Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

이 프로토콜의 전반적인 목표는 체외 환경에서 배아 닭 눈에 대한 액세스를 제공하여 배아의 복잡한 발달 경로에 대한 심층적인 연구를 가능하게 하는 것입니다. 배아 닭의 경우 눈꺼풀 발달, 배아 운동 및 추가 배아 조직의 성장으로 인해 눈을 연구하는 것이 종종 어렵습니다. 약물 및 억제제와 같은 화합물도 배아에 치명적인 영향을 미칠 수 있으며, 이러한 화합물을 사용하여 유전자 경로를 조절하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다.

체외 조직 배양의 발전으로 과학자들은 이러한 조직을 분리하고 앞서 언급한 많은 장벽을 제거할 수 있게 되었습니다. 우리의 프로토콜은 신경 망막 및 망막 색소 상피와 같이 발달 중에 상호 작용할 가능성이 있는 모든 조직을 포함하여 눈 전체를 연구할 수 있다는 점에서 유리합니다. 먼저 재료를 고압멸균하여 절차 전에 모든 용액과 장비가 멸균되었는지 확인합니다.

이를 위해 증류수 2리터와 병아리 식염수 1리터를 티슈 상자, 반다공성 여과지, 철망, 물통 및 일회용 유리 피펫과 함께 오토클레이브합니다. 인큐베이터 선반과 도어를 70% 에탄올로 철저히 살균한 다음 용기에 오토클레이브 증류수를 채우고 인큐베이터를 섭씨 37도로 예열합니다. 인큐베이터에 있는 항생제 페니실린 스트렙토마이신 튜브와 함께 영양 배지를 예열합니다.

작업 공간에 종이 타월을 깔고 70% 에탄올로 소독합니다. 모든 집게와 가위를 소독하십시오. 닭 머리를 오토클레이브 병아리 식염수에 넣은 상태에서 정중선에서 병아리 머리를 이등분하여 각 눈 주위에 약간의 조직을 남깁니다.

여분의 조직은 눈이 배양에서 약간의 긴장을 유지하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 눈 전체의 영양분 흡수를 돕고 눈이 여과지에서 미끄러지는 것을 방지합니다. 이러한 조직은 또한 나중에 분석할 때 눈의 방향을 잡을 때 랜드마크 역할을 합니다. 배양을 준비하는 동안 절개된 조직을 실온의 병아리 식염수에 그대로 둡니다.

배양 접시를 준비합니다. 100mm 페트리 접시 하나에 35mm 페트리 접시 2개를 넣습니다. 각 작은 접시에 하나의 철망 스테이지를 놓습니다.

눈이 있는 반쪽 머리를 여과지 조각에 놓고 눈이 종이에서 미끄러지지 않도록 약간 기울입니다. 티슈와 여과지를 철망 스테이지 상단의 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 같은 배아의 다른 절반 머리로 반복합니다.

두 개의 작은 페트리 접시 각각에 배양 배지를 추가합니다. 매체를 티슈 페이퍼 높이까지 가져옵니다. 매체에 조직을 담그지 마십시오.

박테리아 감염을 방지하기 위해 항생제 페니실린 스트렙토마이신 스톡 용액 50마이크로리터를 각 접시의 영양 배지에 추가합니다. 접힌 얇은 티슈 조각을 더 큰 페트리 접시의 안쪽 가장자리에 놓고 증류수로 적십니다. 섭씨 37도의 어두운 인큐베이터에서 최대 4일 동안 배양합니다.

배양 후 여과지에서 조직을 제거하고 4%파라포름알데히드에 고정합니다. 첫 번째 열은 HH34 눈을 보여주며, 이는 배양 초기의 배아 병아리 눈을 나타냅니다. 두 번째 열은 HH34에서 시작하여 4일 동안 배양된 배아 병아리 눈을 보여줍니다.

세 번째 열은 HH38 눈을 보여주며, 이는 HH34 이후 4일간의 난자 내 발달에 해당합니다. 패널 A에서 F는 염색되지 않은 반면, 패널 G에서 I는 알칼리성 인산가수분해효소에 대해 염색됩니다. 맨 윗줄의 패널 A에서 C는 깃털 새싹의 모양과 눈꺼풀의 성장으로 입증 된 눈이 문화 전반에 걸쳐 계속 발달하고 있음을 보여 주며 각 패널에 화살표로 표시됩니다.

패널 D에서 F까지의 중간 줄은 결막 유두가 배양에서 퇴화하기 시작함을 보여줍니다. 맨 아래 줄의 패널 G에서 I는 공막 이골 유도의 시공간 패턴이 배양에서 유지되고 있음을 보여주며, 이 방법을 사용하여 연구할 수 있는 발달 경로의 예로 사용됩니다. 이 프로토콜은 조직이 전체 문화에 걸쳐 발달의 주요 공간적, 시간적 측면을 유지할 수 있도록 합니다.

이 프로토콜은 전체 감각 기관의 배양에 있어 중요한 발전을 나타내며, 관련된 복잡한 발달 경로를 연구하기 위한 대안적인 방법론을 제공합니다.