Name: Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 배우세요 병원성 배양법을 이용한 닭 배아 눈 조직의 발달 생물학 연구 방법입니다. 이 기술은 신경 망막과 색소 상피 상호작용을 체외 환경에서 관찰하여 복잡한 발달 경로를 심층 분석할 수 있게 합니다.

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저자는 프로토콜의 개발에 그의 예비 작업에 대 한 그레고리 할 러 (마운트 세인트 빈센트 대학)를 감사 하 고 싶습니다. 저자 그의 기술적 전문성과 촬영 및 원고에 대 한 오디오/비디오 부분의 생산에 대 한 니콜라스 존스 (마운트 세인트 빈센트 대학)를 감사 하 고도 싶습니다. 다니엘 앤드류 스에서 MSVU 및 자연 과학 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 통해 학부 학생 연구 보너스 자금에 의해 지원 되었다. 타마라 A. 프란츠-Odendaal NSERC 발견 교부 금에 의해 지원 됩니다.

참고: 배아 단계에 대 한 햄버거와 해밀턴12 (HH) 준비 테이블을 사용 합니다.
1. 배아의 부 화
<ol><li>37 ° C ± 1 ° C, 40% 습도에서 살 균, 온도 제어 인큐베이터에서 수정 된 닭 알을 품 어.</li>
	<li>계란 1 차례 하루 x HH34을 알을 품을 수 있도록 (8 일 후 수정).</li>
</ol>2. 준비 및 재료의 살 균
<ol><li>12 배아, 압력솥 증류수, 0.85% 병아리 염 분, 12 유리 펫, 종이 조직과 24 2.5 c m x 2.5 c m 사각 반 다공성 필터 종이, 강선의 24 2.5 c m x 2.5 c m 사각형의 1 상자 1 L 2 L 메쉬 곡선 아래쪽 가장자리에 대 한. 자료, 소독 압력솥 적어도 15 분 동안 121 ° C에서 그들. 참고: 재료의 압력가 마로 소독 사전에 할 수 있습니다.</li>
	<li>측면, 선반, 및 문을 닦아 하 여 70% 에탄올과 인큐베이터를 소독. 장소 2 플라스틱 용기 포함 압력가 하는 습도 유지 하기 위해 인큐베이터 안에 증류수. 37 ° C ± 1 ° C, 40% 습도에 문화 인큐베이터 prewarm 인큐베이터는 완전히 어두운; 확인 문은 투명, 은박지와 커버.</li>
	<li>문화 인큐베이터에 그들을 배치 하 여 영양소 매체의 및 페니실린의 1 mL 100 mL를 prewarm.</li>
	<li>종이 수건으로 작업 영역을 커버 하 고 70% 에탄올을 분사 하 여 벤치를 소독. 비슷한 방식으로 소독 집게, 해 부가 위, 면도날, 및 70% 에탄올과 플라스틱 숟가락의 2 쌍.</li>
	<li>장소 12 살 균 100 mm 페 트리 접시 그리고 사용에 대 한 벤치에 접시 24 살 균 35 m m. 요리 사용까지 멸 균 가방에 남아 확인 합니다.</li>
</ol>3. 배아 준비
참고:이 시점에서 앞으로, 문화를 훼손 하지 않도록 보호 먼지 얼굴 마스크를 착용 하십시오. 세균 이나 곰 팡이 감염 문화를 망칠 것입니다 그리고 그것은 인큐베이터에서 모든 문화에 빠르게 확산의 위험.
<ol><li>균열 계란 열고 100 mm 페 트리 접시 0.85% 병아리 염 분을 포함 하는 배아를 전송 합니다. 해 부 특징에 따라 배아 햄버거와 해밀턴 준비 지침12 에서 설명 하 고 태아를 확인 단계는 HH34에서 이다.</li>
	<li>목 고 소독된 면도날을 사용 하 여 중간에 태아의 머리를 이등분. 소독 집게를 사용 하 여 두뇌를 제거 합니다. 부리는 그대로 둡니다.</li>
</ol>4. 문화 설치
<ol><li>한 100 mm 페 트리 접시 안에 35 mm 페 트리 접시의 장소 2.</li>
	<li>각 35 mm 페 트리 접시 안에 강철 와이어 메쉬를 배치 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 전송 bisected 머리의 1 2.5 c m x 2.5 c m 반 다공성 필터 종이 위로 향하도록 눈으로. 조직과 보안은 약간 그것을 기울이기로 벗어 버리는 하지 않습니다 확인 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 신중 하 게 장소 눈 조직 및 필터 종이 위에 올려진된 무대 위에 눈 조직으로 만드는 35mm 페 트리 요리의 1 강철 와이어 메쉬.</li>
	<li>4.3 및 4.4 다른 절반 머리와 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>필터 종이의 수준에 도달할 때까지 각 35 mm 페 트리 접시에 직접 영양소 매체를 추가 신중 하 게 메 마른 유리 피 펫을 사용 하 여. 영양소 중에 반 머리를 잠수함 하지 마십시오.</li>
	<li>각 페 트리 접시에 영양 보통 10000 U/mL 페니실린-스의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>작은 광장으로 조직 종이 접어과 100 mm 페 트리 접시 안에 배치. 압력가 증류수와 함께 축 축 하 게.</li>
	<li>최대 4 일 동안 37 ° C ± 1 ° C, 40% 습도에서 살 균, 어두운 인큐베이터에 문화 접시를 놓습니다.</li>
	<li>각 태아에 대 한 3-4 단계를 반복 합니다. 참고: 배아의 수 특정 실험;에 따라 달라 집니다 필요 여기, 우리는 12 배아에 대 한 프로토콜을 설명합니다.</li>
</ol>5. 문화 유지 보수
<ol><li>하루에 한 번, 신선한, 압력가 증류수와 인큐베이터에서 플라스틱 용기를 가기.</li>
	<li>세균 이나 곰 팡이 감염에 대 한 모든 문화는 매일 확인 합니다. 문화는 붕괴 또는 매체 색상을 변경 되었습니다 감염 됩니다. 감염 되는 모든 문화를 삭제 합니다.</li>
</ol>6입니다. 고정
<ol><li>인큐베이터에서 모든 요리를 제거 하는 경작, 다음.</li>
	<li>부드럽게 집게의 쌍을 사용 하 여, 조직을 찢 어 하지 않도록 주의 복용 필터 종이에서 눈을 제거 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 하룻밤 염 인산 염 버퍼 x 1 또는 10% 중립 버퍼링 말린 하룻밤 실 온에서 4 %paraformaldehyde 눈 조직을 수정 했다.</li>
	<li>인산 염 버퍼 염 분 x 1에 4 ° C에서 티슈를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18855894">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li>
<li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+motor+proteins+in+echinoderm+embryos%3A+an+argument+in+support+of+antibody+inhibition+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).</li>
<li>Horakova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+FGFR+inhibitors+on+chicken+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development.</a> Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).</li>
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<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
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<li>Pinto, C. B., Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+understanding+of+the+epithelial+requirement+for+osteogenesis+in+scleral+mesenchyme+of+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).</li>
<li>Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).</li>
<li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 닭 눈 배아 주 8에서에서 (HH34)의 성장을 달성 하기 위해 설립 된 조직 배양 기술을 사용 생체 외에서 4 일 동안. 이 그리드 경작 방법 Trowell15에 의해 원래 기술 되었다. 우리는 핀 토와 홀의 1991 연구16 배아 닭 눈15의 분리 된 조직 층 사이 유도 신호를 공부 하는 그리드와 반 다공성 멤브레인을 활용 하 여 프로토콜을 최적화. 이 메서드를 사용 하 여, 바퀴벌레 14 일 오래 된 닭의 대 퇴 골6교양. 이 방법은 또한 마우스 조직6,17경작에 효과가 입증 되었습니다. 필터 종이의 사용은 영양분을 받아들이고 매체에서 효과적으로 포화 또는 submersing 조직 없이 조직 도움으로 프로토콜의 성공에 중요...

배아 닭고기 (갈 루스 갈 루스)는 생물학의 분야에서 일반적으로 사용 되는 우수한 모델 유기 체. 그 잠복기는 대략 21 일 고 많은 계란 수 있습니다 알을 품을 동시에, 신속 하 고 효율적인 실험을 만들기. 아마도 가장 중요 한 것은, 태아는 또한 쉽게 조작, 광범위 한 연구와 유전자와 이러한 프로세스를 구동 하는 단백질의 주요 개발 프로세스의 사용.
미 발달 닭 눈은 개발을 통해 다양 한 다른 조직 비슷한 많은 다른 시체는 시스템의 상호 작용 하는 복잡 한 기관 이다. 이 메서드는 개발의 고급 단계에서 특히이 조직 개발의 연구를 수 있습니다. 예를 들어 다층된 망막 신경 시스템의 개발을 공부 하 고 그에 게 특히 관심이 될 수 있습니다. 와 같은 각 막, vitreal, 렌즈, sclera, 몸과 눈 꺼 풀 연구자에 게 도움이 다른 눈 조직의 연구를 활성화 하는 방법에 대 한 대체. 닭 배아 눈에는 편평한 뼈, intramembranous 뼈 유도 및 척추1에서 나오고의 연구에 대 한 모델로 사용 될 수 있는 scleral 이소골의 일련을 포함 되어 있습니다.
현재, 배아 발달을 공부 하는 데 사용 하는 방법 수가 있다. 억제 항 체 또는 다른 억제 분자2,3, microinjections 수술 microbeads 억제 물4에 배어 이식 및 electroporation5 는 downregulate 유전자를 사용할 수 있는 모든 방법을 또는 태아의 단백질입니다. 비슷한 메서드는 upregulate 단백질에 사용 됩니다. 이러한 방법을 그들의 제한 없이 되지 않습니다. 예를 들어 화학 물질을 사용 하 여 변경 하는 배아 개발을 태아에 치명적인 영향을 평가 해야 합니다, 그리고 이것의 생존을 보장 하기 위해 충분히 낮은 복용량에서 응용 프로그램의 지역화 된 사이트에 앞서 언급 한 방법의 사용을 제한 합니다 태아입니다.
생체 외에서 조직 배양 연구 개발 생물의 넓은 범위에서 사용 되었습니다 그리고 상기 제한 중 일부를 무시 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 femora6, 깃털 꽃 봉 오리7,8및 사지9 닭의 모든 되었습니다 공부 마우스10 와 뿌리의 고환 및 식물11의 줄기 조직 배양 방법를 사용 하 여. 이러한 방법을 과학자 제어 온도 변동 양분 가용성을 변경 하는 등 조직 개발의 높은 학위를 부여 합니다. 전체 태아에서 직물의 절연은 또한 높은 농도에서 세계적인 규모에 대 한 조작 연구를 활성화 하는 화학 제품의 치명적인 효과를 훨씬 덜 취약 합니다. 체 외에서 배양 하는 또 다른 주목할 만한 이점은 이다 조직의 셀룰러 환경 보존 조직 배열 다른 조직 유형9사이의 상호 작용을 공부 하는 게 가능 하, 상대적으로 변경 되지 않습니다. 따라서, 체 외에서 배양 열립니다 문을 추가 실험 접근 비켜 또는 vivo에서 모델에서 사용할 수 없습니다.
현재, 화학 물질을 사용 하 여 미 발달 닭 눈의 개발을 공부 하 고 특히 도전 이다. Extraembryonic 막 수 커버 태아, 어렵게 적용 microbeads 또는 화학 제품; 태아 그것 수록, 더는 이미 어려운 방법 복잡 계란 내에서 매우 적극적 이기도 합니다. 이 프로토콜에는 눈 및 그 주변 조직, 또한 눈 내 개발 프로세스를 검사 하는 새로운 기회를 제공 하면서이 방 벽을 제거 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 프로토콜은 배아 눈 내 scleral 이소골의 유도 연구 설립 되었다.

<table><tbody><tr><td>35mm 세포 배양 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>쉽게 잡을 수 있는 조직 배양 접시, 폴리스티렌, 비발열성</td></tr><tr><td>100mm 세포 배양 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>조직 배양 접시, 폴리스티렌, 발열성</td></tr><tr><td>종이 티슈</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Kimtech Science 브랜드 작업 와이퍼, 카톤 와이어 메쉬 당 280</td></tr>개 <tr><td></td><td>해당</td><td>없음</td><td>스테인레스 스틸 와이어 메쉬 (그리드 크기 0.7 mm)</td></tr> <tr><td>일회용 유리 피펫</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>붕규산 유리 일회용 5 3/4 "</td></tr><tr><td>영양 매체</td><td>Gibco</td><td>12591-038</td><td>Fitton-Jackson Modification, [+] L-글루타민 페놀 레드 (BGJB)</td></tr> <tr><td>페니실린-스트렙토 마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4458</td><td>10000 units / mL 페니실린 스트렙토 마이신 용액 안정화</td></tr><tr><td>필터 paper</td><td>Whatman</td><td>1454-090</td><td>반다공성 여과지 90mm</td></tr><tr><td>수정 닭 달걀</td><td>Dalhousie University Agricultural College</td><td>해당 사항 없음</td> 지역 <td>농장에서 얻을 수 있습니다</td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>EMD</td><td>SX0420-3</td><td>염화나트륨 결정, 시약 등급</td></tr><tr><td>1 L 유리병</td><td>VWR</td><td>89000-240</td><td>1 L 파이렉스 오토클레이브 유리병</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td>70% 분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>타파웨어 용기</td><td>해당</td><td>사항 없음</td> 매장 구매 <td>및 EtOH</td></tr><tr><td>일회용 면도날</td>로 멸균 <td>VWR</td><td>55411-050</td><td>단일 모서리 산업용 면도날(외과용 탄소강)</td></tr> <tr><td>플라스틱 스푼</td><td>해당 없음</td><td></td> 매장 구매 <td>및 EtOH</td></tr><tr><td>방진 마스크</td><td>3M</td><td>해당 없음</td><td>3M 8500 컴포트 마스크</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>파라포름알데히드, 시약 등급, 결정질</td></tr><tr><td>중성 완충 포르말린</td><td>Fisher Scientific</td><td>72210</td><td>10% 중성 완충 포르말린</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>해당 없음</td><td></td><td>10X 인산염 완충 식염수 pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)</td></tr><tr><td>15 ml 팔콘 튜브</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td>사전 멸균 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>펜치</td><td>FST</td><td>n/a</td><td>파인 펜치</td></tr><tr><td>식염수&nbsp;</td><td>해당 없음</td><td>없음</td><td>0.85% 염화나트륨</td></tr><tr><td>은박지</td><td>N/A</td><td></td><td>해당 없음 매장에서 구매한</td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당</td><td></td></tr></tbody></table> 없음 매장에서 구매

organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

미 발달 닭 척 추가 개발에 대 한 신뢰할 수 있는 모델 생물으로 주로 사용 됩니다. 접근성 및 짧은 인큐베이션 기간 적합 실험에 대 한 합니다. 현재, 닭 태아에 있는이 발달 경로 연구는 저 해제 및 지역화 된 사이트에서 다양 한 방법 사용 하 여 낮은 농도에서 마약을 적용 하 여 실시 됩니다. 생체 외에서 조직 배양은 조직 호스트 유기 체에서 동시에 전체 배아, 배아의 민감성 등을 작업할 때 현재 물리적 한계의 대부분을 무시 하면서 분리의 연구를 가능 하 게 하는 기술 잠재적으로 치명적인 화학 제품의 높은 복용량. 여기, 우리는 배아 치킨 반 머리 생체 외에서현재 설립된 방법 넘어 개발 프로세스의 시험에 대 한 새로운 기회를 선물 한다 경작을 위한 프로토콜을 경작 하는 organotypic 제시.

이 메서드를 사용 하 여 미 발달 닭 눈 수 수 경작 하루 8 개발 (HH34)의 생체 외에서 에서 4 일 동안. 비켜에 개발의 4 일 HH38에 해당 합니다.
이 자란 방법 깃털 싹 눈 주위와 눈 꺼 풀 (그림 1B)에 개발을 지원 합니다. 이러한 깃털 싹 존재 비켜 HH34에서 경작 (그림 1A), 이전 비켜에서13 (그림 1C)은 깃털 새싹 개발 자란 기간 시작 됩니다 나타내는 되지 않습니다. 눈 꺼 풀과 nictitating 막 자란 (그림 1B</stro...

여기, 선물이 배아 치킨 장기 성장 프로토콜을 경작 하는 organotypic 생체 외에서. 이 메서드를 사용 하 여 미 발달 닭 조직 개발 수 수 공부, 문화 환경에 통제의 고차를 유지 하면서.

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 체외 환경에서 배아 닭 눈에 대한 액세스를 제공하여 배아의 복잡한 발달 경로에 대한 심층적인 연구를 가능하게 하는 것입니다. 배아 닭의 경우 눈꺼풀 발달, 배아 운동 및 추가 배아 조직의 성장으로 인해 눈을 연구하는 것이 종종 어렵습니다. 약물 및 억제제와 같은 화합물도 배아에 치명적인 영향을 미칠 수 있으며, 이러한 화합물을 사용하여 유전자 경로를 조절하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다.체외 조직 배양의 발전으로 과학자들은 이러한 조직을 분리하고 앞서 언급한 많은 장벽을 제거할 수 있게 되었습니다. 우리의 프로토콜은 신경 망막 및 망막 색소 상피와 같이 발달 중에 상호 작용할 가능성이 있는 모든 조직을 포함하여 눈 전체를 연구할 수 있다는 점에서 유리합니다. 먼저 재료를 고압멸균하여 절차 전에 모든 용액과 장비가 멸균되었는지 확인합니다.이를 위해 증류수 2리터와 병아리 식염수 1리터를 티슈 상자, 반다공성 여과지, 철망, 물통 및 일회용 유리 피펫과 함께 오토클레이브합니다. 인큐베이터 선반과 도어를 70% 에탄올로 철저히 살균한 다음 용기에 오토클레이브 증류수를 채우고 인큐베이터를 섭씨 37도로 예열합니다. 인큐베이터에 있는 항생제 페니실린 스트렙토마이신 튜브와 함께 영양 배지를 예열합니다.작업 공간에 종이 타월을 깔고 70% 에탄올로 소독합니다. 모든 집게와 가위를 소독하십시오. 닭 머리를 오토클레이브 병아리 식염수에 넣은 상태에서 정중선에서 병아리 머리를 이등분하여 각 눈 주위에 약간의 조직을 남깁니다.여분의 조직은 눈이 배양에서 약간의 긴장을 유지하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 눈 전체의 영양분 흡수를 돕고 눈이 여과지에서 미끄러지는 것을 방지합니다. 이러한 조직은 또한 나중에 분석할 때 눈의 방향을 잡을 때 랜드마크 역할을 합니다. 배양을 준비하는 동안 절개된 조직을 실온의 병아리 식염수에 그대로 둡니다.배양 접시를 준비합니다. 100mm 페트리 접시 하나에 35mm 페트리 접시 2개를 넣습니다. 각 작은 접시에 하나의 철망 스테이지를 놓습니다.눈이 있는 반쪽 머리를 여과지 조각에 놓고 눈이 종이에서 미끄러지지 않도록 약간 기울입니다. 티슈와 여과지를 철망 스테이지 상단의 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 같은 배아의 다른 절반 머리로 반복합니다.두 개의 작은 페트리 접시 각각에 배양 배지를 추가합니다. 매체를 티슈 페이퍼 높이까지 가져옵니다. 매체에 조직을 담그지 마십시오.박테리아 감염을 방지하기 위해 항생제 페니실린 스트렙토마이신 스톡 용액 50마이크로리터를 각 접시의 영양 배지에 추가합니다. 접힌 얇은 티슈 조각을 더 큰 페트리 접시의 안쪽 가장자리에 놓고 증류수로 적십니다. 섭씨 37도의 어두운 인큐베이터에서 최대 4일 동안 배양합니다.배양 후 여과지에서 조직을 제거하고 4%파라포름알데히드에 고정합니다. 첫 번째 열은 HH34 눈을 보여주며, 이는 배양 초기의 배아 병아리 눈을 나타냅니다. 두 번째 열은 HH34에서 시작하여 4일 동안 배양된 배아 병아리 눈을 보여줍니다.세 번째 열은 HH38 눈을 보여주며, 이는 HH34 이후 4일간의 난자 내 발달에 해당합니다. 패널 A에서 F는 염색되지 않은 반면, 패널 G에서 I는 알칼리성 인산가수분해효소에 대해 염색됩니다. 맨 윗줄의 패널 A에서 C는 깃털 새싹의 모양과 눈꺼풀의 성장으로 입증 된 눈이 문화 전반에 걸쳐 계속 발달하고 있음을 보여 주며 각 패널에 화살표로 표시됩니다.패널 D에서 F까지의 중간 줄은 결막 유두가 배양에서 퇴화하기 시작함을 보여줍니다. 맨 아래 줄의 패널 G에서 I는 공막 이골 유도의 시공간 패턴이 배양에서 유지되고 있음을 보여주며, 이 방법을 사용하여 연구할 수 있는 발달 경로의 예로 사용됩니다. 이 프로토콜은 조직이 전체 문화에 걸쳐 발달의 주요 공간적, 시간적 측면을 유지할 수 있도록 합니다.이 프로토콜은 전체 감각 기관의 배양에 있어 중요한 발전을 나타내며, 관련된 복잡한 발달 경로를 연구하기 위한 대안적인 방법론을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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