패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

이 방법은 신경 집단을 특성화하거나 전달 시스템의 출처 및 표적을 식별하는 것과 같은 신경 과학 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 세포에서 미리 선택된 유전자 세트의 발현 프로파일을 빠르고 쉽게 결정할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 방법은 무작위 다양성 마우스에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 성상교세포와 같은 다른 세포 유형 및 많은 동물 모델에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 이러한 시연은 데이터를 분석하기 위해 많은 양의 세포질이 필요하기 때문에 체포 및 포부 단계를 배우기 어려울 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 절편 전에 수술용 가위, 미세한 홍채 가위, 주걱 2개, 집게, 종이 필터 디스크 및 시아노아크릴레이트 접착제가 포함된 박리 키트를 준비합니다.

그런 다음 얼음 냉간 절단 용액을 carbogyn으로 포화시키고 절단 챔버를 섭씨 영하 20도에서 냉각시킵니다. 다음으로 동물의 두피를 제거하고 두개골을 엽니다. 뇌를 조심스럽게 추출하여 발암성 얼음 냉간 절단 용액으로 채워진 작은 비커에 넣으십시오.

그런 다음 섭씨 영하 20도에서 절단 챔버를 제거하고 종이 타월로 물기를 제거합니다. 관심 영역을 분리하기 위해 뇌를 조심스럽게 해부합니다. 절단 챔버에 붙이고 탄화한 얼음 냉간 절단 용액을 첨가하십시오.

비브라톤을 사용하여 300 마이크로 미터 두께의 슬라이스를 잘라냅니다. 슬라이스를 실온에서 산소가 공급된 절단 용액으로 채워진 휴지 챔버로 옮기고 최소 30분 동안 회복되도록 합니다. 단일 세포 RT-PCR 및 표적 세포 특성화의 경우, mRNAse를 보존하기 위해 전체 세포 기록을 20분 이하로 제한합니다.

녹음이 끝나면 2 마이크로 리터의 5xRT 믹스와 0.5 마이크로 리터의 20xDTT로 채워진 500 마이크로 리터 PCR 튜브를 준비합니다. 빙빙 돌려서 보관하세요. 그런 다음 부드러운 음압을 가하여 세포의 세포질을 수확합니다.

단단한 밀봉을 유지하면서 세포의 내용물이 피펫으로 유입되는 것을 모니터링 및 제어하고 일부 유전자를 고려하는 경우 핵을 수집하지 마십시오. 유전자의 경우, 핵 수집을 피하고 일반적인 오염을 준비하기 위해 gDNA를 증폭하는 것을 목표로 하는 프라이머 세트를 포함하는 것이 필수적입니다. 핵이 피펫 끝에 가까워지면 음압을 해제하고 피펫을 멀리 이동시킵니다.

단단히 밀봉된 상태가 유지되었는지 확인하고 새 피펫 위치에서 세포질 채취를 다시 시작합니다. 다음으로, 피펫을 부드럽게 빼내어 세포 외 파편에 의한 오염을 제한하고 후속 조직-화학적 분석을 위해 세포막을 닫는 데 유리하도록 외부 아웃 패치를 형성합니다. nubs, micro-manipulator, computer keyboard 또는 computer mouse는 RNAase 오염의 양성자 전하 원인이라는 것을 명심하십시오.

녹음 중에 장갑을 만졌다면 장갑을 교체하십시오. 그런 다음 피펫을 착유기에 부착하고 양압을 가하여 내용물을 PCR 튜브로 배출합니다. 피펫의 끝을 PCR 튜브에 부수면 내용물 수집에 도움이 됩니다.

그런 다음 튜브를 잠시 원심분리하여 0.5마이크로리터의 RNAse 억제제와 0.5마이크로리터의 RTAse를 추가합니다. 부드럽게 섞고 다시 원심분리기를 한 다음 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 튜브를 돌리고 최대 몇 달 동안 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

PCR 분석 및 제 1 증폭 단계를 수행 할 때까지. PCR을 검증하려면 프라이머 쌍을 혼합 및 희석하고 단일 세포 RTPCR 전용 피펫으로 1마이크로몰을 추가합니다. 온도 순환기를 섭씨 95도에서 3분 동안 설정하고 40사이클을 실행한 다음 5분 동안 섭씨 72도에서 최종 연신율 단계를 수행합니다.

프라이머 이량체의 형성을 최소화하려면 섭씨 95도로 예열된 열 순환기에 PCR 튜브를 배치하여 핫 스타트를 수행합니다. 30초 후 오일 위에 프라이머 믹스 20마이크로리터를 빠르게 배출합니다. 프라이머 쌍이 검증되면 멀티플렉스 프로토콜로 테스트합니다.

외부 프라이머를 하나의 마이크로몰로 함께 혼합하고 희석합니다. 멀티플렉스 프라이머 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 최대 몇 주 동안 보관하십시오. 다음으로 프리믹스를 준비하여 얼음 위에 놓습니다.

PCR 튜브를 튕기고 회전시킨 후 미네랄 오일 2방울을 넣으십시오. 섭씨 95도에서 3분 후 PCR 사이클을 20회 실행합니다. 20마이크로리터의 멀티플렉스 프라이머 혼합물로 설명된 대로 핫 스타트를 수행합니다.

그런 다음 분석 중인 유전자의 수와 동일한 여러 개의 PCR 튜브를 준비합니다. 유전자당 1마이크로리터의 첫 번째 PCR 산물을 주형으로 사용하여 사전 혼합물을 준비합니다. 분석할 유전자의 수에 따라 모든 부피를 조정하고 파이펫팅 오류를 보상하기 위해 10%의 추가 부피를 사용하는 것을 고려하십시오.

부드럽게 흔들고 튜브를 돌린 다음 각 PCR 튜브에 80마이크로리터의 프리믹스를 분배합니다. 튜브의 벽이나 캡을 건드리지 않고 튜브당 미네랄 오일 두 방울을 추가합니다. 35 PCR 사이클을 실행 한 다음 20 마이크로 리터의 내부 프라이머 혼합물을 배출하여 핫 스타트를 수행합니다.

아라고스 겔 전기영동에 의한 두 번째 PCR 프로젝트를 분석합니다. 층 5 피라미드 뉴런은 큰 소마와 눈에 띄는 정점 수상석에 의해 시각적으로 식별되었습니다. 풀 셀 기록은 낮은 입력 저항, 오래 지속되는 활동 전위 및 뚜렷한 스파이크 주파수 적응을 가진 레이어 5 규칙적인 스파이크 뉴런의 전형적인 전기 생리학적 특성을 보여주었습니다.

이 뉴런의 분자 분석은 vGluT1의 발현을 밝혀 글루타마이터 표현형을 확인했습니다. 이 뉴런은 또한 소마토스타틴과 ATP1-알파-1 및 나트륨-칼륨 ATPA의 3개의 하위 단위를 발현했습니다. 기록된 뉴런의 바이오사이틴 라벨링은 피라미드 형태학을 확인했습니다.

글루타마이터 뉴런에서 예상한 바와 같이, 26개의 층-5개 피라미드 세포의 분자 분석에서 vGluT1의 발현이 밝혀졌지만 두 GAD는 모두 나타나지 않았습니다. 일단 기술은 제대로 형성된 경우 이틀 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 오염을 피하기 위해 매우 조심해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 세포질 수확, 역전사 및 핫스타트 PCR 후 뇌 절편에 따라 패치 덩어리로 특징지어지는 단일 세포에서 동시에 10개의 유전자 발현을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 에티듐 브로마이드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 실험복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.