Name: Immunostimulatory 에이전트 평가: 림프 조직 추출 및 주입 경로-종속 수지상 세포 활성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 쥐의 종격 림프절 분리 기술을 이용하여 면역 자극 나노물질 투여 후 수지상 세포 활성화를 평가하는 방법을. 이 기법은 면역학 연구에서 림프 조직 분석에 필수적입니다.

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이 연구는 창작 자료 검색 프로그램 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 과학의 부, 정보 통신 및 미래 계획 (NRF-2017M3D1A1039421)와 해양 생명 공학 프로그램에 의해 자금을 자금에 의해 지원 되었다는 사역의 바다 수 산업, 한국 및 그랜트 (20150220).

동물 처리, 희생, 및 기관 격리를 포함 하 여 모든 실험 절차는 국제 동물 관리 및 사용 위원회 상하이 보건 임상 센터와 서울 아산 병원의 규칙에 따라 수행 했다. 연구 프로토콜 상하이 보건 임상 센터에서 동물 실험의 윤리에 해당 위원회에 의해 승인 되었다 (마우스 프로토콜 번호: SYXK-2010-0098) 아산 의료 센터 (2016-02-168).
1입니다. 자료의 준비
참고: 나노 보조, INP, 자기 조립된 지질-DNA 캐리어, 즉 U4T의 구성 및 CpG 모티브 포함 oligonucleotide, eCpG, 마우스2에서에서 immunotherapy, 예방접종에 대 한 적절 한 주입 경로 테스트를 현재 연구에서 고용 했다 . 중요 한 것은, 항 원, 항 체, 및 보조 에이전트와 같은 다른 잠재적인 치료 분자 INP 대체 하실 수 있습니다 하 고 아래 설명 된 동일한 방법론을 사용 하 여 테스트.
<ol><li>INP 정립2,,47<ol>
<li>Anneal U4T (160 µ M, 캐리어) eCpG (80 µ M, TLR9 주 작동 근 시퀀스가 포함 된)와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4)와 MgCl2 (2 mM) x 1의 존재. 어 닐 링에 대 한 표준 볼륨 PCR 튜브에서 50와 110 µ L 사이입니다. 10 분 동안 95 ° C에 혼합물을가 열 하 고 천천히 thermocycler는을 사용 하 여 25 ° C를 (1 ° C/16 분)을 냉각. 어 닐 링 프로토콜 약 2 시간을 요구 한다. 주의: U4T 포함 된 액체 매우 거품 이며 신중 하 게 처리 되어야 합니다.</li>
		<li>INP 준비; 50 µ L aliquots를 확인 각 주입에 대 한 자료의 50 µ L을 사용 합니다. 참고: 경우 주입 당 100 µ L, 재료의 적절 한 계산 단계 1.1 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 일반 동물 절차
참고: 쥐를 처리 하기 위한 대체 방법은 실험실 요구 사항 및 승인 된 동물 프로토콜8에 따라 사용할 수 있습니다. 사용 하는 마우스의 유형은 이다 6 주 된 C57BL/6과 여성 쥐.
<ol><li>재료의 목록<ol>
<li>액체 마 취 제 (isoflurane), 마 취 기계, 이산화탄소 (CO2) 흡입 챔버, 멸 균된 거 즈, 집게, 마우스 restrainer, 장갑, 갈고리 집게, 1 인치 해가 위, 2-인치 해가 위, 알코올에 대 한 준비 살 균, 그리고 인슐린 주사기입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>흡입 마 취 참고: 마 취는 intranasal, 피하, 노상 강도, 그리고 쥐9정 맥 주사에 대 한 필수. 기화 기 기계와 산소 탱크 연결 유도 챔버를이 절차에 사용 됩니다.<ol>
<li>유도 챔버에서 동물을 놓고 단단히 뚜껑을 닫아야 합니다.</li>
		<li>1 L/min에 산소 흐름을 isoflurane에 대 한 4%의 유도 단계로 기화 설정을 설정 합니다.</li>
		<li>동물 동물 무게;에 따라 챔버에의 노출 시간을 다 그러나, 이상의 10의 노출 및 5 분 마다 모니터링은 마 취10필요. 참고: 없음 페달 반사 성공적인 마 취를 나타냅니다.</li>
		<li>Isoflurane 인덕터를 끄고 직원 노출 isoflurane 가스를 방지 하기 위해 산소 1 L/min 흐름.</li>
	</ol>
</li>
	<li>희생<ol>
<li>CO2 흡입 희생 "지침에 대 한 안락사의 설치류를 사용 하 여 이산화탄소" NIH에 따라 챔버 준비11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 희생 완전히 확인 테스트 개 그 응답.<ol>
<li>마우스의 발 끝을 곤란 하 고 개 그 응답을 확인 하 여 희생 제대로 확인 하십시오. 응답 경우 2.2 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소독<ol>
<li>주사 또는 알코올 스프레이와 멸 균된 거 즈 해 사용 하는 모든 표면 영역을 치료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장기 저장<ol>
<li>집게를 사용 하 여 모든 지방 및 수확된 장기 주변 혈액 제거 하. 3 mL의 PBS로 가득 페 트리 접시에이 수확된 조직을 개별적으로 저장 합니다. 컨테이너와 미디어는 후속 절차 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 사출 노선
<ol><li>6 주입 방법을 사용 하 여 주입-종속 면역 반응 조사: 구강, intranasal, 피하, 노상 강도, 복, 그리고 정 맥8,,1213.</li>
</ol>4입니다. 절연의 림프절과 비장
참고: 사용 하 여 젊고 건강 한 마른 쥐 (6 주 이전)이 일반적으로 더 오래 된 쥐에 있는 림프절 주위를 구축 지방 하기 어렵기 때문에 제거 하 고 장기의 적절 한 시각화를 방지할 수 있습니다.
<ol><li>미리 수확 단계 참고:이 섹션 iLN, 장과 면역 자극을 분석 하기 위한 마우스에서 mLN의 수확 후 주입 설명 합니다. 2.3-2.5 희생에 대 한 단계를 참조 하십시오, 응답, 및 소독 방법 개 그.<ol>
<li>수술 폼 보드를 마우스의 사지를 고정 하 고 70% 에탄올과 마우스의 복 부 측을 소독.</li>
		<li>생식 기 지역 및 텐트 처럼 외부 피부 커버를 사용 하 여 연결 집게 위에 2 cm 위치를 선택 하십시오. 이 위치에는 대략 1 cm 컷을 확인 하 고가 위 (2 인치)는 피부를 더 절 개 상처 아래 슬라이드.</li>
		<li>외피, 잘라 세로로 위 (2 인치)의 두 팔을 가진 외부 피부를 통해. 복 막으로 덮여 내부 장기를 노출 합니다.</li>
		<li>피부의 바깥 레이어를 고정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
사 타 구니 림프절 (iLN)의 절연
	<ol>
<li>기울어진된 문자 'Y'으로 표시 되는 왼쪽된 다리를 내리고 혈관의 함께 다음 다리의 왼쪽에는 iLN을 찾습니다. 참고: 피하 주입 된 쥐에 대 한 주입 위치의 같은 쪽에 iLN 선택 합니다.</li>
		<li>덮여 지질 층을 벗 겨 엷은 노란색 iLN (콩 모양, 2 mm)를 수확 하 두 집게와 레이어를 발견. 후속 처리 및 조직의 저장 단계 2.6 참조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
비장의 절연 14<ol>
<li>텐트 사용 하 여 복 막의 중심에서 한 손에 집게를 연결 및 사용 하 여 작은 얇은 복을 다른 손에 (1 인치)가 위.</li>
		<li>파악 하는 창 고 마우스 복 부의 왼쪽된 상단에 부착 된 빨간 콩 같이 비장 (약 14 m m의 길이)를 찾으려고 그것을 뒤집어 왼손에 놓은 사용 집게.</li>
		<li>부드럽게 구부려 진된 집게와 다른 장기를 분리 하는 동안 오른손에 집게의 또 다른 세트와 함께 비장에 밖으로 당겨. 따라 단계 2.6 비장 저장 하. 참고: 관리는 필요한 때 수확 하는 비장, 그것 쉽게 손상 된 부드러운 기관으로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mediastinal 림프 노드 (mLN)의 절연 참고:는 mLN는 갈비뼈 아래 약 1cm 있으며 심장과 폐 등 다른 장기에 의해 덮여 있다. 위치와 작은 크기 때문에 그것은 신중 하 게 집게와가 위 (1 인치)를 사용 하 여 주변 영역을 노출 하는 것이 중요.<ol>
<li>막 고 갈비뼈에서 분리. 집게와 갈비뼈의 시체를 누른 다음 왼쪽 및 오른쪽 갈비뼈의가 (1 인치) 위로 잘라. 심 혼 및 폐를 노출 오른쪽에 마우스의 어깨 너머로 컷오프 갈비뼈를 고정 합니다. 참고: 주의 하지 잘라 심장과 폐, 주위 혈관의 혈액 유출 어려운 매우 작은 반투명 mLN를 찾을 수로. 어떤 혈관 잘립니다 경우 부드럽게 거 즈와 지역에서 혈액을 흡수.</li>
		<li>오른손에 갈고리 집게를 사용 하 여, 심 혼 및 폐는 오른쪽으로 부드럽게 백본 노출 될 때까지 플립. 왼손에 일반 집게의 쌍을 사용 하 여이 수확을 지원 하기 위해 오른손에 갈고리 집게와는 iLN을 제거.</li>
		<li>폐를 백본 널리 노출 될 때까지 그들을 플립. MLN (반투명 콩 모양의 구조 크기에 약 2 m m)는 폐와 척추 사이 있습니다.</li>
		<li>갈고리 집게는 mLN 주변 영역을 노출 하 고 조직을 추출 하는 다른 집게를 이용 한다. 참고:는 mLN 수확을 하기 전에 집게로 조심 스럽게 제거 해야 합니다 수많은 다른 조직에 의해 둘러싸여 있습니다.</li>
		<li>수확된 mLN 저장에 2.7 지침에 대 한 단계를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. cytometry에 대 한 샘플의 준비
참고: 수확된 iLN 장과 mLN에서 Dc의 활성화, 시험을이 조직의 단일 셀 정지는 스테인드 DC 특정 마커, co-stimulatory 분자, 및 중요 한 조직 적합성 항 체 형광 활용 된 복잡 한 분자 cytometry 분석.
<ol><li>
단일 셀 정지의 준비: 비장
	<ol>
<li>6 m m 문화 요리에 신선한 문화 매체 (CM)의 5 mL을 추가 하 고 얼음에 샘플을 놓습니다.</li>
		<li>주변 혈액과 지방 조직을 제거 하 고 조직 문화 접시의 뚜껑에 배치.</li>
		<li>조직의 작은 조각으로 잘라 (< 1 m m) 곡선가 위. 뒤에 회전 하는 PBS에 파편을 일시 중단 아래로 5 분 646 × g 에서 원심 분리기를 사용 하 여 및 제거는 상쾌한 조직.</li>
		<li>CM의 3 mL에 샘플을 다시 중단 하 고 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 콜라 4 20 분에 대 한 보충의 솔루션의 200 µ L 여 조각 소화.</li>
		<li>부드럽게 흔들 및 1 h. 필터링 나일론 메쉬를 통해 소화 조직에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어 (100 nm) 아래로 회전. PBS의 5 mL에 단일 셀을 세척 하 고는 상쾌한 원심 분리 하 여 제거.</li>
		<li>다시 솔루션을 분리 하는 세포의 5 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 수성 층으로 레이어 스택 형태로 명확한 세포 격리 솔루션의 5 mL의 또 다른 레이어를 다시 로드.</li>
		<li>10 분 구하는 가벼운 밀도 분수 상쾌한 2012 × g 에서 셀 준비 원심 (< 1.077 g/cm3), 이후의 흐름 cytometry 분석을 위해.</li>
		<li>hemocytometer 셀의 개수를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단일 셀 정지의 준비: 림프 노드
	<ol>
<li>5.1.1-5.1.2를 단계를 따릅니다.</li>
		<li>10 mL를 피펫으로 사용 하 여 3-4 회를 pipetting으로 세포를 일시 중단 하는 CM의 5 mL를 추가 합니다. 철저 하 게 중단 후 셀을 사용 하 여 살 균 나일론 메쉬 15 mL 원뿔 튜브에 컬렉션에 대 한 셀을 필터링.</li>
		<li>4 ° C에서 7 분 646 ×g 에서 아래로 셀 회전 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>10 mL 피펫으로 더 pipetting으로 세포를 일시에 CM의 추가 5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>PBS로 세척 하 고 셀의 수를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
교류 cytometry 분석
	<ol>
<li>Aliquot 0.5-1 × 106 셀 정렬 (FACS) 튜브 각 형광 활성화 된 세포로.</li>
		<li>5 분 동안 4 ° C에서 646 × g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
		<li>다시 셀 펠 릿과 소용돌이 일시 중단 하려면 셀에 5 µ L 희석 각각의 형광 활용 된 항 체 준비를 추가 합니다. 참고: 그것은 때문에 붙일 레이블된 항 체는 빛에 민감한 빛 노출 가능한 셀 펠 릿을 보호 하는 것이 중요. 항 체 마스터 믹스를 생성 하 고 항상 Fc 블록을 추가 합니다.</li>
		<li>FACS 버퍼 PBS, 열 비활성화 일반 FBS, 및 0.1% 나트륨 아 지 드의 1%의 100 µ L를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
		<li>30 분 린스 FACS의 2-4 mL와 함께 셀 버퍼링 및 4 ° c.에 7 분 동안 1700 rpm에서 샘플 원심 4 ° C에서 튜브에 샘플을 배치</li>
		<li>다시 어둠에 FACS 버퍼의 500 µ L에서 세포를 일시 중단 합니다. Cytometry 셀 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Preparation+of+dodecynyl+modified+DNA+nanoparticles+with+unmethylated+CpG+adjuvant+and+ovalbumin+for+immunostimulation%22">Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation</a>. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).</li>
<li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li>
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<li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , Veterinary Record. (2013).</li>
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<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10215/compound-administration-iii">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

나노기술과 면역학에서 많은 진보 약물 전달 및 immunostimulation의 치료 연구를 통해 달성 되었습니다. 주입 방법의 주의 깊은 선택이 현재 연구의 초점 이었다 immunostimulation에 대 한 중요 한 것으로 알려져 있다.
다른 주입 경로 자연스럽 게 비-독성 및 생 분해성 DNA 기반 소재에 대 한, INP (immunostimulatory 나노), 최고의 결과 굴복 하는 어떤 경로 확인 평가 했다. 이 접근은 또한 항 체, 항 원, 또는 다른 adjuvants을 포함 하 여 다른 치료제를 제공 하기 위한 관련.
이러한 주사 면역 반응 분석, 림프 조직 (비장, iLN, 및 mLN)의 수확이 필요 합니다. 림프 조직의 고립이이 프로토콜의 가장 중요 한 측면 이며 자세히 하지 이전 설명 되어 있는 기술의 사용을 요구. 또한, 면역 세포를 더 분석을 위한 단일 세포 현 탁 액의 준비 잘 설명 되지 않았습니다. 이...

면역학 및 나노 의학, 약물 전달 및 immunostimulation를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 새로운 치료 전략의 지도 있다. 관리 경로 최적화 immunostimulatory 요원의 효능에 영향을 미치는 중요 한 측면 이다. (INP)로 구성 된 DNA immunostimulatory 나노 자기 조립 microphase 별거에 의해 지질-DNA1amphiphilic 구조 때문에 새로 개발된 된 나노 면역 보조 제 이다. 따라서, INP는 소재1 vivo에서 다른 경로 통해와 같은 사 타 구니 림프절 (iLN), mediastinal LN (mLN), 그리고 비장, 적절 한 조직의 수확에 대 한 세 가지 절차의 관리와 관련 된 프로토콜 설명. 마지막으로,이 조직 면역 시스템에 가장 강력한 항 원 제시 세포 수지상 세포 (DC) 활성화를 위해 분석 되었다. 이 프로토콜은 또한 항 원, 항 체, 또는 다른 면역 adjuvants2평가 하는 데 적용할 수 있습니다.
그것은 위대한 약속 표시는 에이전트 때문에 INP 공식 테스트. INP는 수용 체 통행세 같이 9 (TLR9) immunostimulation의 어떤 평가 대 한 효능은 다른 주입 방법3을 테스트 하는 데 필요한 핵 산을 포함 하는 보조 자료. 이러한 맥락에서 Dc의 자극은 비보에 평가 대 한 강력한 끝점입니다. 항 원 또는 immunostimulatory 분자는 주변 조직이 나 혈액에 DCs에 의해 phagocytosed, 후이 세포 림프 기관 장과 LNs4,5등을 마이그레이션합니다. 따라서, DC 활성화 비장, iLN, 및 주입 된 동물의 mLN에서 분석 했다. 제대로 수확이 조직의입니다 그러므로 또한 새로운 보조 또는 병원 체5에 면역 반응을 평가 하기 위한 중요 한. 이러한 조직 수확도 암 치료로 서 소설 면역학 방법론을 개발 하기 위해 중요 하다. 또한,이 프로토콜 안티 인간 면역 결핍 바이러스 치료제6같은 다른 약물의 효율성을 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td><강>재료</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염</td>수 <td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td>세척 기관</td></tr><tr><td>(PBS, pH 7.4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 용액&nbsp;</td><td>Aesica Queenborough Limited</td><td>26675-46-7</td><td>마취 과정</td></tr><tr><td>투베르쿨린 1mL 주사기 -</td><td>정림</td><td>N/A</td><td>주입</td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브&nbsp;</td><td>S.P.L</td><td>50050</td><td>마취 과정</td></tr><tr><td>1mL 인슐린 주사기&nbsp;</td><td>(BD Ultra-FineTM&shy;II)_short 바늘</td><td>324826</td><td>근육 주사</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당</td><td>Hyclone</td><td>SH30081.01</td><td>장기 저장</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>FACS 분석</td></tr><tr><td>에틸 알코올 무수 99.5 %&nbsp;</td><td>대중</td><td>4022-4110</td><td>소독제</td></tr><tr><td><강력한>장비</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FineCycler C100 (Thermocycler)</td><td>Ssufine-Anealing</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>FACS tube&nbsp;</td><td>FALCON</td><td>2052</td><td>FACS 분석</td></tr><tr><td>자동 고성능 유세포 분석기</td><td>BD(미국), FACSVerse-FACS</td><td></td> <td>분석</td></tr></tbody></table>

immunostimulatory 에이전트 평가: 림프 조직 추출 및 주입 경로-종속 수지상 세포 활성화

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Immunotherapy 또는 예방 접종에 대 한 새로운 치료 대리인의 평가, 대 한 림프 조직에서 면역 세포 활성화의 분석은 필수적입니다. 여기, 우리는 마우스에서 다른 관리 경로에서 나노 입자 형태로 소설 지질-DNA immunostimulant의 면역 효과 조사: 구강, intranasal, 피하, 노상 강도, 복, 그리고 정 맥. 이러한 주사 직접 영향을 미치는 면역 반응, 그리고 수확 하는 림프 조직 하 고 조직에 수지상 세포 (DC) 활성화의 분석은 이러한 평가의 중요 한 부분. Mediastinal 림프 노드 (mLNs)의 추출은 크기와이 오르간의 위치 때문에 중요 하 그러나 매우 복잡 한. 사 타 구니 림프절 (iLN)만 대, 그리고 비장을 수확 cytometry에 의해 DC 활성화를 분석 하기 위한 단계적 절차를 설명 합니다.

INP 림프 조직 DC 활성화에 대 한 적절 한 주입 경로 평가 하려면 혈통으로 DC 인구는 -로 정의 된 CD11c+ , iLN, 장과 mLN에서 세포 및 co-stimulatory 분자의 식 수준 분석. INP 피하 (사우스 캐롤라이나) 및 정 맥 (i.v.) 주입의 치료 (그림 2B 와 2c) 장과 iLN Dc에 CD40, CD80 그리고 CD86 식에 상당한 증가 승진. 노상 강도 그리고 INP 또한 상당히 업 규제 CD40, CD80, 그리고 CD86 장과 iLN Dc에서의 식 수준 PBS 처리 제어 (그림 2B와 2c)에 비해의 복 (i.p.) 주입. 자극된 mLN Dc, intranasal (i.n....

Immunostimulating 접한의 치료 후 림프 조직의 림프 수지상 세포 활성화 테스트 후속 추출에 대 한 실험 절차를 설명 합니다.

Immunostimulatory 에이전트 평가: 림프 조직 추출 및 주입 경로-종속 수지상 세포 활성화

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

이 절차의 전반적인 목표는 마우스에서 내선 림프절을 격리하는 데 필요한 독특한 기술을 숙지하는 것입니다. 수술은 마우스의 6개의 다른 경로에 면역 자극제 물질을 주입한 후에 수행되었습니다. 이 연구에서는 나노 크기의 구조를 형성하는 새로운 종류의 물질을 사용했습니다.계면활성제는 친성모성 헤드 그룹과 소수성 꼬리로 구성됩니다. 그 형태 구형 미셀 또는 microphage 분리로 인해 다른 이차 구조. 우리는 DNA인 생체 거대 분자에 이 속성을 이용했습니다.여기에 나타난 DNA 수륙양용은, A, C, G, T와 같은 일반 뉴클레오티드로서, 지질 변형 신경세포 뉴클레오베이스가 소수성 단위로 작용하는 동안 소수성 블록을 가지고 있다. 수정된 올리고는 대규모 옥토그램에서 DNA 신디사이저에 의해 합성되었다. 양용성 지질 DNA는 나노 크기의 구형 미켈을 자발적으로 형성한다.미셀이 형성되면 DNA는 직경이 약 10 나노미터인 빈 운반체로 단일 좌초 상태로 유지됩니다. 면역 자극제를 가진 담체를 장착하기 위하여는, 전화와 같은 수용체 9 부관 즉 eCpG로 DNA 순서를 확장하는 간단한 문제입니다. 지질 DNA 및 eCpG 염기는 여기에 그러므로 미셀의 외부 표면은 CpG 서열로 저하됩니다.그런 다음 이 면역 자극 나노 입자를 INP로 지정합니다. 면역 반응을 위한 INP의 적절한 방법을 결정하기 위해 우리는 64개의 주사 경로에서 마우스에 INP를 주입하고 결과적으로 적절한 림프절 조직을 분석하였다. 자세한 주입 지침은 2012년 찰스 리버가 발행한 JOB 기사를 찾아보시기 바랍니다.이 비디오의 주요 장점은 심강절을 얻는 방법을 시각적으로 보여주는 것입니다. 비디오는 많은 사람들이 장기를 고립시키는 데 어려움을 발견하는 중질 림프절의 위치를 명시적으로 보여줍니다. 모든 실험은 상하이 공중 보건 임상 센터 또는 울산 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.이 부분은 면역 분석에 중요한 기관 또는 조직의 특정 위치를 보여줍니다. 비장과 두 개의 림프절이 격리됩니다. 우선, 생쥐는 이산화탄소 흡입 안락사에 의해 희생되었고, 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지도에 따라 고통을 최소화하기 위한 모든 노력이 이루어졌습니다.지금부터 장기를 찾아 그들을 격리합시다. 먼저 작동 데스크의 마우스를 마우스 손바닥에 4개의 핀으로 올바르게 고정합니다. 해부 부위를 알코올로 살균합니다.마우스 복부의 바닥을 큰 크기의 가위로 바깥쪽 덮개를 해부합니다. 집게를 사용하여 부착의 양면을 열고 작동 테이블에 핀으로 고정합니다. 잉구인 림프절의 위치는 왼쪽 다리를 향해 내려가는 혈관의 결합을 찾아서 노출됩니다.혈관의 모양은 기울어진 알파벳 문자 Y.가 집게로 층을 발견하고 피부에서 당겨 처럼 보입니다. 내부 장기를 노출하기 위해 작은 가위로 회중을 잘라냅니다. 집게를 사용하여 창자를 오른쪽으로 이동한 다음 복부의 왼쪽, 왼쪽 상단에 표시되는 모양의 비장으로 감쌉니다.비장은 쉽게 방해하기 쉽기 때문에 시술 중에 추가주의가 필요합니다. 마지막으로이 비디오의 핵심 포인트 : 중간 림프절을 수확. 그것은 그것의 작은 크기와 다소 숨겨진 위치 때문에 보기 어려운 폐의 상부 아래에 위치 하 고 있습니다.작은 가위와 집게를 사용하여 부위를 조심스럽게 노출시합니다. 갈비뼈와 다이어프램의 양면을 잘라냅니다. 가슴 위에 갈비뼈를 잘라.절차 도중 반투명 한 중질 림프절을 찾아 사이트를 장님수 있기 때문에 손상 심장과 혈관을 피하십시오. 우연히 혈관이 터지면 거즈로 혈액을 부드럽게 닦아냅니다. 폐의 왼쪽을 잡고 부드럽게 폐 아래를 볼 수있는 다른 쪽으로 뒤집어.집게를 사용하여 중간 림프절을 당깁니다. 중간 림프절을 수확 한 후 원치 않는 조직이 분석에 영향을 줄 수 있기 때문에 림프절을 둘러싼 모든 지방과 혈액을 완벽하게 제거해야합니다. 마지막으로, 미디어로 가득 페트리 접시에 있는 모든 고립된 장기.총 0.1배 10에서 제6세포까지 이 흐름 세포측정에 대해 분석하였다. 힘 게터와 크기 게터 백혈구 인구에 기초하여 문이 있었고 그 세포는 어두운 염색에 의해 배제되었다. INP 주입 후 24시간 후 64개의 사출 경로, 비장, 잉구인림프절 및 중질 림프절은 유동 세포측정에 의한 DC 활성화를 수확하고 분석했다.유동 세포측정 DC 모집단의 전략에 기초하여 살아있는 백혈구에서 CD11C 양성 및 계보 음성 세포로 정의하였다. 특히, INP의 비강 내 분사는 대조군PBS에 비해 중간 림프절에서 CD40, 80, 86 발현에서 상당한 증가를 촉진시켰다. 따라서, 이 데이터는 INP의 비강 내 주입이 폐내 면역의 향상을 위한 점막 보조로 사용될 수 있다는 것을 건의했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 면역조절 약리제를 사용하여 수지상 세포(DC)를 허용 DC(TolDC)로 변환하는 방법을 보여줍니다. 이 변환은 CD4+ T 세포에 대한 면역억제 효과를 통해 TolDC 기능을 평가하여 확인됩니다.

수지상 세포와 CD4+ T 세포 사이의 상호 작용에 대한 면역조절 약리학적 제제의 효과

종양 면역 요법에 사용하기 위해자가 수지상 세포의 큰 숫자 (DCS)를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 방법을 설명합니다. 방법은 단핵 세포에서 수지상 세포를 분화하는 IL-4, GM-CSF를 사용합니다. 그들은 환자에게 다시 주입하기 전에 미성숙 수지상 세포는 성숙하고 항원과 함께로드를 자극한다.

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

예방 및 치료 백신은 종종 노드와 면역 세포의 결과로 가난한 참여 림프로 인해 백신의 주 배수에 강한 면역 반응을 자극하는 데 실패합니다. 림프절 백신의 직접 주사에 의해, 소위 intralymphatic 주입은 백신 효능 강하게 개선 될 수 있으며, 백신의 투여 량을 저감 할 수있다.

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

미성숙 수지상 세포는 내성과 내성 사이의 균형을 조절하기 위해 내성 또는 성숙 수지상 세포로 선택적으로 분화될 수 있습니다. 이 연구는 미성숙 단핵구 유래 수지상 세포(moDC), 체외 내성 및 성숙한 moDC(대사 표현형이 다른 moDC)를 생성하는 방법을 제시합니다.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

여기, 우리가 순진한 CD4 T 세포 (T 세포) 활성화, 확산, 그리고 GM-CSF 골 (BM)에 의해 유도 된 Th1 차별화의 비보에 결정에 대 한 프로토콜을 제시-파생 된 모 수석 세포 (DCs). 또한,이 프로토콜 BM 및 T-세포 절연, DC 생성, 및 DC 및 T-세포 입양 전송을 설명합니다.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

체 외 광 화학요법 (ECP)의 핵심 기능을 복제 하기 위해 실험 설정에서 생리 활성, 가변 수지상 생산을 가능 하 게 하는 (TI) 장치 또는 플레이트 및 관련 프로토콜이 개발 되었습니다. 암 면역 요법을 위한 세포 (DCs).

생리 적 면역 원 성 수지상 세포 생성을 위한 새로운 프로토콜

이 방법론은 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 생성과 소의 잠재적인 동물용 백신 개발 중 항원 후보의 시험관 내 평가를 위한 적용을 설명합니다.

소 단핵구 유래 수지상 세포를 이용한 백신 면역원성 측정

in vitro 에서 naive monocyte 유래 수지상 세포에서 내성 수지상 세포를 생성하는 약리학적 제제의 능력을 평가하고 자가 조절 T 세포 생성을 통해 그 효능을 검증하는 절차를 설명합니다.

인간 CD14+ 단핵구에서 톨러겐 수지상 세포 생성을 위한 면역조절제를 테스트하는 간단하고 효율적인 방법

배우세요 쥐의 종격 림프절 분리 기술을 이용하여 면역 자극 나노물질 투여 후 수지상 세포 활성화를 평가하는 방법을. 이 기법은 면역학 연구에서 림프 조직 분석에 필수적입니다.

Immunostimulatory 에이전트 평가: 림프 조직 추출 및 주입 경로-종속 수지상 세포 활성화

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