Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사

여기에 제시된 절차의 전반적인 목표는 유전자 전사체 수준을 평가할 수 있도록 포자 발아 단계를 식별하는 것입니다. 이러한 변화에 대한 분석을 통해 질병 확산의 중요한 단계에 대한 추가 지식을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 유전자 전사체 수준의 변화와 관련이 있어 유전자 발현 제어의 변화를 반영하는 텔리오스포자 발아 중 전이에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 가시적 형태학적 스위치와 일치하지 않는 호흡 수준의 전이를 식별하고 뚜렷한 발아 단계에서 텔리오스포어를 물리적으로 격리할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 포자 발아의 주요 전이를 식별할 수 있기 때문에 병원체 전파 제어에 영향을 미치며, 이를 변경하면 질병 확산을 차단할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 옥수수 속대 감염, 텔리오스포자 채취, 텔리오스포자 생존력 및 발아 테스트로 이 절차를 시작합니다.

발아를 유도하려면 먼저 각 호흡 실험에 대해 동일한 양의 텔리오스포어의 무게를 측정합니다. 생물 안전 캐비닛에서 텔레오스포어를 오토클레이브 호흡실에 추가합니다. 챔버를 스트렙토마이신 설페이트와 카나마이신 설페이트를 첨가한 감자 포도당 육수로 채웁니다.

텔리오스포어(teliospore) 현탁액을 만들기 위해 위아래로 피펫팅합니다. 챔버 뚜껑을 챔버에 놓아 기밀 밀봉을 만듭니다. OCR 측정을 얻으려면 먼저 챔버를 수조 내부의 챔버 랙에 놓습니다.

그런 다음 산소 프로브를 챔버 입구 내부에 놓습니다. 센서 추적 속도 프로그램에 실시간으로 나타나는 데이터 포인트를 모니터링합니다. 프로브를 챔버에 넣은 후 약 3분 동안 프로브를 안정화시킵니다.

측정을 클릭하면 2초 간격으로 측정값이 기록되어 6시간 동안 지속적으로 산소 농도를 측정할 수 있습니다. 측정을 중지하고 분석할 각 샘플에 대해 이 단계를 반복한 후 데이터를 Microsoft Excel로 내보내고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다. 약 10mg의 umatus teliospores를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.

스트렙토마이신 설페이트가 보충된 500마이크로리터의 PDB에 텔리오스포자를 현탁시킵니다. 배지에 텔리오스포자 덩어리가 없을 때까지 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 텔리오스포어 현탁액을 스트렙토마이신 설페이트가 보충된 PDB가 함유된 자동 클레이브 250ml Erlin Meyer 플라스크로 옮깁니다.

플라스크를 섭씨 28도에서 밤새 배양하고 90RPM으로 흔듭니다. 페트리 접시 위에 5마이크로리터의 증류수 4-5방울을 피펫으로 뿌려 페트리 접시를 준비합니다. 그런 다음 샘플 수집에 사용할 Petri 접시에 2마이크로리터의 RNA 안정화 용액 방울 3개를 피펫팅합니다.

또한 페트리 접시에 발아하는 텔리오스포어의 30개의 5마이크로리터 방울을 피펫팅합니다. 페트리 접시에 미네랄 오일 15ml를 추가합니다. 계속하기 전에 모든 물방울이 오일로 덮여 있는지 확인하십시오.

다음으로, 15미크론 인터 직경, 1mm 플랜지, 55mm 길이 및 20도 팁 각도를 가진 미세 모세관을 준비합니다. 마이크로 모세관 홀더에 넣고 미네랄 오일에 담그면 모세관 작용으로 미네랄 오일이 미세 모세관에 들어갈 수 있습니다. 미세모세관을 물방울로 가져오기 전에 미세모세관의 압력을 해제하십시오.

마이크로 모세관을 물로 준비하기 위해 흡인합니다. micromanipulator의 컨트롤을 사용하여 준비된 미세 모세관을 발아 방울 중 하나로 이동하고 방울을 관통합니다. 미세모세혈관을 낮추고 미세모세관의 입을 관심 발아 단계에서 발아 텔리오포어까지 가져옵니다.

발아하는 텔리오스포자를 포착하기 위해 천천히 흡인합니다. 텔리오스포자가 미세모세혈관에 들어가면 흡인을 중지하십시오. 미세모세혈관에 약 5개의 텔리오스포자가 생길 때까지 반복합니다.

micromanipulator로 미세모세관을 들어 올려 RNA 안정화 용액의 수집 액적에 가져옵니다. 액적을 관통하고 텔리오스포자를 액자에 주입합니다. 약 1,000개의 텔리오스포자가 포착될 때까지 이 단계를 반복합니다.

채취 액적을 회수하려면 채취 액적을 피펫으로 올려 RNA의 DNA에 있는 무료 2.0ml microcenterfuge 튜브의 뚜껑으로 옮깁니다. 수집 방울을 방해하지 않고 피펫으로 미네랄 오일을 조심스럽게 사용하십시오. 텔리오스포자는 이제 RNA 분리와 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

이 플롯은 발아하도록 유도된 텔리오스포어의 현탁액에서 산소 수준 변화를 평가한 일반적인 결과를 보여줍니다. 유도되지 않은 텔리오스포어(teliospores)와 관련하여, 호흡 시작을 나타내는 분리는 약 30분에 발생합니다. 샘플을 산소 프로브로 설정하고 운반하는 데 약 15분이 걸리는 것을 고려하면 이 시간은 실제로 45분입니다.

여기에 표시된 것은 텔리오스포자 발아의 5단계입니다. 1단계에서는 텔리오스포어가 발아하도록 유도되지만 형태학적 발아 징후는 보이지 않습니다. 2단계 텔리오스포어(teliospore)는 텔리오스포어(teliospore)의 지름보다 작은 길이를 가진 출현한 전균사체(promycelium)를 보여줍니다.

3단계에서는 전균사체(promycelium) 길이가 텔리오스포자(teliospore)의 직경보다 큽니다. 4단계는 담자포자가 부착된 전균사(promycelia)가 특징입니다. 그리고 5단계에서는 담자포자(basidiospores)가 싹을 틔웁니다.

여기에서는 비동기적으로 발아하는 텔리오스포어(teliospore)가 표시되고 미세모세관(microcapillary)은 3단계 텔리오스포어(teliospore) 근처에 위치합니다. 그런 다음 3단계 텔리오스포어(teliospore)는 미세모세관으로 흡인되어 채취 용액 한 방울로 전달됩니다. 일단 숙달되면, 이 현미해부 기술은 6-7시간 내에 1, 000개의 스테이지 특이적 텔리오스포어를 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 자주 휴식을 취하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형태학적으로 구별되는 발아 단계에서 포자를 물리적으로 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그리고 호흡 시작 시점을 식별합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 불임 상태를 유지해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 그리고 인내심의 필요성과 현미해부에 의한 세포 유형 격리. 이 기술의 개발은 곰팡이 식물 병리학자들이 세계 식량 안보를 위협하는 파괴적인 검댕이와 녹 곰팡이에서 발아의 형태학적 및 분자적 측면을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 기술은 우리 리고마티스트에게 적용되지만, 매년 수십억 달러의 손실을 초래하는 다른 많은 파괴적인 농업 작물 병원체에도 사용될 수 있습니다. 이 절차에 따라 RNA 분리와 같은 다른 방법을 수행하여 전사체 수준 변화의 프로필과 타이밍과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.