Name: 감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용: (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 감자 뿌리 분비물에 대한 Bacillus mycoides의 전사체 반응 분석 방법을 통해 식물-미생물 상호작용 관련 유전자를 식별하는 기술입니다. 이 프로토콜은 다양한 내생균 연구에 활용 가능합니다.

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우리는 그의 도움이 의견 및 제안에 대 한 제이콥 재를 감사합니다. 우리는 또한 생물 정보학 분석에 그의 도움에 대 한 앤 데 종 감사합니다. Yanglei 이순신 Zhibo Li 중국 장학금 위원회 (CSC)에 의해 지원 됩니다. 우리 감사 NWO TTW Perspectief 전문 직원 Back2Roots (TKI-AF-15510) OPK에 그들의 재정 지원에 대 한.

1. 출 감자 멸 균된 조건에서
<ol><li>감자 표면 살 균 물으로 린스. 그리고 5 분 동안 3% 염소에 70% 에탄올에 감자를 목욕. 다시 모든 나머지 염소 제거 살 균 물으로 린스.</li>
	<li>출 아 하 고 감자 괴 경; 성장에 필요한 자료를 준비 플라스틱 냄비, engraftment 바구니, 질 석, 소독 하 고 20 분 동안 121 ° C에서 그들 압력가 마로 소독 하 여 물. 참고: 사용 되는 모든 재료 멸 인지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 다른 살 균 방법을 사용 합니다.</li>
	<li>표면 살 균 된 감자를 engraftment 바구니에 넣고 젖은 질 석 포함 하는 압력가 마로 소독 냄비에 배치.</li>
	<li>3 주 동안 24 ° C에서 기후 챔버에 냄비 유지. 빛 (120 µmol m-2의-1)와 어둠의 8 h 16 h의 사이클에 그것을 설정 합니다. 미생물 오염을 방지 하려면 냄비를 커버 하는 대형 유리 섬유 상자를 사용 합니다.</li>
</ol>2. 감자 루트 Exudates 수집
<ol><li>새싹 새싹, 전송 압력가 이온된 물 150 mL 소독된 비 커에 전체 감자 바구니 가득 때 감자와 함께 물 표면과 뿌리 바로 위에 배치 tubers는 물에 잠긴 ( 그림 1참조). 기후 챔버에는 종묘를 유지 하 고 동일한 설정을 사용 하기 전에 [24 ° C, 16 h 빛 (120 µmol m-2의-1), 8h 어둠의의].</li>
	<li>두 번째 날부터 exudates를 포함 하는 물을 수집 하 고 살 균 이온을 제거 된 물으로 비 커를 리필. 샘플링을 수행 매일 묘 종 전송 후 7 일까지.</li>
	<li>4 ° c.에서 별도로 각 샘플 저장 각 샘플에 대 한 확산에 Luria Bertani 100 µ L (파운드, 1 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 0.5 %NaCl) 천 배지 미생물 오염에 대 한 확인. 오염 된 샘플을 삭제 합니다.</li>
	<li>1 종묘의 수집 된 샘플을 결합 하 고-40 ° C ~ 150 mL의 최종 볼륨에서 그들을 freeze-drying에 의해 그들을 집중.</li>
</ol>3. 성장 하는 박테리아
<ol><li>B. mycoides 스트레인 파운드 한 천 격판덮개에-80 ° C 글리세롤 재고에서 행진 하 고 하룻밤 30 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>접시에서 단일 식민지와 파운드 액체 매체를 접종 하 고 하룻밤 30 ° c.에서 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 문화를 성장</li>
</ol>4. 치료 및 박테리아의 샘플링
<ol><li>루트 exudates 부정적인 제어를 치료 하는 박테리아의 성장 곡선 비교를 파운드 액체 매체의 50 mL를 포함 하는 플라스 크의 시리즈를 준비 합니다. 모든 플라스 크에 하룻밤 세균성 문화의 0.5 mL을 추가 하 고 중간, 0%, 5%, 10% 또는 15% (v/v) 루트 exudate 또는 살 균 이온된 수를 각각 추가.</li>
	<li>루트 exudates 대신 이온 물 문화를 사용 하 여 컨트롤. 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 마다 1 시간 이후에. 시간 대 세600 값을 그려서 성장 곡선을 생성 합니다. 참고: 우리는 루트 exudates의 10% B. mycoides 의 성장에는 영향을 미치지 않았다 보았다 ( 그림 2참조). 이 비율은 RNA-seq 실험을 위해 사용 되었다.</li>
	<li>희석의 초기 세600 미리 따뜻하게 파운드 매체의 90 mL와 함께 하룻밤 B. mycoides 문화 ~ 300 mL 플라스 크에 0.05. 문화에 루트 exudates의 10 mL를 추가 하 고 1 시간에 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>10 mL 살 균 이온된 수 치료를 사용 하 여 컨트롤. 4 ° c.에 2 분 동안 9000 x g에서 원심 분리 하 여 문화에서 세포를 수집 상쾌한, 삭제 즉시 액체 질소에는 펠 릿을 동결 다음 사용까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.</li>
</ol>5. RNA 격리
참고: 시작 하기 전에 격리, 작업 대, 선반, 및 펫 정리 하 여 준비 그들 RNase 오염 제거 솔루션 ( 재료의 표참조). 모든 시간에 장갑을 착용 하 고 모든 튜브, 팁 및 솔루션은 RNase 무료 다는 것을 확인 한다. 가능 하면 얼음에 샘플 항상 유지.
<ol><li>초순 수 (100 µ L DEPC의 100 mL 해결책 당)에 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 0.1% (v/v)을 추가 하 고 잘 섞어 하룻밤 실 온에서 보관. 압력솥 혼합물 하룻밤 치료 후는 DEPC를 비활성화. 이 DEPC 처리 초순 준비 테 버퍼를 사용 하 여 [10 mM Tris HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] 10 %SDS (w/v) 솔루션.</li>
	<li>얼음에 셀 펠 릿을 녹여 고 테 (DEPC) 버퍼의 400 µ L에서 각각 일시 중단. 2 mL 스크류 캡 튜브에 정지를 전송 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 서 서 혼합물을 허용 그리고 섞은 300 µ L의 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1 v/v) 및 (산 페 놀, RNA 등급), 페 놀의 300 µ L Resuspended 셀에 추가 하려면 유기 상위 단계의 500 µ L를 가져가 라. 튜브에 10 %SDS와 유리 구슬 (0.5 µ m)의 0.5 g 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>모자를 단단히 닫고 비드 밀 균질 화기에 튜브를 배치 ( 재료의 표참조). 얼음에 1 분 간격으로 3 × 45의 펄스 균질 화를 수행 합니다.</li>
	<li>샘플 11000 x g (4 ° C)에서 10 분 원심 하 고 새 튜브를 위 단계를 전송.</li>
	<li>5.5 단계에서 상위 단계로 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1)의 500 µ L을 추가 하 고 11000 x g (4 ° C)에서 5 분을 위한 혼합물을 원심. 참고: 다음 단계는 상업적인 유리 섬유 필터 기반 RNA 격리의 제조 업체의 지시에서 수정 된 키트 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>신선한 튜브를 상위 단계의 500 µ L을 전송 세포/바인딩 버퍼의 2 권 (1 mL)을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>(에서 RNA 격리 kit) 필터 및 컬렉션 튜브를 결합 하 고 필터 튜브를 단계 5.7에서에서 혼합물을 플라스틱. 원심 튜브 15 g와 흐름을 통해 삭제 x 8000에서 s.</li>
	<li>100 µ L DNase 버퍼, DNase의 10 µ L의 microcentrifuge 튜브 1.5 mL를 준비, 그리고 5 µ L의 RNase 억제제 ( 재료의 표참조). 필터 튜브의 필터에 준비 솔루션 믹스를 추가 하 고 15-25 ° c.에 20-30 분 동안 품 어</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 세척 단계를 수행 합니다. 차입 버퍼의 50 µ L를 사용 하 여 RNA elute.</li>
	<li>-80 ° C에서 eluted RNA를 저장 하 고 그것의 주위에 플라스틱 파라핀 영화를 넣어. 동시에 품질 검사를 수행 하는 1.5 mL microcentrifuge 튜브 샘플의 약간 microliters 전송.</li>
</ol>6. RNA 품질 확인 및 시퀀싱
<ol><li>Microvolume 분 광 광도 계와 RNA를 확인 하십시오. 참고: 260/280에서 흡 광도 비율 1.8 이상 이어야 합니다 그리고 비율 260/230에서 적어도 1.8, 2.0 이상 선호 이상 이어야 합니다.</li>
	<li>실행 권장 RNA 분석을 사용 하 여 자동화 된 전기 이동 법 악기에서 정화 RNA 키트 ( 재료의 표참조); RNA 무결성 번호 (린) 진행 7 위 이상 이어야 합니다.</li>
	<li>샘플 당 RNA의 3 µ g의 총 금액을 사용 하 여 RNA-Seq 라이브러리 준비 라이브러리 생성 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 권장 사항에 따라. 참고: 라이브러리 준비는 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱 했다 고 쌍 간 읽기 생성 했다.</li>
</ol>7. 데이터 분석 웹 기반 파이프라인 T-렉스를 사용 하 여
<ol><li>버전 0.0.13 FASTX-도구 키트를 사용 하 여 필터링 품질 (> 20 Phred 품질 평가 점수). Trimmomatic 도구 어댑터 시퀀스에서 원시 RNA-Seq 읽기 트림. 참고: 모든 다운스트림 분석은 고품질을 가진 깨끗 한 데이터에 근거 했다.</li>
	<li>B. mycoides ATCC 6462 NCBI 게놈 데이터베이스 다운로드 (NCBI 승인 번호: CP009692.1) 및 Bowtie2/2.2.3를 사용 하 여 깨끗 한 읽기를 매핑하기 위한 참조 게놈으로 그것을 사용.</li>
	<li>읽기 숫자 계산을 사용 하 여 HTSeq v0.6.1 각 유전자에 매핑되고 각 유전자의 백만 매핑된 읽기 (RPKM) 당 대 본의 kilobase 당 읽기가이 유전자에 매핑된 유전자와 읽기의 길이에 따라.</li>
	<li>T-렉스 파이프라인에 의해 데이터의 분석을 위해 입력, 뿐만 아니라 3 개의 설명 파일 RPKM 테이블 사용: (i) (ii) 어떤 요소가 차동 유전자 발현에 대 한 비교를 정의 하기 위해 대조 파일 요인에 실험을 설명 하기 위해 요인 파일 그리고 (iii) 관심사의 유전자의 그룹을 설명 하는 클래스 파일. 참고: 설명 파일은 in.txt 형식입니다. 예는 T-렉스 (http://genome2d.molgenrug.nl/)의 웹 페이지에서 찾을 수 있습니다. T-렉스를 사용 하 여 데이터 분석에 대 한 자세한 지침 드 종 외. 여 이전 간행물에서 찾을 수 있습니다. 14.</li>
</ol>

<ol><li>Haichar, F. eZ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%3A+Multidisciplinary+Journal+of+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4395/6/1/19">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19(2016).</li>
<li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li>
<li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116(2012).</li>
<li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807170100102X">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li>
<li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li>
<li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.4141/CJSS08021">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li>
<li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139396001266">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li>
<li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02859887">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li>
<li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0885576503904437">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li>
<li>Peng, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s41348-017-0110-z">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li>
<li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/aab.12245/abstract">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li>
<li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REx%3A+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663(2015).</li>
<li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487(2017).</li>
<li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNASwift%3A+a+rapid%2C+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li>
<li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-samtools%3A+Ruby+bindings+for+SAMtools%2C+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+for+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6(2012).</li>
<li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li>
<li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGS-trex%3A+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10(2013).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

식물-미생물 상호작용 박테리아와 식물 사이 가늘게 조정된 평형에 의해 결정 될 가설 되어 있다. 이러한 상호 작용은 매우 복잡 하 고 공부 하기 어려운 자연 시스템에는 구성 다양 한 미생물 종, 잠재적으로 컨소시엄의 역할. 이 문서는 잘 제어 된 조건 하에서 루트 exudates에 세균성 응답을 공부 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. Rhizobacteria, 루트 exudates에 노출 시의 transcriptome 프로필 rhizosphere 틈새에 세균 적응에 자세한 정보를 제공합니다. 이 루트 exudates 컬렉션 프로토콜은 복잡 한 절차와 특수 장비를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 엄격 하 게 메 마른 조건 하에서 모든 절차를 실시 해야 합니다 그리고 불 임의 컨트롤 포함 되어야 합니다. 병렬로 여러 감자 괴 경은 성장 하 고 오염 된 것 들을 버리는 것이 좋습니다. 수정 다른 식물 종의 공부 되 고 있다 하는 경우이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 그것은 적절 한 메서드를 사용 하 여 공차를 적용 하는 소독 제에...

식물 exudate rhizosphere1, 즉, 뿌리 근처 토양의 좁은 영역에 뿌리를 통해 광합성 동안 고정 탄소의 최대 20% 수 있습니다. 더 높은 영양소 여부는 rhizosphere은 식물 성장을 승진 시키는 박테리아를 포함 하 여 다양 한 미생물에 대 한 적당 한 서식 지. 루트 exudates 이온, 무기 산, 산소, 물 같은 무기 화합물의 범위를 포함합니다. 그러나, 대부분의 루트 exudates 화합물 저 분자 무게 화합물 및 고분자 중량으로 분할 될 수 있다 유기 물질에 의해 형성 된다. 저 분자 무게 화합물 아미노산, 유기 산, 설탕, 페 놀 화합물, 지방산 및 2 차 대사 산물의 배열을 포함합니다. 점액과 단백질2,3높은 분자 무게 화합물에 의하여 이루어져 있다. Rhizosphere 미생물 에너지 원으로 성장 및 개발에 대 한 이러한 화합물 중 일부를 사용할 수 있습니다. 루트 exudates 이후는 exudates에서 공장 생산 화합물 영향을 미칠 수 rhizosphere 관련 된 박테리아의 동작에 영향을 주는 특정 유전자의 표현에 의해 rhizobacterial 커뮤니티 형성에 중요 한 역할을.
루트 exudates에 세균성 응답을 이해 해독 식물-미생물 상호작용 메커니즘에서 중요 한 단계입니다. 식물-미생물 상호작용에 세균성 응답 차동 유전자 발현의 제품으로, transcriptome 분석에 의해 공부 될 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 이전 연구 식물-미생물 상호작용에 관련 된 몇 가지 중요 한 유전자를 확인. 녹 농 균, 신진 대사, chemotaxis, 유형 II 분 비에 관여 하는 유전자 사탕 루트 exudates4에 응답을 표시 했다. 팬 외. 5 옥수수 루트 exudates 응답에 B. amyloliquefaciens FZB42의 프로 파일링 transcriptomic 공부. 그들의 결과, 강하게 루트 exudates에 의해 유도 된 유전자의 몇몇 그룹에에서 관련 영양소 사용률, chemotaxis, 운동 성, 및 항균 성 펩 티 드와 polyketides의 비 ribosomal 합성 대사 경로 보여 줍니다.
이러한 연구의 정확도 루트 exudates 컬렉션에 의존합니다. 여러 가지 방법을 서로 다른 목적을 위해 루트 exudates의 컬렉션을 설명 했으며, 비록 그들은 정교한 악기를 요구 하거나 잘 제어 조건6,,78수행 되지 않습니다. 또한, rhizosphere 억제 미생물 수 영향 루트 exudate 구성 식물 세포 막 침투성에 영향을 미치는 미생물9의 컨소시엄의 경우 특히 루트 조직 손상. 루트 exudates에 미생물 반응 조사, 다른 미생물10화합물의 피하기 위하여 잘 정의 된 조건을 사용 하 여 중요 하다. 또한, 높은-품질 RNA가 RNA-seq transcriptome 연구 기반을 위한 필요 합니다. 그러나, 비 모델 세균성 긴장 처리, 표준 프로토콜 또는 상업 키트 보통 있다 알 수 없는 요인 또는 특별 한 성장 특성으로 인해 낮은 효율성.
여기에 설명 된 프로토콜 사용 하 여 B. mycoidesFirmicute 문의 그람 양성, 포자 형성 박테리아를 확인 했습니다. 그것은 다양 한 식물 종의 rhizosphere에 유비 쿼터 스입니다. 여러 식물 성장 촉진 특성 사탕11, 감쇠 떨어져 병원 체의 Pythium 질소로 서 오이12, 억제에에서 체계적인 저항 (ISR)의 유도 포함 한이 종에 대 한 보고 해바라기 rhizosphere13에 고정입니다. 그러나, 호스트 플랜트와의 상호 작용의 분자 메커니즘은 잘 공부 하지.
여기에 제시 된 실험의 목적은 감자 루트 exudates에 endosphere 절연 B. mycoides 의 transcriptomic 반응을 것입니다. 즉, 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 첫째, 메 마른 조건 하에서 감자 루트 exudates 수집. 그런 다음, 루트 exudates 치료 세균 세포에서 높은-품질 RNA를 추출 합니다. 마지막 단계는 T-렉스 웹 기반 파이프라인14를 사용 하 여 데이터 분석. 이 프로토콜 루트 exudates와 접촉 시 식 수준에 변화를 표시 하 고 따라서 식물-미생물 상호작용에 중요 한 역할을 재생 있습니다 B. mycoides 유전자를 식별 하기 위해 사용 되었다.

<table><tbody><tr><td>차아염소산나트륨</td><td>시그마</td><td>&nbsp; CAS : 7681-52-9&nbsp;</td><td>10-15%&nbsp; 활성 염소</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) 국물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0.5 &micro; </td></tr><tr><td>m 2.0 ml tube with screw cap</td><td></td><td></td><td>RNase free</td></tr><tr><td>1.5 ml 및 2.0 ml eppendorf tube</td><td></td><td></td><td>RNase free</td></tr><tr><td>비드 밀 균질화기</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td>Mini_beadbeater</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>시그마</td><td>CAS: 151-21-3&nbsp;</td><td>DEPC 처리된 MQ 물로 제조된 10% 용액</td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td></tr><tr><td>페놀</td><td>시그마</td><td></td><td>RNA 등급</td></tr><tr><td>클로로포름-이소아밀 알코올&nbsp;</td><td></td><td></td><td>클로로포름:이소아밀 알코올을 24:1로 준비하여 실온에서 보관</td></tr><tr><td>고순도 RNA 분리 키트</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>RNase 오염 제거 솔루션</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap</td></tr><tr><td>자동 전기영동 기기</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Microvolume 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA 품질 분석 키트</td><td>Agilent</td><td>RNA 6000 나노 키트&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>방향성 RNA 라이브러리 준비 키트</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>For Illumina</td></tr></tbody></table>

감자 루트 exudates 균 mycoides 의 transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

유익한 식물 관련 박테리아 성장을 촉진 하 고 식물에 질병을 방지에 중요 한 역할. Biofertilizers 또는 biocontrol 대리인으로 식물 성장을 승진 시키는 rhizobacteria (PGPR)의 응용 프로그램 기존의 비료의 사용에 효과적인 대안이 되 고 저렴 한 비용에 작물 생산성을 높일 수 있습니다. 식물-미생물 상호작용 호스트 공장 분 비 신호 및 그들의 관련 된 박테리아에 의해 hereon 반응에 의존. 그러나 어떻게 유익한 박테리아의 분자 메커니즘 응답 그들의 관련 된 식물 유래 신호는 완전히 이해 되지 않습니다. 루트 exudates 박테리아의 transcriptomic 반응 평가 세균성 유전자 발현 rhizospheric 조건 하에서 규제를 결정 하는 강력한 접근 이다. 이러한 정보는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 근본적인 메커니즘을 이해 하는 데 필요한 있습니다. 이 종이 transcriptomic 반응을 B. mycoides EC18, 감자 루트 exudates 감자 endosphere에서 격리 하는 긴장의 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 최근 높은 처리량 시퀀싱 기술의 도움으로,이 프로토콜은 몇 주 및 생산 대규모 데이터 집합에서 수행할 수 있습니다. 먼저, 루트 exudates B. mycoides 문화에 추가 되는 무 균 조건 하에서 수집 합니다. 이러한 문화에서 RNA는 상용 키트와 결합 하 고 자동화 된 전기 악기에 의해 품질 관리 대상이 페 놀/클로 프롬 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 시퀀싱, 데이터 분석 수행 됩니다 웹 기반 T-렉스 파이프라인 차동 표현한 유전자의 그룹을 식별 하는 후에. 이 방법은 세균 유전자 식물-미생물 상호작용에 관련 된 새로운 발견을 촉진 하는 유용한 도구입니다.

식물 관련 미생물 긍정적으로 식물의 성장과 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 식물과 그들의 미생물 symbionts 사이 복잡 한 상호 작용의 메커니즘 완전히 이해 되지 않는다. 루트 exudates rhizobacterial 활동 및 행동 조절에 중요 한 역할 그리고 그것은 일반적으로 가정 하는 뿌리의 미생물 식민지 루트 exudates 미생물의 매력으로 시작. 이 작품의 목표에 감자 루트 exudates B. mycoides rhizobacterial의 transcriptomic 응답을 조사 했다. 이 행, 감자 괴 경 표면 소독 하 고 압력가 vermiculite에 출 아 했다 했다. 다음 그림 1과 같이 루트 exudates 수집 했다. 최대 세균성 성장에 영향을 미치는 루트 exudates의 가능성을 배제 하기 위해 루트 exudates의 15% B. mycoides ...

여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.

감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

이 방법은 식물-미생물 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 박테리아와 식물이 상호 작용하는 동안 내구 또는 근권에서 분리된 박테리아 균주에서 중요한 유전자를 식별할 수 있습니다. 식물과 관련된 다른 박테리아에 대한 연구에도 사용할 수 있는 다재다능한 방법입니다.이 기술의 주요 장점은 비교적 짧은 기간에 식물-미생물 상호 작용 중에 중요한 많은 수의 박테리아 유전자를 식별할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 멸균수로 감자 표면을 헹굽니다. 감자를 70% 에탄올에 5분 동안 담근 다음 3% 차아염소산나트륨에 5분 더 목욕시킵니다.그 후, 멸균수로 다시 헹구어 남아 있는 차아염소산나트륨을 제거합니다. 다음으로, 감자 괴경을 발아시키고 성장시키는 데 필요한 재료를 준비합니다. 플라스틱 냄비, 생착 바구니, 질석 및 물을 섭씨 121도에서 20분 동안 고압멸균하여 살균합니다.그런 다음 표면 살균 된 감자를 생착 바구니에 넣고 젖은 질석이 들어있는 오토 클레이브 냄비에 넣습니다. 미생물 오염을 방지하기 위해 큰 유리 섬유 상자를 사용하여 냄비를 덮으십시오. 냄비를 섭씨 24도의 기후 챔버에 3주 동안 보관하고 16시간의 빛과 8시간의 어둡기 주기로 설정하십시오.감자 뿌리 삼출물을 수집하려면 새싹이 싹이 날 때 감자 전체가 담긴 바구니를 150ml의 오토클레이브 탈이온수로 채워진 멸균된 비커에 넣고 감자 괴경을 수면 바로 위에 놓고 뿌리를 물에 담그십시오. 묘목을 기후 챔버에 보관하고 이전과 동일한 설정을 사용하십시오. 둘째 날부터는 삼출물이 함유된 물을 모으고 비커에 멸균된 탈이온수를 다시 채웁니다.그런 다음 각 샘플을 섭씨 4도에서 따로 보관하십시오. 각 샘플에 대해 Luria-Bertani 한천 플레이트에 100마이크로리터를 펴서 미생물 오염을 확인합니다. 오염된 샘플을 폐기하십시오.수집된 표본 하나를 하나의 묘목으로 조합합니다. 그런 다음 결합된 뿌리 삼출물을 50ml 튜브로 옮깁니다. 뿌리 삼출물이 들어있는 튜브를 섭씨 영하 80도에서 얼립니다.영하 40도에서 동결 건조하여 최종 부피 150ml까지 농축합니다. 박테리아를 성장시키려면 섭씨 영하 80도의 글리세롤 스톡에서 B.마이코이데스 균주를 LB 한천 플레이트에 줄무늬를 만들고 플레이트를 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트의 단일 콜로니를 LB 액체 배지에 접종하고 섭씨 30도에서 밤새 200rpm의 진탕 인큐베이터에서 배양액을 성장시킵니다.박테리아를 처리하고 샘플링하기 위해 300ml 플라스크에서 90ml의 예열된 LB 배지를 0점 0 5의 초기 OD600으로 하룻밤 동안 B.mycoides 배양액을 희석합니다. 그런 다음 10ml의 뿌리 삼출물을 배양액에 추가하고 10ml의 멸균 탈이온수 처리를 대조군으로 사용합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 1시간 동안 배양합니다.한 시간 후 배양액을 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 9, 4 섭씨 온도에 2 분 동안 000 시간 G에 원심 분리에 의하여 배양물에서 세포를 모으십시오. 그 후, supernatent를 버리고 즉시 펠릿을 액체 질소로 동결하십시오.그런 다음 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. RNA를 분리하려면 얼음 위에서 세포 펠릿을 해동하고 각각을 400마이크로리터의 TE 완충액에 현탁시킵니다. 그런 다음 서스펜션을 2밀리리터 나사 캡 튜브로 옮깁니다.튜브에 영점 5g의 유리 구슬을 추가합니다. 그런 다음 캡을 단단히 닫고 튜브를 비드 밀 균질기에 넣습니다. 얼음 위에서 1분 간격으로 45초 펄스 균질화를 세 번 수행합니다.그 후, 11, 000 번 G에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리하고 각 샘플의 상부 상을 새 튜브로 옮깁니다. 클로로포름의 500 마이크로리터를 추가하십시오: 위 단계에 이소아밀 알콜은, 11, 000 시간 G.Then에 5 분 동안 혼합물을 신선한 관에 위 단계의 500 마이크로리터 옮깁니다. lysis binding buffer 1ml를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.다음으로, 100 마이크로리터의 DNase 버퍼, 10 마이크로리터의 DNase I 및 5 마이크로리터의 RNase 억제제가 있는 1포인트 5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브를 준비합니다. 준비된 용액 혼합물을 필터 튜브의 필터에 넣고 섭씨 15-25도에서 20-30분 동안 배양합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 세척 단계를 수행하고 튜브에 50마이크로리터의 엘루젼 버퍼를 추가합니다.원심분리 후 RNA를 용리합니다. 몇 마이크로리터의 샘플을 1점 5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 품질 검사를 수행합니다. 마지막으로, 유출된 RNA를 플라스틱 파라핀 필름으로 덮고 섭씨 영하 80도로 유지합니다.채취 후, 뿌리 삼출물을 10% 비율로 B.mycoides 배양액에 첨가하고, 박테리아 총 RNA를 분리했습니다. 그런 다음 RNA는 자동화된 전기영동 기기에 의해 품질 검사를 받았습니다. 이 그래프는 뿌리 삼출물로 처리된 B.mycoides에서 분리된 RNA를 나타내고, 이 그래프는 대조군에서 분리된 RNA를 나타냅니다.모든 샘플은 16S 및 23S RNA 소단위에 해당하는 두 개의 명확한 띠와 함께 9 이상의 RIN 값을 기록하여 이 프로토콜에 의해 고품질 RNA가 얻어졌음을 입증했습니다. 라이브러리 준비 후, 고처리량 염기서열분석 플랫폼을 사용하여 쌍 말단 판독을 얻었습니다. 원시 RNA-seq 판독은 어댑터 염기서열에서 트리밍되고 참조 게놈 염기서열에 대해 매핑되었습니다.전사체 홈 분석은 T-REx 파이프라인을 사용하여 수행되었으며 차등적으로 발현된 모든 유전자의 비율 강도 플롯이 여기에 나와 있습니다. 잠재적으로 중요한 유전자가 확인된 후, 숙주 식물과의 상호 작용 중 특정 유전자의 예약 발현 시간과 같은 추가 질문에 답하기 위해 프로모터 GFP 융합, 큐-퓨-에어 및 형광 현장 교잡과 같은 다른 생체 내 방법을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Yi, Y., et al. 식물-미생물 상호작용: 감자 뿌리 삼출물에 대한 Bacillus mycoides의 전사 반응. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 식물-미생물 상호 작용을 연구하기 위한 Bacillus mycoides 배양의 준비 및 처리를 보여줍니다. 이는 스톡 배양을 줄무늬로 만들고 액체 배지에서 배양하는 것부터 교반 하에 박테리아를 식물 뿌리 삼출물에 노출시키는 단계에 대해 간략하게 설명합니다. 이 과정은 삼출물에 의해 유도된 유전자 발현 변화의 후속 분석을 위해 박테리아 세포를 수확하고 급속 냉동하는 것으로 마무리됩니다.

시험관 내 식물-미생물 상호 작용을 모방하기 위해 식물 뿌리 삼출물을 사용한 박테리아 처리

농약침과 PVX 농병은 식물에 있는 유전자의 일시적인 자궁 발현을 위한 일상적인 기능적인 분석입니다. 이 방법은 효과적인 전략 (급속한 저항 및 비열유전자 발견)에 있는 능률적인 연구및 분자 식물 병리학에 있는 현대 연구에 결정적입니다. 그들은 공장에서 강력한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족합니다.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

제시 된 방법은 감자의 분리 된 잎에 만두카 sexta 애벌레의 응용 프로그램을 통해 자연 초식 동물 손상된 식물 조직을 만듭니다. 식물 조직은 곤충 허브에 대한 초기 반응에 관여하는 6개의 전사 인자 호몰로그의 발현을 위해 분석된다.

분리 된 잎 어설아는 곤충 만두카 sexta를 츄잉에 의해 감염 하는 동안 감자에 유전자 발현 연구를 단순화 하기 위해

감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

이 프로토콜은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 자세한 요약을 제공합니다. 진균 Verticillium longisporum 및 Verticillium dahliae에 대해 예시된 세 가지 상이한 뿌리 감염 시스템이 기술된다. 잠재적 응용 분야와 가능한 다운스트림 분석이 강조되고 각 시스템에 대한 장단점이 논의됩니다.

식물 뿌리를 토양 매개 미생물로 감염시키는 접종 전략

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

우리는 미생물이 있든 없든 계통발생학적으로 구별되는 다양한 식물의 성장을 지원하는 유리 기반의 반수경재배 실험 시스템에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 성장 배지와 호환되며 다운스트림 분석을 위한 비파괴 뿌리 삼출물 샘플링을 허용합니다.

Semihydroponic Root 삼출물 프로파일링을 위한 다용도 Glass Jar 시스템

이 프로토콜은 생체 내 온실 조건에서 Solanum tuberosum 뿌리를 식물 기생 선충과 감염시키고 광학 현미경을 통한 뿌리 구조의 조직화학적 분석을 위해 감자 체외 형질전환 뿌리를 감염시키는 것을 설명합니다.

유도된 구조적 변화의 평가를 위한 식물 기생 선충을 사용한 감자 뿌리의 생체 내 및 체외 감염

배우세요 감자 뿌리 분비물에 대한 Bacillus mycoides의 전사체 반응 분석 방법을 통해 식물-미생물 상호작용 관련 유전자를 식별하는 기술입니다. 이 프로토콜은 다양한 내생균 연구에 활용 가능합니다.

감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:

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