후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

이 방법은 인유두종 바이러스를 포함한 질병 결과와 관련된 유전자 마커를 검출하는 것과 같은 임상 진단 및 유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비용 효율적이고 표적화되며 시간 효율적인 진단 방법이라는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 주문한 동결건조된 프라이머를 분자 등급의 물로 재구성합니다.

각 multiplexed assay에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 스톡 프라이머 혼합물로 당겨 각 프라이머가 0점 5밀리몰 농도로 포함되도록 합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 이 혼합물 4마이크로리터를 384웰 PCR 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 마이크로리터당 5-10나노그램 농도의 게놈 DNA 1마이크로리터를 추가합니다.

플레이트를 플레이트 커버로 덮고 실온에서 1분간 200회 G로 원심분리합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 1마이크로리터의 PCR 산물과 3마이크로리터의 로딩 버퍼를 2%아가로스 겔에 로드합니다.

DNA 증폭이 성공적이었는지 확인하기 위해 100볼트에서 45분 동안 실행합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SAP 마스터 믹스를 준비합니다. 갓 만든 SAP 마스터 믹스 2마이크로리터를 이전에 실행된 PCR 플레이트의 각 웰에 추가합니다.

1, 000 번 G에서 1 분 동안 간단히 원심 분리기. 그런 다음 플레이트를 thermocycler로 되돌립니다. 써모사이클러를 섭씨 37도에서 40분 동안 작동시킵니다.

그런 다음 섭씨 85도에서 5분 동안 효소를 비활성화합니다. 각 프라이머의 희석 계수를 계산한 후, 각각의 결정된 부피를 결합하여 프라이머 풀을 구성합니다. 이 수영장을 희석하기 위해 필요에 따라 물을 추가하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 high plex assay 또는 low plex assay에 대한 확장 마스터 믹스를 조립합니다. 플레이트의 각 웰에 2마이크로리터의 확장 마스터 믹스를 추가하여 각 웰의 총 부피를 최대 9마이크로리터까지 가져옵니다. 1, 1 분 동안 000 시간 G에 짧게 분리기를 꼽고, thermocycler에 그 후에 판을 돌려보내십시오.

그런 다음 각 우물에 16마이크로리터의 탈이온수를 추가하여 우물당 총 부피를 최대 25마이크로리터로 만듭니다. 전체 딤플 수지 플레이트에 6mg의 수지를 골고루 바르십시오. 수지를 실온에서 20분 동안 건조시킵니다.

그런 다음 수지를 반응판에 도포합니다. 서스펜션 믹서를 사용하여 실온에서 5분 동안 저속으로 플레이트를 회전시킵니다. 다음으로, 질량 스펙트럼 칩에 수지가 적용되지 않도록 3, 200 회 G에서 5 분 동안 플레이트를 원심 분리하십시오.

플레이트의 샘플 레이아웃을 시스템의 소프트웨어 인터페이스에 업로드합니다. 디스펜싱 시스템을 사용하여 플레이트의 유전형 분석 물질 혼합물을 유전형 분석 칩에 적용합니다. 칩을 MALDI-TOF 시스템에 로드하여 분석물 혼합물에서 질량 스펙트럼을 생성하고 플랫폼의 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 이를 해석합니다.

이 연구에서는 질량 분석법을 사용하여 다중 유전형 분석을 수행합니다. 식품 알레르기에 대한 표현형 임상 코호트에서 후보 유전자 IL13에 대한 대표 SNP 데이터가 생성되고 분석됩니다. 한 가지 변형인 rs1295686은 챌린지에서 입증된 식품 알레르기와 관련이 있습니다.

이는 이 프로토콜에서 입증된 다중 유전형 분석 접근법을 사용하여 복제 코호트에서 연관성이 확인됩니다. 두 코호트의 결과에 대한 메타 분석은 IL13과 FA 사이의 연관성에 대한 강력한 증거를 제공합니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플이나 시약을 오염시키지 않는 것이 중요합니다. 또한 파이펫팅 오류를 설명하기 위해 각 PCR에 대해 추가로 10%의 마스터 믹스를 준비하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 유전자 발현이 확인된 질병 관련 유전자 마커와 상관관계가 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 Real-Time PCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 임상 진단 및 유전학 분야의 연구자들이 환자 코호트의 질병 연관성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 유전형 분석 시약과 MALDI-TOF 시스템으로 작업할 때 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때 항상 장갑과 실험실 가운을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.