Name: 황색 포도상구균 Biofilm에 5-Aminolevulinic 산-중재 Photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 학습하세요 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 바이오필름에 대한 5-아미노레불린산(ALA) 매개 광역동 요법의 항균 효과를 평가하는 체외 실험 방법을. 이 프로토콜은 바이오필름 감염 치료를 위한 대안적 접근법으로 활용될 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 젊은 학자 (No. 81300810), 상하이 젊은 의사 훈련 프로그램 (No. 20141057), 및 자연 과학 재단의 중국 국가 (81671982, 81271791 및 81571955)에 대 한 자연 과학 재단의 중국 국가 의해 투자 되었다. 우리는이 원고 준비 기간 동안 언어 지원을 제공 하기 위한 LetPub (www.letpub.com)를 감사 하 고 싶습니다.

1. Biofilm 형성
<ol><li>
96-잘 microplates에 Biofilm 형성
	<ol>
<li>S. 구 균 긴장 USA300 및 3 biofilm 형성 임상 긴장 (C1-C3)-80 ° c.에 저장 된 검색 참고: 양식에 biofilms 결정 플레이트 분석 결과 의해 결정 되었다 임상 긴장의 능력15이전 설명.</li>
		<li>5 mL tryptone 콩 국물 (TSB) 매체에 박테리아를 접종 하 고 하룻밤 고정 단계를 37 ° C에서 흔들어와 인큐베이터에서 배양.</li>
		<li>원심 4000 x g 25 ° C에서 10 분에서 하룻밤 세균성 문화 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 알 약 2.0 x 10의 최종 농도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 resuspend9 CFU/mL. 참고:는 박테리아의 농도 광학 밀도 측정 하 여 예상 되었고 더 판에 의해 결정 수16을 포함 된 서 스 펜 션의 그 1 OD600 공개 1.5 x 108 CFU/mL.</li>
		<li>1: 200 세균 현 탁 액 희석 (1.0 x 107 CFU/mL)에 TSB 매체 0.5% 포도 당을 포함 하. 셀 문화 취급 하는 폴리스 티 렌 96 잘 microplate의 각 음에 세균 현 탁 액의 200 µ L을 접종.</li>
		<li>잘 산소 환경에서 24 h 동안 37 ° C에서 정적 microplate 품 어. 참고: 성숙한 biofilm 형성을 위한 보육 시간 따라 달라질 수 있습니다 다른 세균성 긴장; 이 PDT15실험 하기 전에 결정 되어야 합니다.</li>
		<li>우물에서 미디어를 삭제 하 고 PBS와 부드럽게 microplate 우물 세 번 세척 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 참고: 단계 실행 되어야 한다 밖으로 매우 부드럽게 형성된 된 biofilm을 방해 하지 않으려면.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
요리에 Biofilm 형성
	<ol>
<li>TSB 매체의 5 mL로 S. 구 균 긴장 USA300를 inoculate 하 고 고정 단계로 하룻밤 37 ° C에서 흔들어와 인큐베이터에서 배양.</li>
		<li>원심 4000 x g 25 ° C에서 10 분에서 하룻밤 세균성 문화 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 2.0 x 10의 최종 농도에 PBS에 산 탄을 resuspend9 CFU/mL. 다음, 1: 200 세균 현 탁 액 희석 (1.0 x 107 CFU/mL)에 TSB 매체 0.5% 포도 당을 포함 하. 35 m m 광학 품질 유리 아래 셀 문화 접시에, 세균 현 탁 액 2 mL를 접종 하 고 정적으로 24 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 참고:는 박테리아의 농도 광학 밀도 측정 하 여 추정 되었다.</li>
		<li>피 펫와 함께 미디어를 발음 하 고 린스는 biofilms에 부드럽게 PBS 가진 접시 3 번 후, 신중 하 게는 상쾌한을 삭제. 참고: 접시의 바닥에 피 펫 팁을 만지지 마십시오. 2.2 단계 형성된 된 biofilm의 건조를 방지 하기 위해이 단계 후에 즉시 수행 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 가벼운 방사선 조사
<ol><li>4 ° C 냉장고에 5-ALA를 저장 합니다. 실험을 하기 전에 10 m m PBS 가진 5-ALA 희석. 참고: 5-ALA 솔루션 준비 되어야 한다 갓 실험 전에.</li>
	<li>실험적인 그룹에 미 판 또는 문화 접시 2 mL의 각 음에 10mm ALA의 200 µ L를 추가 합니다. 커버 플레이트/접시 알루미늄 호 일, 그리고 1 시간에 품 어. 다음, 1 h 633 ± 10 nm17의 주요 파장에서 360 J/c m2 의 가벼운 복용량을 달성 하기 위한 100 mW/cm2 의 빛 강도 발광 다이오드 (LED)와 플레이트/접시를 비추는. 참고: 웰 스/요리의 모든 biofilm에 동등 하 게 효과적으로 배달할 빛 에너지를 하자, 6.0 cm에서 잘/요리 하는 광원의 절정에서 거리를 해결 하 고 중앙 조사 면적 (10 cm x 8을 실험 지역 제한 cm). 하려면 결과 재현성 실험 같은 실내 온도에서 수행 되어야 한다. LED 조사 단계에서 접시의 햇빛, 실내 조명 등 등불, 다른 광원에 직접 노출을 피하기 위해 LED는 방사선 조사 영역에 접시/접시를 이동 하기 전에 돌아서 빛 충분히 밝은 작업을 마무리 했다.</li>
	<li>제어 그룹 (3 개의 제어 그룹 설치 되었다 우리의 실험)을 설정 합니다.<ol>
<li>첫 번째 컨트롤에 대 한 그룹 (-LED-ALA)는 미 판 또는 문화 접시 2 mL 각 우물에 PBS의 200 µ L를 추가 합니다. 커버 플레이트/접시 알루미늄 호 일, 그리고 2 시간을 위해 그것을 품 어.</li>
		<li>두 번째 컨트롤 그룹에 대 한 (ALA + LED-), 각 잘은 미 판 또는 문화 접시 2 mL에 10 mM ALA의 200 µ L를 추가. 커버 플레이트/접시 알루미늄 호 일, 그리고 2 시간을 위해 그것을 품 어.</li>
		<li>세 번째 컨트롤 그룹에 대 한 (ALA-LED +), 각 잘은 미 판 또는 문화 접시 2 mL PBS의 200 µ L 추가. 커버 플레이트/접시 알루미늄 호 일, 그리고 1 시간에 품 어. 다음 접시 360 J/c m2 빛 주요 파장에서의 방사선 633 ± 10 nm17와 LED 노출 합니다. 참고: LED 조사 단계에서 접시의 햇빛, 실내 조명, 등불 등 다른 광원에 직접 노출을 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PDT 치료의 효과의 결정
참고: S. 구 균 biofilms에 PDT ALA의 효과 확인 하려면 또는 PDT ALA 없이 세포의 생존 생존 얼룩 뿐만 아니라 CFU 계산 하 여 평가 되었습니다.
<ol><li>
나머지 실행 가능한 박테리아 세포의 결정
	<ol>
<li>PDT ALA 치료 후 우물에서 미디어를 삭제 하 고 모두 실험에 대 한 모든 비 부착 한 세포를 제거 하 여 그룹 제어 PBS와 웰 스 세 번을 씻어. 참고:이 단계가 수행 되어야 합니다 밖으로 아주 부드럽게.</li>
		<li>피 펫 팁 우물에서 부착 박테리아 세포를 철저 하 게 긁 고 원뿔 튜브에 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>4 ° C에서 10 분 동안 4000 x g에서 세균 현 탁 액을 원심 다음 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>PBS에서 0.25 %pancreatin 효소의 1 mL에 박테리아 resuspend와 1.5 h 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>10 분;에 대 한 4000 x g에서 원심 상쾌한, 삭제 후 PBS의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>확인 1시 10분; PBS와 셀 솔루션의 직렬 희석 그런 다음, 5 µ L tryptone 콩 agar (TSA) 접시에 각 직렬 희석 샘플의 추가. 16 h; 37 ° C에서 TSA 격판덮개를 품 어 그런 다음, 수를 셀 (맨 눈)에 의해 세균성 식민지 (CFU/mL)의.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CLSM으로 S. 구 균 biofilms의 관찰
	<ol>
<li>가벼운 방사선 조사 후 PBS로 문화 접시에 있는 biofilms 세 번 씻어. 참고:이 단계가 수행 되어야 합니다 밖으로 아주 부드럽게.</li>
		<li>1 µ M 녹색 형광 핵은 prokaryotic 세포 막 (예, SYTO9) 하 고 1 µ M propidium 요오드 화물 (PI) 죽은 세포 뿐 아니라 biofilm 얼룩을 20 분의 1 mL 침투성 이다 염색체 얼룩의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>관찰 가능한 셀 (녹색 형광, 전 / Em 485 nm/530 nm) 및 죽은 세포 (빨간 형광, 전 / Em 485 nm/630nm)는 63 X 1.4 나 기름 침수 렌즈와 CLSM 아래.</li>
		<li>현미경 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 생성 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11257008">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).</li>
<li>Rabin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+mechanisms+and+targets+for+developing+antibiofilm+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents.</a> Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue-mediated+photodynamic+effects+on+staphylococcal+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).</li>
<li>Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effectiveness+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+%28APDT%29+using+a+660+nm+laser+and+malachite+green+dye+in+Staphylococcus+aureus+biofilms+arranged+on+compact+and+cancellous+bone+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens.</a> Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+using+a+660+nm+laser+and+methyline+blue+dye+for+inactivating+Staphylococcus+aureus+biofilms+in+compact+and+cancellous+bones%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+Photodyn+Ther%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study.</a> Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+effect+of+sinoporphyrin+sodium+photodynamic+therapy+on+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures.</a> Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).</li>
<li>Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+by+disruptive+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies.</a> Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).</li>
<li>Baltazar, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+photodynamic+therapy%3A+an+effective+alternative+approach+to+control+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections.</a> Front Microbiol. 6, 202(2015).</li>
<li>Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+novel+approaches+for+control+of+dental+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Current and novel approaches for control of dental biofilm.</a> Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).</li>
<li>De Sordi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Photodynamic+Antimicrobial+Chemotherapy+%28PACT%29+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile.</a> PLoS One. 10 (8), e0135039(2015).</li>
<li>Harris, F., Pierpoint, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+based+on+5-aminolevulinic+acid+and+its+use+as+an+antimicrobial+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent.</a> Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).</li>
<li>Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antifungal photodynamic therapy.</a> Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).</li>
<li>Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+Candida+albicans+biofilms%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+Photodyn+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study.</a> Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).</li>
<li>Zhang, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-aminolevulinic+acid-mediated+photodynamic+therapy+and+its+strain-dependent+combined+effect+with+antibiotics+on+Staphylococcus+aureus+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm.</a> PLoS One. 12 (3), 0174627(2017).</li>
<li>Chang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single+cell+detection+of+Staphylococcus+aureus+by+aptamer-conjugated+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles.</a> Sci Rep. 3, 1863(2013).</li>
<li>Barra, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+and+Antibiotic+Therapy+in+Combination+to+Fight+Biofilms+and+Resistant+Surface+Bacterial+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections.</a> Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).</li>
<li>St Denis, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+you+need+is+light%3A+antimicrobial+photoinactivation+as+an+evolving+and+emerging+discovery+strategy+against+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease.</a> Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).</li>
<li>O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+bacteria+in+multi-species+biofilms+can+be+killed+by+red+light+in+the+presence+of+toluidine+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue.</a> Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-aminolevulinic+acid-mediated+photodynamic+therapy+on+antibiotic-resistant+staphylococcal+biofilm%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study.</a> J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Elias, S., Banin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-species+biofilms%3A+living+with+friendly+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Multi-species biofilms: living with friendly neighbors.</a> FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Proof+of+Programmed+5-Aminolevulinic+Acid+Prodrug+Nanocarriers+for+Targeted+Photodynamic+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).</li>
</ol>

저자 공개할 게 없다

초 암 치료에 대 한 잘 공부 치료 이후 100 여 년 전 발명 했다18. 지난 10 년간 초 항균 전략으로 적용 하 고12일부 항생제 내성 병원 성 박테리아 대 한 효과 보이고 있다. Planktonic 상태에 비해 박테리아 biofilms biofilms에 PDT ALA의 효과 없습니다 되어 완전히 아직 조사 하는 동안 항생제 치료3, 더 강한 것 처럼.
이 문서에서는, 생체 외에서 PDT ALA 시스템 설명 했다, 그리고 미 균 biofilms에이 모델의 항균 효과 입증 되었다. 두 방법은이 프로토콜에서 미 균 biofilms에 PDT ALA의 효과 테스트 하 사용 되었다. CFU 테스트 실행 가능한 세포 치료 후 계산 하 여 항균 효과 시연 하는 동안 CLSM과 얼룩이 지기 형광 생존 CFU 테스트...

S. 구 균 은 피부와 점 막의 인간의 호스트 colonizes는 중요 한 그람 양성 병원 체 이다. 양식 biofilms 능력 그것의 병 인1의 중요 한 측면으로 간주 됩니다. 박테리아 biofilms는 박테리아 세포 외 고분자 물질, 다 당 류, 단백질, DNA 등의 구성 되는 자체 제작된 매트릭스에 포함 된의 커뮤니티입니다. 이 행렬은 인간의 면역 체계와 현재 항균 요법2의 높은 수준에 기여 하는 세균성 감염의 지 속성에 중요 한 역할을 한다. 항생제는 여전히 biofilm 감염에 대 한 주요 치료 biofilms에 항생제의 효과 제한. 그것은 표시 되었습니다 이전 biofilms에 셀 10-1000 배 더 그들의 planktonic 대응3에 비해 항생제에 저항력이 있다. 따라서,이 문제를 정복 하기 위해 대체 전략 필요 합니다.
PDT, 세균 감염에 대 한 대안 치료는 적절 한 파장의 빛을 사용 하 여 photosensitizers를 활성화. 세포 벽을 방해, 효소, 비활성화 및 손상 DNA4대상 세포에 치명적인는 반응성 산소 종 (선생님)의 생산을이 끈다. 이 다중 대상 특성 PDT 치료에 저항을 개발 하는 박테리아에 대 한 어려운 있습니다.
이전 보고서5,6,에서에서 공부 하고있다 톨루이 블루 등 여러 photosensitizers와 세균과 곰 팡이 biofilms, 말라 카이트 그린, 메 틸 렌 블루, 염소 e6 및 porphyrins, PDT의 항균 효과 7,,89,10,11,,1213. 5-ALA, 실제 photosensitizer PpIX, prodrug 작은 분자량 및 신속한 허가12,14에 의해 특징입니다. 이러한 장점은 치료 응용 프로그램으로 PDT ALA 주요 잠재력을 제공합니다. Planktonic 박테리아에 PDT ALA의 효과 많은 그룹12공부 하고있다, 비록 박테리아 biofilms에 PDT ALA의 항균 효과 하지 아직 고 해명 했습니다. 한편, 이전 연구 사이 결과 비교 하기가 어렵습니다. 이유 중 하나는 다양 한 그룹에서 다른 프로토콜을 사용 하는. 따라서,이 프로토콜 이전 작업15에 따라 PDT ALA 시스템의 생체 외에서 모델을 설명 합니다. 이 모델의 효과 CFU 계산 및 생존 CLSM과 얼룩에 의해 확인 되었다.

<table><tbody><tr><td>Tryptone Soya Broth (TSB)</td><td>OXOID</td><td>CM0129B</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone Soya Agar (TSA)</td><td>OXOID</td><td>CM0131</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7012</td><td>The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits&nbsp;</td></tr><tr><td>Propidium iodide (PI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7012</td><td>The LIVE/DEAD BacLight 세균 생존 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>Pancreatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3292</td><td></td></tr><tr><td>5-aminolevulinic acid (ALA)</td><td>Fudan Zhangjiang Bio-Pharm</td><td>3.1</td><td></td></tr><tr><td>포도상구균 아우레우스 균주 USA300</td><td>/</td><td>/</td><td>The source of USA 300 참고 문헌 " 테노버 FC, 괴링 RV. J 항균 화학체모. 2009 년 9 월; 64(3):441-6"입니다.</td></tr><tr><td>황색포도상구균 임상 균주(C1-C3)</td><td>/</td><td>/</td><td>모든 임상 균주는 푸단대학교 안과 및 이비인후과 병원의 만성 비부비동염 환자로부터 분리되었습니다[Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].</td></tr><tr><td>96웰 마이크로플레이트</td><td>Corning Inc</td><td>3599</td><td>투명 평면 바닥 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트, 개별 포장, 뚜껑 포함, 멸균</td></tr><tr><td>Fluorodish</td><td>NEST Biotechnology</td><td>801001</td><td>유리 바닥, 비발열성</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge 5417</td><td>Eppendorf</td><td>Z365998 |&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MaxQ 4000 벤치탑 오비탈 쉐이커</td></tr><tr><td>발광 다이오드(LED)</td><td>Wuhan Yage, 광학 및 전자 기술, CO</td>, <td>LED-IB</td><td></td></tr>, <tr><td>Leica TCS SP8, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td>, <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Leica LAS AF 소프트웨어</td>, <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>IMARIS 소프트웨어</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

황색 포도상구균 biofilm에 5-aminolevulinic 산-중재 photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

황색 포도상구균 (S. 구 균)은 pyogenic 및 조직의 감염을 일으키는 원인이 되는 일반적인 인간 병원 체. S. 구 균 감염은 항생제-저항 하는 긴장의 출현 뿐만 아니라 양식 biofilms 능력 때문이 아니라 근절 어렵다. 최근, photodynamic 치료 (태평양 서머 타임) biofilm 감염을 제어 하기 위한 잠재적인 치료의 하나로 표시 되었습니다 했습니다. 그러나, 더 연구 해야 우리의 지식의 기본 메커니즘 뿐 아니라 박테리아 biofilms에 미치는 영향을 개선 합니다. 이 원고는 5-aminolevulinic 산 (5-ALA), 실제 photosensitizer protoporphyrin IX (PpIX)의 선구자 PDT의 에 체 외 모델을 설명합니다. 간단히, 성숙 미 균 biofilms ALA와 incubated 되었고 그 후 빛에 노출. 그 후, 미 균 biofilm에 PDT ALA의 항균 효과 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지를 계산 하 여 정량 되었고 생존 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM) 통해 얼룩이 지기 형광에 의해 시각. 대표 결과 미 균 biofilms에 PDT ALA의 강한 항균 효과 설명 했다. 이 프로토콜은 간단 하 고 PDT ALA와 S. 구 균 biofilms의 치료 연구를 생체 외에서 모델을 개발 하기 위해 사용할 수 있습니다. 미래에, 그것은 또한 최소한의 조정으로 다른 세균성 긴장에 대 한 다른 photosensitizers를 이용 하 여 초 연구에서 참조할 수 수 있습니다.

biofilms에 있는 박테리아의 생존 컨트롤에 비해 PDT ALA 치료 후 감소 했다 (ALA-LED-, ALA + LED-, 그리고 살라-LED +) USA300에 3 개의 임상 변종 (그림 1).
CFU에서 결과 분석 결과 및 관찰 하는 항균 S. 구 균 biofilm에는 제자리에서USA300 biofilms에 PDT ALA의 효과 생존 얼룩과 CLSM으로 시각화 했다. 실용적이 고 죽은 세포는 각각 녹색과 적색 형광으로 얼룩진 했다. 이미지는 biofilms에 있는 박테리아의 대부분 이었던 CFU 분석 결과 (그림 2)의 결과와 일치를 살라-PDT에 의해 사망 했다는 것을 보여주었다.
<p class="jove_...

이 원고는 황색 포도상구균 biofilm에 5-aminolevulinic 산-중재 photodynamic 치료 (PDT ALA)의 항균 효과 연구 하는 프로토콜을 설명 합니다. 미래에 PDT와 박테리아 biofilms의 치료 연구를 생체 외에서 모델을 개발 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

황색 포도상구균 Biofilm에 5-Aminolevulinic 산-중재 Photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

이 실험의 전반적인 목표는 황색포도상구균 생물막에 대한 5-아미노레불린산 또는 ALA 매개 광역학 요법의 항균 효과를 평가하는 것입니다. 이 방법은 광역학적 세포 복구가 생물막 감염을 제어하기 위한 대체 치료법으로 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 박테리아 생물막 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 절차의 장점은 최소한의 조정으로 다른 박테리아에 사용할 수 있다는 것입니다.96웰 플레이트에서 생물막을 생성하기 위해 먼저 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5밀리리터의 트립톤 소야 육수 또는 TSB(배지)가 들어 있는 개별 14ml 둥근 바닥 튜브에서 임상 균주 배양을 형성하는 3개의 생물막에 섭씨 영하 80도의 ThOD 포도상구균 USA 300을 접종합니다. 배양액이 고정상에 도달하면 박테리아 세포를 원심 분리하고 펠릿과 PBS를 밀리리터 농도당 9번째 집락 형성 단위의 2배 10으로 다시 현탁시킵니다. 이러한 박테리아 현탁액을 1:200 비율로 희석하고 0 포인트 5% 포도당이 보충된 TSB 배지와 폴리스티렌 세포 배양 처리된 96웰 마이크로플레이트에서 웰당 균주당 3개의 웰에 200마이크로리터의 박테리아 세포를 시딩하여 섭씨 37도에서 산소와 함께 24시간 배양합니다. 흔들리지 않고.다음날, 생물막을 방해하지 않고 PBS로 웰을 세 번 부드럽게 씻습니다. 다음으로, 갓 준비한 ALA 200마이크로리터를 적절한 실험용 웰에 넣고 플레이트를 섭씨 25도에서 1시간 동안 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 1시간 동안 평방 센티미터당 100밀리와트의 광도에서 발광 다이오드를 플레이트에 조사합니다.그룹당 생존 가능한 박테리아의 수를 세려면 광선 요법 치료가 끝날 때 PBS로 각 웰을 세 번 부드럽게 씻어 부착되지 않는 세포를 제거합니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 각 웰의 바닥에서 부착 박테리아를 긁어냅니다. 실험 조건별로 각 그룹의 세포를 하나의 eppendorf tube로 끌어당기고 원심분리를 통해 세포를 펠릿화합니다.펠릿을 0.25% 판크레아틴 효소와 PBS 1ml에 다시 현탁시켜 섭씨 37도에서 90분 동안 배양한 다음 다시 원심분리합니다. 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시키고 각 그룹을 1-10회 연속 희석하여 연속 희석된 시료 5마이크로리터를 개별 트립톤 대두 한천 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 16시간 동안 플레이트를 배양하고 그룹당 박테리아 군집의 수를 계산합니다.컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 생물막을 평가하기 위해 시연된 바와 같이 생물막을 생성하고 조사합니다. 방사선 조사된 생물막을 PBS로 세척하고 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 1ml의 녹색 형광 핵 및 염색체 원핵 세포막 투과성 염료와 1ml의 1마이크로몰 프로피듐 요오드화물로 염색합니다. 20분 후, 과도한 얼룩을 제거하고 63배 1.4 NA 오일 이멀젼 대물 렌즈 아래에서 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 생물막을 이미지화합니다.알파 리포산 광선 요법 이중 치료 후 생물막 박테리아 생존율은 대조군-단일 또는 비치료 생물막 박테리아 생존율 및 테스트된 4가지 균주 모두에 비해 감소합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에 의한 생물막의 시각화는 이 발견을 확인하며, 대부분의 세포는 프로피듐 요오드화물에 대해 양성으로 서 있는 ALA 광선 요법 이중 치료 그룹에서 관찰되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 전체 ALA 처리된 박테리아 조작은 어둠 속에서 수행되어야 하며 형성된 생물막을 방해하지 않도록 재료 생물막을 부드럽게 다루어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 메시지는 세균 감염 분야의 연구자들이 체외 박테리아 생물막에 대한 광역학 요법의 항균 효과를 탐구하는 데 적용될 수 있습니다.

an-vitro-model-to-study-effect-5-aminolevulinic-acid-mediated

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: 자오, K. 외 5-아미놀레불린산 매개 광역학 치료가 황색포도상구균 바이오필름에 미치는 영향을 연구하기 위한 시험관 내 모델. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 그람 양성 박테리아 바이오필름에 대한 항균 효과를 평가하는 광역학 치료 프로토콜을 시연합니다. 바이오필름은 네 그룹으로 나뉩니다: 두 그룹은 광감성 전구체를, 두 그룹은 완충제를 받습니다. 모든 종은 어두운 환경에서 배양되며, 이후 전구체 처리된 그룹과 완충 단독 그룹에 적색광 노출을 합니다. 반응성 산소 종은 전구체와 빛을 모두 받는 그룹에서만 생성되어 박테리아 세포 사멸을 초래합니다. 치료 효능을 평가하기 위해 모든 그룹에서 생존 가능성을 비교합니다.

광감감제 전구체를 이용한 박테리아 바이오필름의 광 활성화 처리

이 비디오에서는 폴리-L-라이신으로 코팅된 멀티웰 플레이트에서 S. aureus에 의한 체외 생물막의 준비를 보여줍니다. 생물막 형성된 플레이트는 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 체외 생물막 합성(In vitro Biofilm Synthesis)

다제내성(MDR) 박테리아 균주에 의한 감염은 공중 보건에 대한 심각한 위협으로 부상하여 대체 치료제의 개발을 필요로 하고 있습니다. 생물발광 영상을 사용하여 마우스 화상에서 MDR Acinetobacter baumannii 감염에 대한 항균 블루라이트(aBL) 요법의 효과를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

다제 내성 항 감염 블루 라이트 치료의 생체 조사에서 아시네 토 박터 바우 마니는 생물 발광 영상을 사용하여 감염을 굽기

여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

Photodynamic 치료 (PDT)는 것 적용된 photosensitizer (PS) 뒤에 보이는 빛 photoactivation apoptosis 유도 보육 관련 의료 절차입니다. 우리는 생체 외에서 PDT 프로토콜 PS 인큐베이션 및 가벼운 치료 매개 변수는 차이 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 태평양 표준시를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 제시.

Photodynamic 치료 체 외에서 접근

녹농균 생물막 구조에 대한 항균 유도 변화는 낭포성 섬유증 및 만성 폐 감염 환자로부터 배양한 임상 분리물 간에 다릅니다. 컨포칼 현미경 검사 후 COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 항감염제의 효능을 평가하기 위해 개별 분리체에 대한 생물막 구조(예: 표면적, 두께, 바이오매스)의 변화를 정량화할 수 있습니다.

COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 체외 생물막 아키텍처에 대한 항균제의 효과 정량화

이 워크플로우는 낭포성 섬유증을 가진 개별의 폐에 있는 세균성 생물막의 확립된 ex vivo 모형을 사용하여 항생제 감수성 시험을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 모델의 사용은 MBEC의 임상 타당성을 향상시킬 수 (최소한의 생물 막 박멸 농도) 에세이.

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

본 프로토콜은 광 조명 시스템을 사용한 투과 전자 현미경(TEM) 변형, 액체 세포의 제조 및 박테리아 세포와 감광제 간의 광 유도 상호작용에 대한 현장 TEM 관찰을 설명합니다. 샘플 준비 방법, 전자빔 손상 및 이미징에 대해서도 설명합니다.

액체-연질 물질 상호 작용 관찰을 위한 광 유도 현장 투과 전자 현미경

본 프로토콜은 호중구-생물막 상호작용의 연구를 기술한다. 황색포도상구 균 생물막은 시험관 내에서 확립되고 말초 혈액 유래 인간 호중구와 함께 배양됩니다. 호중구의 산화 파열 반응은 정량화되고 생물막 내의 호중구 국소화는 현미경으로 결정됩니다.

인간 호중구와 황색포도상구균 생물막 사이의 상호작용을 시각화하고 정량화하기 위한 표준화된 체외 분석

이 프로토콜은 LED 패널 광원과 결합된 96웰 플레이트 형식을 사용하여 항균 광역학 불활성화(aPDI)에서 잠재적인 광감작제의 효과를 평가하기 위한 간단하고 경제적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 다양한 농도, 화합물 및 박테리아 균주를 포함한 여러 실험 조건을 동시에 테스트할 수 있습니다.

박테리아 광역학 불활성화에서 광활성 분자를 평가하기 위한 LED 기반 체외 스크리닝

학습하세요 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 바이오필름에 대한 5-아미노레불린산(ALA) 매개 광역동 요법의 항균 효과를 평가하는 체외 실험 방법을. 이 프로토콜은 바이오필름 감염 치료를 위한 대안적 접근법으로 활용될 수 있습니다.

황색 포도상구균 Biofilm에 5-Aminolevulinic 산-중재 Photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델

더 많은 동영상 탐색