이 상자를 자기 교반기에 부착합니다. 상자의 두 모서리에 두 개의 마그네틱 교반 막대를 배치한 다음 샘플이 든 튜브를 상자 중앙에 놓습니다.분 당 60의 회전에 48 시간 동안 실내 온도에 상자를 동요하는 것을 계속하고십시오, 그 후에 18, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 G 000 시간에 관을 원심 분리하십시오. 원심분리 후 상층액을 수집합니다. 점 블로팅 분석을 위해 니트로셀룰로오스 멤브레인을 1cm 너비의 스트립으로 자른 다음 2마이크로리터의 샘플을 각 포인트 간격이 0.5cm인 스트립 1과 2에 균일하게 놓습니다.멤브레인에 샘플을 분출할 때 고르게 퍼져야 하며 다른 샘플이 서로 연결되지 않도록 다른 방울을 제어해야 합니다. 다음으로, 물방울이 마를 때까지 실온에서 5분 동안 스트립을 배양합니다. 5분 후, 실온에서 30분 동안 5% 소 혈청 알부민으로 스트립을 배양합니다.배양이 끝나면 TBST 버퍼로 스트립을 5분 동안 세척합니다. 세척이 완료된 후 완충액을 흡입한 다음 1을 항올리고머 항체 A11로 제거하고 2를 항 A-베타 항체 6E10 용액으로 한 시간 동안 배양합니다. 1시간 후, TBST로 스트립을 각각 3회 5분 동안 세척한 다음 완충액을 흡인하고 스트립을 40분 동안 2차 항체 용액으로 배양합니다.2차 항체 배양 후 다시 TBST로 스트립을 3회씩 5분씩 세척합니다. 그런 다음 약 300마이크로리터의 혼합 ECL 유체를 촉촉한 스트립 표면에 추가한 다음 스트립을 자동 화학발광 이미징 시스템에 노출시킵니다. TEM 연구에 따르면 HFIP에 용해된 A-베타 단량체 용액에는 가시적인 응집체가 없지만 48시간 배양 후 동일한 단량체가 올리고머를 형성하며, 이는 주로 직경이 10-80나노미터인 구형 응집체입니다.A-베타 단량체 및 올리고머가 풍부한 샘플을 점 블롯 분석을 실시한 결과, A-베타 올리고머가 풍부한 샘플에서 A11 양성 A-베타 올리고머가 존재함을 확인할 수 있습니다. 흥미롭게도, A-beta 6E10 양성 A-베타 펩타이드는 A-베타 단량체와 올리고머가 풍부한 샘플 모두에 존재합니다. 다음으로, 특정 항체 양성 A-베타 단량체 및 올리고머가 풍부한 샘플을 대조군의 백분율로 표현하기 위해 반정량 분석도 수행됩니다.A11 양성 A-베타 펩타이드는 A-베타 올리고머가 풍부한 샘플에서 단량체에 비해 훨씬 높습니다. 반대로, A-beta 6E10 양성 A-베타 펩타이드는 단량체와 올리고머가 풍부한 샘플 모두에 존재합니다. 실제로, A-베타 올리고머는 커큐민 및 A-베타 올리고머 억제제와 함께 배양됩니다.커큐민은 커큐민을 공동 배양한 A-베타 올리고머 샘플에서 A11 염색을 감소시켜 A11 양성 A-베타 올리고머의 상대적 양을 크게 감소시킵니다. 그러나 다양한 농도의 커큐민은 A11 양성 샘플과 비교할 때 6E10 양성 단량체 및 올리고머가 풍부한 샘플의 A-베타 펩타이드 수에 영향을 미치지 않습니다. 일단 숙달되면 이 기술이 제대로 수행되면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 연구자들이 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에 대한 약물 후보를 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 A-베타 올리고머를 준비하고 그 양을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

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