황색 포도상구균 Biofilm에 5-Aminolevulinic 산-중재 Photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델
2018년 4월 16일
이 원고는 황색 포도상구균 biofilm에 5-aminolevulinic 산-중재 photodynamic 치료 (PDT ALA)의 항균 효과 연구 하는 프로토콜을 설명 합니다. 미래에 PDT와 박테리아 biofilms의 치료 연구를 생체 외에서 모델을 개발 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
이 실험의 전반적인 목표는 황색포도상구균 생물막에 대한 5-아미노레불린산 또는 ALA 매개 광역학 요법의 항균 효과를 평가하는 것입니다. 이 방법은 광역학적 세포 복구가 생물막 감염을 제어하기 위한 대체 치료법으로 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 박테리아 생물막 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 절차의 장점은 최소한의 조정으로 다른 박테리아에 사용할 수
있다는 것입니다.96웰 플레이트에서 생물막을 생성하기 위해 먼저 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5밀리리터의 트립톤 소야 육수 또는 TSB(배지)가 들어 있는 개별 14ml 둥근 바닥 튜브에서 임상 균주 배양을 형성하는 3개의 생물막에 섭씨 영하 80도의 ThOD 포도상구균 USA 300을 접종합니다. 배양액이 고정상에 도달하면 박테리아 세포를 원심 분리하고 펠릿과 PBS를 밀리리터 농도당 9번째 집락 형성 단위의 2배 10으로 다시 현탁시킵니다. 이러한 박테리아 현탁액을 1:200 비율로 희석하고 0 포인트 5% 포도당이 보충된 TSB 배지와 폴리스티렌 세포 배양 처리된 96웰 마이크로플레이트에서 웰당 균주당 3개의 웰에 200마이크로리터의 박테리아 세포를 시딩하여 섭씨 37도에서 산소와 함께 24시간 배양합니다. 흔들리지 않고.
다음날, 생물막을 방해하지 않고 PBS로 웰을 세 번 부드럽게 씻습니다. 다음으로, 갓 준비한 ALA 200마이크로리터를 적절한 실험용 웰에 넣고 플레이트를 섭씨 25도에서 1시간 동안 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 1시간 동안 평방 센티미터당 100밀리와트의 광도에서 발광 다이오드를 플레이트에 조사합니다.
그룹당 생존 가능한 박테리아의 수를 세려면 광선 요법 치료가 끝날 때 PBS로 각 웰을 세 번 부드럽게 씻어 부착되지 않는 세포를 제거합니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 각 웰의 바닥에서 부착 박테리아를 긁어냅니다. 실험 조건별로 각 그룹의 세포를 하나의 eppendorf tube로 끌어당기고 원심분리를 통해 세포를 펠릿화합니다.
펠릿을 0.25% 판크레아틴 효소와 PBS 1ml에 다시 현탁시켜 섭씨 37도에서 90분 동안 배양한 다음 다시 원심분리합니다. 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시키고 각 그룹을 1-10회 연속 희석하여 연속 희석된 시료 5마이크로리터를 개별 트립톤 대두 한천 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 16시간 동안 플레이트를 배양하고 그룹당 박테리아 군집의 수를 계산합니다.
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 생물막을 평가하기 위해 시연된 바와 같이 생물막을 생성하고 조사합니다. 방사선 조사된 생물막을 PBS로 세척하고 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 1ml의 녹색 형광 핵 및 염색체 원핵 세포막 투과성 염료와 1ml의 1마이크로몰 프로피듐 요오드화물로 염색합니다. 20분 후, 과도한 얼룩을 제거하고 63배 1.4 NA 오일 이멀젼 대물 렌즈 아래에서 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 생물막을 이미지
화합니다.알파 리포산 광선 요법 이중 치료 후 생물막 박테리아 생존율은 대조군-단일 또는 비치료 생물막 박테리아 생존율 및 테스트된 4가지 균주 모두에 비해 감소합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에 의한 생물막의 시각화는 이 발견을 확인하며, 대부분의 세포는 프로피듐 요오드화물에 대해 양성으로 서 있는 ALA 광선 요법 이중 치료 그룹에서 관찰되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 전체 ALA 처리된 박테리아 조작은 어둠 속에서 수행되어야 하며 형성된 생물막을 방해하지 않도록 재료 생물막을 부드럽게 다루어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.
이 메시지는 세균 감염 분야의 연구자들이 체외 박테리아 생물막에 대한 광역학 요법의 항균 효과를 탐구하는 데 적용될 수 있습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
본 원고는 Staphylococcus aureus 바이오필름에 대한 5-aminolevulinic acid 매개 광역동 치료(ALA-PDT)의 항균 효과를 연구하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 바이오필름 감염 조절을 위한 대체 치료법과 관련하여 박테리아 바이오필름 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미생물학
- 광역동 치료
- 바이오필름 연구
배경
- Staphylococcus aureus는 바이오필름 감염과 관련된 흔한 병원균입니다.
- 광역동 치료(PDT)는 빛으로 활성화되는 화합물을 사용하여 박테리아를 제거하는 치료법입니다.
- 5-aminolevulinic acid(ALA)는 PDT에 사용되는 광감작제 합성의 전구체입니다.
- 본 연구의 목적은 박테리아 바이오필름에 대한 ALA-PDT를 테스트하기 위한 인 비트로(in vitro) 모델을 개발하는 것입니다.
연구 목적
- ALA 매개 PDT의 Staphylococcus aureus 바이오필름에 대한 항균 효과를 평가합니다.
- 바이오필름 감염의 대체 치료법으로서 PDT의 가능성을 탐구합니다.
- 다른 세균 균주에도 적용 가능한 프로토콜을 수립합니다.
사용된 방법
- 바이오필름 형성을 위해 tryptone soya broth (TSB)에 Staphylococcus aureus를 접종합니다.
- 배양액을 37 °C에서 배양하여 정지기에 도달하게 합니다.
- 세균 세포를 원심 분리한 후 PBS에 재부유합니다.
- PDT 처리를 위해 96-well 마이크로플레이트에 세균 세포를 분주합니다.
주요 결과
- 본 프로토콜은 ALA-PDT 테스트에 적합한 바이오필름을 성공적으로 생성합니다.
- ALA-PDT는 Staphylococcus aureus 바이오필름에 대해 잠재적인 항균 효과를 나타냈습니다.
- 이 방법은 최소한의 조정만으로 다른 박테리아 균주에도 적용할 수 있습니다.
- 치료 조건을 최적화하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
결론
- ALA-PDT는 세균 생체막 치료를 위한 유망한 접근 방식입니다.
- 본 연구는 광역학 치료의 향후 연구를 위한 토대를 제공합니다.
- PDT의 메커니즘을 이해하면 생체막 관련 감염에 대한 개선된 치료 전략을 수립할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 인비트로(in vitro) 모델은 항균제 개발의 증가하는 과제인 바이오필름 관련 감염에 대한 광역동 치료(PDT)의 기전적 평가를 가능하게 합니다. 군락 형성 단위(CFU)를 정량화하고 공초점 현미경을 통해 생존력을 시각화함으로써, 이 분석법은 발굴 초기 단계에서 PDT 후보 물질의 리스크를 줄일 수 있는 재현 가능하고 정량적인 판독 값을 제공합니다. 이 플랫폼은 항바이오필름 전략을 위한 표적 검증 및 리드 물질 식별을 지원하며, 특히 Staphylococcus aureus 및 기타 바이오필름 형성 병원균에 유용합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: CFU 감소 및 생존능 염색을 통해 S. aureus 바이오필름에 대한 ALA-PDT 효능의 치료 가설을 검증합니다.
- 운영적 가치: 제어된 바이오필름 모델에서 광감작제 활성화를 박테리아 사멸 메커니즘과 연결함으로써 기능적 표적 검증을 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 표준화된 조건에서 용량 및 시간 의존적인 항균 효과를 입증함으로써 전임상 단계의 진행 여부(go/no-go) 결정을 지원합니다.
스크리닝 및 어세이 개발
- 분석 준비도: 고처리량 PDT 화합물 스크리닝에 적합한 96-well 형식의 성숙하고 재현 가능한 S. aureus 바이오필름을 생성합니다.
- 정량적 결과: 화합물의 효능 및 바이오필름 투과도 평가를 위한 직교 판독 값으로 CFU 수치와 공초점 현미경 데이터를 제공합니다.
- 플랫폼 재사용성: 최소한의 프로토콜 조정으로 다른 박테리아 균주 및 광감작제에 적용 가능하여, 광범위한 항감염 스크리닝 응용이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 임상적으로 유의미한 S. aureus 바이오필름 감염을 모델링하여, in vitro 연구 결과와 PDT 기반 항감염제의 전임상 검증 사이의 가교 역할을 합니다.
- 기전적 리스크 감소: live/dead 염색을 통해 PDT 기전을 명확히 하여, 바이오필름 제거 경로의 모호성을 줄입니다.
- 중개 연구의 연속성: 여러 균주와 실험 반복 수행을 통해 재현 가능한 바이오필름 억제 데이터를 제공함으로써 후속 단계 진행 결정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 분석법은 타겟 검증부터 리드 최적화, 그리고 전임상 효능 시험에 이르는 항균제 발굴 연속 과정에 적합하며, 특히 바이오필름 표적 방식에 유용합니다.
- 발견 생물학: 생리학적으로 유의미한 모델에서 PDT로 유도된 바이오필름 붕괴 및 박테리아 생존력 상실의 기전적 가설을 검증합니다.
- 스크리닝: 항바이오필름 활성에 대한 광감각제 및 광량 매개변수의 표준화된 평가를 가능하게 합니다.
- 분석: 처리 조건을 비교하고 구조-활성 관계를 안내하기 위해 CFU 감소 및 형광 기반의 생존력 지표를 제공합니다.
- 중개 연구: 정량화 가능하고 재현 가능한 종말점을 통해 인비트로(in vitro) 바이오필름 억제를 전임상 효능 모델과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 병원균 표적 및 광감각제 화학형에 적용 가능한 모듈형 바이오필름 PDT 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 박테리아 사멸의 직접적인 시각화 및 정량화를 통해 PDT-바이오필름 상호작용의 메커니즘적 모호성을 감소시킵니다.
- 운영적 가치: 실험실 간 재현성을 위해 배양, 조사 및 판독 단계가 정의된 표준화된 차광 워크플로우를 제공합니다.
- 전략적 가치: 임상적으로 유의미한 바이오필름 모델에서 초기 효능 데이터를 제공함으로써 PDT 후보 물질의 진행 여부(go/no-go) 결정에 대한 신뢰도를 높입니다.
- 포트폴리오 영향: 바이오필름 침투 및 항균 활성이 입증된 화합물을 식별함으로써 PDT 프로그램의 위험 조정 우선순위 설정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 미생물학적 기법, 바이오필름 배양 및 광생물학적 안전 프로토콜에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 제어된 광노출 장비(예: LED 조사량계)와 CFU 및 이미지 판독을 위한 형광 현미경 또는 플레이트 리더가 필요합니다.
- 재현성을 보장하기 위해 실험군 간의 ALA 조제, 배양 시간 및 광전달의 표준화가 필수적입니다.
- 다른 세균 균주에 적용할 경우, 바이오필름 형성 조건과 광감각제 흡수 효율의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실질적 제한 사항: 바이오필름의 감수성은 성장 단계와 매트릭스 조성에 따라 다를 수 있으므로, 비교 연구를 위해 정밀한 대조군 설정이 필요합니다.
