A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

이 방법은 신경 약리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 베타 아밀로이드 올리고머를 형성하는 것이 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현성이 있다는 것입니다. 베타 올리고머를 준비하는 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시연이 중요하다는 것을 보여줍니다.

먼저 튜브에 900마이크로리터의 이중 증류수를 첨가하여 A-베타 단량체 용액의 농도를 밀리리터당 0.25mg으로 조정합니다. 그런 다음 부피가 밀리리터당 약 0.29밀리그램의 농도로 약 850마이크로리터에 도달할 때까지 고순도 질소 가스로 단량체 용액을 계속 증발시킵니다. HR5P의 존재는 A-베타 올리고머의 형성에 영향을 미칩니다.

따라서 가능한 한 많이 증발하는 것이 이 절차의 중요한 단계입니다. 다음으로, 이중 증류수를 사용하여 커큐민 스톡 용액을 희석하여 0.2 및 2 마이크로 몰의 작업 용액을 준비합니다. 1:1의 비율을 유지하고 A-베타 용액과 커큐민을 혼합하여 0.1 및 1마이크로몰에서 커큐민의 최종 농도를 달성합니다.

그런 다음 용액을 자기 교반기에 두십시오. 플라스틱 칸막이 상자를 자기 교반기에 부착합니다. 상자의 두 모서리에 두 개의 마그네틱 교반 막대를 배치한 다음 샘플이 든 튜브를 상자 중앙에 놓습니다.

분 당 60의 회전에 48 시간 동안 실내 온도에 상자를 동요하는 것을 계속하고십시오, 그 후에 18, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 G 000 시간에 관을 원심 분리하십시오. 원심분리 후 상층액을 수집합니다. 점 블로팅 분석을 위해 니트로셀룰로오스 멤브레인을 1cm 너비의 스트립으로 자른 다음 2마이크로리터의 샘플을 각 포인트 간격이 0.5cm인 스트립 1과 2에 균일하게 놓습니다.

멤브레인에 샘플을 분출할 때 고르게 퍼져야 하며 다른 샘플이 서로 연결되지 않도록 다른 방울을 제어해야 합니다. 다음으로, 물방울이 마를 때까지 실온에서 5분 동안 스트립을 배양합니다. 5분 후, 실온에서 30분 동안 5% 소 혈청 알부민으로 스트립을 배양합니다.

배양이 끝나면 TBST 버퍼로 스트립을 5분 동안 세척합니다. 세척이 완료된 후 완충액을 흡입한 다음 1을 항올리고머 항체 A11로 제거하고 2를 항 A-베타 항체 6E10 용액으로 한 시간 동안 배양합니다. 1시간 후, TBST로 스트립을 각각 3회 5분 동안 세척한 다음 완충액을 흡인하고 스트립을 40분 동안 2차 항체 용액으로 배양합니다.

2차 항체 배양 후 다시 TBST로 스트립을 3회씩 5분씩 세척합니다. 그런 다음 약 300마이크로리터의 혼합 ECL 유체를 촉촉한 스트립 표면에 추가한 다음 스트립을 자동 화학발광 이미징 시스템에 노출시킵니다. TEM 연구에 따르면 HFIP에 용해된 A-베타 단량체 용액에는 가시적인 응집체가 없지만 48시간 배양 후 동일한 단량체가 올리고머를 형성하며, 이는 주로 직경이 10-80나노미터인 구형 응집

A-베타 단량체 및 올리고머가 풍부한 샘플을 점 블롯 분석을 실시한 결과, A-베타 올리고머가 풍부한 샘플에서 A11 양성 A-베타 올리고머가 존재함을 확인할 수 있습니다. 흥미롭게도, A-beta 6E10 양성 A-베타 펩타이드는 A-베타 단량체와 올리고머가 풍부한 샘플 모두에 존재합니다. 다음으로, 특정 항체 양성 A-베타 단량체 및 올리고머가 풍부한 샘플을 대조군의 백분율로 표현하기 위해 반정량 분석도 수행됩니다.

A11 양성 A-베타 펩타이드는 A-베타 올리고머가 풍부한 샘플에서 단량체에 비해 훨씬 높습니다. 반대로, A-beta 6E10 양성 A-베타 펩타이드는 단량체와 올리고머가 풍부한 샘플 모두에 존재합니다. 실제로, A-베타 올리고머는 커큐민 및 A-베타 올리고머 억제제와 함께 배양됩니다.

커큐민은 커큐민을 공동 배양한 A-베타 올리고머 샘플에서 A11 염색을 감소시켜 A11 양성 A-베타 올리고머의 상대적 양을 크게 감소시킵니다. 그러나 다양한 농도의 커큐민은 A11 양성 샘플과 비교할 때 6E10 양성 단량체 및 올리고머가 풍부한 샘플의 A-베타 펩타이드 수에 영향을 미치지 않습니다. 일단 숙달되면 이 기술이 제대로 수행되면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 연구자들이 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에 대한 약물 후보를 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 A-베타 올리고머를 준비하고 그 양을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.