Name: Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 미세호흡 분석 및 미세분리 기법을 사용하여 흑막병균 텔리오스포어 발아 단계를 식별하고 유전자 발현 변화를 연구하는 방법. 이 기술은 병원체 확산 제어에 중요한 대사 전환을 밝혀냅니다.

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우리는 그의 microrespirometer의 사용을 위한 닥터 폴 리와 니콜 바그너와 기술 지원에 대 한 알렉스 벨에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 투자는 NSERC 그랜트 B.J.S.에 의해

1. 옥수수 옥수수 속 감염
<ol><li>지 시 메이 스 (cv. 골든 자그마한) 성장까지 cobs 형성 되 고 실크 (약 60 일)를 시작 했습니다.</li>
	<li>호환 단일 미국 maydis 문화 긴장 이전 표준 프로토콜을 사용 하 여 설명7.</li>
	<li>앞에서 설명한7표준 프로토콜을 사용 하 여 옥수수 cobs 감염.</li>
</ol>2. teliospore 수확
<ol><li>고압 장비 (Büchner 퍼 널, Büchner 플라스 크, blenders, 250 mL 원심 분리기, 편평한 주걱, 병과 물) 표준 건조를 사용 하 여 적어도 30 분 살 균 121 ° C (물에 대 한 표준 액체 주기)에 주기.</li>
	<li>감염 된 속 식물 (약 28 ~ 35 일 게시 감염)에서 면도칼을 사용 하 여 제거 하 고 벤치 보호자에 덮여 쟁반에는 속 설정.</li>
	<li>면도날으로 속에서 있는 종양을 제거 하 고 비 커에서 수집.</li>
	<li>250 mL 실험실 믹서 기 컵 종양으로 약 1/3 전체 때까지 믹서 컵은 약 3/4까지 압력가 dH2O 추가 전체. 무 균 때까지 낮은, 믹서 기를 펄스는 종양을 방해.</li>
	<li>물 함정 그리고 1 L Büchner 플라스 크 진공 펌프를 연결 합니다.</li>
	<li>플라스 크에 큰 Büchner 퍼 널을 삽입 하 고 투박한 무명의 4 개의 층을 가진 Büchner 퍼 널의 바닥을 일렬로 세우십시오.</li>
	<li>진공 펌프를 켭니다.</li>
	<li>주걱으로 투박한 부스러기를 통해 무 균된 종양의 일부를 부 어.</li>
	<li>일부 dH2O을 통해 teliospores를 플러시 순서는 투박한 무명에 붓으십시오.</li>
	<li>DH2까지 반복 O는 투박한 무명을 통해 분명 하다.</li>
	<li>최대 teliospore 복구 되도록 필터에 무 균된 종양 물자를 포함 하는 투박한 아웃 찰 짜 십시오.</li>
	<li>1 L Büchner 플라스 크에 가까운 지 고 완전 한, 큰 삼각 플라스 크에 빈 고 따로 설정.</li>
	<li>투박한 무명의 새로운 조각을 필터에 넣고를 반복 (2.7-2.12) 단계는 종양의 모든 중단 하 고 필터링.</li>
	<li>압력가 250 mL 원심 병 및 5 분, 1000 x g에서 원심 분리기로 필터링 된 teliospores를 부 어 하 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>모든 필터링 된 teliospores는 수송과 원심 분리에 의해 때까지 2.14 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>적은 양의 물과 전송 50 mL 원심 분리기 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>5 분, 1000 x g에서 튜브 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>DH2O의 약 50 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고, 5 분, 1000 x g에서 튜브 원심는 상쾌한 가만히 따르다. 부드럽게 주걱와 그것의 dispose 회색 상위 레이어를 다쳤어요. 위에 회색 레이어는 더 이상 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>건조는 샘플 진공 desiccator에서 하룻밤.</li>
	<li>사용 될 때까지 4 ° C에서 건조 teliospores를 저장 합니다.</li>
	<li>
원하는 경우, 발 아를 유도 하기 전에 구리 황산 염8 teliospores을 취급 합니다. 치료 하지 않으면 다음 샘플 순수 teliospores 나타내고 박테리아 또는 다른 오염 없는 것인지 teliospores의 철저 한 현미경 분석을 수행 합니다.
	<ol>
<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 teliospores의 대략 50 밀리 그램을 무게.</li>
		<li>포함 하는 teliospores 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 0.75% CuSO4 의 약 1.0 mL를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽 3 h에 대 한 샘플 교 반 이어서 CuSO4 솔루션에는 teliospores를 일시 중단 하는 플라스틱.</li>
		<li>5 분 동안 2500 x g에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. Resuspend 살 균 물 teliospore 펠 릿, 원심 분리, 반복 하 고는 상쾌한 제거.</li>
		<li>단계 2.21.3 두 번 더 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. teliospore 생존 능력 및 발 아 시험
<ol><li>그들의 생존 능력을 평가 하는 1.5 mL microcentrifuge 관에서 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 발 아의 타이밍 무게.</li>
	<li>Biosafety 내각에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보충 감자 포도 당 국물 (PDB, 24 g/L)를 준비 합니다.</li>
	<li>PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 teliospores의 모든 덩어리 헤어 플라스틱.</li>
	<li>Teliospore 정지 압력가 250 mL 삼각 플라스 크는 PDB의 10 mL를 포함 전송.</li>
	<li>28 ° c 12-16 h 90 rpm 동요 플라스 크를 품 어.</li>
	<li>Biosafety 내각에서 발 아 하 고 현미경 슬라이드를 준비 하도록 유도 하는 teliospores의 20 µ L 샘플을 제거 합니다.</li>
	<li>
존재 하는 발 아의 단계 및 세균 오염 물질의 존재를 평가 시각적으로 현미경을 사용 하 여.
	<ol>
<li>teliospores의 수를 계산 하는 hemocytometer를 사용 하 여 V를 통해 나의 단계와 출 아 했다가지고 % 결정.</li>
		<li>경우에 단계 I teliospores는, teliospore 발 아를 평가 하기 전에 24 시간 총 플라스 크를 품 어 계속. 샘플을 실행 가능한 비 deeming 전에 최대 48 h에 대 한 보육을 계속 합니다.</li>
		<li>세균성 오염 있으면 스 황산 (160 µ g/mL) 뿐만 아니라 대 황산 (50 µ g/mL)와 PDB를 보충 하 고 단계 3.1 3.7 반복. 세균 오염 계속 되 면 황산 구리와 teliospores를 치료 하 고 단계 3.1 3.7를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 호흡 모니터링에 대 한 발 아의 유도
<ol><li>동일한 금액을 무게 (예., 50 mg) 각 호흡 실험에 대 한 teliospores의.</li>
	<li>Biosafety 내각에 압력가 호흡 약 실에 teliospores을 추가 합니다.</li>
	<li>채우기 PDB (24 g/L)와 챔버 스 황산 (160 µ g/mL)과 대 (50 µ g/mL)와 보충.</li>
	<li>아래로 teliospore 정지를 만드는 플라스틱.</li>
	<li>공기가 꽉 인감을 만들려고 챔버 챔버 뚜껑을 놓습니다.</li>
</ol>5. 산소 소비 속도 (OCR) 측정을 얻기
<ol><li>물 목욕 (28 ° C에 미리 데워) 내부 챔버 선반에 챔버를 놓습니다.</li>
	<li>O2 프로브는 챔버의 개통 안에 놓습니다.</li>
	<li>"SensorTrace 속도" 프로그램에 실시간으로에서 표시 하는 데이터 요소를 모니터링 하 고 프로브 (~ 3 분 후 프로브는 챔버에 배치 됩니다)을 안정화 하자.</li>
	<li>O2 수준을 지속적으로 6 h 2 s 간격 기록 측정 측정을 "측정"을 클릭 합니다.</li>
	<li>측정을 중지 하 고 각 샘플 분석을 위해 단계 4.1-5.4 반복 합니다.</li>
	<li>클릭 하 여 Microsoft Excel로 데이터를 내보내기 "파일 | 수출 | .Xls로 저장 "합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>
OCR을 계산
	<ol>
<li>"Within_Rates" 탭에서 내보낸된 Excel 파일에서 각 챔버 측정 (nmol/h)에 대 한 "속도"를 기록 합니다.</li>
		<li>각 실험 샘플에 대 한 수정 된 OCR 값을 얻기 위해 실험 시료 챔버의 "속도"에서 빈 챔버의 "속도"를 빼기 고이 숫자의 절대 값.</li>
		<li>Teliospores의 밀리 그램 당 총 OCR 대량 사용 하는 휴대 하 여 수정 된 절대 OCR 값을 나누어 계산 합니다.</li>
		<li>평균 각 변형에 대 한 "teliospores의 밀리 그램 당 OCR" 값을 복제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 통계적 방법을 사용 하 여 데이터를 분석 (예., 스튜던트 t-검정, 분산 분석) 다른 통계 소프트웨어의 Microsoft Excel을 사용 하 여.</li>
	<li>원시 데이터를 그래프, 그래프 하고자 하는 각 시간 점에 대 한 남아 있는 산소의 비율을 계산. 자체에 나누어 첫 번째 읽기 (100% 산소 남은) 100을 곱하면, 다음 첫 번째 독서에 나누어 각 후속 읽기 그리고 산소 챔버에 남아 %를 100을 곱하십시오.</li>
</ol>7. Teliospore 발 아 발 아의 다른 단계에서 Teliospores을 유도
<ol><li>PDB (24 g/L) biosafety 캐비닛에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보완을 준비 합니다.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 관으로 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 놓습니다.</li>
	<li>PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 매체에 teliospores의 아무 덩어리까지 피 펫.</li>
	<li>Teliospore 서 스 펜 션 스 황산으로 보충 하는 PDB를 포함 하는 압력가 250 mL 삼각 플라스 크에 전송.</li>
	<li>90 rpm에서 떨고 28 ° C에서 하룻밤 플라스 크를 품 어.</li>
</ol>8입니다. 페 트리 접시 및 Micromanipulator 준비
<ol><li>
Microcapillary 준비 및 샘플 컬렉션에 대 한 방울의 pipetting 행 페 트리 접시 (57 c m2)를 준비 합니다.
	<ol>
<li>페 트리 접시의 위쪽에 5 µ L (x 4) dH2O 방울 플라스틱.</li>
		<li>샘플 컬렉션에 사용할 페 트리 접시에 RNA 안정화 솔루션의 2 µ L (x3) 플라스틱</li>
		<li>페 트리 접시에 teliospores 출의 5 µ L (x 30) 물방울 플라스틱</li>
	</ol>
</li>
	<li>페 트리 접시에 미네랄 오일 15 mL를 추가 합니다. 모든 방울 진행 하기 전에 기름에 의해 보호 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>15 µ m 내부 직경, 1 mm 플랜지, 55 m m 길이와 각도 20 ° 팁 microcapillary microcapillary 홀더에 그것을 배치 하 고 미네랄 오일에 모 세관 작용 광 유는 microcapillary를 입력 하면 그것을 물속으로 준비 합니다. 물 방울을 가져오기 전에 microcapillary에서 압력을 릴리스 합니다. 준비 물으로 microcapillary 발음.</li>
</ol>9. 단계-특정 출 Teliospores의 격리
<ol><li>micromanipulator의 컨트롤을 사용 하 여 이동 준비 microcapillary 발 아 방울 중 하나. 작은 물방울을 관통 하 고 microcapillary, 낮은 관심의 발 아 단계에서 germinating teliospore까지 microcapillary의 입을 가져다.</li>
	<li>천천히 발음 germinating teliospore 캡처. 발음은 teliospore에서 microcapillary를 입력 했습니다 일단 중지 합니다. 약 5 teliospores는 microcapillary에 도착할 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>micromanipulator와 microcapillary를 RNA 안정화 솔루션의 컬렉션 방울을가지고. 드롭릿에 관통 하 고는 작은 물방울에는 teliospores를 주입.</li>
	<li>8.1 8.3 단계를 반복 하 여 약 1000 teliospores 체포 되었습니다.</li>
</ol>10입니다. 컬렉션 물방울의 복구
<ol><li>컬렉션 물방울을 pipette 고는 RNase/DNase 무료 2.0 mL microcentrifuge 튜브의 뚜껑을 전송. 조심 스럽게 컬렉션 물방울을 방해 하지 않고 한 피 펫과 미네랄 오일 제거.</li>
	<li>teliospores를 사용 하 여 RNA 격리 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한.</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 공개할 수 있다.

담 biotrophic 식물 병원 균을 일으킬 작물 손실에 수십억 달러의 매년. 이러한 병원 균의 대부분 곰 팡이 분산 및 유성 생식에 통합 되는 teliospores 생산. 개발의 지식과 teliospores의 발 아를 확보 하는 것이 이러한 곰 팡이로 인 한 치명적인 질병의 확산을 이해 중요 합니다. 주요 제어 지점에서 분자 변화를 파악 하기 위해 우리 생리 적 변화와 발 아의 다른 단계에서 teliospores을 다른의 타이밍을 식별 하는 방법을 고안 했다. 세토 외. 가벼운 현미경 검사 법 (그림 2)에 의해 발 아 teliospore의 (미 발표) 지적된 5 단계. 동안 생리 활성화를 조사 하기 위하여 단계 I 고 발 아 동안 호흡 속도 평가, 우리 사용 클라크-유형 microrespirometer 산소 소비량에서 변화를 정확 하 게 측정. 샘플 데이터는 우리의 방법은 정확 하 고 재현성 높은 나타냅니다. 우리의 연구 결과 미국 maydis</...

Smut 버섯 (Ustilaginales) 잔디, 옥수수, 보 리, 밀의 중요 한 곡물을 포함 한 작물 손실에 수십억 달러를 일으키는 감염 1600 이상의 종 이루어져 매년1. 이 균 류는 세포 벽을 착 음울는 분산 에이전트는 teliospores의 생산 특징입니다. Teliospores는 호스트 식물 사이의 분산의 스트레스 중 유전 물질을 방패로 작동 하 고 년2에 대 한 휴면 상태에 유지할 수 있습니다. 따라서, teliospores는 질병 확산의 필수적인 구성 요소.
Teliospore 생물학을 공부 하기 위하여 우리의 실험실 모델 smut 균을 Ustilago maydis (미국 maydis)은 '옥수수의 일반적인 검 댕' 질병의 인과 대리인을 이용 한다. 성숙한 미국 maydis teliospores 성장 검거, 감소 된 세포 물질 대사, 세포 호흡3의 낮은 수준에 의해 특징입니다. 유리한 환경 조건에서 (예., 특정 설탕의 존재), 미국 maydis teliospores 발 아 하 고 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 감수 분열, 생산 basidiospores 완료. 발은 증가 한 호흡, 대사를 반환 활동 및 발 아4의 현저한 형태학 단계를 통해 진행이 특징 이다.
그러나 증가 한 호흡 및 대사 기능을 포함 하는 발 아 초기 단계,, 변화의 형태학 표시가 없습니다. 원래 미국 maydis 에 호흡 변화 측정 50 년 전, 바르 부르 크 플라스 크 장치5와 manometrically 산소 소비량 측정 실행 되었다. 클라크-유형 microrespirometer을 사용 하 여 발 아의 시간 과정을 통해 산소 소비량을 측정 하 여 호흡 teliospore 발 아 동안에 정확한 변화를 공부 하 고 새로운, 간단한 방법을 개발 했습니다. 우리는 이전 야생-타입 사이의 호흡 속도에 변화를 공부 하이 메서드를 사용 미국 maydis 단일 세포 및 결함이 있는 미토 콘 드리 아6, 돌연변이가지고 여기에 프로토콜 teliospore 호흡 동안에 변화를 공부 하 발 아입니다. 이 우리가 발 아 초기 분자 이벤트 조사 개시 후 적절 한 시기에 teliospores을 타겟팅 할 수 있도록 호흡의 타이밍을 정확 하 게 식별 하는 수단을 제공 합니다. 일단은 promycelia, teliospore에서 나온다 하지만 비동기 자연 조사에 대 한 특정된 단계에서 충분 한 teliospores의 절연을 저해 발 아의 진행을 현미경으로 다음 수 있습니다. 우리는 비슷한 물리적으로 발 아의 고유한 형태소 단계에서 teliospores 수집을 체 외에서 수정에 사용 되는 기정 기법 개발.

<table><tbody><tr><td>스트렙토 마이신 황산염</td><td>BioShop</td><td>STP101</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신 황산</td><td>염 BioShop</td><td>KAN201</td><td></td></tr><tr><td>감자 포도당 육수</td><td>BD Difco</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>1 L Waring Laboratory 블렌더</td><td>Waring</td><td>7011S</td><td></td></tr><tr><td>치즈 천</td><td>VWR</td><td>470150-438</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 폴리 프로필렌 데시케이터 (스톱콕 포함</td>)<td>ThermoFisher Scientific</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>Unisense 미세호흡 시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세호흡 센서(O2)</td><td>Unisense</td><td>OX10</td><td></td></tr><tr><td>MicroOptode 미터 증폭기</td><td>Unisense</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MR-Ch 소형</td><td>Unisense</td><td>MR-Ch</td><td></td></tr><tr><td>센서추적 속도 소프트웨어</td><td>Unisense</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>미세호흡 랙</td><td>Unisense</td><td>MR2-Rack</td><td></td></tr><tr><td>미세호흡 교반기</td><td>Unisense</td><td>MR2-Co</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1 도립광 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse Manipulator</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>3축 교수형 조이스틱 오일 유압 미세 조작기</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>공압 마이크로인젝터</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>TransferTip (ES)</td><td>Eppendorf</td><td>5175107004</td><td></td></tr></tbody></table>

microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 teliospore 발 아 조사

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

흑 수병 균은 여러 가지 파괴적인 농업 질병의 etiological 대리인. 그들은 두꺼운 분산 에이전트는 teliospores의 생산에 의해 특징은. Teliospores는 수십 년 동안 휴면 유지 수 있습니다. 휴면 낮은 신진 대사 속도 의해 특징 이다, 생 합성 고분자를 일시 중지 하 고 호흡의 레벨을 크게 감소. 필요한 환경 신호를 받으면 teliospores 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 단일 셀을 생산 하는 출 아 할. Teliospore 발 아 생 합성 고분자, 증가 한 호흡 및 극적인 형태 변화의 재개에 의해 특징입니다. 발 아의 초기 단계에서 세포 호흡에 변화를 정확 하 게 측정 하기 위해 간단한 프로토콜 클라크-유형 respirometer 고용 개발 했습니다. 발 아의 나중 단계 특정 형태학 상 변화에 의해 구별 된다 하지만 발은 비동기. 우리는 뚜렷한 발 아 단계에서 teliospores를 수집 수 서 기술 개발.

우리는 휴면 teliospores 전시 호흡 (~ 1075 µ / h/mg) 출에 비해 낮은 수준 확인 teliospore 휴면 및 발 아 동안 호흡에 변화를 측정의 클라크-유형 microrespirometer 기반 방법을 사용 하 여, teliospores (~ 2,614 µ / h/mg; 그림 1A)입니다. 이 휴면 teliospores와 teliospores 발 아를 유도 하는 호흡의 평균 속도 ~2.4-fold 변화를 나타냅니다. 또한, 우리는 발 아를 유도 하는 teliospores 있는 ~ 45 분 지연 산소 통풍 관 (그림 1B)을 확인 했습니다. 이 뿐만 아니라 발 아의 유도 및 산소 측정의 시작 ~ 15 분 간격 ~ 30 분 지연 산소 통풍 관 (그림 1B)에 의해 표시 됩니다. 이 눈에 띄게 변...

Smut 버섯 많은 파괴적인 농업 질병을 일으킬. 그들은 환경 큐에 응답에 발 아 휴 teliospores로 분산 됩니다. 우리는 발 아 동안에 분자 변화를 조사 하기 위해 두 방법 개요: 호흡 증가 대사 활성화를 감지 측정 하 고 평가 고유한 형태소 단계에서 teliospores를 분리 하 여 분자 이벤트를 변경.

Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

여기에 제시된 절차의 전반적인 목표는 유전자 전사체 수준을 평가할 수 있도록 포자 발아 단계를 식별하는 것입니다. 이러한 변화에 대한 분석을 통해 질병 확산의 중요한 단계에 대한 추가 지식을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 유전자 전사체 수준의 변화와 관련이 있어 유전자 발현 제어의 변화를 반영하는 텔리오스포자 발아 중 전이에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 가시적 형태학적 스위치와 일치하지 않는 호흡 수준의 전이를 식별하고 뚜렷한 발아 단계에서 텔리오스포어를 물리적으로 격리할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 포자 발아의 주요 전이를 식별할 수 있기 때문에 병원체 전파 제어에 영향을 미치며, 이를 변경하면 질병 확산을 차단할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 옥수수 속대 감염, 텔리오스포자 채취, 텔리오스포자 생존력 및 발아 테스트로 이 절차를 시작합니다.발아를 유도하려면 먼저 각 호흡 실험에 대해 동일한 양의 텔리오스포어의 무게를 측정합니다. 생물 안전 캐비닛에서 텔레오스포어를 오토클레이브 호흡실에 추가합니다. 챔버를 스트렙토마이신 설페이트와 카나마이신 설페이트를 첨가한 감자 포도당 육수로 채웁니다.텔리오스포어(teliospore) 현탁액을 만들기 위해 위아래로 피펫팅합니다. 챔버 뚜껑을 챔버에 놓아 기밀 밀봉을 만듭니다. OCR 측정을 얻으려면 먼저 챔버를 수조 내부의 챔버 랙에 놓습니다.그런 다음 산소 프로브를 챔버 입구 내부에 놓습니다. 센서 추적 속도 프로그램에 실시간으로 나타나는 데이터 포인트를 모니터링합니다. 프로브를 챔버에 넣은 후 약 3분 동안 프로브를 안정화시킵니다.측정을 클릭하면 2초 간격으로 측정값이 기록되어 6시간 동안 지속적으로 산소 농도를 측정할 수 있습니다. 측정을 중지하고 분석할 각 샘플에 대해 이 단계를 반복한 후 데이터를 Microsoft Excel로 내보내고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다. 약 10mg의 umatus teliospores를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.스트렙토마이신 설페이트가 보충된 500마이크로리터의 PDB에 텔리오스포자를 현탁시킵니다. 배지에 텔리오스포자 덩어리가 없을 때까지 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 텔리오스포어 현탁액을 스트렙토마이신 설페이트가 보충된 PDB가 함유된 자동 클레이브 250ml Erlin Meyer 플라스크로 옮깁니다.플라스크를 섭씨 28도에서 밤새 배양하고 90RPM으로 흔듭니다. 페트리 접시 위에 5마이크로리터의 증류수 4-5방울을 피펫으로 뿌려 페트리 접시를 준비합니다. 그런 다음 샘플 수집에 사용할 Petri 접시에 2마이크로리터의 RNA 안정화 용액 방울 3개를 피펫팅합니다.또한 페트리 접시에 발아하는 텔리오스포어의 30개의 5마이크로리터 방울을 피펫팅합니다. 페트리 접시에 미네랄 오일 15ml를 추가합니다. 계속하기 전에 모든 물방울이 오일로 덮여 있는지 확인하십시오.다음으로, 15미크론 인터 직경, 1mm 플랜지, 55mm 길이 및 20도 팁 각도를 가진 미세 모세관을 준비합니다. 마이크로 모세관 홀더에 넣고 미네랄 오일에 담그면 모세관 작용으로 미네랄 오일이 미세 모세관에 들어갈 수 있습니다. 미세모세관을 물방울로 가져오기 전에 미세모세관의 압력을 해제하십시오.마이크로 모세관을 물로 준비하기 위해 흡인합니다. micromanipulator의 컨트롤을 사용하여 준비된 미세 모세관을 발아 방울 중 하나로 이동하고 방울을 관통합니다. 미세모세혈관을 낮추고 미세모세관의 입을 관심 발아 단계에서 발아 텔리오포어까지 가져옵니다.발아하는 텔리오스포자를 포착하기 위해 천천히 흡인합니다. 텔리오스포자가 미세모세혈관에 들어가면 흡인을 중지하십시오. 미세모세혈관에 약 5개의 텔리오스포자가 생길 때까지 반복합니다.micromanipulator로 미세모세관을 들어 올려 RNA 안정화 용액의 수집 액적에 가져옵니다. 액적을 관통하고 텔리오스포자를 액자에 주입합니다. 약 1,000개의 텔리오스포자가 포착될 때까지 이 단계를 반복합니다.채취 액적을 회수하려면 채취 액적을 피펫으로 올려 RNA의 DNA에 있는 무료 2.0ml microcenterfuge 튜브의 뚜껑으로 옮깁니다. 수집 방울을 방해하지 않고 피펫으로 미네랄 오일을 조심스럽게 사용하십시오. 텔리오스포자는 이제 RNA 분리와 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.이 플롯은 발아하도록 유도된 텔리오스포어의 현탁액에서 산소 수준 변화를 평가한 일반적인 결과를 보여줍니다. 유도되지 않은 텔리오스포어(teliospores)와 관련하여, 호흡 시작을 나타내는 분리는 약 30분에 발생합니다. 샘플을 산소 프로브로 설정하고 운반하는 데 약 15분이 걸리는 것을 고려하면 이 시간은 실제로 45분입니다.여기에 표시된 것은 텔리오스포자 발아의 5단계입니다. 1단계에서는 텔리오스포어가 발아하도록 유도되지만 형태학적 발아 징후는 보이지 않습니다. 2단계 텔리오스포어(teliospore)는 텔리오스포어(teliospore)의 지름보다 작은 길이를 가진 출현한 전균사체(promycelium)를 보여줍니다.3단계에서는 전균사체(promycelium) 길이가 텔리오스포자(teliospore)의 직경보다 큽니다. 4단계는 담자포자가 부착된 전균사(promycelia)가 특징입니다. 그리고 5단계에서는 담자포자(basidiospores)가 싹을 틔웁니다.여기에서는 비동기적으로 발아하는 텔리오스포어(teliospore)가 표시되고 미세모세관(microcapillary)은 3단계 텔리오스포어(teliospore) 근처에 위치합니다. 그런 다음 3단계 텔리오스포어(teliospore)는 미세모세관으로 흡인되어 채취 용액 한 방울로 전달됩니다. 일단 숙달되면, 이 현미해부 기술은 6-7시간 내에 1, 000개의 스테이지 특이적 텔리오스포어를 분리하는 데 사용할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 자주 휴식을 취하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형태학적으로 구별되는 발아 단계에서 포자를 물리적으로 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그리고 호흡 시작 시점을 식별합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 불임 상태를 유지해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 그리고 인내심의 필요성과 현미해부에 의한 세포 유형 격리. 이 기술의 개발은 곰팡이 식물 병리학자들이 세계 식량 안보를 위협하는 파괴적인 검댕이와 녹 곰팡이에서 발아의 형태학적 및 분자적 측면을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 기술은 우리 리고마티스트에게 적용되지만, 매년 수십억 달러의 손실을 초래하는 다른 많은 파괴적인 농업 작물 병원체에도 사용될 수 있습니다. 이 절차에 따라 RNA 분리와 같은 다른 방법을 수행하여 전사체 수준 변화의 프로필과 타이밍과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

investigating-teliospore-germination-using-microrespiration-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

효모 세포의 미세 조작은 diploid의 zygotes을 선택 meiotic 유전 분석 또는 필요합니다. 이러한 micromanipulations은 해부 현미경의 microneedle를 사용하여 수행됩니다. microneedle는 세포를 재배치하는 데 사용됩니다 및 자동화의 다양한 학위와 함께 사용할 수 있습니다 micromanipulator에 의해 제어됩니다.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

출처: Wen, J., Pasman, et. al., Bacillus subtilis 포자의 제르미노솜 및 내막 시각화. J. Vis. Exp. (2019년)이 비디오는 박테리아 포자 내에서 발아 단백질의 조직을 밝히는 3차원 형광 이미지를 획득하기 위해 구조화된 조명 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다.

박테리아 포자 내막의 발아 단백질 시각화

여기에서는 박테리아 포자 발아 중 환원당의 존재를 감지하기 위한 비색 분석법을 설명합니다.

세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

이 프로토콜 추적에 의해 모니터링 활력 매개 변수 및 저압 플라즈마 처리 후 새 균의 subtilis 포자를 되살리는에서 DNA 복구 프로세스의 관련성을 평가 하는 데 필요한 중요 한 연속 단계를 보여 줍니다. 형광 표시 DNA 복구 시간 해결 confocal 현미경 검사 법 및 전자 현미경 검사를 통해 단백질.

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.

매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

여기 우리는 초보자에 대 한 프로토콜 Streptomyces약리학 중요 한 세균 속에 대 한 형질을 시작 하는 연구원을 제시.

Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

'Germinosomes' 새 균의 subtilis 포자의 내부 막에서에 germinant 수용 체 단백질 클러스터. 우리는 슈퍼 해상도 현미경 및 형광 기자 단백질 germinosomes 시각화를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 또한 우선적으로 막 염료 FM4-64와 스테인드 포자 내부 막 도메인을 식별 합니다.

Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 종자에서 배유 세포층의 온전한 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주사 바늘 및 정밀 겸자와 같은 일반적인 실험실 장비만 필요하며 개발 중인 종자와 성숙한 종자 모두에서 배유 세포의 고해상도 형광 라이브 셀 이미징을 가능하게 합니다.

Preparation of intact tissue for microscopic analysis of the endosperm cell layer in Developing and mature Arabidopsis seeds(개발 및 성숙한 애기장대 종자에서 배유 세포층의 현미경 분석을 위한 온전한 조직의 준비)

배우세요 미세호흡 분석 및 미세분리 기법을 사용하여 흑막병균 텔리오스포어 발아 단계를 식별하고 유전자 발현 변화를 연구하는 방법. 이 기술은 병원체 확산 제어에 중요한 대사 전환을 밝혀냅니다.

Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사

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