Name: 단편 작은 장 허 혈의 돼지 모델에서 문화와 장 줄기 세포 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 단편 장 허혈 돼지 모델에서 장 줄기 세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 허혈성 손상 후 상피 복구 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 프로젝트는 NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987, 및 부의 임상 과학 보급 자금에 의해 지원 되었다

이 실험에 대 한 모든 동물 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 노스 캐롤라이나 주립 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 문화에 대 한 준비
참고: 모든 시 약은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다. 특정 성장 인자 농도 표 1에 나열 됩니다.
<ol><li>이온을 제거 된 증류수 (ddH2O)에서 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션을 준비 합니다. 적절 하 게 혼합 하 고 NaOH 및 HCl 솔루션을 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 합니다. 참고: 각 실험 전에 신선한 EDTA 재고 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>다음과 같이 분리 시 #1 (닥터 #1)를 준비 하 고 얼음에: 결합 인산 염 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + (PBS), 0.5 M EDTA, 1 M 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 µ M 없이 버퍼링 Y27632 및 1 X 항생제 Antimycotic 솔루션 (방지) 페니실린, 스, 암포 b를 포함 하 참고: 조직 컬렉션 직전 Y27632를 추가 합니다.</li>
	<li>분리 시 #2 (박사 #2)를 다음과 같이 준비 하 고 37 ° C 물 목욕에: 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 0.5 M EDTA, 10 µ M 없이 결합 PBS Y27632 및 1 X 방지. 참고: 조직 컬렉션 직전 Y27632를 추가 합니다.</li>
	<li>장 상피 줄기 세포 (IESC) 미디어를 다음과 같이 준비: 믹스 25 mL 고급 1 X n 2 보충과 DMEM/F12 매체, 1 X B-27 보충, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax 및 1 X 방지. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>다음과 같이 감소 된 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스 (matrix) 및 보충 성장 요인의 마스터 믹스를 준비: 얼음에 매트릭스를 녹여. Microcentrifuge 튜브에서 100 ng/mL을 추가 재조합 인간 머리, 500 ng/mL 재조합 인간 R-Spondin 1, 50 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자 (EGF), 100 ng/mL 재조합 인간 Wnt3a, 10mm 니코틴, 10 nM gastrin, 500 nM A-83-01, 10 µ M Y-27632 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 및 2.5의 글 리 코겐 synthase 키 니 아 제 3 억제제 (GSK3i, CHIR99021). 매트릭스를 해 동 때 성장 인자 믹스 (믹스 마스터 만들기)와 함께 보충 하 고 얼음에 저장. 참고: 도금 동안 매트릭스 패티 내 유물을 만들 것이 공기 방울을 소개 하지 않도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>미리 따뜻하게 세포 격리 절차를 시작 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 24-잘 조직 문화 접시.</li>
</ol>2. 수술 모델 허 혈 및 조직의 컬렉션의
<ol><li>8 10 주 오래 된 요크 셔를 사용 하 여 잡종 돼지 중 섹스 (권장). 수술 전에 모든 피드 16-18 h를 제거 합니다. 돼지 물이 항상 액세스를 허용 합니다.</li>
	<li>예약 도착 돼지 환경 새 환경 순응 수 있도록 실험 하기 전에 적어도 48 h. 참고: 허용한 수 의사에 의해 감독 하는 훈련 된 동물 및 실험실 기술자 일상적인 동물 보호와 마 취 절차와 지원을 제공 합니다.</li>
	<li>Premedicate xylazine와 돼지 (1.5 mg/kg 피하 (IM))와 케 타 민 (11-20 mg/kg (IM))15. 일단 진정, 넣어야 돼지 orotracheally.</li>
	<li>안락사의 시간까지 100% O2 에 증발 isoflurane (2-5%)와 일반 마 취 돼지를 유지 합니다.</li>
	<li>정 맥 (IV) 카 테 터 (권장 귀 정 맥)을 놓고 15 mL/kg의 유지 속도로 lactated ringers 솔루션 등 교체 유체 관리/h.</li>
	<li>마 취 펄스 프로브가, 심전도 및 간접 혈압 측정15를 포함 하 여 모니터링 루틴을 수행 합니다. 돼지의 호흡 속도 노력을 모니터링 하 고 수동으로 또는 끝 갯벌 공동2 55-60 mmHg 이상으로 상승 하는 경우 필요에 따라 기계적으로 환기. 참고: 적절 한 마 취 심장 박동 (범위 80-130 비트/분), 비-침략 적 혈액 압력 (평균 동맥 압력 75-100 mmHg), 호흡 속도 (10 월 25 일 호흡/min)16, 및 정기 검사 동향의 지속적인 모니터링에 의해 확인 된다 대 한 턱과 항문 톤의 부재. 마 취의 깊이 또한 근육 이완과 근육 fasciculation 다음 수술 자극의 정도 의해 재판 될 수 있습니다. 눈 반사는 일반적으로 아무 값16의. 진통 기관 IACUC 정책 지시에 따라 제공 될 수 있다. 이 경우에 opioid buprenorphine, 같은 수술 중 시행 수 있습니다.</li>
	<li>생리대에 돼지를 놓고 수술에 대 한 지 느 러 미 recumbency에서 억제 합니다.</li>
	<li>복 부 복 부를 면도 하 고 수술 스크럽 (액체 솔루션)과 이소프로필 알코올을 사용 하 여 준비.</li>
	<li>복 부에 액세스 하는 배꼽 중심으로 메스 블레이드를 사용 하는 8-10-cm 복 부 정중 선 절 개를 확인 합니다.</li>
	<li>작은 창 자 (공장) 약 40 cm 구두 ileocecal 연결을 식별 합니다. 원주 창 두 번 ligating에 의해 공장의 10 cm 긴 루프 윤곽을 그리 다, 후속 만들기 전에 각 합자 한 cm 루프 10 cm 구두 위치 (그림 1).</li>
	<li>만들 허 혈의 시간 포인트 당 2 개의 루프에 인접 한 다른 국 소 빈 혈과 허 혈에 대 한 하나 하나 reperfusion의 추가 1 시간 원하는 경우. 완전 한 국 소 빈 혈 동맥 또는 정 맥 (흐름)를 만들려면 클램프 또는 mesenteric 맥 관 구조 1, 2, 3, 및 4 h에 대 한 불독 혈관 클램프, 곡선된 테드 모기 hemostats, 또는 2-0 비 흡수 실크를 사용 하 여 선 한 다음 제거를의 1 시간에 대 한 클램프 reperfusion, 원하는 경우 참고: 저자 허 혈의 모든 루프 4 h 허 혈 성 루프 시작 순서로 만들어지고 proximally (최소화 하기 위해 전체 수술 시간) 이동 진행. 해결 하기 위해 허 혈 성 장 세그먼트 이웃 인접 루프를 손상 될 수 있습니다 가능성, 허 혈 성 루프의 다양 한 수 있습니다. 이 전체 수술 시간을 변경할 수 있습니다. 참고: reperfusion 시간 프레임 수 있을 다양 한 관심 또는 치료 reperfusion 기간 동안 테스트 하고자 하는 경우의 연구 문제에 따라. 그러나, 혼자 허 혈의 기간을 증가에서 더 심각한 조직 손상 되면서 reperfusion 상해 가능성이 더 상피 부상에 공헌 하지 않는다. Reperfusion 허 혈 성 손상의 가벼운 기간을 다음 역할을 담당할 가능성이 않습니다.</li>
	<li>허 혈 시간 점 사이 복 부 커버 또는 메 마른 수건 또는 수건 클램프를 사용 하 여 폐쇄 유지. 참고:이 실험에 대 한 단일 동물, 이내 8 허 혈 성 세그먼트 만들 수 있습니다. 적어도 5-10 cm는 내부 일반 컨트롤 역할을 하, 마지막 허 혈 성 루프 인접 한 추가 jejunal 세그먼트를 식별 합니다.</li>
	<li>불독 혈관 클램프 또는 곡선된 테드 모기 hemostat 당 약 3 개의 mesenteric 배를 방해. 해야 합니다 주의 hemostat 응용 프로그램 동안 혈관은 쉽게 충격 때문에. 클램프의 문 턱에서 용기를 스택 하려고 합니다.</li>
	<li>실험, 다음 안락사 pentobarbital 85-100 mg/kg iv,의 끝에 하트 비트 auscultated 및 각 막 반사의 손실 없이 죽음 확인 된 후 metzenbaum가 위를 사용 하 여 조직의 모든 루프를 수집 합니다. 마지막으로 허 혈 성 루프에 인접 정상 공장 적어도 5-10 cm의 제어 부분을 수집 하 여 시작 합니다.</li>
	<li>하 고 토 굴 격리에 대 한 준비까지 얼음 차가운 PBS의 작은 용기에 각 상해 시간 지점에서 루프를 저장 합니다. 참고: 원하는 경우, 허 혈 성 게 루프 충분히 조직학 및 장 줄기 세포 배양에 대 한 별도 샘플으로 분할 하 그러나, 저자는 보다 큰 대략 10 cm 긴 루프는 대부분 출혈 될 가능성이 발견 했다.</li>
</ol>3. 암호 (줄기 세포) 격리에서 허 혈 성 및 제어 루프
<ol><li>소장 점 막 표면 노출 20 게이지 와이어 및 조직 집게를 사용 하 여의 각 루프 반전. 와이어 봉합 사 (2-0 비 흡수 실크 또는 동등 물)를 사용 하 여 안전 하 게 루프의 위아래를 묶어.</li>
	<li>반전, 다음 얼음 차가운 PBS luminal 파편 제거 하에서 각 루프를 씻어.</li>
	<li>30 분 동안 얼음에 닥터 # 1 50 mL 원뿔 튜브로 즉시 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>수집 제어 시작 루프와 허 혈의 기간을 점진적으로 증가의 루프 함께 하십시오. 덜 손상 된 조직 (즉, 제어 및 1 시간 허 혈 성 조직)에서 루프는 강제로, 최상의 결과 위해 손목 스냅 동요 될 수 있다. 심각 하 게 손상 된 조직 (국 소 빈 혈의 3, 4 h)에서 조직 해야 부드럽게 누 볐 어 하거나 거꾸로 토 굴 중단 및 추가 조직 파괴 하면 너무 많이 떨고 하는 때에. 튜브는 동요 하거나 얼음을 하는 동안에 매 5 분을 거꾸로 해야 합니다.</li>
	<li>37 ° C 물 탕에서 10 분 박사 # 2로 샘플을 전송. 흔들어 또는 반전 튜브 마다 5 분.</li>
	<li>조직 전송 후 원심 원뿔 관 표면에 뜨는 EDTA를 제거 하려면 2-4 h 손상 루프에서 닥터 # 1를 포함 된 (200 x g 5 분). 이러한 조직 매우 손상으로 지하실 이미 해리 될 가능 하다. 상쾌한을 제거 하 고 PBS (5 mL)의 작은 볼륨으로 펠 릿 resuspend 3.9 단계로 진행.</li>
	<li>박사 # 2에서 샘플을 제거 하 고 얼음 (라벨 세척 # 1)에서 차가운 PBS의 25 mL에 직접 조직 샘플을 배치. 60 rpm에서 얼음에 궤도 셰이 커에 샘플을 놓습니다. 흔들어 또는 반전 30 각 튜브를 계속 s 마다 2 ~ 5 분.</li>
	<li>원뿔 관 2-4 h에서 박사 # 2를 포함 하는 조직, 스핀 전송 후 표면에 뜨는 EDTA (200 x g 5 분)을 제거 하는 루프를 손상 된. 이러한 조직 매우 손상으로 지하실 해리 될 가능 하다. 상쾌한을 제거 하 고 PBS (5 mL)의 작은 볼륨으로 펠 릿 resuspend 3.9 단계로 진행.</li>
	<li>50 µ L 약 수 또는에서 제거 세척 #1 (DR) 토 굴 분리의 정도 및 파편의 양을 확인 하기. 새로운 50 mL 원뿔 관으로 조직 배치 (워시 #2, #3, 등) 그대로 지하실 최소한의 파편과 villi 격리 될 때까지 차가운 PBS와 쉐이크의 25 mL로 가득. 참고: 목표는 그대로 지하실 및 최소한의 파편 한 깨끗 한 부분을 수 있을 것입니다. 그러나 각 추가 세척 보조 조직/세포 손상에 시작 됩니다 너무 떨고 세포를 청소 합니다. 또한, 최소 오염 된 최상의 결과 세척 단계와 분리 시 약 단계에서 아닙니다 지하실은 도금 하는 경우 달성 될 것입니다.</li>
	<li>남아 있는 조직을 제거 하 고 상쾌한, 제거에 5 분 동안 200 x g에서 50 mL 원뿔 튜브 원심 다음 PBS (5 mL)의 작은 볼륨에 남아 있는 토 굴 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>거꾸로 현미경을 사용 하 여, 지하실/분수의 수를 결정 하기 위해 각 샘플의 50 µ L aliquots를 검사 합니다. 목표는 50-100 지하실/50 µ L,이 최종 매트릭스 버거의 크기를 될 것입니다. 참고: 샘플은 너무 집중 하 고, 계속 해 서 원하는 농도 도달할 때까지 차가운 PBS를 추가. 샘플 너무 희석 이면 원하는 암호 수익률에 도달 하 고 조정 하는 데 필요한 aliquots의 수를 결정 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브로 (aliquot 관측에 의해 결정 되는) 지하실의 적절 한 볼륨을 aliquot. 예를 들어 샘플 포함 50 지하실/50 µ L 다음 패티 X 3 복제 당 aliquot 50 µ L = 150 µ L / microcentrifuge 관. 샘플만 포함 25 지하실/50 µ L 다음 필요한 2 aliquots / 패티 X 3 복제 하는 경우 = 300 µ L/튜브.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 200 x g에서 펠 릿 지하실</li>
	<li>부드럽게 수송과 지하실 마스터 믹스 (잘 당 50 µ L)의 적절 한 볼륨으로 resuspend. 빠르게 공기 거품을 만들지 않고 15 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 참고: 사전 발음 마스터 믹스 이전에 찬 메 마른 PBS 가진 피 펫 팁 멋진. 이 밖으로 확산 마스터 믹스를 유지 도움이 됩니다. 팁 또한 냉장고에 보관 하 고 즉시 사용 하기 전에 후드에 배치 수 있습니다.</li>
	<li>미리 데워 진된 24 잘 플레이트의 각 우물의 센터에 50 µ L 마스터 믹스 플러스 토 굴 방울을 분배.</li>
	<li>37 ° c.에 30 분 동안 문화 접시를 품 어</li>
	<li>500 µ L / IESC 미디어 (없음 추가 성장 요인으로 그들은 마스터 믹스에 포함 된 0에 필요한)의 각 매트릭스 패티를 오버레이 합니다.</li>
	<li>습도 유지 하기 위해 접시에 어떤 사용 되지 않는 우물에 500 µ L 살 균 PBS를 추가 합니다.</li>
	<li>0을 도금된 지하실의 수를 계산 합니다. 참고: 각 셀 더 정확 하 게 계산 될 수 있도록 사분면으로 격판덮개 문화 사전 격자에 도움이 됩니다.</li>
	<li>Enterospheres 모든 24 h의 수를 계산 하 고 매일 enteroid 개발에 대 한 모니터링 합니다.</li>
	<li>각 잘 모든 48 헤에 성장 인자 IESC 미디어 모든 96 h 제거와 500 µ L 신선한 미디어 (성장 인자 다음에 추가 되어야 합니다 미디어) 바꿉니다 추가 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

단편 장 허 혈의 돼지 모델의 개발 같은 동물 내 조직 상해의 여러 시간 점의 연구 함으로써 이전 murine 모델에 따라 확장 합니다. 적절 한 혈관 결 찰, 성공적인 암호 세포 배양, 조직 reperfusion 등이 프로토콜의 몇 가지 중요 한 논의 점 있다.
적절 한 혈관 결 찰 완전 한 국 소 빈 혈의 모델의 생성에 필수적 이다. 봉합 균등 하 게 연결 또는 클램프 하지 완전히, 혈액에서 강화 두꺼운 동맥 조직 입력을 계속 수 있습니다 고 얇은 벽 정 맥 붕괴 때문 종료 수 없습니다. 추가 조직 손상을 일으키는 lamina propria에 혈액의 넘쳐 흐름 발생 합니다. 그러나, 공부 되 고 허 혈 성 손상의 유형에 따라 전체 또는 출혈 성 허 혈을 원하는 수 있습니다. 예를 들어 장 이식 과정에서 창 완전히 분리 절차를 완전 한 장의 허 혈의 절제 단계 혈관 공급 (동맥 및 정 맥)에서. 그러나 또는,,는 mesentery 장 volvulus 같은 이벤트 동안 트위스트는 때 정 맥 반환은 종종 방해 먼저 동맥 공급 되 고 전에 조직 내에서 추가 혈액을 선도 하는 방해, 따라서 만들기 출혈 성 허 혈입니다.
허 혈 성 손상 모 끝에 시작 하 고 토 굴3의 기지까지 확장 조직의 손상을 발생 합니다. 허 혈, 중 아데노신 3 인산 염의 형태로 에너지 사용을 계속 하 고 대사 산물 hypoxanthine를 생성 합니다. 조직이 산소와 reperfused는, hypoxanthine 세 산화 효소에 의해 대사 되 고 점 막 상해 및 조직 손상 호 중구17,18의 초과 자유 래 디 칼 생성. 다양 한 표현의 세 산화 효소, 점 막 혈관 구조에 종 차이 reperfusion 상해3의 다양 한 각도 귀 착될. 국 소 빈 혈 reperfusion의 고양이 쥐 모델은 반응성 산소 대사 산물19,20에서 reperfusion 상해에 더 취약. 반면에, 돼지 더 적은 세 산화 효소와 따라서 적은 reperfusion 상해, 인간의 장 허 혈21의 더 비교이 모델을 만드는을 발견 했다. 이 시점에서 녹아웃 또는 장 부상 공부 유전자 변형 돼지 모델의 사용은 하지 설명,이이 모델의 주요 한계를 만들기. 질병 과정에 따라 적절 한 동물 모델의 선택 또는 특정 조건 연구원 공부 하고자 합니다. 예를 들어 h 6까지 허 혈 성 손상의 돼지 모델 되었습니다 설명된22, 반면 murine 모델에서 가장 허 혈 성 절차는 45-60 분23.
정상적이 고 ischemically 손상 창 자에서 장 지하실의 성공적인 격리 문화에서 상피 복구의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 시스템에는 초점을 유일 하 게 혼자, 상피 하지 혈관 공급 또는 고려 하는 면역 세포 구성 요소를 연구 수 있습니다. 이 상피 세포 상호 작용 및 다른 성장 인자, 또는 문화 미디어를 보완 하 여 수술 또는 다음 암호 격리 하는 동안 관리 하는 치료에 반응 이외에 상해 다음 복구를 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 단계에서 가장 어려운 남아 있다, 심각 하 게 손상 된 루프에서 격리를 필요로 해 서 부드러운 진동 및 EDTA를 포함 하는 솔루션의 빠른 제거 경우에 납골당 될 중간 해리. 장의 이러한 루프는 철저 하 게 세척 되지, 하는 경우는 지하실 문화에 오염 될 가능성이 있다. 결과적으로, 항생제 antimycotic 솔루션 IESC 미디어 뿐만 아니라 두 박사 솔루션에 추가 되었습니다. 또 다른 토론 지점 일반 컨트롤로 수집 소장에 중점을 둡니다. 동물 수술 마 취 보조 국 소 빈 혈, 염증 성 중재자 순환의 가능성과 함께 조직의 조직 관류에 가능한 변경 된으로 "정상" 제어 조직 진정한 컨트롤을 대표 하지 않을 수 있습니다. 이 실험에서 제어 조직 조잡 한 및 조직학에 비해 조직 (곤잘레스, 임, 게시 되지 않은 데이터, 2017) 다른 실험에서 허 혈을 받아야 하지 않은 동물에서 등장 하는 노트입니다.
요약 하자면, 돼지 장 허 혈, 그 밀접 하 게 인간의 허 혈 성 손상에서 발생 하는 어떤 모델의 재현 모델을이 방법에 설명 합니다. 또한, 허 혈 성 루프에서 장 줄기 세포의 고립은 설명,이 상피 수리 및 문화에서 치료에 대 한 가능한 응답을 공부 하는 역할.

장 허 혈 성 손상, 감소 또는 소장에 혈액 흐름의 완전 한 폐색 감소 산소 가용성의 결과 병 적 상태와 사망률 인간과 동물 환자1,2의 중요 한 원인이 남아 있다. 연속적인 염증 및 세포 침투, 허 혈 성 손상, 점 막 장벽 타협 이끌어 낸다. 점 막 방 벽은 조직의 순환3,4로 세균성 전 좌와 관련 된 독 소의 예방에 중요 합니다. 허 혈 성 조직의 후속 reperfusion 상해5악화 수 있습니다 반응성 산소 종 손상의 형성에 발생할 수 있습니다. 장 허 혈 거의 예방 이기 때문에, 최신 연구는 국 소 빈 혈의 조기 발견 및 reperfusion 상해 또는 대상 점 막 복구를 줄일 수 있는 소설 치료 접근의 개발을 위한 기술 발전에 집중 했다.
동물 모델 국 소 빈 혈 reperfusion 상해의 우리의 기본적인 과학 지식을 확장 하 고 변환 연구에 대 한 필수 유지를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 설치류 모델 될 유전자 조작된6을 자신의 능력으로 인해 가장 널리 사용 되었습니다. 그러나 최근에, 큰 동물 모델, 특히 돼지의 사용 장점 인간7,8돼지 해 부와 생리 적인 유사성을 포함 하 여 수 미래 변환 연구 주장 되었습니다. 상해 모델의 다양 한 국 소 빈 혈 reperfusion 상해를 공부 하 고 완전 한 혈관 폐색, 단편 mesenteric 혈관 폐색, 낮은 흐름 허 혈 등을 개발 되었습니다. 그러나이 모델의 전체 리뷰 저자 최근 검토3독자 들을 직접이 문서의 영역 밖에 있다.
Vivo에서 모델 이외에 ex vivo 세포 배양 시스템의 사용 장 항상성 그리고 부상 다음 수리 공부를 유망한 도구를 제공 합니다. 장 줄기 세포는 세포 증식과 장내 상피 안 대기의 하는 일을 담당 합니다. 정상 또는 부상 창 자에서 분리, 장 줄기 세포 문화에서 유지 될 수 있다 고 도구 또는 줄기 세포와 상피 세포 생물학 공부 모델 역할. 격리 하 고 이러한 3 차원 설정 방법 문화 시스템 (enteroids 그리고 colonoids 각각 크고 작은 창 자에서 파생 된 경우 나) 다양 한 수 종과 기관 시스템9,10에 대 한 설명 ,11,,1213. 특히, 위 장관 내에서, 이러한 문화 시스템 모델 위장 질병 암, 병원 체 감염 및 염증 성 장 질환14를 포함 하 여에 사용 되었습니다. 이 시점에서 절연 및 어떤 종에서 ischemically 부상된 소장에서 장 줄기 세포의 유지 보수를 설명 보고 있다. 따라서, 우리가 여기 소설, 큰 동물 돼지 모델에서 재현 부상과의 추가 연구에 대 한 정상 및 ischemically 부상 창 자에서 장 줄기 세포를 분리 하는 기능 귀착되는 장의 허 혈의 과정을 설명 복구 전 비보입니다.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수, Ca2+, Mg 2+ 무료</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP-399</td><td>묽게 1:10</td></tr><tr><td>증류수, 탈이온수(ddH2O)</td><td></td><td></td><td>EDTA 및 PBS 제조에 사용</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아메네 테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마 알드리치</td><td>ED45</td><td>각 실험 전에 새로 만들기; pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마 알드리치</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>시그마 알드리치</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>고급 DMEM/F12</td><td>생명 기술</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충</td><td>생명 기술</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충</td><td>생명 기술</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>생명 기술</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스</td><td>생명 기술</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>안티 용액</td></tr><tr><td>재조합 인간 Wnt-3a</td><td>R & D 시스템</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 Rspondin1</td><td>R & D Systems</td><td>4645-RS</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 Noggin</td><td>R & D 시스템</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF</td><td>R & D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Human [leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마 알드리치</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>물, WFI 품질</td><td>Corning, Inc.</td><td>25-055-CM</td><td>멸균수(SW)라고 함. 성장 인자 주식의 경우</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>페놀 레드 프리</td></tr><tr><td>24 웰 배양 접시</td><td>코닝</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 50 ml&nbsp;</td><td>코닝(Corning, Inc.)</td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>메스 핸들</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>탄소강 수술 블레이드, No. 10</td><td>세계 정밀 기기</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>조직 집게</td> 세계 <td>정밀 기기</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>Debakey 조직 집게 세계</td><td>정밀 기기</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>World 정밀 기기</td><td>501752</td><td>곡선 또는 직선</td></tr><tr><td>Metzenbaum 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>모기 집게, 곡선</td><td>세계 정밀 기기</td><td>503724-12</td><td>곡선 또는 직선 (503728-12)</td></tr> <tr><td>Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Stoelting Co.</td><td>52120-40P</td><td>스트레이트</td></tr><tr><td>실크, 2-0&nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>유사한 브랜드도 허용됩니다</td></tr>. <tr><td>타월 클램프</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>와이어 봉합사, 20 게이지</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>사용하기 전에 자르고 곧게 펴십시오.</td></tr><tr><td>수술 용 수건</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>젖산 링거 솔루션</td><td>Henry Schein</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhex 방부 스크럽 (4%)</td> <td>Henry Schein</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>유사한 브랜드가 허용됩니다</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올 70%</td><td>Henry Schein</td><td>MS071HS</td><td>유사한 브랜드가 허용됩니다</td></tr><tr><td>IV 카테터, 22 게이지</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>정맥의 크기에 따라 20g 또는 24g이 필요할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>자일라진 (100 mg / ml)</td> <td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>케타민 (100 mg / ml)</td> <td>Henry Schein</td><td>11695-6835-1</td><td>규제 약물</td></tr><tr><td>Isoflurane 용액</td><td>Henry Schein</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (치명적인 플러스 안락사 용액 (390 mg / ml))</td> <td>Vortech Pharm.</td><td></td><td>여러 브랜드의 Pentobarbital Sodium을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>발열 패드&nbsp;</td><td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump 코어 온난화 시스템; 다른 시스템을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray 북미</td><td></td><td>어떤 동등한 모니터링 장비도 허용됩니다</td></tr><tr><td>. 기화기&nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>은 Y 피스가 있는 원형 시스템을 사용하는 것이 좋습니다; 여러 공급업체가 가능합니다.</td></tr><tr><td>유체 펌프</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+; 유사한 제조업체를 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr></tbody></table>

단편 작은 장 허 혈의 돼지 모델에서 문화와 장 줄기 세포 격리

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

장 허 혈 병 적 상태 및 인간과 수의 환자에서 사망률의 주요 원인이 남아 있습니다. 많은 질병 과정 장 허 혈, 소장에 혈액 공급과 그러므로 산소 감소 때 발생할. 장 방 벽 손실 및 기본 조직에 손상이 리드. 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 기지에 있으며 항상성 그리고 다음 부상 하는 동안 장 갱신에 대 한 책임이 있습니다. 셀 문화 기술을 vivo ex 상피 줄기 세포 상호 작용의 성공적인 연구에 대 한 3 차원 상피 기관 같은 시스템의 성장을 지 원하는 문화 조건을 설정 하 여 허용 ("enteroids" 나 " colonoids"크고 작은 창 자에서 각각). 이러한 enteroids 크립 트와 모 같은 도메인으로 구성 되며 상피 내 세포 유형의 모든 포함 성숙. 역사적으로, murine 모델 장 부상 연구에 이용 되어 있다. 그러나, 돼지 모델의 크기 뿐 아니라 위장 해부학과 생리학의 인간을 포함 한 여러 가지 이점을 제공 합니다. 돼지 모델을 활용 하 여 우리는 단편 루프 장 허 혈의 단일 동물 내에서 만들 수 있습니다, 다른 연구 허 혈 성 손상의 시간 및 에 비보를 복구 하는 프로토콜을 설정 합니다. 또한, 우리 설명 소장의 허 혈 성 루프에서 장 줄기 세포 문화를 격리 하는 방법 줄기 세포에 의해 변조 상피 수리의 지속적인된 연구에 대 한 허용 비보 전.

완전 한 장의 허 혈 봉합 또는 클램프 그림 1에서 보듯이 혈관 폐색을 이용 하 여 작은 창 자 루프에서 만들었습니다. 클램프를 방출 하 여 reperfusion의 제어 기간 수행할 수 있습니다, 필요한 경우 후속 reperfusion 상해의 추가 연구에 대 한 허용. 모든 동물 안락사까지 최소한의 합병증과 절차 동안 살아남았다. 가장 일반적인 수술 합병증 저 혈압, dobutamine 등 긍정적인 inotrope의 보완으로 해결 했다.
제대로 수행 하는 경우 허 혈 성 부상 장 모의 끝에 시작 하 고 아래로 크립 내 허 혈 증가 (그림 2)의 기간으로 마이그레이션할. 수술 방법으로 하나의 일반적인 실수 때 혈관 출혈 하거나 균등 하 게 채워 하지 발생할 수 있습니다. 결과 출혈 성 허 혈 (그림 3), 얇은-벽으로 정 맥이 동맥, 추가 혈액 조직 침투를 허용 하기 전에 축소 하는 이다. 이것은 어두운 자주색 serosal 표면으로 (그림 3, 왼쪽) 완전 한 국 소 빈 혈 (그림 3, 오른쪽) 동안 더 창백한 표면에 비해 심하게 보인다.
허 혈 성 장 루프의 제거, 다음 장 지하실 분리 프로토콜 (그림 4)를 다음 성공적으로 격리 했다. 예상 했던 대로, 더 심각 하 게 손상 된 timepoints에서 지하실 깨진 자주 했다 (f; 조각) 토 굴 분수 포함 더 많은 배경 세포질 파편 아니오를 받았다 하는 그에 비해 가벼운 손상. 프로토콜, 동안 심각 하 게 부상된 창 자 기본 조직에 추가 손상을 방지 하기 위해 부드럽게 동요 될 해야 합니다. 떨고 너무 대략 더 크립 트 손상과 EDTA, 추가 붕괴의 결과 포함 하는 DR 솔루션에서 끝나는 지하실의 대부분에서 발생할 수 있습니다.
일단 도금, 국 소 빈 혈의 모든 시간 지점에서 지하실 생존과 문화 (그림 5)에 설립 될 수 있습니다. 문화에서 정상적이 고 약간 손상 된 장 지하실은 도금 하는 때, 24-48 시간 이내 enterospheres 형태. 심한 허 혈 성 손상 (3, 4 h), 장 지하실 생존 하지만, 처음 훨씬 더 작은 분야의 형성의 결과로 손상 된. 72-120 h, enteroids 더 명백한 중앙 루멘 및 신진 구조와 복잡 한 될. 전반적으로, 지하실의 감소 성장 효율 뿐만 아니라 심각 하 게 손상된 된 장의 조직 (곤잘레스, 임, 게시 되지 않은 데이터, 2017)에서 파생 된 enteroids의 감소 크기입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> 그림 1 : 돼지 모델에서 완전 한 장의 허 혈의 수술 모델. Exteriorized A) 정상적인 돼지 공장입니다. B) mesenteric 혈관 봉합 만드는 장 국 소 빈 혈과 출혈 되어 있다. C) 허 혈 원하는 경우 조직 reperfusion 있도록 불독 혈관 클램프를 사용 하 여 만든. D) 장의 맥 관 구조 직후 혈관 클램프의 제거. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> 그림 2 : 완전 한 장의 허 혈의 더 긴 기간을 따라 상피 손상을 증가의 더 증거 (hematoxylin 및 오신 (H &amp; E) 얼룩). 손상의 끝에 모 단일 셀 상피 층, 모 blunting 및 세포 손상 심한 부상 (최대 4 h 기간) 기본 토 굴 아래로 연장의 점차적인 손실 시작 합니다. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> 그림 3 : 심한 출혈 성 허 혈의 더 증거. A) 총 사진 출혈 국 소 빈 혈 (왼쪽된 루프)와 완전 한 국 소 빈 혈 (오른쪽 루프) 비교. 맥 관 구조 출혈 또는 균등 하 게 채워, 혈액 추가 염증 및 손상의 결과로 조직에 침투 하기 위해 계속 수 있습니다. 1-4 h에서 기간 증가의 출혈 성 허 혈의 B) H &amp; E 이미지. 세포 손상을 완전 한 국 소 빈 혈으로 본, 뿐만 아니라 주변 lamina propria 내 적혈구 침투의 증거가 있다. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> 그림 4 : 허 혈 성 및 정상적인 내장의 루프에서 격리 장 지하실의 aliquots. 완전 한, 그대로 장 지하실 (별표) 내장의 각 루프에서 성공적으로 격리 했다. 예상 했던 대로, 더 심각 하 게 손상 된 시간 지점에서 지하실 깨진 자주 했다 (f; 조각) 토 굴 분수 포함 더 많은 배경 세포질 파편 아니오를 받았다 하는 그에 비해 가벼운 손상. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> 그림 5 : 격리 소장의 허 혈 성 루프에서 다음 장 줄기 세포 성장의 시간 과정. 정상적인 장 지하실 문화에 도금 했다, enterospheres 24-48 시간 이내에 형성. 심한 허 혈 성 손상 (3, 4 h), 지하실 생존 하지만 처음 훨씬 더 작은 구체를 형성. 72-120 h, enteroids 더 명백한 중앙 루멘 및 신진 구조와 복잡 한 될. 20 µ m 규모 언급 하지 않는 한 바. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>성장 인자</td>
			<td>희석제</td>
			<td>사진 농도</td>
			<td>재고 희석</td>
			<td>작업 희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>1 µ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>머리</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10 mM 아세트산</td>
			<td>10000 X</td>
			<td>500 µ g/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 Μ M</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>니코틴</td>
			<td>소프트웨어</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10000 X</td>
			<td>100 Μ M</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 m m</td>
			<td>10 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0.5 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 m m</td>
			<td>2.5 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 성장 인자 시 테이블. 성장 인자 재고 솔루션 및이 프로토콜에 사용 되는 작업 솔루션의 요약.

이 프로토콜에는 단편 장 허 혈의 돼지 모델을 성공적으로 설정 하 고 이후 격리 하 고 상피 수리 부상 다음의 연구에 대 한 장 줄기 세포 문화 독자 수 있게 됩니다.

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

이 절차의 전반적인 목표는 장 상피 줄기 세포에 대한 장 허혈의 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법은 줄기세포가 어떻게 손상에 저항하고 허혈성 손상 후 복구에 기여하는지와 같은 줄기세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 임상 장 질환 및 복구 연구에 사용할 수 있는 대형 동물 모델이라는 것입니다.대학원생인 에이미 스틸러 스튜어트(Amy Stieler Stewart)와 제 연구실의 연구 전문가인 존 프로운드(John Freund)가 시연을 할 것입니다. 메스 날을 사용하여 8-10주 된 요크셔 교잡 돼지의 배꼽 중심에 있는 복부에 8-10cm의 복부 정중선을 절개하는 것으로 시작합니다. 회장 접합부에서 약 40cm 구강인 jejunum을 찾습니다.장을 둘레로 두 번 연결하여 각 합자 사이에 1cm의 10cm 길이의 제주넘 고리를 그립니다. 서로 인접한 허혈 시점당 두 개의 루프를 생성하는데, 하나는 허혈에 대한 루프이고 다른 하나는 허혈에 대한 루프이며 추가로 1시간의 재관류가 있습니다. 가역적 완전 허혈을 유도하려면 불독 혈관 클램프 또는 지혈기를 사용하여 적절한 실험 기간 동안 클램프당 약 3개의 장간막 혈관을 막습니다.허혈 기간 동안 복부를 덮으십시오. 실험이 끝나면 Metzenbaum 가위를 사용하여 먼저 마지막 허혈 루프에 최소 5-10cm 근접한 정상 jejunum의 대조군을 채취한 다음 나머지 루프를 채취합니다. 각 부상 시점의 루프를 크립트 격리까지 얼음처럼 차가운 PBS의 작은 용기에 보관하십시오.crypt 줄기 세포를 분리하려면 20게이지 와이어와 조직 집게를 사용하여 소장의 각 루프를 뒤집어 점막 표면이 노출되도록 합니다. 각 루프의 상단과 하단을 와이어에 단단히 봉합하고 거꾸로 된 각 루프를 얼음처럼 차가운 PBS로 헹굽니다. 모든 내강 파편이 제거되면 즉시 샘플을 30ml의 해리 시약 1번이 들어 있는 개별 50ml 원뿔형 튜브에 얼음 위에서 5분마다 흔들고 뒤집으면서 30분 동안 놓습니다.배양 기간이 끝나면 30ml의 해리 시약 2번이 포함된 해당 50ml 튜브로 샘플을 옮기고 원심분리로 2-4시간 허혈성 루프 샘플을 펠릿화합니다. 펠릿을 5ml의 PBS에 재현탁시키고 각 샘플에서 50마이크로리터 분취액을 사용하여 광학 현미경으로 crypt association 정도와 debris의 양을 확인합니다. 다음으로, 샘플을 섭씨 37도의 수조에 10분 동안 넣고 5분마다 흔들거나 뒤집습니다.그런 다음 샘플을 얼음 위에 올려 얼음 위에 25ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 직접 옮기고 60RPM으로 설정하여 2-5분 동안 흔들고 30초마다 추가 수동 흔들기 또는 반전을 합니다. 진탕 배양이 끝나면 crypt association의 정도와 파편의 양을 확인하고 샘플을 25ml의 차가운 PBS가 포함된 새로운 50ml 원추형 튜브로 옮겨 최소한의 파편과 융모로 손상되지 않은 crypt가 분리될 때까지 진탕합니다. 루프가 완전히 해리되면 남은 조직을 제거하고 원심분리로 샘플을 펠렛화한 다음 나머지 crypt pellet을 5ml의 새로운 PBS에 재현탁합니다.그런 다음 튜브당 150개의 크립트를 개별 마이크로 원심분리기 튜브로 분취하고 마이크로 원심분리로 크립트를 펠릿화합니다. 사전 냉각된 피펫을 사용하여 웰당 50마이크로리터의 마스터 믹스로 펠릿을 부드럽게 재현한 다음 15회 빠르게 피펫팅하여 혼합합니다. 다음으로, 50마이크로리터 크립트 액적을 사전 구충 및 격자 무늬 24웰 플레이트의 각 웰 중앙에 분배하고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다.30분 후, 각 매트릭스 패티를 장 상피 줄기 세포 배지 웰당 500마이크로리터로 오버레이하여 사용하지 않는 웰에 500마이크로리터의 멸균 PBS를 추가하여 습도를 유지하고 도금된 데이 제로 crypt의 수를 계산합니다. 48시간마다 각 웰에 성장 인자를 추가하고, 96시간마다 상층액을 500마이크로리터의 신선한 성장 인자 보충 배지로 교체합니다. 완전한 장 허혈은 그림과 같이 봉합사 또는 클램프를 사용한 혈관 폐색을 사용하여 소장 루프에서 생성됩니다.올바르게 수행되면 허혈성 손상은 장 융모 끝에서 시작하여 허혈 기간이 길어짐에 따라 장낭선 내에서 아래로 이동합니다. 이 수술 기법의 흔한 실수 중 하나는 혈관이 결찰되거나 균일하게 조여지지 않아 얇은 벽의 정맥이 동맥보다 먼저 무너져 추가 혈액이 조직에 침투하는 출혈성 허혈을 초래할 수 있습니다. 허혈성 장 루프(ischemic intestinal loops)를 제거한 후, 방금 설명한 바와 같이 해리 프로토콜(dissociation protocol)에 따라 장샘(intestinal crypt)을 성공적으로 분리할 수 있습니다.더 심하게 손상된 시점의 crypt는 종종 파손되며 손상이 없거나 경미한 손상이 있는 것에 비해 더 많은 배경 세포 파편을 포함합니다. 정상적이고 경미하게 손상된 장샘이 배양액에 도금되면 24-48시간 이내에 장구가 형성됩니다. 심각한 허혈성 손상이 있으면 장샘은 살아남지만 손상되어 처음에는 훨씬 더 작은 구체가 형성됩니다.72-120시간이 지나면 모든 소crypt의 장내 세포는 뚜렷한 중앙 내강과 싹이 트는 구조로 인해 더욱 복잡해지고, 전체적으로 소낭선 성장 효율이 감소할 뿐만 아니라 심하게 손상된 장 조직에서 유래한 장내 세포의 크기가 감소합니다. 일단 숙달되면, 크립트 분리 도금 절차는 적절하게 수행되면 약 2-3 시간 내에 완료 될 수 있습니다. 도금을 위해 수집된 crypt는 분리 분획에서 배양 오염 가능성이 증가하기 때문에 분리 분획이 아닌 세척에서 파생되는 것이 가장 좋습니다.이 방법은 허혈 플러스 또는 마이너스 재관류로 인한 상피 손상 치료를 위한 약물의 효능을 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 위장 생물학 분야의 연구자들이 임상적으로 관련된 중개 동물 모델에서 상피에 대한 허혈의 영향, 특히 장 줄기 세포에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 재관류 유무에 관계없이 장 허혈을 생성하는 방법과 생체 내 손상 후 3D 배양을 위해 장 소굴을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 문서와 함께 비디오 organoid 단위 온 발판 접근법을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기 위해 우리의 프로토콜을 제시한다.

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

여기에서 우리는 들판을 가로 질러이 기술의 표준화를 장려하기 위해 사망률없이 재현 부상 결과 생쥐의 장 허혈 - 재관류의 상세 절차를 설명합니다. 창자 허혈 재관류 손상이 모델은 부상 및 재생의 세포 및 분자 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

창자 허혈 - 재관류 손상의 쥐 모델

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

여기에서 우리는 텔로세포를 포함한 쥐의 장 중간엽을 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이들은 마우스 또는 인간 유래 오가노이드와의 공동 배양과 같은 여러 응용 분야에 사용하여 성장을 지원하고 원래 조직의 상황을 더 잘 반영할 수 있습니다.

쥐 장 중간엽의 분리로 텔로세포의 높은 수율

설치류에서 널리 사용되는 장 허혈 재관류 손상(IRI) 수술 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 시술은 상장간막 동맥의 폐색과 혈류의 회복을 포함합니다. 이 모델은 수의학 및 인간 의학 모두에서 장내 IRI의 폐색 원인을 조사하는 연구에 유용합니다.

상장간막 동맥의 폐색을 통한 장 허혈-재관류 손상의 설치류 모델

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

여기에서는 냉동보존된 상피 선와에서 돼지 장 3D 오가노이드를 배양하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 3D 오가노이드에서 파생된 세포 단층을 확립하여 상피 세포의 정점 측면에 접근할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다.

냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

이 프로토콜은 섬 분리 및 정제를 위한 돼지 췌장 조달을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

Islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

배우세요 단편 장 허혈 돼지 모델에서 장 줄기 세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 기술은 허혈성 손상 후 상피 복구 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

단편 작은 장 허 혈의 돼지 모델에서 문화와 장 줄기 세포 격리

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