Name: 비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 e10.5 마우스 췌장 창시자에서 3차원 인슐린 표현 Pancreatoids를 생성하는 방법을 체외 배양으로. 이 기술은 내분비 세포 형성과 췌장 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

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프로토콜 및 원고에 관한 유용한 토론에 감사 Jolanta Chmielowiec 하 고. 우리는 또한 confocal 현미경에 접근을 위한 벤자민 Arenkiel 감사합니다. 이 작품은 NIH (P30-DK079638 M.B.)와 T32HL092332-13 마스와 M.B., 맥 네 어 의료 재단 (M.B.), 및 BCM 지적 발달 장애 연구 센터에서 confocal 코어에 의해 지원 되었다 (NIH U54 HD083092는 유 니스에서 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 건강 그리고 인간 발달).

이 방법에 설명 된 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 베일 러 대학의 약에 의해 승인 되었다.
1. 마우스 배아 일 10.5 췌 장 창시자의 준비
그러나 참고:이 프로토콜 않습니다 필요가 없습니다 2 단계까지 무 균 조건 하에서 지켜질 해 부 도구를 소독 하 고 사용 하기 전에 70% 에탄올 스프레이에 최적입니다.
<ol><li>해 부에 대 한 설정, 얼음 양동이 얼음에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 컨테이너를 놓습니다. 두 개의 뾰족한 집게 및 해 부가 위 70% 에탄올으로 청소. 컨테이너를 3 개 이상 붕 모 세관 튜브, 입 피 펫, 라이터와 1000 µ L 피 펫 팁을 필터링 해 부 지역 근처 설정.<ol>
<li>1.25 mg/mL 찬 dispase에 얼음에 12 잘 플레이트의 두 번째 잘 소독된 물에 희석의 적어도 1 mL를 준비 합니다. 첫 번째, 세 번째 및 네 번째에서 PBS를 넣어 12의 우물 잘 접시. 0.05%의 장소 1 mL Trypsin 1.5 ml에서 튜브 얼음에. 미리 따뜻하게 37 oc.에 떨고 인큐베이터</li>
	</ol>
</li>
	<li>E10.5 타임-임신 쥐 IACUC 지침에 따라 안락사 복 부 지역 V 자형 절 개를 성 기 영역에서의 위와 집게를 사용 하 여 마우스를 하기 전에 청소 하 고 횡 경 막까지 계속 70% 에탄올 스프레이. 참고:이 프로토콜에 질 플러그의 모양을 하루 0.5를 나타냅니다. 5-6 주 오래 된 마우스를 사용 하 여 이상의 2 g의 체중 증가 성공적인 임신의 보조 수단으로 역할을 합니다.<ol>
<li>조심 스럽게 반대편에 반복 하기 전에 생식 기 지역으로 위쪽으로 마우스, 그리고이 절에 따라 장기를 당겨 자 궁의 맨 측면 부분에 절 개를 함으로써 자 궁을 삭제할. 10 cm 차가운 PBS와 페 트리 접시에에서 놓습니다. 그러나 참고: 그것은 e10.5 pancreatoids와 달리이 organoids 특징 되지 않습니다 및 따라서 모든 세 가지 주요 췌 장 혈통으로 분화 하는 능력을 유지 하지 않을 수 있습니다 e11.5 해리 셀에서 organoids를 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가벼운 해 부 현미경 페 트리 접시를 놓고 하 고 신중 하 게 각 태아 사이 두 집게 배치 하 노른자위 낭에서 조직을 박 리 하 여 자 궁 조직을 엽니다. 집게와 10cm 신선한, 페 트리 접시에서 부드럽게 노른자위 sac를 파악 하 여 배아를 전송 차가운 PBS. 얼음에 페 트리 접시를 놓습니다. 참고: 그것은 heedfully 강력한 제거 탯, 태아의 조직 고 구조적 무결성을 손상 시 키 지를 뽑을 수 선호 노른자위 낭 내에서 유지 하는 배아를 제거 하는 것이 중요.</li>
	<li>10 cm 배양 접시 뚜껑에 여러 PBS 방울을 배치 합니다. 이 방울을 사용 하 여 extraembryonic 조직 가시성을 보장 하기 위해 제거는 해 부 동안 배아를 전송. PBS 드롭 배아를 전송 하 고 나머지 배아 얼음 (그림 1A)에 PBS에 체류 하는 동안 집게를 사용 하 여 노 른 자 골목에서 부드럽게 제거 합니다. 가볍게 푸 하지 손상 조직 (그림 1B), 태아를 집게를 사용 하 여 새로운 PBS 드롭 배아를 이동 하기 전에 머리를 제거 합니다. 참고: 조직 액체의 불투명도 따라 여기서 설명한 것 보다 신선한 PBS 방울을 더 자주 전송 되도록 해야 합니다.<ol>
<li>새로운 PBS 드롭 forelimb 싹 집게 (그림 1B)를 사용 하 여 제거 합니다. 사지 새싹은 현재 오프닝으로 집게를 배치 하 고 부드럽게 anteriorly 가장 외부 조직만을 찢 어 (그림 1B). 배아를 회전 하 고 hindlimb 새싹에서 후부 방향으로 반복 합니다. 이 시점에서, 위장 표시 (그림 1B) 해야 합니다.</li>
		<li>위장의 후부 지역의 약간의 굴곡 (그림 1 층) 있다. 위장과 체 벽의 척추 지역 사이이 벤드 뒤에 집게를 삽입 합니다. 위장, 가장 앞쪽 영역 심장 지역 (그림 1B-E)를 연결 하는 곳에 도달할 때까지 천천히 위쪽으로 작업을 분리 합니다. 선택 사항: 원시 심장과 간 싹에서에서 제거만 연속 직감 튜브를 떠나 위 장관의 복 부 지역. 이 프로토콜을 수행 하는 처음 몇 번 그것은 두고 심장과 간 위장와 등 쪽 췌 장 새싹의 형태까지 복 부 랜드마크는 더 쉬울 수도 있습니다 (그림 1C 와 D 익숙한 ).</li>
		<li>신선한 PBS 물방울에 위장을 전송.</li>
		<li>집게를가지고 부드럽게 돌출 버드와 소장 아래 조직을 꼬 집 고 약간 들어올립니다 (그림 1D-F)을 외부 조직. 참고: 등 쪽 췌 장 새싹은 위장과 소장 (그림 1C G) 사이 있습니다. 아래 췌 장 새싹 라운드, 혹 구조 (그림 1G) 처럼 보이게 한다.</li>
		<li>꽃 봉 오리 핀치 위로 새싹 (그림 1G)을 완화 하 고 소장에 연결 집게에 놓습니다. 얼음에 차가운 PBS에 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 꽃 봉 오리를 전송 하기 전에 새로운 PBS 거품에 한 번 씻어. 모든 새싹 및 배아에서 수집한 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 배치 될 때까지 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가벼운 해 부 현미경 아래 12 잘 접시를 놓습니다. 성공적으로 나중에 분할 비율을 계산 해 부 췌 장 새싹의 수를 계산 합니다.<ol>
<li>장소는 모 세관 튜브 입 피 펫에 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 첨부. 화 염 모 세관 튜브를 소독 하 고 사용의 용이성에 대 한 튜브에 벤드를 만듭니다. 모 세관을 사용 하 여 깨끗 한 PBS (그림 1G)와 세 번째 우물을 전송 하기 전에 2 분 동안 두 번째 잘 포함 하 찬 dispase 솔루션에 싹을 전송. 참고: 꽃 봉 오리를 dispase에서 PBS를 전송 하는 동안 조직 모 세관 튜브의 팁을 만지지 마십시오. 조직 관의 끝에 걸리면, 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 또는 느슨하게 때까지 깨끗 한 PBS 솔루션에 흔들.</li>
		<li>꽃 봉 오리를 아래로, 플라스틱 그리고 깨끗 한 PBS 가진 4 잘 전송. 마지막으로, 0.05%는 1.5 mL 튜브에 새싹 모 세관 장치 전송 사용 하 여 트립 신. 미리 데워 진된 37 oC 셰이 커에 튜브를 놓고 4 분 1500 rpm에서 흔들어.</li>
		<li>약 10 소용돌이 s 다음 즉시 튜브에 배치는 원심 분리기와 200에서 5 분 동안 스핀 g. centrifuged 세포 (그림 1G)을 방해 하지로 조심 스럽게 솔루션의 모든 하지만 약 50 µ L를 제거.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 경작 Pancreatoids를 형성 하기 위하여 해리 창시자
참고: 다음는 표준 살 균 절차를 사용 하 여 표준 조직 문화 후드에 메 마른 분위기에서 수행 합니다.
<ol><li>수집 된 모든 새싹, centrifuged 셀 400 µ L organogenesis 미디어16,17 (표 1)를 추가 합니다. 펄스 소용돌이 세 번 하 고 플레이트 100 µ L 당 낮은 첨부 파일 96의 잘 잘 플레이트, 싹 (그림 1G) 1:4 비율로 분할.</li>
	<li>시각화를 해리 셀 (그림 1H)를 자유롭게 떠 현미경 아래에서 확인 하십시오. 중간 속도에서 로커에 5% CO2 와 37 oC 인큐베이터에서 문화 접시를 놓습니다.</li>
	<li>매일 pancreatoids의 진행 상황을 모니터링 합니다. 신선한 미디어 3 일 마다 미세한 제어 후드 우물에서 pancreatoid를 떠나 있는 동안 제거에 신중 하 게 pipetting 미디어의 100 µ L를 바꿉니다. 또는 신선한 100 µ L 미디어의 입 피 펫 및 1000 µ L에 연결 된 붕 규 산 세관 피 펫 팁 필터링 새로운 잘 사용 하 여 전송 하는 pancreatoid에 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 처리 Pancreatoids Immunofluorescent 이미징
<ol><li>Immunofluorescent 이미지 pancreatoids를 처리 하려면 먼저 4 %paraformaldehyde / PBS, pH7.4 (PFA) 솔루션 준비 합니다. 4%의 장소 50 µ L PFA는 96의 우물에 잘 플레이트.<ol>
<li>Pancreatoids 4% 신선한 잘으로 가능한 작은 미디어를 복용 하는 문화 매체에서 전송 1000 µ L 필터링 된 피 펫 팁 붕 규 산 모 세관 튜브 및 입 피 펫을 사용 하 여, PFA. 15 분 동안 실내 온도에 로커에 설정 합니다.</li>
		<li>4%에서 pancreatoids 전송 3 신선한 PBS 세척의 총에 대 한 5-10 분 반복에 대 한 상 온에서 신선한 PBS의 100 µ L로 잘으로 PFA 바위. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지, 여기 4 oC에서 PBS의 100 µ L에 최대 1 주일까지 저장 하는 pancreatoids와.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wholemount 이미징 (경우 항 체는 섹션 3.3에에서 적합 한 대체 접근 권장. 그리고 3.4에서 현미경 검사 법.), PBS에서 블록을 0.1% 비 세제 (PBST)로 1 x PBS에서 50 µ L 5% 당나귀 혈 청으로 전송. 4 oC에서 하룻밤 바위 또는 양자 택일로 실 온에서 4 시간.<ol>
<li>1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 하는 주 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 4 oC에서 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에 대 한 최적의 바위. 참고: 항 체 Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400), 및 Pdx1에 대 한 재료의 테이블에 에서 나열 된 (1: 100) wholemount 얼룩;에 적합 다른 항 체 최적화가 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>Pancreatoids 신선한 PBST 세척 하 고 실 온에서 30 분 동안 바위의 100 µ L를 포함 하는 잘 전송. 3 신선한 PBST 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 2 차 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 빛에서 접시를 보호 하 고 4 oC, 락을 최적으로 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에. 참고: 테이블의 재료 와 DAPI 핵 counterstain에 나열 된 모든 이차 항 체는 wholemount 얼룩 적합 합니다.</li>
		<li>Pancreatoids x PBST와 바위 1에 3 개의 세척의 총 30 분 반복에 대 한 실 온에서 1의 100 µ L를 포함 하는 새로운 잘 전송 x PBST. 제 3의 그리고 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.</li>
		<li>마지막으로, 깨끗 한 PBS의 저장소 4 oC 최상의 결과 즉시 얼룩 후 영상에서 온 confocal 현미경 검사 법에 의해 이미징 하기 전에 주일에 대 한 빛에서 보호에서 100 µ L을 넣으십시오. 이미징 동안 pancreatoids의 움직임을 방지 하지만 밖으로 건조 방지, PBS의 20 µ L 방울에 각 pancreatoid를 놓습니다. Pancreatoids 아직도 남아 있지, PBS 볼륨을 줄일 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동된 섹션에 대 한 pancreatoids에서에서 전송할 PBS 30% 자당 해결책 하룻밤에 4 o3.<ol>
<li>해 부 현미경 거품에서 포함 미디어를 추가 합니다. 미세한 제어 집게를 사용 하 여 부드럽게 밀어 포함 미디어를 통해 여러 번 냉동 포함 미디어 조직 블록을 전송 하기 전에 잔여 자당을 제거 하 여 pancreatoids를 담근 다.</li>
		<li>8 µ m에서 cryostat에 고정 될 때까지 드라이 아이스에 조직 블록 및 섹션을 놓습니다. 참고: 섹션 저장할 수 있습니다-80 oC 또는 immunostained에 즉시.</li>
		<li>섹션-80 oC 건조까지 약 5 분 동안 실 온에서 해 동 하실 수 있습니다. 소수 성 장벽을 조직과 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석을 사용 하 여 블록 주위 소수 pap 펜을 사용 하 여 그리는 실 온에서 30 분 동안 x PBST.</li>
		<li>미디어를 제거 하 고 기본 항 체 5% 당나귀 혈 청 1 x PBST에서 4 o3. 하룻밤에 희석에 희석 즉시 바꿉니다</li>
		<li>기본 솔루션을 제거 하 고 씻어 조직 세 번 1 10 분 x PBST. 이것 다음, 이차 항 체 솔루션 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석에 희석 추가 실 온에서 1 h x PBST 빛에서 슬라이드를 보호 하 고.</li>
		<li>보조 솔루션을 제거 하 고 1에 슬라이드 세 번 씻고 10 분 x PBST. 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.</li>
		<li>미디어를 제거 하 고 설치 미디어와는 coverslip 추가. 스토어 이미지 준비까지 멀리 빛 4 oC에에서 슬라이드.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 대 본 분석에 대 한 Pancreatoids에서 RNA의 격리
<ol><li>Pancreatoids 1.5 mL 튜브에 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션의 500 µ L로 불 임 및 장소에 대 한 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 입 피 펫에 연결 된 붕 규 산 모 세관을 사용 하 여 수집 합니다. -80 oC에 저장 하거나 즉시 RNA 격리를 진행.</li>
	<li>RNA 격리에 대 한 필요한 경우 얼음 샘플을 해 동 하 고 클로 프롬의 100 µ L를 추가 합니다. 4 oC 15 분에 대 한 장소와 소용돌이 잘 미리 냉각 4 oc. 원심 분리기<ol>
<li>장소 튜브 원심 분리기 및 스핀 4 oc.에서 12000 g에서 20 분</li>
		<li>조심 스럽게 튜브 레이어 분리를 방해 하지 않는를 제거. 200 µ L 피 펫을 사용 하 여, 명확한 수성 해결책을 수집 하 고 흰색 단백질 층 및 분홍색 DNA 층에서 버퍼에 작은 금액을 뒤에 남겨두고 새로운 1.5 mL 튜브에 배치. 이 과정에서 아무것도 피 펫의 끝을 만지지 마십시오 하 고 1.5 mL 튜브의 벽을 만지지 마십시오.</li>
		<li>수성 층과 소용돌이 포함 하는 새 튜브를 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L를 추가 합니다. 앉게 실 온에서 20 분, 얼음, 더 이상 또는 최대 강수량 하룻밤 사이에 두고-20 oc.</li>
		<li>4 oC를 작은 RNA에서 15 분 동안 12000 g에서 원심. 펠 릿을 방해 하지 않고는 소 프로 파 놀을 제거 합니다. 참고: pancreatoids는 작은, 그것은 가능성이 펠 릿 표시 되지 것입니다.</li>
		<li>감기, 75% 에탄올을 추가 하 고 여러 번 튜브를 반전. 원심 분리기에 놓고 에탄올과 9000 x g에서 2 분 동안 회전 4 oC. 제거에서 10 분 동안 9000 x g에서 회전 합니다.</li>
		<li>200 µ L 피 펫을 사용 하 여 지역에 거주 하는 펠 릿 하지 않고 튜브에 어떤 나머지 에탄올을 제거. 잔여 에탄올의 증발 되도록 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 튜브에 뚜껑 열어 둡니다.</li>
		<li>깨끗 한, nuclease 무료 물 20 µ L에서 vortexing에 의해에 펠 릿을 resuspend. 선택 사항: 열 RNA 65 oC 3 분 하 고 즉시 얼음에 반환 합니다. RNA-80 oC에 저장 하거나 즉시 반전 녹음 방송 및 정량에 사용 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

셀 문화 모델의 진행은 제대로 개발 모델, 임상 관련 세포 유형, 시험 약물 효능, 또는 심지어 이식 환자에 게 중요 합니다. 그러나, 인위적으로 업과 접시에 개발은 도전으로 우리는 여전히 organogenesis과 생리학의 메커니즘을 이해 멀리 vivo에서. 따라서 체 외에서 세포는 효율적으로 생성 된, 완전히 기능, 시간, 오랜 기간 동안 유지 될 또는 본문에 대 등 한 셀에서 다른 이상 항구 수 없습니다. 많은 다른 세포 유형 개발 및 생리학에 영향을 발생 하는 복잡 한 전체적 변화 하는 동안 상호 작용 하는 때문입니다. 체 외에서 의 편의 결합 하 여 개발 진행 하는 방법에 대 한 이해를 얻고 vivo에서 개발의 복잡성을 유지 하면서 시스템 것 이라고가 르 친다 생명 의학 연구를 위한 유용한 도구를.
Organoids의 개발은 개발의 복잡성을 모델링으로 유망한 애비뉴. 이 프로토콜에서 우리 췌 장 organo...

정상적인 개발 및 생리의 메커니즘을 묘사 하는 것은 질병 병 인을 이해 하 고 궁극적으로 치료 방법을 육성에 답해야 합니다. 배양 및 분화 줄기 세포 개발의 신속 하 고 높은 처리량 분석을 수 있습니다, 그것은 기존의 신체의 세포 운명 조절 메커니즘에 관한 지식에 의해 제한 됩니다 고 인위적으로 개발에이 상대적으로 균질 성, 2 차원 상태1,2. 뿐만 아니라 vivo에서 개발 틈새와 환경에서 서로 다른 세포 유형으로 외부 영향에 의해 영향을 받는 paracrine 신호 및 조직 지원 organogenesis, 가이드를 제공 하는 있지만 이러한 세포의 기능에 의존 하 고 또한 그들의 주변 지도3,,45. 이러한 외부 단서의 중요성, vivo에서 마우스 모델의 힘 드는 자연과 분화 프로토콜의 한계를 감안할 때, 새로운 시스템 기본 개발 프로세스 및 생리학을 실험적으로 조사 필요 합니다.
Organogenesis, 생리학, 약물 효능 및 심지어 pathogenesis. 을 편리 하 고 적합 한 시스템을 제공 하는 3 차원, 복잡 한 organoids를 생성 하는 프로토콜의 출현 대 위6 과 대 장7 다른 시스템 organogenesis에 대 한 우리의 이해를 확장 했다 murine organoids를 설립, 연구 개발 복잡성 vivo에서 보다 적게 제한 하는 도구를 제공 하 그리고 생체 외에서 모델입니다. Murine organoid이 진보 때문 형성과 인간 만능의 출현 줄기 세포, 인간의 장8, 망막9, 신장10,11, 그리고 대뇌12 organoids 생산 되어,이 레 퍼 토리만 개발 메커니즘에 관한 기존의 지식에 의해 제한 됩니다.
질병의 무수 한 재앙 다른 췌 장 세포 유형, 외 분 비 췌 장 불충분13,14, 췌 장 염 포상 세포에에서 포상 세포와 덕트를 포함 한 췌 장 organoids의 생성은 특별 한 관심의 고 15당뇨병 베타 세포입니다. 이러한 서로 다른 세포 유형의 개발에 관한 지식을 얻고 고 또한, 맞춤된 약물 검사 또는 이식에 대 한 플랫폼 역할을 할 수, 있습니다. 그들의 병 리를 이해에 도움이 수 있습니다. 이전, Greggio 외. 만들 murine 췌 장 organoids morphogenesis vivo에서 정리 하 고 모든 주요 췌 장 상피 세포의 구성 하는 조직, 3 차원, 복잡 한 구조를 개발 하는 방법 개발 유형16,17. 이것은 췌 장 분야에서 앞으로 중요 한 단계 이다, 특히 만드는 세포에 생체 외에서 베타 세포 개발의 생물 학적 조사를 설정할 수 있습니다. 그러나, 내 분 비 세포의 부족은 organoids 조직, 틈새 상호 작용 수 및 교육용 신호17제공으로 이식 했다 하지 않는 한이 프로토콜에서 형성 했다. 틈새 시장, 무 겁 게 내 분 비 박 등 차별화3,4, 후기에 organogenesis의 초기 단계에서 개발 상피를 뒤 덮 었의 가장 큰 부분을 구성 하는 mesenchyme 18. 개발 췌는 mesenchyme의 상호작용은 아직 외부 신호 및 생체 내에서 세포 복잡성을 유지의 중요성 organogenesis 연구의 또 다른 예.
여기, 우리는 3 차원 췌 장 organoids, pancreatoids, 해리 e10.5 murine 췌 장 창시자에서 불리를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 pancreatoids 네이티브 mesenchyme 유지, 부동성 조건에서 자기 조립 및 내 분 비 하는 베타 세포19의 강력한 수를 포함 한 모든 주요 췌 장 세포 종류를 생성. 이 방법은 이전 프로토콜 강력한 내 분 비 차별화 부족으로 내 분 비 발달의 분석을 위해 가장 적합 하다. 그러나, 췌 장 organoids에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 Greggio 외. 췌 장의 상피 분기 및 morphogenesis의 분석에 대 한 더 적합에 의해 설명 된 대로 분기로 더 제한 됩니다 pancreatoids.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>보정 미세모세관 피펫용 흡인기 튜브 어셈블리</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure 뉴클레아제가 없는 물</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 모세관</td><td>셔터 기기</td><td>GB1007515</td><td>O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm 길이</td></tr><tr><td>CaCl2</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr>, <tr><td>세포 기피제, 96웰 마이크로플레이트,</td><td>Greiner Bio-One,</td><td>650970</td>, <td>U-바닥</td></tr><tr><td>원심분리기, 5424 R</td>, <td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranin-A 항체</td>, <td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr>, <tr><td>소형, 모듈식 스테레오 현미경 M60</td><td>라이카</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수기 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미딘-2'-페닐린돌-디하이드로클로라이드)</td><td>로슈</td><td>10 236 276 001</td><td>분말</td></tr><tr><td>DBA 항체</td><td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, 분말</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11251-10</td><td>0.05 x 0.02 mm; 타이타늄; 생물학 팁</td></tr><tr><td>EGF (표피 성장 인자)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri Cycle CO2 Incubators</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 항체</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>다클론 마우스 IgG</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>피셔</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>이소테시아 이소플루란, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 항체</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>Polyclonal Guinea Pig</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 교체</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE 고해상도 스펙트럼 컨포칼</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>마우스 C-펩타이드 ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>마우스 초민감 인슐린 ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 마이크로톰 블레이드</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>노멀 당나귀 혈청</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 항체</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>단클론 마우스 MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way 일회용 임베딩 금형</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristate 13- 아세테이트)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1.5mL 용량</td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-10 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-산성</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 R-Spondin I 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>벤치마크</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>설탕 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. 컴파운드</td><td>사쿠라</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>인비트로겐</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>인비트로겐</td><td>12604039</td><td>(1x), 페놀 없음</td></tr><tr><td>레드 트리판 블루 스테인</td><td>인비트로겐</td><td>15250061</td><td>세포 계수 슬라이드용</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05% </td><td>)Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Phenol Red</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 24-Well Plate</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 스페로이드 플레이트 96-Well</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin 항체</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Polyclonal Chicken IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td>: <td>ROCK 억제제라고도 함</td></tr><tr><td>Zeiss 710 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비 계, 3 차원 인슐린 표현 pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

췌 장 혈액 포도 당 항상성 및 소화를 함께 작동 하는 많은 다른 세포 유형의 구성 하는 복잡 한 기관 이다. 이 셀 형식 효소를 은닉 포상 세포는 arborized ductal 시스템 본질적인, 그리고 호르몬 생산 하는 내 분 비 세포에 효소의 수송에 대 한 책임을 포함합니다.
내 분 비 하는 베타 세포는 낮은 혈액 포도 당 수준에 인슐린을 생성 하는 본문에 유일한 셀 유형입니다. 당뇨병, 손실 또는 베타 세포의 기능 장애를 특징으로하는 질병 전염병 비율에 도달입니다. 따라서, 파생 약물 및 세포 기반 치료제 심사 목적으로 사용할 수 있는 베타 세포 개발 조사를 프로토콜을 확립 필수적 이다. 마우스 개발의 실험 조사는 필수, vivo에서 학문은 힘들고 시간이 많이 소요. 배양된 세포 검사;에 대 한 더 편리한 플랫폼을 제공 그러나, 그들은 세포 다양성, 건축, 조직과 세포 상호 작용 발견 유지할 수 없습니다 vivo에서. 따라서, 췌 장 organogenesis 및 생리학 조사 하는 새로운 도구를 개발 하는 것이 필수적입니다.
세포 구성 하 고 복잡 한, 순수 유능한 성인 기관으로 분화 췌 장 상피 세포는 organogenesis의 발병에서 mesenchyme와 가까운 협회에서 개발. 췌 장 mesenchyme 내 분 비 개발에 대 한 많은 이해 되지 않는다 잘 아직, 따라서 생체 외에서 문화 동안 정리 하기 어려운 중요 한 신호를 제공 합니다. 여기, 우리 유지 mesenchyme, pancreatoids 라고 하는 문화 3 차원, 셀룰러 복잡 한 마우스 organoids에 프로토콜을 설명 합니다. E10.5 murine 췌 장 새싹은 해 부, 해리, 및 비 계 없는 환경에서 경작. 이러한 셀을 떠 자기 mesenchyme 개발 pancreatoid 및 내 분 비 베타 세포에는 포상 및 덕트 세포 개발의 강력한 수 포와 함께 조립. 이 시스템은 organogenesis, 또는 약물 이나 작은 분자, 유전자 검사에 대 한 세포 운명 결정, 구조, 조직과 morphogenesis, 세포-세포 상호 작용을 공부 하 사용할 수 있습니다.

마우스 배아 자 궁 경적에서 e10.5에서의 주의 해 부 추가 해 부 (그림 1A)에 대 한 PBS에 손상 되지 않은 배아 항복 한다. 위장은 배아 (그림 1B), 내장 및 위 (그림 1C F)의 교차점에서 등 쪽 췌 장 새싹의 분별을 허용에서 효율적으로 제거할 수 있습니다. E10.5 췌 장 새싹 이전 특징 되었습니다; 창시자는 Pdx1, Sox9, Ptf1a, 및 Hes120,21,,22<sup clas...

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

이 방법은 이러한 췌장암을 사용하여 구조적으로나 세포적으로 복잡한 환경에서 내분비 세포가 어떻게 형성되는지 이해함으로써 췌장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 췌장이 주변 중간엽을 포함하기 때문에 내분비 세포를 발달시킨다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 췌장이 e10.5로 매우 작기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.그리고 해부는 오염되지 않은 조직을 충분히 얻기 위해 췌장암을 형성하는 데 중요합니다. 해부를 준비하려면 얼음 양동이를 채우고 얼음 속에 인산염 완충 식염수 용기를 놓습니다. 두 개의 가는 끝 집게와 해부 가위를 70% 에탄올로 청소합니다.해부 영역 근처에 최소 3개의 붕규산 모세관 튜브, 더 가볍고 여과된 1000마이크로리터 피펫 팁이 있는 용기를 설정합니다. 다음으로, 얼음 위의 12웰 플레이트의 두 번째 웰에서 멸균수에 희석된 1.25밀리리터의 냉간 디스페이아제 1밀리리터 이상을 피펫으로 만듭니다. 12웰 플레이트의 첫 번째, 세 번째 및 네 번째 웰에 있는 피펫 PBS.또한 얼음 위에서 1.5ml 튜브에 0.05% 트립신 1ml를 피펫으로 넣습니다. IACUC 지침에 따라 e10.5 임신 마우스를 안락사시킨 후 복부에 70% 에탄올을 분사하여 해당 부위를 청소합니다. 그런 다음 가위와 집게를 사용하여 마우스의 생식기 부위를 V자 절개하고 횡격막까지 절개를 계속합니다.자궁의 가장 위쪽 외측을 절개하여 자궁을 조심스럽게 절제하고, 장기를 마우스에서 위쪽으로 당겨 빼낸 다음 생식기 부위까지 절개한 후 반대쪽에서도 반복합니다. 절제된 자궁을 차가운 PBS와 함께 10cm 페트리 접시에 넣습니다. 광박리 현미경으로 페트리 접시를 놓고 각 배아 사이에 두 개의 집게를 놓고 난황낭에서 조직을 벗겨내어 자궁 조직을 조심스럽게 엽니다.집게로 난황낭을 부드럽게 잡고 신선하고 차가운 PBS가 있는 10cm 페트리 접시에 넣어 배아를 이식합니다. 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 10cm 페트리 접시 뚜껑에 PBS 방울을 여러 방울 떨어뜨립니다.이 비말을 사용하여 가시성을 보장하기 위해 배아 외 조직을 제거하므로 해부 중에 배아를 이식합니다. 배아를 PBS 방울로 옮기고 나머지 배아는 얼음 위의 PBS에 머무르는 동안 집게를 사용하여 난황낭에서 배아를 부드럽게 제거합니다. 배아를 새 PBS 드롭으로 옮기기 전에 머리를 제거하고 조직을 손상

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

췌장과 같은 progenitors은 인슐린을 표현 식민지로 차별화할 수있는 3 차원 clonogenic 분석이 설명되어 있습니다. 이 방법은 메틸 셀룰로오스, Matrigel 및 성장 요인을 포함하는 반 고체의 미디어 활용,하는 하나의 progenitors는 분아 따위에 의해 중식과...

인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

여기, 우리는 마우스 배아 췌장의 고립, 문화, 조작하는 방법을 설명합니다. 이 훌륭한을...

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

여기, 우리 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 로 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 차별화 하는 상세한 프로토콜을 제시 (PDX1+) 췌 장 계보의 세대에 대 한 셀의 비 식민지 유형 단층 성장에 따라 단일 세포를 해리 했다. 이 메서드는 생산 하는 동종 hPSC 파생 된 세포, 유전자 조작 및 심사에 적합 합니다.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

배우세요 e10.5 마우스 췌장 창시자에서 3차원 인슐린 표현 Pancreatoids를 생성하는 방법을 체외 배양으로. 이 기술은 내분비 세포 형성과 췌장 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

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