단편 작은 장 허 혈의 돼지 모델에서 문화와 장 줄기 세포 격리

이 절차의 전반적인 목표는 장 상피 줄기 세포에 대한 장 허혈의 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법은 줄기세포가 어떻게 손상에 저항하고 허혈성 손상 후 복구에 기여하는지와 같은 줄기세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 임상 장 질환 및 복구 연구에 사용할 수 있는 대형 동물 모델이라는 것입니다.

대학원생인 에이미 스틸러 스튜어트(Amy Stieler Stewart)와 제 연구실의 연구 전문가인 존 프로운드(John Freund)가 시연을 할 것입니다. 메스 날을 사용하여 8-10주 된 요크셔 교잡 돼지의 배꼽 중심에 있는 복부에 8-10cm의 복부 정중선을 절개하는 것으로 시작합니다. 회장 접합부에서 약 40cm 구강인 jejunum을 찾습니다.

장을 둘레로 두 번 연결하여 각 합자 사이에 1cm의 10cm 길이의 제주넘 고리를 그립니다. 서로 인접한 허혈 시점당 두 개의 루프를 생성하는데, 하나는 허혈에 대한 루프이고 다른 하나는 허혈에 대한 루프이며 추가로 1시간의 재관류가 있습니다. 가역적 완전 허혈을 유도하려면 불독 혈관 클램프 또는 지혈기를 사용하여 적절한 실험 기간 동안 클램프당 약 3개의 장간막 혈관을 막습니다.

허혈 기간 동안 복부를 덮으십시오. 실험이 끝나면 Metzenbaum 가위를 사용하여 먼저 마지막 허혈 루프에 최소 5-10cm 근접한 정상 jejunum의 대조군을 채취한 다음 나머지 루프를 채취합니다. 각 부상 시점의 루프를 크립트 격리까지 얼음처럼 차가운 PBS의 작은 용기에 보관하십시오.

crypt 줄기 세포를 분리하려면 20게이지 와이어와 조직 집게를 사용하여 소장의 각 루프를 뒤집어 점막 표면이 노출되도록 합니다. 각 루프의 상단과 하단을 와이어에 단단히 봉합하고 거꾸로 된 각 루프를 얼음처럼 차가운 PBS로 헹굽니다. 모든 내강 파편이 제거되면 즉시 샘플을 30ml의 해리 시약 1번이 들어 있는 개별 50ml 원뿔형 튜브에 얼음 위에서 5분마다 흔들고 뒤집으면서 30분 동안 놓습니다.

배양 기간이 끝나면 30ml의 해리 시약 2번이 포함된 해당 50ml 튜브로 샘플을 옮기고 원심분리로 2-4시간 허혈성 루프 샘플을 펠릿화합니다. 펠릿을 5ml의 PBS에 재현탁시키고 각 샘플에서 50마이크로리터 분취액을 사용하여 광학 현미경으로 crypt association 정도와 debris의 양을 확인합니다. 다음으로, 샘플을 섭씨 37도의 수조에 10분 동안 넣고 5분마다 흔들거나 뒤집습니다.

그런 다음 샘플을 얼음 위에 올려 얼음 위에 25ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 직접 옮기고 60RPM으로 설정하여 2-5분 동안 흔들고 30초마다 추가 수동 흔들기 또는 반전을 합니다. 진탕 배양이 끝나면 crypt association의 정도와 파편의 양을 확인하고 샘플을 25ml의 차가운 PBS가 포함된 새로운 50ml 원추형 튜브로 옮겨 최소한의 파편과 융모로 손상되지 않은 crypt가 분리될 때까지 진탕합니다. 루프가 완전히 해리되면 남은 조직을 제거하고 원심분리로 샘플을 펠렛화한 다음 나머지 crypt pellet을 5ml의 새로운 PBS에 재현탁합니다.

그런 다음 튜브당 150개의 크립트를 개별 마이크로 원심분리기 튜브로 분취하고 마이크로 원심분리로 크립트를 펠릿화합니다. 사전 냉각된 피펫을 사용하여 웰당 50마이크로리터의 마스터 믹스로 펠릿을 부드럽게 재현한 다음 15회 빠르게 피펫팅하여 혼합합니다. 다음으로, 50마이크로리터 크립트 액적을 사전 구충 및 격자 무늬 24웰 플레이트의 각 웰 중앙에 분배하고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다.

30분 후, 각 매트릭스 패티를 장 상피 줄기 세포 배지 웰당 500마이크로리터로 오버레이하여 사용하지 않는 웰에 500마이크로리터의 멸균 PBS를 추가하여 습도를 유지하고 도금된 데이 제로 crypt의 수를 계산합니다. 48시간마다 각 웰에 성장 인자를 추가하고, 96시간마다 상층액을 500마이크로리터의 신선한 성장 인자 보충 배지로 교체합니다. 완전한 장 허혈은 그림과 같이 봉합사 또는 클램프를 사용한 혈관 폐색을 사용하여 소장 루프에서 생성됩니다.

올바르게 수행되면 허혈성 손상은 장 융모 끝에서 시작하여 허혈 기간이 길어짐에 따라 장낭선 내에서 아래로 이동합니다. 이 수술 기법의 흔한 실수 중 하나는 혈관이 결찰되거나 균일하게 조여지지 않아 얇은 벽의 정맥이 동맥보다 먼저 무너져 추가 혈액이 조직에 침투하는 출혈성 허혈을 초래할 수 있습니다. 허혈성 장 루프(ischemic intestinal loops)를 제거한 후, 방금 설명한 바와 같이 해리 프로토콜(dissociation protocol)에 따라 장샘(intestinal crypt)을 성공적으로 분리할 수 있습니다.

더 심하게 손상된 시점의 crypt는 종종 파손되며 손상이 없거나 경미한 손상이 있는 것에 비해 더 많은 배경 세포 파편을 포함합니다. 정상적이고 경미하게 손상된 장샘이 배양액에 도금되면 24-48시간 이내에 장구가 형성됩니다. 심각한 허혈성 손상이 있으면 장샘은 살아남지만 손상되어 처음에는 훨씬 더 작은 구체가 형성됩니다.

72-120시간이 지나면 모든 소crypt의 장내 세포는 뚜렷한 중앙 내강과 싹이 트는 구조로 인해 더욱 복잡해지고, 전체적으로 소낭선 성장 효율이 감소할 뿐만 아니라 심하게 손상된 장 조직에서 유래한 장내 세포의 크기가 감소합니다. 일단 숙달되면, 크립트 분리 도금 절차는 적절하게 수행되면 약 2-3 시간 내에 완료 될 수 있습니다. 도금을 위해 수집된 crypt는 분리 분획에서 배양 오염 가능성이 증가하기 때문에 분리 분획이 아닌 세척에서 파생되는 것이 가장 좋습니다.

이 방법은 허혈 플러스 또는 마이너스 재관류로 인한 상피 손상 치료를 위한 약물의 효능을 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 위장 생물학 분야의 연구자들이 임상적으로 관련된 중개 동물 모델에서 상피에 대한 허혈의 영향, 특히 장 줄기 세포에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 재관류 유무에 관계없이 장 허혈을 생성하는 방법과 생체 내 손상 후 3D 배양을 위해 장 소굴을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.