Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

이 기술의 전반적인 목표는 번역 중 개별 mRNA와 폴리솜의 관계를 연구하는 것입니다. 폴리솜 프로파일링은 리보솜 및 폴리솜과 mRNA의 관계를 연구하는 강력한 기술입니다. 이 기술은 단백질 합성 조절, 번역 활성화 및 억제에 대한 연구에 중요합니다.

여기에서 우리 팀은 다염색체 분획 기술과 세 가지 유기체의 예에 대한 분획 분석을 제시합니다. 기생충 리슈마니아 주요, 배양된 인간 세포 및 동물 조직. 이 접근법은 용해물 준비, 자당 그래디언트 준비 및 초원심분리, 폴리솜 분획 및 샘플 수집의 4가지 주요 단계로 구성됩니다.

분획 분석. 다른 근원에서 세포는 바늘 또는 Dounce 균질화기를 통해서 통행에 의해 lysis 완충기에서 모아지고, 세척되고 lysed. 원심분리법은 세포 파편을 제거하여 용해물을 정화하는 데 사용됩니다.

연속 자당 그래디언트는 그래디언트 메이커에서 10%와 50% 슈크로스 용액을 혼합하여 형성됩니다. 용해물은 그래디언트의 맨 위에 로드됩니다. 초원심분리는 서로 다른 수의 리보솜과 관련된 mrNA를 분리합니다.

이는 분별 중에 UV 검출기에 의해 모니터링되어 뚜렷한 흡수 스펙트럼을 형성합니다. 용해물 준비. 출처에 따라 용해물의 준비에 약간의 차이가 있습니다.

용해물 준비 후 절차는 시료 출처에 관계없이 동일합니다. Leishmania 주요 Cytoplasmic Lysate 준비. Leishmania 주요 세포를 100, 밀리리터 당 000 세포의 밀도로 30 밀리리터의 매체에 배치하십시오.

이 단계는 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 리슈마니아 배양액이 담긴 플라스크를 인큐베이터에 놓고 로그 단계까지 섭씨 27도에서 세포를 성장시킵니다. 자라는 데 보통 이틀 정도 걸립니다.

리슈마니아 주요 세포는 현미경으로 쉽게 볼 수 있습니다. 성장한 리슈마니아 배양액에 시클로헥시미드를 최종 농도인 밀리리터당 100마이크로그램까지 첨가하여 번역된 mRNA에서 리보솜을 정지시킵니다. 세포를 다시 인큐베이터에 넣고 섭씨 27도에서 10분 동안

시클로헥시미드 처리가 완료된 후 세포를 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 8분 동안 1, 800g을 회전시킵니다. 상등액을 버리십시오. 30ml의 PBS와 원심분리기로 세포를 세척합니다.

상등액을 버리고 1ml의 pbs에 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포의 분취액을 취하여 포름알데히드 용액과 혼합합니다. 그런 다음 혈구계로 세포를 계수합니다.

원하는 수의 세포를 마이크로분리관으로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 8분 동안 1, 800g에서 세포를 회전시킵니다. 그런 다음 상등액을 버리십시오.

단백질 분해 효소 억제제와 RNAsin을 함유한 1ml의 용해 완충액에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 23 게이지 바늘에 세포를 세 번 통과시킵니다. 바늘을 통과 한 후 용해물이 투명해집니다.

11, 용해물을 명백하게 하기 위하여 4 섭씨 온도에 10 분 동안 200 g에 분리기. 정화된 용해물을 새 마이크로분리 튜브로 옮기고 자당 구배 초원심분리가 일어날 때까지 얼음 위에 보관합니다. 배양된 인간 세포로부터의 세포질 용해물 준비.

인큐베이터의 큰 플레이트에서 섭씨 37도의 온도에서 5%CO2로 HeLa 세포를 성장시킵니다.성장한 HeLa 세포에 시클로헥시미드를 최종 농도인 밀리리터당 100마이크로그램까지 첨가하여 번역된 mRNA의 리보솜을 정지시킵니다. 섭씨 37도에서 5%CO2로 10분 동안 세포를 배양합니다.

중간 흡입 및 차가운 PBS로 얼음 위에 접시를 두 번 씻습니다. 플레이트에 500마이크로리터의 용해 완충액을 추가하고 세포를 긁어냅니다. 용해된 세포를 마이크로분리관으로 옮깁니다.

23 게이지 바늘에 세포를 세 번 통과시킵니다. 11, 200g에서 8분 동안 회전시켜 용해물을 정화합니다. 원심분리 후 얼음 위의 튜브를 이동하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.

부분 표본을 취하여 희석하고 나노 방울을 사용하여 260나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 샘플이 여러 개 있는 경우 용해물을 동일한 광학 밀도로 조정하고 자당 구배 초원심분리가 이루어질 때까지 샘플을 얼음 위에 보관합니다. 마우스 고환에서 세포질 용해물 준비.

마우스 고환을 해부합니다. tunica albugenia를 작게 절개하고 고환의 정세관을 채취하여 5ml의 pbs가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 조직을 세게 섞습니다.

그리고 티슈가 얼음 위에 5분 동안 가라앉도록 합니다. 버퍼를 제거하고 pbs로 두 번 더 세척합니다. 2ml 튜브에 정액세관을 옮기고 500g에서 1분 동안 회전시킵니다.

상층액을 제거합니다. 세뇨관에 500마이크로리터의 용해 완충액을 추가하고 피펫을 사용하여 조직을 파괴합니다. 현탁액을 소량 dounce 균질화기로 옮깁니다.

유리절굿공이를 7-8번 휘둘러 조직을 파괴한다. 용해물을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 12, 4 섭씨 온도에 8 분 동안 000 g에 표본을 용해물을 맑게 하기 위하여 원심 분리하십시오.

상층액을 새 튜브에 옮기고 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 자당 구배 준비를 진행합니다. 자당 그라디언트 준비.

초원심분리기 튜브를 마이크로블록에 넣고 블록의 위쪽 레벨을 따라 선을 그립니다. 그런 다음 튜브를 안정적인 랙으로 옮깁니다. 레이어링 장치가 부착된 10밀리리터 주사기를 가지고 주사기에 10% 자당 용액을 채웁니다.

자당 용액이 표시에 도달할 때까지 초원심분리기 튜브 바닥에서 부드럽게 분리합니다. 다른 주사기에 50% 자당 용액을 채우고 10% 자당 층을 통해 튜브 바닥에 레이어링 장치를 조심스럽게 삽입합니다. 튜브의 표시에 도달할 때까지 바닥에서 시작하여 자당 용액을 부드럽게 방출합니다.

그런 다음 제공된 캡으로 튜브를 밀봉합니다. 자당 그라디언트를 준비하려면 그라디언트 메이커 장치를 켜십시오. 그런 다음 위쪽 또는 아래쪽 버튼을 사용하여 플레이트의 수평을 맞추고 완료를 누릅니다.

플레이트를 평평하게 한 후 grad를 누릅니다. 그라디언트 메뉴 목록으로 이동하여 SW41 로터를 선택합니다. 그런 다음 원하는 자당 그라디언트를 선택합니다.

사용을 누릅니다. 그라디언트 메이커에 자석 베이스 튜브 홀더를 놓습니다. 그런 다음 튜브를 홀더로 옮깁니다.

최대 6개의 그래디언트를 동시에 준비할 수 있습니다. 실행을 누릅니다. 그라디언트 메이커는 프로그램 속도와 각도로 튜브를 회전시켜 선형 그래디언트를 형성합니다.

그래디언트를 준비하는 데 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. 프로세스가 완료되면 튜브를 랙에 놓습니다. 자당 그래디언트가 있는 초원심분리 튜브 상단에서 샘플 부피와 동일한 부피를 제거합니다.

500 마이크로 리터의 용해물을 조심스럽게 위에 넣으십시오. 튜브를 로터 버킷에 넣고 균형을 맞춥니다. 260, 000g에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 원심분리기.

폴리솜 분별 및 시료 채취. 초원심분리 후 로터 버킷의 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 분획 분취기와 분획기를 켭니다.

분류기 메뉴에서 scan을 클릭합니다. 수집 튜브가 있는 랙을 분획 분취기에 넣습니다. 분별기 측면의 헹굼 탱크에 탈이온수를 채웁니다.

린스 키를 10초 동안 눌러 펌프를 헹굽니다. 보정을 위해 주사기에 물을 채운 헹굼 어댑터를 피스톤에 부착합니다. 컴퓨터에서 분획기 소프트웨어를 엽니다.

보정을 누릅니다. 기본 설정을 사용하고 주사기에서 물을 주입할 준비를 Ok.Be 를 누릅니다. 확인을 눌러 보정을 수행합니다.

즉시 5초 동안 물을 주입하기 시작합니다. 제로 보정 완료 기호가 나타납니다. 주사기로 헹굼 어댑터를 제거하고 분획기의 피스톤에 팁을 부착합니다.

황동 공기 밸브를 열고 공기 키를 10초 동안 눌러 공기 튜브와 플로우 셀을 건조시킵니다. 공기 밸브를 닫습니다. 로터 버킷에서 그라디언트 튜브를 가져와 랙에 놓습니다.

튜브 홀더 캡을 튜브 상단에 적용하고 튜브를 튜브 홀더에 조심스럽게 넣고 잠급니다. 홀더를 피스톤 아래에 놓습니다. 종종 다염색체 띠는 눈으로 볼 수 있습니다.

분수 및 부피에 대해 원하는 설정을 소개합니다. 파일 이름을 지정하고 Ok를 누른 다음 그래프 버튼으로 이동합니다. 다음 창에서 스캔 시작을 누릅니다.

설정이 나타나고 Ok.The collector가 거터에서 첫 번째 분수로 이동하고 피스톤이 튜브 내부로 이동합니다. 피스톤이 기울기의 상단에 도달하면 선택한 속도로 느려지고 분획이 수집됩니다. 일반적으로 각각 500마이크로리터에서 24개의 분획을 수집합니다.

완료되면 피스톤이 그라디언트 튜브 밖으로 이동합니다. 황동 공기 밸브를 엽니다. 분획기의 air 키를 눌러 마지막 분수를 검색합니다.

실행이 끝나면 그래디언트의 흡광도 프로파일을 볼 수 있습니다. 분획 분석. 얻어진 분획은 RNA 및 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.

RNA는 전기영동으로 분석한 후 노던 블롯(Northern Blot)으로 분석하거나 cDNA 생산에 사용한 다음 RT-qPCR 반응을 통해 개별 mRNA와 폴리솜의 연관성을 분석할 수 있습니다. 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing)은 전사체 규모에서 mRNA의 번역 상태를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 다염색체 분획의 단백질 분석을 위해 단백질을 트리클루리세딕산(tricluricedic acid)으로 침전시켜 단백질을 농축합니다.

그런 다음 단백질은 Western Blotting 또는 단백질체 수준에서 Mass Spec에 의해 분석됩니다. 결과. 여기에서는 세 가지 유기체의 예에 대한 폴리솜 분별 및 분석 결과를 제시합니다. 리슈마니아, 배양된 인간 세포 및 마우스 조직.

폴리솜 분획은 번역 및 리슈마니아 전공 기간 동안 Sherp 및 Tubulin mRNA와 리보솜의 연관성을 연구하는 데 사용되었습니다. 분별에 대한 흡광도 그래프는 리보솜 소단위 40S 및 60S, 단소체 80S 및 폴리솜에 대한 일반적인 피크와 함께 뚜렷한 모양을 가지고 있습니다. 분수의 부분 표본은 세 그룹으로 결합되었습니다.

프리 폴리솜, 가벼운 폴리솜 및 무거운 폴리솜. mRNA 상대 수준은 실시간 정량 PCR로 연구했습니다. 이 데이터는 Tubulin mRNA가 활발하게 번역되고 있음을 시사합니다.

그것은 주로 무겁고 가벼운 폴리솜과 관련이 있었기 때문입니다. Sherp mRNA의 번역은 덜 활성입니다. 그것은 주로 pre-polysomes 및 light polysomes와 관련하여 발견되었습니다.

따라서 이 실험은 번역에서 개별 mRNA 참여를 연구하는 기술의 능력을 명확하게 보여줍니다. 이 그림은 HeLa 세포 폴리솜 분별의 일반적인 흡광도 그래프를 보여줍니다. 단백질은 10% 트리클로로아세트산으로 침전에 의해 농축되었습니다.

작은 소단위인 리보솜 단백질 RPS6과 큰 소단위인 리보솜 단백질 RPL11이 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다. 그들의 분포는 흡광도 스펙트럼에서 뚜렷한 피크와 잘 상관관계가 있었습니다. 이 그림에서는 마우스 고환에서 분획된 폴리솜에서 전기영동에 의한 리보솜 RNA의 검출 예를 제시합니다. 결론.

다염색체 프로파일링은 개별 mRNA의 번역 상태를 분석하고, 리보솜 관련 단백질을 검사하고, 다양한 조건에서 다른 모델 유기체의 번역 조절을 연구하는 데 사용할 수 있는 다목적 기술입니다.