Name: 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 기법으로 신경과학에서 개별 뉴런의 유전자 발현 프로파일을 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 뇌 조각에서 세포질 채취 후 RT-PCR을 통해 신경세포 다양성과 기능 특성을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

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원고에 대 한 그의 의견에 감사 박사 알렉산더 Mourot 하 고. 이 작품은 직원 회 드 라 검색 (ANR 2011 MALZ 003 01;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 ANR-15-CE16-0010 고 ANR-17-CE37-0010-03), BLG Fondation 부 라 검색 르 츠에서에서 친교에 의해 지원 됩니다. 우리는 IBPS (파리, 프랑스)의 동물 시설 감사.

저자는 공개 없다.

단일 셀 다중 RT-PCR 후 패치 클램프 동시에 하 고 확실 하 게 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 유전자의 표현을 조사할 수 있습니다. 단일 셀 수준에서 유전자 발현을 분석 고효율 PCR 뇌관을 요구 한다. 가장 제한 단계 중 하나를 셀의 내용의 모음입니다. 그것의 효율성은 셀 크기를 일치 하는 동안 가능한 한 크게 해야 패치 피 펫 팁의 직경에 따라 다릅니다. 1-2 µ m 오픈 팁 직경을 가진 펫은 가장 신경 종류에 적합 해야 입증 되었다. 또한 셀룰러 콘텐츠만 수집 되도록 필수적 이다 고 하지 주위 조직. 이 제어 electrophysiologically 수확 동안 단단한 물개를의 보존 하 여 이루어집니다. 피 펫 철수 더 동안 외부 아웃 패치 구성의 형성 세포 파편에서 수확된 세포질을 보호합니다. 멀티플렉스 RT-PCR는 또한 조사 셀 형식의 mRNAs 풍부에 따라 단일 셀의 성공률. 예를 들어, 항복 이다, 상대적으로 낮은 금액<s...

대뇌 피 질에는 다양 한 생리 적 프로세스에 관련 된 수많은 셀 형식을 구성 되어 있습니다. 그들의 식별 및 특성화, 그들의 특정 기능에 대 한 이해를 전제 조건 매우 도전 수 대뇌 피 질의 세포 유형1 특징 큰 형태, 생리, 및 분자 다양성 부여 2,,34.
단일 셀 다중 RT-PCR 패치 클램프와 RT-PCR 기술의 결합을 기반으로 합니다. 그것은 동시에 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 미리 정의 된 유전자의 표정을 프로브 수 있습니다. 기록 피 펫 추가에 신경 추적 프로그램의 포함 허용 조직화 학적인 계시6,7,,89, 후 기록 된 세포의 형태학 특성 10. 그것은 그들의 phenotypic 특성5,,910,11,12의 복수 변수 분석에 따라 신경 유형의 분류에 대 한 매우 유용한 기술입니다 ,,1314. 단일 셀 멀티플렉스 RT-PCR은 또한 이다15,,1617, 같은 비 신경 세포의 특성에 적합 하 고 거의 모든 뇌 구조18에 적용 될 수 있습니다. 19,20,21,22,23 및 셀 유형, 가정 그들은 전체 셀 구성에 기록 될 수 있습니다.
이 기술은 세포 소스의 식별 및 전송 시스템7,8,15,,1620,21, 목표에 대 한 매우 편리 하다 24,25,26,,2728, 특정 항 체 부족 하는 경우에 특히. 그것은 시각적으로 식별 된 셀29, 패치 클램프 기록에 의존 하며 따라서 또한 특정 세포 환경8,,1516셀을 대상으로 수 있습니다. 또한 뇌 조직의 cytoarchitecture 두뇌 분할 영역에 유지 됩니다, 이후이 방법은 또한 수 있습니다 신경 및 비 신경 요소7,8 특징이 세포의 해부학 적 관계의 연구를 , 18.
이 기술은 수확된 세포질의 크기와 RT의 효율에 의해 제한 된 있기 때문에, 낮은 복사 번호에서 표현 하는 mRNA의 검출은 어려울 수 있습니다. RNaseq 기술에 따라 다른 접근 분석 하는 단 세포3,4,,3031, 전체 transcriptome 있게 비록 그들은 반드시 높은 처리량 비싼 시퀀서 필요 모든 실험실을 사용할 수 있습니다. 단일 셀 다중 실시간 PCR 기술을 사용 하므로 끝점 PCR, 그것만 널리 thermocyclers를 요구 한다. 그것은 실험실을 갖춘 electrophysiological 설정에서 쉽게 개발 될 수 있다 하 고 비싼 장비가 필요 하지 않습니다. 그것은 제공할 수 있습니다, 어느 날, 내 유전자의 미리 정의 된 집합의 식에 대 한 질적 분석. 따라서,이 방법은 신속한 방식으로 단일 세포의 분자 특성에 대 한 쉬운 액세스를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>프라이머 설계를 위한</td> <td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td> 다중 정렬</tr>, <tr><td>디티오트레이톨</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr>, <tr><td>랜덤 프라이머</td>, <td>시그마-알드리치(머크)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr>, <tr><td>dNTP,</td><td>GE 헬스케어, 생명 과학</td><td>28-4065-52</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>RNasin 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II 역전사 효소</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합 효소</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>M5904-5ML</td><td>PCR PCR</td></tr><tr><td>프라이머</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td> <td>PCR / 탈염 및 200 &micro에서 희석; M</td></tr><tr><td>튜브, 0.5 mL, 플랫 캡</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>BT10 시리즈 - 10 &마이크로; L 필터 팁</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>BT20 시리즈 - 20 &마이크로; L 필터 팁</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>BT200 시리즈 - 200 & 마이크로; L 필터 팁</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>BT1000 시리즈 - 1000 &마이크로; L 필터 팁</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT 및 PCR</td></tr><tr><td>DNA 열 실린더</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>트리스-붕산염-EDTA 완충액</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>T4415-1L</td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>UltraPure 아가로스</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>&Phi; X174 DNA-Hae III 다이제</td>스트 <td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>코닥</td><td></td><td>아가로스 젤 전기영</td></tr>동 <tr><td>전기영동 전원 공급 장치 EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>미디 수평 전기영동 유닛 모델 SHU13</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td></td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>새틴 외관의 매끄러운 종이</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>60377</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N&프라임;,N&프라임-테트라아세트산</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>E3889</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>H4034</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>D-글루콘산 칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr> 염화<tr><td>마그네슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>5500 증기압 삼투압계</td><td>Wescor</td><td></td><td>패치 클램프 내부 솔루션</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>패치 클램프 내부 용액</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>S5016</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>D-(+)-포도당 일수화물</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>49159</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>S6191</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>60128</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>31437-M</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>인산 나트륨 일 염기성</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>S5011</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>염화 마그네슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>63069</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>염화칼슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>21115</td><td>슬라이스 준비</td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>패치 클램프 셋업 세척</td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 얇은 벽 유리 모세 혈관</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>BX51WI 정립 현미경</td><td>올림푸스</td><td></td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD B/W 비디오 카메라</td><td>Sony</td><td></td><td>패치 클램프</td></tr><tr><td>Axopatch 200B 증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 소프트웨어 제품군</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>E Series with Straight Body (holder)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>시그마-알드리치(Merck)</td><td>S7907</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td><td>성 시그마-알드리치(머크)</td><td>S8282</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td>P6148</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치(머크)</td><td>X100</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>냉수 생선 피부</td><td>에서 추출한 젤라틴Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 접합체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>조직화학적 계시</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>조직화학적 계시</td></tr></tbody></table>

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

대뇌 피 질은 수많은 종류의 세포 다양 한 형태, 생리, 및 분자 기능을 전시로 구성. 이 다양성에는 쉽게 식별 하 고 이러한 세포 유형, 그들의 특정 기능을 공부 하는 전제의 지장을 초래할 수 있습니다. 이 문서에서는 다중 단일 셀 반전 녹음 방송 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 프로토콜을, 패치 클램프 조각, 기록 후 허용 하는 단일 셀에 유전자의 수만의 표현을 동시에 감지 하는 설명 합니다. 이 간단한 방법 형태학 상 특성을 구현할 수 있다 고 널리 혈관 주변 등 다양 한 세포 유형 및 그들의 특정 세포 환경 phenotypic 특성 결정에 적용 됩니다. 이 프로토콜의 원리 기록 하 패치 클램프 기술 수확 및 역방향 셀의 세포질 내용 녹음 이며 질적으로 감지 하 여 유전자의 미리 정의 된 집합의 표현 다중 PCR. PCR 뇌관 및 RT-PCR과 호환 세포내 패치 클램프 솔루션의 설계를 필요합니다. 선택적이 고 신뢰할 수 있는 증명서를 위해 탐지,이 기술은 또한 증폭 단계에 수확 하는 세포질에서 적절 한 컨트롤을 필요 합니다. 여기서 설명 하는 조치를 엄격 하 게 따라야 합니다, 하지만 거의 모든 electrophysiological 실험실 다중 단일 셀 RT-PCR 기법을 사용할 수 있습니다.

멀티플렉스 RT-PCR의 대표 유효성 검사는 그림 3에 표시 됩니다. 프로토콜은 12 다른 유전자의 표현을 동시에 조사 하도록 설계 되었습니다. 기공을 글루타민 산 염 운송업 자 vGluT1 glutamatergic 신경42에 대 한 긍정적인 제어로 찍은. GABA 합성 효소 (GAD65와 갓 67), Neuropeptide Y (NPY), 및 Somatostatin (SOM) GABAergic 수3,,511의 표식으로 사용 되었다. Cyclooxygenase 2 효소 (COX-2) 피라미드 셀 하위 인구3,16</s...

이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

이 방법은 신경 집단을 특성화하거나 전달 시스템의 출처 및 표적을 식별하는 것과 같은 신경 과학 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포에서 미리 선택된 유전자 세트의 발현 프로파일을 빠르고 쉽게 결정할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법은 무작위 다양성 마우스에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.또한 성상교세포와 같은 다른 세포 유형 및 많은 동물 모델에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 이러한 시연은 데이터를 분석하기 위해 많은 양의 세포질이 필요하기 때문에 체포 및 포부 단계를 배우기 어려울 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 절편 전에 수술용 가위, 미세한 홍채 가위, 주걱 2개, 집게, 종이 필터 디스크 및 시아노아크릴레이트 접착제가 포함된 박리 키트를 준비합니다.그런 다음 얼음 냉간 절단 용액을 carbogyn으로 포화시키고 절단 챔버를 섭씨 영하 20도에서 냉각시킵니다. 다음으로 동물의 두피를 제거하고 두개골을 엽니다. 뇌를 조심스럽게 추출하여 발암성 얼음 냉간 절단 용액으로 채워진 작은 비커에 넣으십시오.그런 다음 섭씨 영하 20도에서 절단 챔버를 제거하고 종이 타월로 물기를 제거합니다. 관심 영역을 분리하기 위해 뇌를 조심스럽게 해부합니다. 절단 챔버에 붙이고 탄화한 얼음 냉간 절단 용액을 첨가하십시오.비브라톤을 사용하여 300 마이크로 미터 두께의 슬라이스를 잘라냅니다. 슬라이스를 실온에서 산소가 공급된 절단 용액으로 채워진 휴지 챔버로 옮기고 최소 30분 동안 회복되도록 합니다. 단일 세포 RT-PCR 및 표적 세포 특성화의 경우, mRNAse를 보존하기 위해 전체 세포 기록을 20분 이하로 제한합니다.녹음이 끝나면 2 마이크로 리터의 5xRT 믹스와 0.5 마이크로 리터의 20xDTT로 채워진 500 마이크로 리터 PCR 튜브를 준비합니다. 빙빙 돌려서 보관하세요. 그런 다음 부드러운 음압을 가하여 세포의 세포질을 수확합니다.단단한 밀봉을 유지하면서 세포의 내용물이 피펫으로 유입되는 것을 모니터링 및 제어하고 일부 유전자를 고려하는 경우 핵을 수집하지 마십시오. 유전자의 경우, 핵 수집을 피하고 일반적인 오염을 준비하기 위해 gDNA를 증폭하는 것을 목표로 하는 프라이머 세트를 포함하는 것이 필수적입니다. 핵이 피펫 끝에 가까워지면 음압을 해제하고 피펫을 멀리 이동시킵니다.단단히 밀봉된 상태가 유지되었는지 확인하고 새 피펫 위치에서 세포질 채

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표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

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여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

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여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

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배우세요 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 기법으로 신경과학에서 개별 뉴런의 유전자 발현 프로파일을 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 뇌 조각에서 세포질 채취 후 RT-PCR을 통해 신경세포 다양성과 기능 특성을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

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