Name: 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 기법으로 신경과학에서 개별 뉴런의 유전자 발현 프로파일을 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 뇌 조각에서 세포질 채취 후 RT-PCR을 통해 신경세포 다양성과 기능 특성을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

원고에 대 한 그의 의견에 감사 박사 알렉산더 Mourot 하 고. 이 작품은 직원 회 드 라 검색 (ANR 2011 MALZ 003 01;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 ANR-15-CE16-0010 고 ANR-17-CE37-0010-03), BLG Fondation 부 라 검색 르 츠에서에서 친교에 의해 지원 됩니다. 우리는 IBPS (파리, 프랑스)의 동물 시설 감사.

저자는 공개 없다.

단일 셀 다중 RT-PCR 후 패치 클램프 동시에 하 고 확실 하 게 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 유전자의 표현을 조사할 수 있습니다. 단일 셀 수준에서 유전자 발현을 분석 고효율 PCR 뇌관을 요구 한다. 가장 제한 단계 중 하나를 셀의 내용의 모음입니다. 그것의 효율성은 셀 크기를 일치 하는 동안 가능한 한 크게 해야 패치 피 펫 팁의 직경에 따라 다릅니다. 1-2 µ m 오픈 팁 직경을 가진 펫은 가장 신경 종류에 적합 해야 입증 되었다. 또한 셀룰러 콘텐츠만 수집 되도록 필수적 이다 고 하지 주위 조직. 이 제어 electrophysiologically 수확 동안 단단한 물개를의 보존 하 여 이루어집니다. 피 펫 철수 더 동안 외부 아웃 패치 구성의 형성 세포 파편에서 수확된 세포질을 보호합니다. 멀티플렉스 RT-PCR는 또한 조사 셀 형식의 mRNAs 풍부에 따라 단일 셀의 성공률. 예를 들어, 항복 이다, 상대적으로 낮은 금액<s...

대뇌 피 질에는 다양 한 생리 적 프로세스에 관련 된 수많은 셀 형식을 구성 되어 있습니다. 그들의 식별 및 특성화, 그들의 특정 기능에 대 한 이해를 전제 조건 매우 도전 수 대뇌 피 질의 세포 유형1 특징 큰 형태, 생리, 및 분자 다양성 부여 2,,34.
단일 셀 다중 RT-PCR 패치 클램프와 RT-PCR 기술의 결합을 기반으로 합니다. 그것은 동시에 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 미리 정의 된 유전자의 표정을 프로브 수 있습니다. 기록 피 펫 추가에 신경 추적 프로그램의 포함 허용 조직화 학적인 계시6,7,,89, 후 기록 된 세포의 형태학 특성 10. 그것은 그들의 phenotypic 특성5,,910,11,12의 복수 변수 분석에 따라 신경 유형의 분류에 대 한 매우 유용한 기술입니다 ,,1314. 단일 셀 멀티플렉스 RT-PCR은 또한 이다15,,1617, 같은 비 신경 세포의 특성에 적합 하 고 거의 모든 뇌 구조18에 적용 될 수 있습니다. 19,20,21,22,23 및 셀 유형, 가정 그들은 전체 셀 구성에 기록 될 수 있습니다.
이 기술은 세포 소스의 식별 및 전송 시스템7,8,15,,1620,21, 목표에 대 한 매우 편리 하다 24,25,26,,2728, 특정 항 체 부족 하는 경우에 특히. 그것은 시각적으로 식별 된 셀29, 패치 클램프 기록에 의존 하며 따라서 또한 특정 세포 환경8,,1516셀을 대상으로 수 있습니다. 또한 뇌 조직의 cytoarchitecture 두뇌 분할 영역에 유지 됩니다, 이후이 방법은 또한 수 있습니다 신경 및 비 신경 요소7,8 특징이 세포의 해부학 적 관계의 연구를 , 18.
이 기술은 수확된 세포질의 크기와 RT의 효율에 의해 제한 된 있기 때문에, 낮은 복사 번호에서 표현 하는 mRNA의 검출은 어려울 수 있습니다. RNaseq 기술에 따라 다른 접근 분석 하는 단 세포3,4,,3031, 전체 transcriptome 있게 비록 그들은 반드시 높은 처리량 비싼 시퀀서 필요 모든 실험실을 사용할 수 있습니다. 단일 셀 다중 실시간 PCR 기술을 사용 하므로 끝점 PCR, 그것만 널리 thermocyclers를 요구 한다. 그것은 실험실을 갖춘 electrophysiological 설정에서 쉽게 개발 될 수 있다 하 고 비싼 장비가 필요 하지 않습니다. 그것은 제공할 수 있습니다, 어느 날, 내 유전자의 미리 정의 된 집합의 식에 대 한 질적 분석. 따라서,이 방법은 신속한 방식으로 단일 세포의 분자 특성에 대 한 쉬운 액세스를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>프라이머 설계를 위한</td> <td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td> 다중 정렬</tr>, <tr><td>디티오트레이톨</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr>, <tr><td>랜덤 프라이머</td>, <td>시그마-알드리치(머크)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr>, <tr><td>dNTP,</td><td>GE 헬스케어, 생명 과학</td><td>28-4065-52</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>RNasin 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II 역전사 효소</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합 효소</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>M5904-5ML</td><td>PCR PCR</td></tr><tr><td>프라이머</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td> <td>PCR / 탈염 및 200 &micro에서 희석; M</td></tr><tr><td>튜브, 0.5 mL, 플랫 캡</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>BT10 시리즈 - 10 &마이크로; L 필터 팁</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>BT20 시리즈 - 20 &마이크로; L 필터 팁</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>BT200 시리즈 - 200 & 마이크로; L 필터 팁</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>BT1000 시리즈 - 1000 &마이크로; L 필터 팁</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>DNA 열 실린더</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>트리스-붕산염-EDTA 완충액</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>T4415-1L</td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>UltraPure 아가로스</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>&Phi; X174 DNA-Hae III 다이제</td>스트 <td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>코닥</td><td></td><td>아가로스 젤 전기영</td></tr>동 <tr><td>전기영동 전원 공급 장치 EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>미디 수평 전기영동 유닛 모델 SHU13</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td></td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>새틴 외관의 매끄러운 종이</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>60377</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N&프라임;,N&프라임-테트라아세트산</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>E3889</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>H4034</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>D-글루콘산 칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr> 염화<tr><td>마그네슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>5500 증기압 삼투압계</td><td>Wescor</td><td></td><td>패치 클램프 내부 솔루션</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>S5016</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>D-(+)-포도당 일수화물</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>49159</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>S6191</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>60128</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>31437-M</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>인산 나트륨 일 염기성</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>S5011</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>염화 마그네슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>63069</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>염화칼슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>21115</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>패치 클램프 셋업 세척</td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 얇은 벽 유리 모세 혈관</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>BX51WI 정립 현미경</td><td>올림푸스</td><td></td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD B/W 비디오 카메라</td><td>Sony</td><td></td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>Axopatch 200B 증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 소프트웨어 제품군</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>E Series with Straight Body (holder)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>S7907</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td><td>성 시그마-알드리치(머크)</td><td>S8282</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td>P6148</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td>X100</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>냉수 생선 피부</td><td>에서 추출한 젤라틴Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 접합체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>조직화학적 계시</td></tr></tbody></table>

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

대뇌 피 질은 수많은 종류의 세포 다양 한 형태, 생리, 및 분자 기능을 전시로 구성. 이 다양성에는 쉽게 식별 하 고 이러한 세포 유형, 그들의 특정 기능을 공부 하는 전제의 지장을 초래할 수 있습니다. 이 문서에서는 다중 단일 셀 반전 녹음 방송 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 프로토콜을, 패치 클램프 조각, 기록 후 허용 하는 단일 셀에 유전자의 수만의 표현을 동시에 감지 하는 설명 합니다. 이 간단한 방법 형태학 상 특성을 구현할 수 있다 고 널리 혈관 주변 등 다양 한 세포 유형 및 그들의 특정 세포 환경 phenotypic 특성 결정에 적용 됩니다. 이 프로토콜의 원리 기록 하 패치 클램프 기술 수확 및 역방향 셀의 세포질 내용 녹음 이며 질적으로 감지 하 여 유전자의 미리 정의 된 집합의 표현 다중 PCR. PCR 뇌관 및 RT-PCR과 호환 세포내 패치 클램프 솔루션의 설계를 필요합니다. 선택적이 고 신뢰할 수 있는 증명서를 위해 탐지,이 기술은 또한 증폭 단계에 수확 하는 세포질에서 적절 한 컨트롤을 필요 합니다. 여기서 설명 하는 조치를 엄격 하 게 따라야 합니다, 하지만 거의 모든 electrophysiological 실험실 다중 단일 셀 RT-PCR 기법을 사용할 수 있습니다.

멀티플렉스 RT-PCR의 대표 유효성 검사는 그림 3에 표시 됩니다. 프로토콜은 12 다른 유전자의 표현을 동시에 조사 하도록 설계 되었습니다. 기공을 글루타민 산 염 운송업 자 vGluT1 glutamatergic 신경42에 대 한 긍정적인 제어로 찍은. GABA 합성 효소 (GAD65와 갓 67), Neuropeptide Y (NPY), 및 Somatostatin (SOM) GABAergic 수3,,511의 표식으로 사용 되었다. Cyclooxygenase 2 효소 (COX-2) 피라미드 셀 하위 인구3,16</s...

이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

이 방법은 신경 집단을 특성화하거나 전달 시스템의 출처 및 표적을 식별하는 것과 같은 신경 과학 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포에서 미리 선택된 유전자 세트의 발현 프로파일을 빠르고 쉽게 결정할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법은 무작위 다양성 마우스에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.또한 성상교세포와 같은 다른 세포 유형 및 많은 동물 모델에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 이러한 시연은 데이터를 분석하기 위해 많은 양의 세포질이 필요하기 때문에 체포 및 포부 단계를 배우기 어려울 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 절편 전에 수술용 가위, 미세한 홍채 가위, 주걱 2개, 집게, 종이 필터 디스크 및 시아노아크릴레이트 접착제가 포함된 박리 키트를 준비합니다.그런 다음 얼음 냉간 절단 용액을 carbogyn으로 포화시키고 절단 챔버를 섭씨 영하 20도에서 냉각시킵니다. 다음으로 동물의 두피를 제거하고 두개골을 엽니다. 뇌를 조심스럽게 추출하여 발암성 얼음 냉간 절단 용액으로 채워진 작은 비커에 넣으십시오.그런 다음 섭씨 영하 20도에서 절단 챔버를 제거하고 종이 타월로 물기를 제거합니다. 관심 영역을 분리하기 위해 뇌를 조심스럽게 해부합니다. 절단 챔버에 붙이고 탄화한 얼음 냉간 절단 용액을 첨가하십시오.비브라톤을 사용하여 300 마이크로 미터 두께의 슬라이스를 잘라냅니다. 슬라이스를 실온에서 산소가 공급된 절단 용액으로 채워진 휴지 챔버로 옮기고 최소 30분 동안 회복되도록 합니다. 단일 세포 RT-PCR 및 표적 세포 특성화의 경우, mRNAse를 보존하기 위해 전체 세포 기록을 20분 이하로 제한합니다.녹음이 끝나면 2 마이크로 리터의 5xRT 믹스와 0.5 마이크로 리터의 20xDTT로 채워진 500 마이크로 리터 PCR 튜브를 준비합니다. 빙빙 돌려서 보관하세요. 그런 다음 부드러운 음압을 가하여 세포의 세포질을 수확합니다.단단한 밀봉을 유지하면서 세포의 내용물이 피펫으로 유입되는 것을 모니터링 및 제어하고 일부 유전자를 고려하는 경우 핵을 수집하지 마십시오. 유전자의 경우, 핵 수집을 피하고 일반적인 오염을 준비하기 위해 gDNA를 증폭하는 것을 목표로 하는 프라이머 세트를 포함하는 것이 필수적입니다. 핵이 피펫 끝에 가까워지면 음압을 해제하고 피펫을 멀리 이동시킵니다.단단히 밀봉된 상태가 유지되었는지 확인하고 새 피펫 위치에서 세포질 채취를 다시 시작합니다. 다음으로, 피펫을 부드럽게 빼내어 세포 외 파편에 의한 오염을 제한하고 후속 조직-화학적 분석을 위해 세포막을 닫는 데 유리하도록 외부 아웃 패치를 형성합니다. nubs, micro-manipulator, computer keyboard 또는 computer mouse는 RNAase 오염의 양성자 전하 원인이라는 것을 명심하십시오.녹음 중에 장갑을 만졌다면 장갑을 교체하십시오. 그런 다음 피펫을 착유기에 부착하고 양압을 가하여 내용물을 PCR 튜브로 배출합니다. 피펫의 끝을 PCR 튜브에 부수면 내용물 수집에 도움이 됩니다.그런 다음 튜브를 잠시 원심분리하여 0.5마이크로리터의 RNAse 억제제와 0.5마이크로리터의 RTAse를 추가합니다. 부드럽게 섞고 다시 원심분리기를 한 다음 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 튜브를 돌리고 최대 몇 달 동안 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.PCR 분석 및 제 1 증폭 단계를 수행 할 때까지. PCR을 검증하려면 프라이머 쌍을 혼합 및 희석하고 단일 세포 RTPCR 전용 피펫으로 1마이크로몰을 추가합니다. 온도 순환기를 섭씨 95도에서 3분 동안 설정하고 40사이클을 실행한 다음 5분 동안 섭씨 72도에서 최종 연신율 단계를 수행합니다.프라이머 이량체의 형성을 최소화하려면 섭씨 95도로 예열된 열 순환기에 PCR 튜브를 배치하여 핫 스타트를 수행합니다. 30초 후 오일 위에 프라이머 믹스 20마이크로리터를 빠르게 배출합니다. 프라이머 쌍이 검증되면 멀티플렉스 프로토콜로 테스트합니다.외부 프라이머를 하나의 마이크로몰로 함께 혼합하고 희석합니다. 멀티플렉스 프라이머 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 최대 몇 주 동안 보관하십시오. 다음으로 프리믹스를 준비하여 얼음 위에 놓습니다.PCR 튜브를 튕기고 회전시킨 후 미네랄 오일 2방울을 넣으십시오. 섭씨 95도에서 3분 후 PCR 사이클을 20회 실행합니다. 20마이크로리터의 멀티플렉스 프라이머 혼합물로 설명된 대로 핫 스타트를 수행합니다.그런 다음 분석 중인 유전자의 수와 동일한 여러 개의 PCR 튜브를 준비합니다. 유전자당 1마이크로리터의 첫 번째 PCR 산물을 주형으로 사용하여 사전 혼합물을 준비합니다. 분석할 유전자의 수에 따라 모든 부피를 조정하고 파이펫팅 오류를 보상하기 위해 10%의 추가 부피를 사용하는 것을 고려하십시오.부드럽게 흔들고 튜브를 돌린 다음 각 PCR 튜브에 80마이크로리터의 프리믹스를 분배합니다. 튜브의 벽이나 캡을 건드리지 않고 튜브당 미네랄 오일 두 방울을 추가합니다. 35 PCR 사이클을 실행 한 다음 20 마이크로 리터의 내부 프라이머 혼합물을 배출하여 핫 스타트를 수행합니다.아라고스 겔 전기영동에 의한 두 번째 PCR 프로젝트를 분석합니다. 층 5 피라미드 뉴런은 큰 소마와 눈에 띄는 정점 수상석에 의해 시각적으로 식별되었습니다. 풀 셀 기록은 낮은 입력 저항, 오래 지속되는 활동 전위 및 뚜렷한 스파이크 주파수 적응을 가진 레이어 5 규칙적인 스파이크 뉴런의 전형적인 전기 생리학적 특성을 보여주었습니다.이 뉴런의 분자 분석은 vGluT1의 발현을 밝혀 글루타마이터 표현형을 확인했습니다. 이 뉴런은 또한 소마토스타틴과 ATP1-알파-1 및 나트륨-칼륨 ATPA의 3개의 하위 단위를 발현했습니다. 기록된 뉴런의 바이오사이틴 라벨링은 피라미드 형태학을 확인했습니다.글루타마이터 뉴런에서 예상한 바와 같이, 26개의 층-5개 피라미드 세포의 분자 분석에서 vGluT1의 발현이 밝혀졌지만 두 GAD는 모두 나타나지 않았습니다. 일단 기술은 제대로 형성된 경우 이틀 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 오염을 피하기 위해 매우 조심해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 비디오를 시청한 후에는 세포질 수확, 역전사 및 핫스타트 PCR 후 뇌 절편에 따라 패치 덩어리로 특징지어지는 단일 세포에서 동시에 10개의 유전자 발현을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 에티듐 브로마이드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 실험복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

single-cell-multiplex-reverse-transcription-polymerase-chain-reaction

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

고효율을위한 신뢰할 수있는...

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

뉴런 먼저 electrophysiologically 특징입니다. 그런 다음 기록된 신경 세포의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 이온 채널, 수용체에 대한 mRNAs의 표현을 감지하기 위해 전사 - PCR 분석을 반대를 받게됩니다.

단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

다중 전극 패치 클램프 녹음은 복잡한 작업을 구성한다. 여기에서 우리는 실험 단계의 많은 자동화함으로써, 성능과 녹음 수의 질적 향상으로 이어지는 프로세스를 가속화 할 수 방법을 보여줍니다.

컴퓨터를 이용한 다중 전극 패치 클램프 시스템

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

이 기사에서는 HEK293 세포를 사용한 전기생리학적 전체 세포 패치 클램프 기록으로 채널로돕신의 이온 선택도를 측정하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 음이온 선택성 채널로돕신의 염화물 선택성을 조사하기 위한 실험 절차를 설명합니다. 그러나 이 절차는 뚜렷한 선택성을 가진 다른 채널로돕신으로 이전할 수 있습니다.

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

이 프로토콜은 레이저 포획 미세 분면을 사용하여 높은 정확도와 해부학 적 특성으로 편도체의 중앙 핵에서 단일 뉴런, 마이크로 글리아 및 성상 세포를 수집하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 이 세포의 전사체의 부분 집합을 측정하기 위하여 미세 유체 성 RT-qPCR의 우리의 사용을 설명합니다.

레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

배우세요 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 기법으로 신경과학에서 개별 뉴런의 유전자 발현 프로파일을 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 뇌 조각에서 세포질 채취 후 RT-PCR을 통해 신경세포 다양성과 기능 특성을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

더 많은 동영상 탐색