Name: Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: 학습하세요 폴리솜 프로파일링 기법으로 Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 mRNA 번역 활성을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 단백질 합성 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 오디오 녹음에 대 한 칭이 감사합니다. 연구 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에서 창업 자금에 의해 지원 되었다 및 변환 신경 과학 및 치료제 (CTNT) 우수의 센터에 의해 부여 PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; NIH 교부 금에 의해 부분에서 R01AI099380 K.Z. 제임스 C. 퍼레이드와 순 영 R. Baca CISER (줄기의 통합 교육 및 연구를 위한 센터) 학자 고 프로그램에 의해 지원 되었다.

모든 동물 치료 및 연구에서 얻은 조직의 취급 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 국가 학회에 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 했다 건강 동물 복지 지침, 프로토콜 번호 96005입니다. 척 추가 있는 동물을 희생 하 고 지침에 따라 조직 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 준비 하십시오. 이러한 위원회 부족, 건강의 국가 학회 동물 복지 가이드라인을 참조 하십시오. 성인 (> 60 일 이전) C57BL/6 마우스 사용 되었다. 모든 동물 및 조직 기관 동물 관리 및 사용 위원회 건강의 국가 학회 동물 복지 지침에 따라 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 얻은 했다. 안락사, 단일 마우스 작은 챔버에 배치 했다 그리고 공중 약 30%로 점차적으로 전치 되었다 이산화탄소는 동물의 고통을 최소화 하 고 anesthetize. 호흡의 정지, 다음 우리는 조직 수확 전에 동물의 죽음을 확인 하 경부 전위를 사용.
주의: 라이브 Leishmania 경작된 한 인간 세포와 모든 작업 biosafety BSL-2 실험실 인증 캐비닛에서 이루어졌다.
1. 준비에서 세포질 Lysates의 Leishmania 주요 , 경작된 한 인간 세포 및 마우스 조직
참고: 다른 원본 자료에서 lysate 준비에 몇 가지 차이점이 있습니다. 자당 그라데이션 준비와 polysomal 분류를 포함 하 여 다른 단계는 동일 하 고 샘플 소스에 종속 되지 않습니다.
<ol><li>
Leishmania 주요 세포질 lysate 준비
	<ol>
<li>주요 Leishmania (FV1 스트레인) 셀 1 x M199 중간29 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 페니실린/스 혼합물 포함 30 mL에 접종 (100 단위 및 100 μ g/mL correspondingly)1 x 105 셀/mL의 농도에서 . 참고: 캐비닛 biosafety Leishmania 주요 셀을 포함 하는 모든 단계를 실시 해야 합니다.</li>
		<li>인큐베이터에 셀을 배치 하 고 로그 단계까지 27 ° C에서 그들을 성장 (로그 중반에 해당 5 x 106 셀/mL). 그것은 일반적으로 성장을 약 2 일 걸립니다.</li>
		<li>Leishmania 주요 문화 번역 된 mRNAs에 리보솜 체포를 100 μ g/mL의 최종 농도에 cycloheximide를 추가 합니다. 27 ° c.에서 10 분 동안 인큐베이터에 다시 장소 세포</li>
		<li>Cycloheximide 치료 완료 후 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 하 고 1800 x g와 8 분 삭제 상쾌한에 4 ° C에서 그들을 회전.</li>
		<li>Dulbecco의 버퍼 인산 염 (DPBS) 30 mL로 세포 세척. 원심 분리기에서 1800 x g와 4 ° C 8 분.</li>
		<li>폐기는 상쾌한. 셀 DPBS의 1 mL에 resuspend</li>
		<li>셀의 약 수 고 3.5% 포름알데히드 솔루션을 함께 섞는다.</li>
		<li>Hemocytometer 여 셀 개수 하 고 그들의 농도 결정 합니다. Microfuge 관으로 원하는 셀 수를 전송 합니다. 0.5x108-2 x 108 셀/mL에서 준비 Lysate 한 자당 그라데이션 선적을 위해 충분 하다.</li>
		<li>1800 x g에서 셀 회전와 4 ° C 8 분에 대 한 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>Protease 억제제와 RNase 억제제 (20 mM HEPES-코, pH 7.4, 100 m m KCl, 10mm MgCl2, 2mm DTT, 1 %NP-40, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (EDTA 무료), 200 단위/mL RNase 억제제)를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 얼음에 셀 펠 릿 resuspend</li>
		<li>통과 lysate 23 게이지 바늘을 통해 세 번. lysate 해야 될 투명 바늘 통과 후.</li>
		<li>원심 분리기 11,200 x g와 lysate 명확 하 게 10 분 동안 4 ° C 명확히 전송 lysate 신선한 튜브와 자당 그라데이션 ultracentrifugation까지 얼음에 그것을 유지.</li>
		<li>수집 입력으로 (나중에 분석), lysate의 400-500 μ 바로 미래의 단백질 분석을 위한 액체 질소 동결 또는 RNA 분석에 대 한 동결 전에 RNA 정화 시 약을 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
배양된 인간 헬러 세포에서 세포질 lysate 준비
	<ol>
<li>헬러 세포를 분할 하 고 20 mL의 10 %FBS 페니실린/스 혼합물 포함 된 DMEM 매체에 씨앗 (100 단위 및 100 μ g/mL correspondingly) 셀 계산 2 x 105 셀/mL 15 cm 접시에.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 제조 업체의 프로토콜에 따라 20-24 h. 수행 플라스 미드 DNA transfection에 HeLa 세포 성장.</li>
		<li>37 ° c, 5% CO2transfection 후 24 h에 대 한 셀을 전파 합니다.</li>
		<li>번역 된 mRNAs에 리보솜을 체포 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 10 분에 대 한 셀을 품 어를 100 μ g/mL의 최종 농도에 성장된 HeLa 세포에 cycloheximide를 추가 합니다. 중간 발음 얼음에 차가운 DPBS 셀 두 번 씻는 다.</li>
		<li>접시에 500 μ의 세포의 용 해 버퍼 (20 mM HEPES 코 pH 7.4, 100 m m KCl, 5 mM MgCl2, DTT, 0.5 %NP-40, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 1 mM (EDTA-무료), 단위/200ml의 RNase 억제제 또는 1 mg/mL 헤 파 린)를 추가 하 고 얼음에 셀을 다쳤어요.</li>
		<li>Microfuge 관 lysed 세포를 전송 합니다. 0.5% 및 MgCl2 는 샘플의 양이 증가 따라 5mm NP-40의 농도 조정 합니다.</li>
		<li>통과 lysate 23 게이지 바늘 3-6 시간.</li>
		<li>스핀 11,200 x g와 lysate 명확 하 게 8 분 4 ° C. 원심, 후 상쾌한 새로운 튜브를 전송 합니다. 세포 세포의 용 해 효율을 평가 하 고 그라데이션에 로드에 대 한 샘플 크기를 결정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다. 0.1%의 0.5 mL를 추가 하는 샘플의 10 μ 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS). 0.1 %SDS 대 한 빈. 260에서 흡 광도 측정 nm. 예상된 흡 광도 값은 주위 15-20 단위/mL.</li>
		<li>자당 기온 변화도 원심 분리 하기 전에 같은 흡 광도 값을 세포의 용 해 버퍼 모든 샘플을 희석. 자당 기온 변화도 원심 분리까지 얼음에 샘플을 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 고환에서 세포질 lysate 준비
	<ol>
<li>마우스 고환 해 부. Tunica albuginea에 작은 절 개를 하 게 하 고 testes의 seminiferous tubules를 수집 하 고 0.1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 보충 하는 DPBS의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.</li>
		<li>여러 번을 반전 하 여 적극적으로 조직을 믹스. 5 분 동안 얼음에 단위 중력에 정착을 조직을 수 있습니다.</li>
		<li>제거 하 고 연결 세포와 조직 파편을 포함 하는 흐린 버퍼를 삭제 합니다. 절차 2-3 번 더 반복 합니다. 나머지 흰색 펠 릿 seminiferous tubules 및 생식 세포 농축입니다.</li>
		<li>2 mL microcentrifuge 튜브를 seminiferous 관 펠 릿을 전송 및 스핀 1 분에 500 x g에서 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>tubules에 세포의 용 해 버퍼 (20 mM Tris HCl, pH 7.4, 100 m m KCl, 5 mM MgCl2, DTT, 0.5 %NP-40, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 1 mM (EDTA-무료), 1 mg/mL 헤 파 린 또는 RNase 억제제의 200 단위/mL)의 500 µ L를 추가 합니다. 한 피 펫을 사용 하 여 조직 triturate.</li>
		<li>작은 정지 전송 (0.5-1.0 mL) Dounce 균질 화기. 유리 유 봉의 7 ~ 8 스트로크 조직 방해.</li>
		<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브 lysate를 전송할.</li>
		<li>12000 x g와는 lysate를 8 분 동안 4 ° C에서 샘플 원심 자당 기온 변화도에 로드 될 때까지 얼음에 새로운 튜브와 저장소에는 상쾌한 전송.</li>
		<li>수집 하는 입력된 샘플으로 lysate의 50 μ, 향후 단백질 분석;-80 ° C에서 그것을 지금 당장 동결 또는 RNA 분석에 대 한 동결 전에 RNA 정화 시 약을 추가.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 자당 그라데이션 준비 및 Ultracentrifugation
<ol><li>두 자당 그라데이션 (20 mM HEPES-코, pH 7.4, 100 m m KCl, 10mm MgCl2, 1mm DTT, 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일), 포함 하는 솔루션 10% 자당 또는 50% 자당을 준비 합니다. (PH 7.4, Tris HCl HEPES 대신 사용할 수 있습니다). 200 단위/mL RNase 억제제 또는 1 mg/mL 헤 파 린 실험 디자인에 따라 추가 합니다. 마커 블록으로 남서 41로 터에 대 한 ultracentrifuge 튜브를 놓고 블록의 상위 레벨에 따라 라인을 그립니다. 안정적인 랙 튜브를 전송 합니다.</li>
	<li>연결 된 레이어 링 장치 10 mL 주사기를가지고 하 고 10% 자당 해결책 (위와 같이 준비)와 주사기를 입력. 마크 튜브에 도달할 때까지 부드럽게 ultracentrifuge 튜브의 하단에 그것을 해제.</li>
	<li>50% 자당 해결책으로 다른 주사기를 조심 스럽게 삽입 튜브의 아래쪽 10% 자당 레이어를 통해 그것의 레이어 링 장치. 부드럽게 튜브에 마크에 도달할 때까지 아래에서 시작 하는 자당 솔루션 출시. 제공 된 모자와 튜브 인감.</li>
	<li>자당 기온 변화도 준비 하려면 그라데이션 메이커 장치에 설정 합니다. 위로 또는 아래로 단추를 사용 하 여 접시를 레벨 하 고 DONE을 누릅니다. 수평 선형 그라데이션에 대 한 중요 하다입니다.</li>
	<li>접시를 평준화 후 대학원 그라데이션 메뉴를 열려면 누릅니다. 목록 에 그라데이션 메뉴에가 고 남서 41 Ti로 터를 선택. 다음 위로 및 아래로 단추를 사용 하 여 메뉴의 목록에서 원하는 자당 그라디언트를 선택 합니다. 사용키를 누릅니다.</li>
	<li>그라데이션 튜브 홀더를 그라데이션 메이커 접시에 놓습니다. 소유자에 튜브를 전송 합니다. 6 그라데이션까지 동시에 준비 될 수 있다. 눌러서 실행합니다. 그라데이션 메이커 프로그램된 속도 선형 그라데이션을 형성 하는 각도에서 튜브를 회전 합니다. 그라디언트를 준비 하는 몇 분 밖에 소요 됩니다.</li>
	<li>프로세스가 완료 되는 때, 튜브 랙에 배치. 모자를 벗어. Ultracentrifuge 튜브의 상단에서 샘플 볼륨으로 동일한 볼륨을 제거 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 lysate의 상단에 polysomes 15 20 A260 단위를 포함 하는 400-500 μ 로드. 로 터 양동이에 튜브를 놓고 균형을 합니다.</li>
	<li>원심 분리기 260000 x g와 4 ° C 2 h SW 41로 터를 사용 하 여.</li>
</ol>3. polysome 분류 및 샘플 컬렉션
참고: lysate 준비 소스에 따라 약간의 차이가 있지만, 그라데이션 준비 및 polysome 분별 프로토콜은 lysates의 모든 종류에 대해 동일 합니다.
<ol><li>완료 후에 ultracentrifugation의, 얼음에 튜브와로 터 양동이 놓습니다. 일부 수집기 및 그라데이션 fractionator ON을 설정 합니다. Fractionator 메뉴에서 검색 을 클릭 합니다. 분수 수집기에 24 컬렉션 튜브와 선반을 넣어.</li>
	<li>이온을 제거 된 물으로 fractionator 측면 린스 저수지를 작성. 린스 키 10 s fractionator에 펌프를 씻어. 보정에 대 한 피스톤에 물으로 채워진 주사기 린스 어댑터를 연결 합니다.</li>
	<li>컴퓨터에 fractionator 소프트웨어를 엽니다. 보정을 누릅니다. 기본 설정을 사용 하 고 확인을 누릅니다. 주사기에서 물을 주사를 준비가 되어있습니다.</li>
	<li>보정 확인 을 누릅니다. 즉시 다음 5에 대 한 물 주입 시작 s. 이 시간 동안 UV 검출기 흐름 셀 통해 물 흐름 것 이다 하 고 악기를 측정 될 것 이다. 부호 0 교정 완료 나타납니다. 악기 분류에 대 한 준비가 되어있습니다.</li>
	<li>주사기와 린스 어댑터를 제거 합니다. 팁은 fractionator의 피스톤에 연결 합니다.</li>
	<li>황동 공기 밸브와 언론에 어 키 10 건조 관과 흐름 셀을 s. 공기 밸브를 닫습니다.</li>
	<li>부드럽게 회전자 통에서 그라데이션 튜브를 제거 하 고 선반에 그것을 배치. 튜브의 상단에 튜브 홀더 캡 적용 신중 하 게 튜브 튜브 홀더 이동 하 고 위치에 그것을 잠금.</li>
	<li>아래는 fractionator 피스톤 홀더를 배치 합니다. 종종, polysomal 악대는 눈으로 볼 수 있습니다. 분수 숫자와 볼륨에 대 한 원하는 설정을 소개 (500 μ/분수 24 분수는 일반적으로 충분 한). 파일을 적절 하 게 이름을 지정 합니다. 확인, 그리고 그래프를 이동 버튼을 누릅니다. 다음 창에서 검색 시작을 누릅니다. 확인을 눌러 설정 표시 됩니다. 수집기는 첫 번째 분수 시 궁 창에서 이동할 것 이다 고 피스톤 튜브로 이동 합니다. 피스톤 그라데이션의 상단에 도달 하면 선택한 속도에 느린 것입니다 하 고 분수를 수집 합니다. 완료 되 면, 피스톤 그라데이션 튜브 이동 합니다.</li>
	<li>황동 공기 밸브와 언론 어 키를 마지막 분수 검색 fractionator에서 엽니다.</li>
	<li>얼음에는 선반에서 튜브를 이동 합니다.</li>
	<li>2 양의 RNA 정화 시 약 각 분수를 플래시 RNA 정화까지 액체 질소에서 고정을 추가 합니다. 또는, 단백질 분석 하는 경우, 서쪽 더 럽 히 (섹션 8 참조)에 대 한 집중에 10%의 최종 농도에 trichloroacetic 산을 추가 합니다.</li>
</ol>4. 실시간 정량 데이터 분석 수준 동안 mRNAs의 정규화에 대 한 합성 RNA 생체 외에서 준비
참고: 대장균 OmpA mRNA 정규화에 대 한이 프로토콜에 사용 됩니다. 광범위 한 정체성 공부 유 기체의 mRNAs가 없는 다른 RNA (포유류 또는 Leishmania) 사용할 수 있습니다.
<ol><li>OmpA 유전자30를 포함 하는 플라스 미드에서 표준 PCR 반응에 의해 SP6 발기인 시퀀스가 포함 된 OmpA DNA 파편을 준비 합니다.</li>
	<li>혼합물의 100 µ L를 준비: 80 mM HEPES-코, pH 7.5, 16 m m MgCl2, 2 mM Spermidine, 10mm DTT, ATP, CTP, 3mm 3mm 3mm UTP, 3mm GTP, 0.5 U/μ RNase 억제제, OmpA PCR DNA, 3 μ s p 6 RNA 중 합 효소의 1 μ g 0.005 U/μ pyrophosphatase.</li>
	<li>2 시간 동안 40 ° C에서 품 어.</li>
	<li>RNA 정화 키트에 의해 RNA를 정화.</li>
	<li>분 광 광도 계에 의해 농도 측정 하 고 agarose 젤 전기 이동 법으로 검사.</li>
</ol>5. RNA 격리 그라데이션 분수를 cDNA 준비
참고: RNase 억제제 ribonuclease 억제제로 사용 하는 경우이 프로토콜 RNA 정화와 직접 진행 합니다. 그러나, ribonuclease 억제제로 사용 하는 경우 헤 파 린 역전사 cDNA 준비에 사용 된 억제 됩니다. 따라서, 추가 정화 RNA의 헤 파 린 세포의 용 해 버퍼 및 그라데이션에 사용 된 경우에 필요 합니다. 헤 파 린 사용 cDNA 합성에 RNA를 준비 섹션 6을 참조 하십시오.
<ol><li>RNA 정화 시 약을 포함 하는 샘플을 녹여, 20를 추가 실시간 정량 Pcr 결과의 정규화에 대 한 내부 통제로 합성 RNA의 ng. 한 수정 제외 하 고 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 준비 진행. RNA 학년 glycogen (20 µ g) 이전 소 프로 파 놀 강수량의 1 µ L를 추가 합니다. 20-25 µ L RNase 무료 물 펠 릿 RNA를 분해. 참고: Glycogen 캐리어 역할 하 고 손실을 방지 하 고 정화 동안 RNA 펠 릿을 시각화 하는 데 도움이. OmpA mRNA는 실시간 정량 Pcr 반응에 더 정규화에 사용 됩니다.</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 적절 한 수익률을 보장 하는 RNA 농도 측정 합니다. 40, 60 및 prepolysomes로 monosomes를 포함 하는 RNA 분수의 동일한 볼륨을 결합 한다. 2-4 리보솜을 포함 하는 분수 빛 polysomes로 결합 하 고 5-8 리보솜과 분수 무거운 polysomes로 결합.</li>
	<li>결합 된 분수에서 RNA의 5-10 µ L를 사용 하 여 cDNAs 키트를 사용 하 고 제조 업체의 권장 사항에 따라 준비.</li>
	<li>CDNA의 20 µ L를 nuclease 무료 물 80 µ L를 추가 합니다. -20 ° c.에 cDNA 샘플을 동결</li>
</ol>6. RNA 정화 덤플링 오염에서
참고: 헤 파 린 같은 역전사 효소를 처리 하는 핵 산을 억제. 따라서, 세포의 용 해 버퍼 또는 그라데이션에서 헤 파 린 사용이 추가 정화 프로토콜을 사용 합니다.
<ol><li>순화 된 RNA 샘플을 1 M 최종 농도에 LiCl을 추가 합니다.</li>
	<li>샘플을 혼합 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>샘플에서 16000 x g와 15 분 동안 4 ° C 회전.</li>
	<li>가능한 한 피 펫을 사용 하 여 완전 한 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>약 5 분 동안 펠 릿 건조</li>
	<li>다시 물 RNase 무료 초기 볼륨에 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>260에 spectrophotometric 측정을 수행 RNA의 농도 결정 하기 위해 nm. 일반적으로, 샘플의 손실 최소화 됩니다.</li>
</ol>7. 실시간 정량 Pcr 및 mRNA 분포의 데이터 분석
<ol><li>물, SYBR 녹색의 20 μ, 유전자 특정 뇌관 (2.5 μ M 세트)의 4.8 μ의 10.2 μ, cDNA의 5 μ를 결합 하 고 잘 섞어 384-잘 접시에 잘 triplicates에 당 10 μ를 로드.</li>
	<li>접착 필름으로 접시를 단단히 커버 하 고 접시 5 분 1800 x g에서 원심.</li>
	<li>실시간 PCR 악기를 사용 하 여 표 1에 표시 된 조건에서 정량 반응을 설정 합니다.</li>
	<li>사이클 임계값 (CT)를 사용 하 여 값과 비교 CT (ΔΔCT) 방법31 계산 백분율 (%) prepolysomes, 빛, 그리고 무거운 polysomes 한 수정 설명된32 로 mRNA 분포의. 합성 RNA (OmpA 여기)를 사용 하 여 실시간 정량 데이터 분석에서 데이터 정규화에 대 한. 합성 RNA 상대 mRNAs 레벨을 계산 하 여 그라디언트의 다른 분수에 그들을 비교할 수 있는 정규화 제어를 제공 합니다.</li>
</ol>8. 서 부 Blotting에 의해 Polysomal 분수에 단백질의 분석
<ol><li>100% (w/v) 주식에서 추가 trichloroacetic 산 (TCA) 10%의 최종 농도에 선택한 분수 (500 μ) 적어도 15 분, 5 분 대에 microfuge 분리기 얼음 계속, 상쾌한 삭제, 차가운 아세톤과 두 번 세척 및 25 μ S의 분해 전기 이동 법에 대 한 DS-페이지 샘플 로딩 버퍼입니다.</li>
	<li>SDS 페이지에 로드 하 고 다음 전송 전송 PVDF 막에 표준 전기 이동 법을 실시. 33를 더럽혀 서 진행 합니다.</li>
</ol>

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<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
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<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+Controls+Mitochondrial+Dynamics+and+Cell+Survival+via+MTFP1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1.</a> Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
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저자는 공개 없다.

자당 기온 변화도 의해 polysome 분별 RNA와 결합 및 분수의 단백질 분석은 개별 mRNAs 또는 전체 translatome의 변환 상태 뿐만 아니라 변환 조절 단백질 요인의 역할을 분석 하는 강력한 방법을 정상적인 생리 적 또는 질병 상태 기계입니다. Polysomal 프로 파일링은 Leishmania transcriptional 제어 크게 결 석 하 고 유전자 표현 규제는 주로 발생을 포함 하는 trypanosomatids와 같은 유기 체에 있는 변환 규칙을 공부 하는 특히 적합 한 기법 동안에 번역.
여기, 우리 3 모델에 사용 되는 polysome 분별 프로토콜 설명: Leishmania 기생충, 경작된 한 인간 세포 및 마우스 조직. Polysome 분류 단계는 본질적으로;이 연구에 사용 된 다른 유기 체를 위해 동일 이다 그러나, lysate 준비 몇 가지 차이점이 있다. Leishmania 셀 액체 문화에서 성장...

세포에 있는 유전자 발현의 규칙 transcriptional, posttranscriptional 및 posttranslational 메커니즘에 의해 제어 됩니다. 깊은 RNA 시퀀싱에서 전례 없는 수준에 게놈 넓은 규모에 정상 mRNA 수준의 연구를 수 있습니다. 그러나, 최근 연구 결과 밝혀 정상 mRNA 수준은 단백질 생산1,2와 항상 연결 되지 않습니다. 개별 성적표의 운명 매우 복잡 하 고 내부/외부 자극, 스트레스 등과같은 많은 요인에 따라 달라 집니다. 단백질 종합 동안에 유전자 발현의 규칙 변화에 신속한 대응에 필요한 식 컨트롤의 또 다른 레이어를 제공 합니다. 프로 파일링, 분리 및 리보솜, 적극적으로 번역의 시각화 polysome (또는 "polyribosome") 단백질 종합의 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 비록, 그것의 첫번째 실험적인 응용 프로그램 1960 년대3에 등장, polysome 프로 파일링은 현재 단백질 번역 연구4에서 가장 중요 한 기술 중 하나. 단일 mRNAs는 polysome의 형성을 선도 하는 하나 이상의 리보솜에 의해 번역 될 수 있다. 성적 증명서 cycloheximide5 리보솜에 지연 수 있습니다 및 mRNAs polysomes의 다른 숫자를 포함 하 여 자당 그라데이션 ultracentrifugation6,7 polysome 분류 과정에서 분리 될 수 있다 , 8 , 9. polysomal 분수의 RNA 분석 수 있습니다 개별 mRNAs의 변환 상태에 변화의 측정 및 다른 생리 적인 조건4,7, 중 게놈 넓은 규모에 10. 5' UTR 및 3' UTR 시퀀스 mRNA translatability11의 제어의 역할을 공개, 번역 상 진압12miRNAs의 역할을 검토, 리보솜 속13에에서 결함을 밝히기 메서드를 또한 사용 , 인간의 질병14,15리보솜 관련 단백질의 역할을 이해 하 고. 지난 10 년 동안 번역 중 유전자 발현의 규칙을 위한 성장 역할 인간의 질병에 그것의 중요성을 나타내는 등장 했습니다. 암, 대사에 변환 제어 및 신경 퇴행 성 질환에 대 한 증거는 압도적인15,,1617,18. EIF4E-종속 변환 제어의 dysregulation에 기여 하는 예를 들어 자폐증 관련 적자15 와 FMRP은 자폐증14에 연결 된 mRNAs에 리보솜의 연기에 참여 하 고. 따라서, polysomal 프로 파일링 변환 여러 인간 질병에 있는 결함을 공부 하는 매우 중요 한 도구입니다.
다른 생리 적인 조건 하에서 polysomal 분수의 단백질 분석 번역 중 리보솜과 관련 된 요인의 기능 dissects. Polysome 프로 파일링 기법 등 효 모, 포유류 세포, 식물, 원생 동물10,19,,2021많은 종에서 사용 되었습니다. Trypanosoma 등 Leishmania protozoan 기생충 유전자 발현의 제한 된 transcriptional 제어를 전시 한다. 그들의 유전자는 polycistronic 유전자 클러스터 발기인 통제 전사22부족으로 구성 됩니다. 대신, 발달 유전자 발현은 주로 단백질 번역 및 trypanosomatid 종23,24에 mRNA 안정성의 수준에서 제어 됩니다. 따라서, 이해 transcriptional 규칙의 부재에서 변환 제어의이 유기 체에 대 한 특히 중요 하다. Polysomal 프로 파일링 Leishmania25,26,,2728에 유전자 발현의 posttranscriptional 레 귤 레이 션을 공부 하는 강력한 도구입니다.
진짜 개인적인 mRNAs 레벨의 검출에 최근 진행 시간 정량 PCR (RT-정량) 및 차세대 시퀀싱, 프로 테오 믹스 기술에 의해 전체 transcriptome, 해상도 새로운 수준 polysomal 프로 파일링의 장점을 제공 합니다. 이러한 메서드를 사용 하 여 깊은 RNA 시퀀싱 proteomic 분석 게놈 넓은 규모에 셀의 변환 상태를 모니터링을 결합 하 여 개별 polysomal 분수의 분석에 의해 더 확장 수 있습니다. 다른 생리 적 및 병 적인 조건 하에서 번역을 규제 하는 새로운 분자 선수의 식별 수 있습니다. 여기, 우리는 세 가지 모델에 사용 되는 프로토콜을 프로 파일링 범용 polysome 제시: 기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. 우리는 다른 유기 체, 그라데이션 조건의 최적화, RNase 억제제의 선택과 polysome 분수가이 연구에서 분석 하는 실시간 정량, 서쪽 오 점 및 RNA 전기 이동 법의 응용 프로그램에서 세포 lysates의 준비에 조언을 제시.

<table><tbody><tr><td>Instruments: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient 마스터</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>피스톤 그라디언트 분획기</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>분획 수집기</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Nikon 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2-FL/TS2</td><td></td></tr><tr><td>2720 Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems by Life</td> Technologies <td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>HERATHERM 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 작업대, 클래스 II, 유형 A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Revco 냉동고</td>, <td>Revco Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr>, <tr><td>Beckman L8-M 초원심분리기</td><td>, Beckman Coulter</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 로터, SW41</td>, <td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버켓 로터</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>Fixed angle rotor</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td><강력한>소프트웨어&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triax 소프트웨어&nbsp;</td><td>Biocomp 악기 Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Counting slides, 세포 계수기용 이중 챔버</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>개방형 폴리클리어 원심분리기 튜브, (14 mm x 89 mm)</td><td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 5 mL</td><td>BD</td><td></td><td></td>309646</tr><tr><td>BD 주사기 3 mL23 게이지 1 인치 니들</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 표면 플레이트, 14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 표면 플레이트, 9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene rapid-flow 90mm 필터 장치, 500 mL, 0.2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm3 플라스크</td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>둘베코의 변형 독수리 중고포도당(DMEM)</td><td>시그마</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>시그마</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(P/S)</td><td>시그마</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000</td><td>인비트로겐</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>둘베코의 인산염 완충 식염수( DPBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물(MgCl2x6H2O)</td><td>아크로스 유기물</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>시그마</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>노니뎃 P 40(NP-40)</td><td>플루카(시그마-알드리치)</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>재조합 나신 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 염</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA free 프로테아제 억제제</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨 탈수물(EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Life Technologies</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>퓨로마이신 디하이드로클로</td>라이드 <td>시그마</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 솔루션</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hgh 용량 cDNA 역전사 효소 키트</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨(KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RPL11 항체</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>리보솜 단백질 S6(C-8) 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>리튬 클로라이드</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>겔 로딩 버퍼 II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로아세트산(TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS 화학발광 기질</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>황산나트륨(SDS)</td><td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP)</td><td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP)Sigma</td><td></td> <td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염 수화물(GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>피로포샤타제</td><td>시그마</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>시그마</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

polysome leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

적절 한 단백질 식 및 오른쪽 금액에 적절 한 시기에 정상적인 세포 기능 및 빠르게 변화 하는 환경에서 생존의 기초 이다. 오랜 동안에, 유전자 표현 연구 transcriptional 수준에 대 한 연구에 의해 지배 되었다. 그러나, mRNAs의 정상 수준을 잘 단백질 생산, 연관 되지 않습니다 그리고 translatability mRNAs의 조건에 따라 크게 다릅니다. Leishmania, 기생충 같은 몇몇 유기 체에서 단백질 식이 주로 변환 수준에서 통제 된다. 최근 연구는 단백질 번역 dysregulation는 암, 대사, 신경 및 기타 인간의 질병 관련 된 시연 했다. Polysome 프로 파일링 단백질 번역 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 그것은 개별 mRNAs의 변환 상태를 측정 하거나 게놈 넓은 규모에 번역을 검토 수 있습니다. 이 기법의 기초 polysomes, 리보솜, 그들의 소 단위 및 자당 그라디언트를 통해 lysate는 세포질의 원심 분리 동안 무료 mRNAs의 분리 이다. 여기, 우리가 현재 보편적인 polysome 프로 파일링 사용 되는 프로토콜에 세 가지 모델-기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. Leishmania 셀 서 스 펜 션에서 자유롭게 성장 하 고 마우스 고환 동물 조직 샘플을 나타내는 부착 단층에서 경작된 한 인간 세포 성장. 따라서, 기술은 이러한 소스의 모든 적응 이다. Polysomal 분수의 분석을 위한 프로토콜 개별 mRNA 수준의 실시간 정량 Pcr에 의해 서쪽 오 점 및 전기 이동 법에 의해 리보솜 RNAs의 분석에 의해 단백질의 탐지를 포함 한다. 메서드는 분수의 질량 분광학에 의해 mRNAs 연관 깊은 RNA-seq에 의해 transcriptome 수준에 리보솜의 검사 및 리보솜 관련 단백질의 분석에 의해 더 확장할 수 있다. 메서드는 다른 생물 학적 모델을 쉽게 조정할 수 있습니다.

이 연구에서는 3 개의 서로 다른 소스에 polysomal 프로 파일링 기술의 응용 프로그램 설명: 기생 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 마우스 고환. Leishmania 세포 현 탁 액에 있는 액체 매체에서 자유롭게 성장, 경작된 한 인간 세포 플레이트에 부착 단층에서 성장 하 고 마우스 고환 조직 샘플을 나타냅니다. 메서드를 사용 하면 다른 종류의 서 스 펜 션, 다양 한 종류의 조직, 또는 다른 유기 체에서 및 배양된 세포의 종류에 자유롭게 성장된 세포를 쉽게 조정할 수 있습니다. 접근 방식 4 개의 주요 단계로 구성 됩니다: lysate 준비, 자당 그라데이션 준비 및 ultracentrifugation 단계, polysome 분류와 샘플 컬렉션 뒤에 분수의 분석. 서로 다른 소스에서 세포는 수집, 세차 고 바늘 또는 Dounce 균질 화기를 통해 통행에 의해 세포의 용 해 버퍼에서 lysed. 원심 분리는 ly...

Polysome 프로 파일링 기술의 전반적인 목표 단백질 합성 하는 동안 개별 mRNAs 또는 transcriptome mRNAs의 변환 활동의 분석입니다. 방법은 단백질 합성 규제, 번역 활성화 및 건강과 여러 인간의 질병에 억압의 연구에 대 한 중요 합니다.

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

이 기술의 전반적인 목표는 번역 중 개별 mRNA와 폴리솜의 관계를 연구하는 것입니다. 폴리솜 프로파일링은 리보솜 및 폴리솜과 mRNA의 관계를 연구하는 강력한 기술입니다. 이 기술은 단백질 합성 조절, 번역 활성화 및 억제에 대한 연구에 중요합니다.여기에서 우리 팀은 다염색체 분획 기술과 세 가지 유기체의 예에 대한 분획 분석을 제시합니다. 기생충 리슈마니아 주요, 배양된 인간 세포 및 동물 조직. 이 접근법은 용해물 준비, 자당 그래디언트 준비 및 초원심분리, 폴리솜 분획 및 샘플 수집의 4가지 주요 단계로 구성됩니다.분획 분석. 다른 근원에서 세포는 바늘 또는 Dounce 균질화기를 통해서 통행에 의해 lysis 완충기에서 모아지고, 세척되고 lysed. 원심분리법은 세포 파편을 제거하여 용해물을 정화하는 데 사용됩니다.연속 자당 그래디언트는 그래디언트 메이커에서 10%와 50% 슈크로스 용액을 혼합하여 형성됩니다. 용해물은 그래디언트의 맨 위에 로드됩니다. 초원심분리는 서로 다른 수의 리보솜과 관련된 mrNA를 분리합니다.이는 분별 중에 UV 검출기에 의해 모니터링되어 뚜렷한 흡수 스펙트럼을 형성합니다. 용해물 준비. 출처에 따라 용해물의 준비에 약간의 차이가 있습니다.용해물 준비 후 절차는 시료 출처에 관계없이 동일합니다. Leishmania 주요 Cytoplasmic Lysate 준비. Leishmania 주요 세포를 100, 밀리리터 당 000 세포의 밀도로 30 밀리리터의 매체에 배치하십시오.이 단계는 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 리슈마니아 배양액이 담긴 플라스크를 인큐베이터에 놓고 로그 단계까지 섭씨 27도에서 세포를 성장시킵니다. 자라는 데 보통 이틀 정도 걸립니다.리슈마니아 주요 세포는 현미경으로 쉽게 볼 수 있습니다. 성장한 리슈마니아 배양액에 시클로헥시미드를 최종 농도인 밀리리터당 100마이크로그램까지 첨가하여 번역된 mRNA에서 리보솜을 정지시킵니다. 세포를 다시 인큐베이터에 넣고 섭씨 27도에서 10분 동안 보관합니다.시클로헥시미드 처리가 완료된 후 세포를 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 8분 동안 1, 800g을 회전시킵니다. 상등액을 버리십시오. 30ml의 PBS와 원심분리기로 세포를 세척합니다.상등액을 버리고 1ml의 pbs에 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포의 분취액을 취하여 포름알데히드 용액과 혼합합니다. 그런 다음 혈구계로 세포를 계수합니다.원하는 수의 세포를 마이크로분리

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

감염 THP1 셀과 기생충 - 구조 및 변화...

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

스트레스에 적응하는 세포의 능력은 세포의 생존에 매우 중요합니다. mRNA 번역의 조절은 그러한 적응 전략 중 하나로, 단백질체의 빠른 조절을 제공합니다. 여기에서는 스트레스 조건에서 선택적으로 번역되는 특정 mRNA를 식별하기 위해 표준화된 폴리솜 프로파일링 프로토콜을 제공합니다.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

이 프로토콜은 결합된 리보솜의 수를 기준으로 식물 조직에서 전사체를 추출하고 분획하는 쉬운 방법을 설명합니다. 이를 통해 translation activity의 전반적인 추정치와 특정 mRNA의 translational status 결정을 수행할 수 있습니다.

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

여기에서, 우리는 고환에서 RBP 후보자의 주요 RNA 표적을 결정 하는 eCLIP 프로토콜을 제시 합니다.

마우스 고환에서 단백질 결합 RNA를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eCLIP) 방법

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

여기에서는 pLEXSY 시스템을 사용하여 안정적인 통합 이식 유전자로서 eGFP에 대한 유전자를 발현하는 L . panamensis 및 L . donovani 균주를 생성하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다. 형질주입된 기생충은 희석을 제한하여 클로닝하고, 두 종 모두에서 가장 높은 형광 강도를 갖는 클론을 약물 스크리닝 분석에 추가로 사용하기 위해 선택했습니다.

eGFP의 구성적 발현을 통한 리슈만편모충 종 균주의 개발

여기에서는 생물 발광 이미징 및 PCR에 의해 L. infantum-Luc에 복강내(IP) 또는 치은내(IG)를 통해 감염된 골든 햄스터에 대한 종단 평가를 제시합니다. 햄스터는 감염 후 1일(1dpi), 감염 1주일(8dpi), 감염 후 3주(22dpi)에 평가를 받고 50번째 dpi와 감염 후 8개월에 안락사시켰다.

생체 내 루시페라아제를 발현하는 Axenic Amastigotes의 치은 접종에 의한 Leishmania infantum-infected Hamsters의 이미징

학습하세요 폴리솜 프로파일링 기법으로 Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 mRNA 번역 활성을 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 단백질 합성 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

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