황색 포도상구균 Biofilm에 5-Aminolevulinic 산-중재 Photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델

이 실험의 전반적인 목표는 황색포도상구균 생물막에 대한 5-아미노레불린산 또는 ALA 매개 광역학 요법의 항균 효과를 평가하는 것입니다. 이 방법은 광역학적 세포 복구가 생물막 감염을 제어하기 위한 대체 치료법으로 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 박테리아 생물막 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 절차의 장점은 최소한의 조정으로 다른 박테리아에 사용할 수

96웰 플레이트에서 생물막을 생성하기 위해 먼저 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5밀리리터의 트립톤 소야 육수 또는 TSB(배지)가 들어 있는 개별 14ml 둥근 바닥 튜브에서 임상 균주 배양을 형성하는 3개의 생물막에 섭씨 영하 80도의 ThOD 포도상구균 USA 300을 접종합니다. 배양액이 고정상에 도달하면 박테리아 세포를 원심 분리하고 펠릿과 PBS를 밀리리터 농도당 9번째 집락 형성 단위의 2배 10으로 다시 현탁시킵니다. 이러한 박테리아 현탁액을 1:200 비율로 희석하고 0 포인트 5% 포도당이 보충된 TSB 배지와 폴리스티렌 세포 배양 처리된 96웰 마이크로플레이트에서 웰당 균주당 3개의 웰에 200마이크로리터의 박테리아 세포를 시딩하여 섭씨 37도에서 산소와 함께 24시간 배양합니다. 흔들리지 않고.

다음날, 생물막을 방해하지 않고 PBS로 웰을 세 번 부드럽게 씻습니다. 다음으로, 갓 준비한 ALA 200마이크로리터를 적절한 실험용 웰에 넣고 플레이트를 섭씨 25도에서 1시간 동안 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 1시간 동안 평방 센티미터당 100밀리와트의 광도에서 발광 다이오드를 플레이트에 조사합니다.

그룹당 생존 가능한 박테리아의 수를 세려면 광선 요법 치료가 끝날 때 PBS로 각 웰을 세 번 부드럽게 씻어 부착되지 않는 세포를 제거합니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 각 웰의 바닥에서 부착 박테리아를 긁어냅니다. 실험 조건별로 각 그룹의 세포를 하나의 eppendorf tube로 끌어당기고 원심분리를 통해 세포를 펠릿화합니다.

펠릿을 0.25% 판크레아틴 효소와 PBS 1ml에 다시 현탁시켜 섭씨 37도에서 90분 동안 배양한 다음 다시 원심분리합니다. 펠릿을 200마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시키고 각 그룹을 1-10회 연속 희석하여 연속 희석된 시료 5마이크로리터를 개별 트립톤 대두 한천 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 16시간 동안 플레이트를 배양하고 그룹당 박테리아 군집의 수를 계산합니다.

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 생물막을 평가하기 위해 시연된 바와 같이 생물막을 생성하고 조사합니다. 방사선 조사된 생물막을 PBS로 세척하고 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 1ml의 녹색 형광 핵 및 염색체 원핵 세포막 투과성 염료와 1ml의 1마이크로몰 프로피듐 요오드화물로 염색합니다. 20분 후, 과도한 얼룩을 제거하고 63배 1.4 NA 오일 이멀젼 대물 렌즈 아래에서 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 생물막을 이미지

알파 리포산 광선 요법 이중 치료 후 생물막 박테리아 생존율은 대조군-단일 또는 비치료 생물막 박테리아 생존율 및 테스트된 4가지 균주 모두에 비해 감소합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에 의한 생물막의 시각화는 이 발견을 확인하며, 대부분의 세포는 프로피듐 요오드화물에 대해 양성으로 서 있는 ALA 광선 요법 이중 치료 그룹에서 관찰되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 전체 ALA 처리된 박테리아 조작은 어둠 속에서 수행되어야 하며 형성된 생물막을 방해하지 않도록 재료 생물막을 부드럽게 다루어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 메시지는 세균 감염 분야의 연구자들이 체외 박테리아 생물막에 대한 광역학 요법의 항균 효과를 탐구하는 데 적용될 수 있습니다.