Name: 후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 학습하세요 다중화 유전형 분석법을 이용한 후보 유전자 질량 분석 기술로 임상 코호트에서 질병 관련 유전 마커를 효율적으로 검출하는 방법을 배우세요.

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저자 아무 승인 있다.

<ol><li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 다중화 된 유전형 질량 분석을 사용 하 여 방법을 설명 합니다. 대표 결과 MALDI TOF 질량 분석4 분석 결과 화학 재료의 표13에 나열와 결합 하는 PCR를 사용 하 여 생성 되었다. 이 플랫폼으로 실험실에서 총 1,255 개인 40 h 이내 9 Snp에 대 한 11,295 genotypes 생성 했습니다.
우리는 생성 SNP 후보 유전자 IL13 발견 임상 코 호트 독립 복제와 음식 알레르기에 대 한 phenotyped에 대 한 데이터를 분석 하 여 유전자 가설에 기술의 유용성을 설명 합니다. 플랫폼은 DNA 품질 낮은 상대적으로 강력 하며 최소한의 시작 소재, 10의 입력 ng. 프로토콜의 중요 한 단계는 다음과 같습니다: 조심 최대한 SNP 포함 다중화 분석 실험에서 증폭 PCR, 성공적인 단일 동안 대상 지역의 성공적인 증폭 되...

인간의 복잡 한 질병에 유전 이체 질병 민감성에 기여 하 고 이러한 변형 측정 이해 병 인, 고 위험 환자 그룹, 및 치료 조치를 식별 하는 데 유용 있을 수 있습니다. 실제로, 정밀 의학의 약속은 환자 서브 그룹1을 식별 하는 게놈 정보를 이용 하 여 의존 합니다. 불행히도, 공간 내에 복잡 한 질병 생물학, 어디 질병 고기 상당한 유전이 성분, 낮은 penetrance, 가변 표현력에 의해 underpinned 아 르, 일대 소설 식별을 게놈 넓은 접근에 대 한 요구 사항 크기 후보 들은 엄청나게 큰2입니다. 또한, 대상된 후보 유전자 접근 질병 병 인3특정 유전자/경로 대 한 선험적 가설으로 시작합니다. 경로 분석 도구 일반적으로 탐구 될 수많은 후보 경로 생성 한 확인된 대상 loci의 이상 조사 하는 데 사용 됩니다. 여기 다중화 유전형 접근 인간의 코 호트 연구4에 적합 한 분석 결과 함께 Snp의 수백 수만의 조사에 대 한 수 있도록 설명 합니다. 이 방식은 상대적으로 높은 통해-넣어, 수백 수 소설 발견 연구에 대 한 genotyped DNA 샘플의 수천 및 특정 경로 조사를 허용 합니다. 여기에 설명 된 메서드는 유용 식별 위험 대립 유전자 및 임상 특성의 그들의 협회에 대 한 상대적으로 신속 하 고 저렴 한 방식으로 합니다. 이 플랫폼은 미생물 감염7 및 인간 유 두 종 바이러스8등에 대 한 검사 및 진단 목적5,6, 최근, 매우 유리한 되었습니다.
이 프로토콜은 조사, 즉유전자의 세트의 선택과 시작., 일반적으로 문학 검색, 또는 질병 과정;에 참여에 대 한 선험적 가설을 통해 결정 대상 지역 또는 아마도 검색 게놈 넓은 협회 (GWA) 연구의 주요한 연결으로 복제에 대 한 선택. 유전자 집합에서 연구원 태그 Snp의 세련 된 목록을 선택 합니다. 즉, 결합 불균형 (LD), 또는 지역에서 변종 사이 상호 관계는 haplotype 이라고 높은 LD에 Snp의 그룹에 대 한 대표 '태그 SNP' 식별 하 데 사용 됩니다. 지역의 높은 LD는 유전형 한 SNP는 haplotype에서 모든 Snp에 변화를 표현 하기 위해 충분 한 Snp는 함께 상속 자주는 것을 의미 합니다. 또는, 많은 지역, 예를 들어에서 Snp의 최종 목록에 다음과 같은 경우., GWA 연구에 대 한 복제,이 프로세스 해야 하지. 멀티플렉스 유전형 분석 결과 다음 설계 되어야 합니다 이러한 목표 주위는 증폭 뇌관 연장 뇌관의 질량 다른의 고 해석할 생산 제품 질량 스펙트럼. 이 매개 변수는 멀티플렉스 유전형 분석 결과 디자인 도구에 의해 쉽게 구현 됩니다. 이 디자인에서 앞으로 역 뇌관 관심의 마커를 대상 하는 SNP를 포함 하는 시퀀스를 증폭에 사용 됩니다. 확장 뇌관은 Snp에 직접 인접 연결 하 고 단일, 대량 수정, '터미네이터' 기반은 SNP에 보완을 추가 됩니다. 터미네이터 자료 추가 DNA의 확장을 방지합니다. 기지의 대량 수정 파편을 질량 분석에 의해 감지 되는 단일 자료에 의해 다른 수 있습니다. 유전형 화학을 포함 하는 접시 측정 질량 분석 플랫폼에 대 한 칩에 적용 됩니다. 시스템에 의해 감지 원시 유전형 호출에 적절 한 품질 제어를 적용 한 후 데이터는 수출 고 연관 질병 고기에 대 한 테스트에 통계 분석을 위해 사용 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>게놈 DNA&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>1 &뮤; L 농도 5-10 ng/&mu; L</td></tr><tr><td>Primers: 정방향 및 역방향 증폭 및 확장</td><td>IDT</td><td>-</td><td>프라이머 탈이온수 설계에 대한 원고 섹션 1.2.1 참조</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>예: Milli-Q 물&nbsp;</td><td>-</td><td>18.2 M&Omega로 탈이온화됨;. cm 저항성</td></tr><tr><td>유전형 분석 시약 키트. iPLEX Gold Chemistry 시약 세트&nbsp;</td><td>Agena Bioscience</td><td>#10148-2</td>는 <td>2.2.1, 2.3.1 및 2.4.2, 칩 및 수지</td></tr><tr><td>PCR 플레이트 (384-well)</td><td>Abgene</td><td>#ABGAB-1384</td>에서의 반응을 위한 모든 시약을 포함하고 있습니다. <td>Abgene의 MassARRAY 시스템 플레이트에는 호환 가능한</td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td></td><td></td><td>단일 및 8-채널</td></tr><tr><td>원심분리기가 있습니다.</td><td></td><td></td><td>384-웰 플레이트와 호환</td></tr><tr><td>가능 Thermocycler</td><td></td><td></td>는 <td>2.2.4, 2.3.2 및 2.4.3에 자세히 설명된 PCR 프로그램과 호환됩니다</td></tr>. <tr><td>딤플 레진 플레이트&nbsp;</td><td>Agena Bioscience</td><td></td><td>6mg, 384웰</td></tr><tr><td>플레이트 로테이터&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassARRAY 분석기 4 시스템</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>MALDI-TOF(매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 &ndash; 비행 시간) 질량 분석기.</td></tr><tr><td>RS1000 나노 디스펜서</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분석 디자인 스위트</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>도구는 다중 유전형 분석 분석을 설계하는 데 사용됩니다</td></tr>. 핫 <tr><td>스타트 Taq</td><td></td><td></td><td>DNA 중합효소 효소&nbsp;</td></tr><tr><td>수지&nbsp;</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>iPLEX 키트와 함께 제공</td></tr></tbody></table>

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

복잡 한 질병 종종 질병 민감성에 기여 하는 여러 일반적인 유전자 변종에 의해 underpinned 아 르. 여기, 우리는 질량 분석, 있는 멀티플렉스 유전형 분석 결과 사용 하 여 임상 동료에 있는 유전자 통로 협회 조사 비용 효율적인 태그 단일 염기 다형성 (SNP) 접근을 설명 합니다. 우리는 예를 들어 음식 알레르기 후보 소재 시 Interleukin13 (IL13)를 조사합니다. 이 메서드는 효율적으로 지역 내의 공유 결합 불균형 (LD)을 이용 하 여 범위를 최대화 합니다. 선택 된 LD Snp는 다음에 설계 다중화 분석 결과 40 다른 Snp 동시에 분석할 수 있도록 비용 효율성을 향상. 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 확장명 대상 loci를 증폭 하는 사용 되 고 있는 amplicons 다음 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 flight(MALDI-TOF) 질량 분석을 사용 하 여 측정 됩니다. 원시 출력 소프트웨어, 엄격한 품질 관리 정 및 컷-오프를 사용 하 여 호출 하는 유전자 형을 분석 하 고 높은 확률 genotypes 되 고 데이터 분석에 대 한 출력.

위에서 설명한 프로토콜, genotyped 우리는 Th2 면역 유전자 IL13 의 음식 알레르기의 경우 및 컨트롤9일대에 걸쳐 Snp를 태그. 우리 음식 알레르기 위험을 증가 하는 관심의 영역 내에 유전자 변형 여부를 테스트 하는 조상과 다른 잠재적인 covariates에 대 한 조정 하는 로지스틱 회귀 분석을 적용. 표 10 9 한 변형 rs1295686 도전 입증 된 음식 알레르기와 관련 된 우리는 동일을 사용 하 여 복제 일대에이 협회 다중화 유전형 접근 확인 보여줍니다. 메타 분석 결과에서 두 동료의 FA (표 11)9 IL13 의 협회의 강력한 증거를 제공합니다. 우리는 유전자 유추 하 고 가계는 가계 유익한 SNP 마커 패널 게시 패널<sup...

복잡 한 인간의 질병에 기여 하는 유전 이체의 소설 메커니즘을 식별 수 있습니다. 여기, 후보 유전자 또는 유전자 통로 분석 낮은 비용 범위를 극대화 하 고 코 호트 기반 연구 의무가 멀티플렉스 유전형 접근 방식을 설명 합니다.

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

이 방법은 인유두종 바이러스를 포함한 질병 결과와 관련된 유전자 마커를 검출하는 것과 같은 임상 진단 및 유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비용 효율적이고 표적화되며 시간 효율적인 진단 방법이라는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 주문한 동결건조된 프라이머를 분자 등급의 물로 재구성합니다.각 multiplexed assay에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 스톡 프라이머 혼합물로 당겨 각 프라이머가 0점 5밀리몰 농도로 포함되도록 합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 이 혼합물 4마이크로리터를 384웰 PCR 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 마이크로리터당 5-10나노그램 농도의 게놈 DNA 1마이크로리터를 추가합니다.플레이트를 플레이트 커버로 덮고 실온에서 1분간 200회 G로 원심분리합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 1마이크로리터의 PCR 산물과 3마이크로리터의 로딩 버퍼를 2%아가로스 겔에 로드합니다.DNA 증폭이 성공적이었는지 확인하기 위해 100볼트에서 45분 동안 실행합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SAP 마스터 믹스를 준비합니다. 갓 만든 SAP 마스터 믹스 2마이크로리터를 이전에 실행된 PCR 플레이트의 각 웰에 추가합니다.1, 000 번 G에서 1 분 동안 간단히 원심 분리기. 그런 다음 플레이트를 thermocycler로 되돌립니다. 써모사이클러를 섭씨 37도에서 40분 동안 작동시킵니다.그런 다음 섭씨 85도에서 5분 동안 효소를 비활성화합니다. 각 프라이머의 희석 계수를 계산한 후, 각각의 결정된 부피를 결합하여 프라이머 풀을 구성합니다. 이 수영장을 희석하기 위해 필요에 따라 물을 추가하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 high plex assay 또는 low plex assay에 대한 확장 마스터 믹스를 조립합니다. 플레이트의 각 웰에 2마이크로리터의 확장 마스터 믹스를 추가하여 각 웰의 총 부피를 최대 9마이크로리터까지 가져옵니다. 1, 1 분 동안 000 시간 G에 짧게 분리기를 꼽고, thermocycler에 그 후에 판을 돌려보내십시오.그런 다음 각 우물에 16마이크로리터의 탈이온수를 추가하여 우물당 총 부피를 최대 25마이크로리터로 만듭니다. 전체 딤플 수지 플레이트에 6mg의 수지를 골고루 바르십시오. 수지를 실온에서

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

유전자 단체는 종종 기능 수준에서 설명할 남아있다. 이 방법은 베꼈는데 SNPs에 대한 heterozygous 세포를 분석하여 유전자 발현에 대한 표현형 - 관련 유전자 마커의 효과를 평가하는 것을 목표로하고있다. 이 기술은 allele 특정 뇌관 확장 제품을 수치 든 - TOF 질량 분석법에 의해 정확한 측정이 가능합니다.

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

프로토콜은 대규모 유전자형을 수행 Illumina 사 Infinium의 분석법을 사용하는 것이 기재되어있다. 이러한 분석은 안정적으로 사흘 만에 개인의 DNA 샘플의 수백에 걸쳐 수백만의 SNP 유전자형 수 있습니다. 일단 생성,이 유전자형이 다른 질병 또는 표현형의 다양한 연결을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

대규모 SNP 유전자형 응용 프로그램에 대한 Infinium 분석

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

아미노산 수준 신호-잡음 분석 주어진 인구의 유전 변이 배경으로 정규화는 주어진된 아미노산 위치에 유전 변이의 보급을 결정 합니다. 이 인구 (잡음)에 희소 한 이체의 주파수 이상으로 상승 하는 단백질 시퀀스 (신호) 내에서 변형 "핫스폿"의 확인에 대 한 수 있습니다.

유전 변이의 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용 하 여 Variant Pathogenicity의 가능성 확인

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

이 기사에서는 임상 고형 종양 샘플에서 종양 발생 유전자 융합을 평가하기 위해 차세대 염기서열 분석 뒤에 앵커된 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응 기반 라이브러리 준비 키트의 사용을 자세히 설명합니다. 습식 벤치 와 데이터 분석 단계가 모두 설명되어 있습니다.

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

이 프로토콜은 반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 이수성에 대한 이식 전 유전자 검사에 필요한 전체 실험실 내 절차를 제시합니다. 여기에서는 전체 게놈 증폭, DNA 단편 선택, 라이브러리 구축, 템플릿 준비 및 대표적인 결과와 함께 시퀀싱 작업 흐름의 자세한 단계를 제시합니다.

반도체 기반 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 Aneuploidy에 대한 이식 전 유전자 검사

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

학습하세요 다중화 유전형 분석법을 이용한 후보 유전자 질량 분석 기술로 임상 코호트에서 질병 관련 유전 마커를 효율적으로 검출하는 방법을 배우세요.

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

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