비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

이 방법은 이러한 췌장암을 사용하여 구조적으로나 세포적으로 복잡한 환경에서 내분비 세포가 어떻게 형성되는지 이해함으로써 췌장 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 췌장이 주변 중간엽을 포함하기 때문에 내분비 세포를 발달시킨다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 췌장이 e10.5로 매우 작기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

그리고 해부는 오염되지 않은 조직을 충분히 얻기 위해 췌장암을 형성하는 데 중요합니다. 해부를 준비하려면 얼음 양동이를 채우고 얼음 속에 인산염 완충 식염수 용기를 놓습니다. 두 개의 가는 끝 집게와 해부 가위를 70% 에탄올로 청소합니다.

해부 영역 근처에 최소 3개의 붕규산 모세관 튜브, 더 가볍고 여과된 1000마이크로리터 피펫 팁이 있는 용기를 설정합니다. 다음으로, 얼음 위의 12웰 플레이트의 두 번째 웰에서 멸균수에 희석된 1.25밀리리터의 냉간 디스페이아제 1밀리리터 이상을 피펫으로 만듭니다. 12웰 플레이트의 첫 번째, 세 번째 및 네 번째 웰에 있는 피펫 PBS.

또한 얼음 위에서 1.5ml 튜브에 0.05% 트립신 1ml를 피펫으로 넣습니다. IACUC 지침에 따라 e10.5 임신 마우스를 안락사시킨 후 복부에 70% 에탄올을 분사하여 해당 부위를 청소합니다. 그런 다음 가위와 집게를 사용하여 마우스의 생식기 부위를 V자 절개하고 횡격막까지 절개를 계속합니다.

자궁의 가장 위쪽 외측을 절개하여 자궁을 조심스럽게 절제하고, 장기를 마우스에서 위쪽으로 당겨 빼낸 다음 생식기 부위까지 절개한 후 반대쪽에서도 반복합니다. 절제된 자궁을 차가운 PBS와 함께 10cm 페트리 접시에 넣습니다. 광박리 현미경으로 페트리 접시를 놓고 각 배아 사이에 두 개의 집게를 놓고 난황낭에서 조직을 벗겨내어 자궁 조직을 조심스럽게 엽니다.

집게로 난황낭을 부드럽게 잡고 신선하고 차가운 PBS가 있는 10cm 페트리 접시에 넣어 배아를 이식합니다. 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 10cm 페트리 접시 뚜껑에 PBS 방울을 여러 방울 떨어뜨립니다.

이 비말을 사용하여 가시성을 보장하기 위해 배아 외 조직을 제거하므로 해부 중에 배아를 이식합니다. 배아를 PBS 방울로 옮기고 나머지 배아는 얼음 위의 PBS에 머무르는 동안 집게를 사용하여 난황낭에서 배아를 부드럽게 제거합니다. 배아를 새 PBS 드롭으로 옮기기 전에 머리를 제거하고 조직을 손상시키지 않고 배아를 가볍게 퍼낼 수 있도록 집게를 사용합니다.

새 PBS 드롭에서 집게를 사용하여 4개의 팔다리 새싹을 제거합니다. 사지 새싹이 있는 구멍에 집게를 놓고 앞쪽으로 가장 바깥쪽 조직만 부드럽게 찢습니다. 배아를 회전시키고 뒤쪽 방향으로 반복하여 뒷다리 새싹에서 멈춥니다.

이 시점에서 위장관이 보여야 합니다. 위장관의 뒤쪽 부위는 약간 구부러져 있습니다. 위장관과 신체 벽의 척추 부위 사이의 개구부에 있는 이 구부러진 뒤에 집게를 삽입합니다. 위장관을 분리하고 심장 영역이 연결되는 가장 앞쪽 영역에 도달할 때까지 천천히 위쪽으로 작업합니다.

다음 단계에서는 췌장이 아닌 조직으로 췌장을 오염시키지 않도록 배양에서 주변 조직을 피하는 것이 중요합니다. 그러나 췌장 새싹 전체를 잡지 않으면 췌장 새싹의 수와 크기가 손상됩니다. 위장관을 새로운 PBS 액적으로 옮깁니다.

위장관을 둘러싼 외부 조직을 계속 제거합니다. 이 외부 조직이 제거되면 췌장 싹은 위와 장 사이에 있는 간 싹 뒤쪽으로 시각화될 수 있습니다. 그런 다음 집게를 잡고 장에서 튀어나온 새싹 아래의 조직을 부드럽게 꼬집고 췌장 새싹을 살짝 들어 올립니다.

싹이 장과 연결되는 부위를 꼬집은 후 싹을 분리합니다. 새싹을 12웰 플레이트의 첫 번째 웰로 옮기기 전에 새 PBS 버블에서 한 번 세척하고 얼음 위의 차가운 PBS를 넣습니다. 배아에서 모든 새싹을 모아 12웰 플레이트의 첫 번째 웰에 넣을 때까지 반복합니다.

다음으로, 12웰 접시를 광해부 현미경 아래에 놓습니다. 나중에 분할 비율을 계산하기 위해 성공적으로 절개된 췌장 새싹의 수를 세십시오. 여과된 1000마이크로리터 피펫 팁을 모세관 튜브가 부착된 피펫에 넣습니다.

화염 살균은 모세관 튜브를 살균하고 사용하기 쉽도록 튜브에 구부러진 부분을 만듭니다. 모세관을 사용하여 깨끗한 PBS가 들어 있는 세 번째 웰로 옮기기 전에 2분 동안 차가운 디스페이스 용액이 들어 있는 두 번째 웰로 새싹을 옮깁니다. 새싹을 위아래로 피펫으로 고정하고 깨끗한 PBS가 들어 있는 네 번째 웰로 옮깁니다.

마지막으로 모세관 장치를 사용하여 0.05% 트립신이 함유된 1.5ml 튜브로 새싹을 옮깁니다. 예열된 섭씨 37도 셰이커에 튜브를 넣고 1, 500RPM으로 4-5분 동안 흔듭니다. 약 10초 동안 와류를 돌린 후 즉시 튜브를 원심분리기에 넣고 200g에서 5분 동안 회전합니다.

원심분리된 세포를 방해하지 않도록 약 50마이크로리터를 제외한 모든 용액을 조심스럽게 제거합니다. 400마이크로리터의 유기형성 배지에서 원심분리된 세포로 수집된 모든 새싹에 대해 펄스 와류를 세 번 누르고 부착성이 낮은 96웰 플레이트의 웰당 100마이크로리터를 플레이트화하여 새싹을 1:4 비율로 분할합니다. 현미경 아래를 확인하여 해리된 세포가 자유롭게 떠다니는 것을 시각화합니다.

그런 다음 배양 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 로커에 5%의 이산화탄소를 중간 속도로 놓습니다. 자궁 뿔에서 e10.5의 마우스 배아를 주의 깊게 해부하면 추가 해부를 위해 PBS에서 손상되지 않은 배아를 얻을 수 있습니다. 위장관은 배아에서 효율적으로 제거될 수 있으며, 장과 위의 접합부에서 등쪽 췌장 새싹을 식별할 수 있습니다.

유기형성 배지에서 이러한 자유 부유 골격이 없는 세포는 자가 조립되어 배양에서 최소 10일 동안 성장하고 지속되는 3차원 췌장질로 조직됩니다. 단백질 키나아제 C 활성제를 고농도로 적용하면 췌크레아토이드 발달의 형태가 변경되어 느슨하게 연결된 상피 세포와 증가된 분지화가 발생합니다. 또한 형질전환 동물을 사용하면 세포가 분화할 때 실시간으로 시각화

췌장 중간엽 조직과 췌장 상피 세포의 연관성을 평가하기 위해 각 조직의 마커에 대해 면역염색을 수행할 수 있습니다. 내분비 마커와 핵이 있는 덕트 마커의 면역 염색은 췌장에서 다중 계통 형성을 나타냅니다. 췌장 전구 마커와 함께 염색된 중간엽 마커는 중간엽이 췌장을 둘러싸고 있음을 보여줍니다.

베타 세포 발달은 상피 마커와 베타 세포 마커에 대한 염색을 통해 밝혀집니다. 정량적 PCR 분석을 사용하여 전구 유전자 및 분화 마커와 같은 전구 세포 및 분화 세포의 전사체를 평가할 수 있습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 준비 시간을 포함하여 약 1시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 10.5마리의 마우스에서 췌장 조직을 얻어 췌장을 생성하기 위해 해부를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 배아에서 위장관을 조심스럽게 제거하는 것을 기억하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 췌장 싹을 찾기가 매우 어려울 것입니다. 이 절차에 따라 GSIS 및 ELISA와 같은 다른 방법을 수행하여 포도당 자극 후 얼마나 많은 인슐린 또는 C-펩타이드가 생성되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 작은 분자를 사용하여 PKC 활성화의 형태학적 결과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 발현의 전사 인자의 효과를 연구하고 중요한 epistasis 실험을 수행하기 위해 이 시스템을 추가로 구현하는 방법입니다.