Name: 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 배우세요 면역형광현미경법을 이용한 DNA 이중가닥절단 복구 복합체 형성 및 해소 과정 분석 방법을. U2OS/DR-GFP 세포를 활용하여 유전체 안정성 연구에 필수적인 DNA 손상 응답 메커니즘을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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우리는 조 엘 Sanneman와 박사 Philine Wangemann에 의해 캔자스 주립 대학 대학의 수의학,이 기술을 개발 하기 위해 노력에의 그들의 지원에 대 한 자금 Confocal 현미경 코어의 감사 합니다. pCBASceI 마리아 Jasin (Addgene 플라스 미드 # 26477)에서 선물 했다 30. U2OS 박사-GFP 셀 마리아 Jasin18종류 선물 했다.

제발 참고,이 프로토콜은 작성 된-SceI 인식 사이트18를 포함 하는 U2OS 세포. 셀은 U2OS 필요가 없습니다 하지만-SceI 사이트를 포함 해야 합니다. 프로토콜 조정 (예를 들어, 셀 시드 및 보육 시간) 되도록 할 수 있습니다 사용 하는 세포의 종류에 따라.
1. 정의 DSB 수리 복잡 한 대형의 활동
<ol><li>Confluent 85-90%까지 10cm 조직 문화 접시에 U20S DRGFP 세포를 성장 한다.</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 2 분에 대 한 EDTA의 3 mL에서 실 온 (RT)에서 품 어.</li>
	<li>트립 신 1 mL를 EDTA를 대체 하 고 5 분 확인 셀에서 현미경으로 접시의 표면에서 분리는 37 ° C에서 품 어. 5 mL의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충 된 트립 신을 무력화.</li>
	<li>이 정지는 hemocytometer trypan 블루 제외 메서드를 사용 하 여 셀의 농도 결정 합니다.</li>
	<li>시드 6 x 103 유리 하단 96 잘 접시 200 µ L에 셀/잘. 또는, 12 m m coverslips에 8 mL에 씨앗 4 x 106 전지 10 cm 접시에 배치합니다. 참고: 각 잘 또는 coverslip 컨트롤을 포함 하 여 한 번 포인트를 나타냅니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 세포 성장.</li>
	<li>유도 하는 DSBs
	<ol>
<li>H2O2 DMEM + 10%와 25 µ M의 농도를 희석 96 잘 접시/10 cm 접시에서 미디어 바꿉니다 FBS와 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>워시 PBS x 1 3 x와 신선한 DMEM 바꿀 보충 10 %FBS 1% 페니실린/스 셀. 0, 1, 4, 8, 24, 37 ° C에서 48 h. 확인 H2O2 의 신선한 희석 각 실험을 위해 사용 되는 셀을 품 어. 참고: 여기에 사용 된 H2O2 농도에서 세포를 죽이 피하기 위해, 충분히 apoptosis와 노화 세포의 대량 피할 것 이다 그런 손상의 복용량 낮은 인지 확인 합니다. 복구 프로세스를 관찰 하는 것이 중요 하다입니다. 이 최고의 복용량의 범위에 감도 측정 하 여 이루어집니다. MTT 분석 결과 또는 사용할 수 있는 과산화 수소의 최소 농도 결정 하기 위해 다른 세포 생존 능력 분석 실험을 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>담합 및 셀 permeabilizing
	<ol>
<li>3 번 1 x PBS로 세포 세척. coverslip 각 시간 지점에 대 한 10 cm 접시에서 제거 하 고 해결을 위한 24-잘 접시의 단일 우물에. 바늘과 포 셉을 사용 하 여 조심 스럽게 제거 하는 coverslip 고 coverslip 표면에서 세포를 긁힘 방지.</li>
		<li>H2O2 노출 및 신선한 DMEM 교체 (0, 1, 4, 8, 24, 및 48 h)의 1 시간 후에 시간을 지정 하는 셀에 4 %paraformaldehyde (PFA)와 15 분 동안 배양 하 여 수정.</li>
		<li>고정된 coverslips PBS로 3 회 세척. 1 x PBS에 희석 0.5% 비 이온 세제로 세포를 permeabilize. PBS 가진 3 배를 세척 하기 전에 RT에서 15 분 동안 품 어. 참고: 후에 permeabilization, coverslips의 저장 가능 하다 PBS에 4 ° C에서 적어도 일주일 동안.</li>
	</ol></li>
	<li>복잡 한 시각화를 복구
	<ol>
<li>3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)과 0.1% 비 이온 세제 1 x PBS에 희석의 솔루션에 96 잘 접시/coverslips 차단 (3 %BSA 솔루션) 실시간에서 1 h</li>
		<li>관심, RT에서 1 h 3 %BSA 솔루션에서 제조업체의 사양에 따라 1 x PBS로 3 회 세척 하기 전에 희석의 수리 단백질을 대상으로 1 차 항 체로 품 어.</li>
		<li>이차 항 체 3 %BSA 솔루션에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 희석 된 96 잘 접시/coverslips를 품 어. 확인 하는 보조 fluorophores 겹치는 구동 또는 없는 방출 스펙트럼.</li>
		<li>셀 PBS 3 시간을 세척 후 추가 DAPI, 1 x PBS에 제조업체의 사양에 따라 희석 하 고 5 분 RT에서 품 어.</li>
		<li>아래 셀 쪽 얼굴 확인 하 장착 에이전트의 드롭 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다. coverslips를 신중 하 게 누르고 닦기와 어떤 초과 설치 에이전트를 흡수.</li>
		<li>투명 매니큐어 빠른 건조와 coverslips를 밀봉 하 고 슬라이드 coverslip의 완전 한 도장 합니다.</li>
		<li>실험으로 편견을 소개 하는 피하기 위해 DAPI 채널 (관심사의 DNA 복구 유전자에서 신호)와 다른 채널 앞에 초점을 맞춤 으로써 confocal 현미경 이미지를 가져가 라.</li>
		<li>또는, 이미지 Z-섹션의 원하는 영역을 복용 하 고 모든 감지 foci 시각화 하는 단일 평면에 이미지를 응축 하 여 취득 될 수 있다. 참고: DSB 해상도 또는 관심사의 단백질은 시간 포인트 선택에 나타나지 않으면, 결정 DSBs 처음 시간 포인트의 넓은 범위를 선택 하 여 해결 하는 경우 (0-48 h 후 DSB 유도). 관심의 시간 포인트 DSB 유도 방법 및 관심사의 수리 단백질에 의해 달라 집니다.</li>
	</ol></li>
	<li>ImageJ는 무료 소프트웨어를 사용 하 여 면역 형광 현미경 이미지에 핵을 정의. 참고: 현미경 이미지를 열려면 바이오 포맷 플러그인 ImageJ에 설치 되어야 합니다.<ol>
<li>ImageJ의 "플러그인" 도구 모음에서 confocal 이미지 (.czi 또는.tif) ImageJ 창에 이미지 파일을 드래그 하거나 "바이오 형식 가져오기"를 선택 하 여 엽니다. 참고: "바이오 형식 가져오기 옵션" 창이 나타납니다.</li>
		<li>"분할 채널" 제정 DAPI와 "바이오 형식 가져오기 옵션" 창에서 형광 이미지 이미지 분할을 선택 합니다.</li>
		<li>드롭 다운 메뉴에서 "색상 옵션"에서 "Colorized"를 선택 합니다. DAPI와 히스톤 H2AX를 엽니다 "확인"을 선택 합니다 (H2AX)로 windows를 별도 영상과 DAPI 이미지를 선택 하십시오.</li>
		<li>"이미지" 도구 모음 및 핵을 선택 하는 "조정 임계값" 옵션을 선택 합니다. 참고: "임계값" 창이 나타납니다.</li>
		<li>오른쪽에 "임계값" 윈도우의 하단 표시줄을 완전히 밀어 이미지 임계값을 조정 합니다. 핵 뚜렷한 윤곽선과 배경 블랙 완전 빨간색 표시 될 때까지 가기 막대를 조정 합니다. 선택 하지 않으면 적용. "임계값 조정" 창을 닫습니다.</li>
		<li>"분석" 도구 모음 및 "입자 분석" 옵션을 선택 합니다. 화면에 나타나는 "입자 분석" 창을 참조 하십시오.</li>
		<li>핵의 최소 크기를 입력 합니다. 참고: 입력 크기 아래 입자 핵으로 계산 하지 않습니다.</li>
		<li>"보기" 드롭다운 메뉴에서 "설명"을 선택 합니다. "관리자 추가" 옵션을 선택 합니다. "ROI 관리자" 창을 엽니다 "확인"을 클릭 합니다. 참고: 핵의 윤곽선은 별도 창에 표시 됩니다.</li>
		<li>"ROI 관리자" 창에서 선택할 수 있는 핵에 번호를 할당 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>ImageJ를 사용 하 여 면역 형광 현미경 이미지에 H2AX foci 계량.
	<ol>
<li>"H2AX" foci 창 (물 붙일 활용 된 이차 항 체)를 선택 합니다. 다음, "프로세스" 도구 모음을 선택 하 고 "맥시 마 찾기"는 핵 내에서 포커스를 찾을 수를 선택 합니다. 참고: "맥시 마 찾기" 창이 열립니다.</li>
		<li>"출력 형식" 드롭 다운 메뉴에서 "단일 포인트" 옵션을 선택 하 고 "미리 보기 위치 선택"을 선택 맥시 마/foci 시각화. "잡음" 허용치 이미지 (그림 1)의 형광 강도 따라 입력 합니다. 작은 검은 점 들과 흰색 창의 모양을 확인 합니다. 참고:이 점을 고 H2AX foci/맥시 마 검색 된 나타냅니다. 소음 허용 오차 값 분석 되 고 모든 이미지에 대 한 상수 유지 되어야 합니다. 낮은/높은 소음 허용 오차는 핵 내에서 너무 많은/몇 맥시 마 (포커스)를 묘사 하 고 핵 내의 foci의 정확한 표현 되지 않습니다.</li>
		<li>핵을 H2AX foci 해야 합니다 측정할 수에 대 한 "투자 수익 관리자" 창에서 선택 합니다. "모두 표시" 옵션을 선택 하 여 모든 핵을 선택 합니다.</li>
		<li>맥시 마/foci 선택한 핵 내에서 수를 측정 하는 "측정"을 선택 합니다. 참고: 맥시 마/foci 수 255, 즉의 배수로 표시, 하나의 최대 255의 "RawIntDen" (통합된 밀도) 읽기.</li>
		<li>"RawIntDen" 값을 복사 하 고 데이터 분석을 위한 소프트웨어에 붙여 넣어.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 오랫동안 이중 가닥 DNA 틈에 지역화 분석
<ol><li>96 잘 접시/coverslips 설명 섹션 1.1와 1.2에 시드 셀.</li>
	<li>
이중 가닥 DNA 틈의 유도
	<ol>
<li>제조업체의 사양에 따라 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여-SceI 식 벡터와 셀 transfect. Transfection endonuclease 식 최대화 하기 후 24-72 h를 기다립니다. 단 수 큰 핵 γ-H2AX 초점 세포를 찾아 transfection는 성공 했는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지의 획득
	<ol>
<li>수정, permeabilize, 차단, 그리고 1.8 섹션에 설명 된 대로 96 잘 접시/coverslips 세척.</li>
		<li>공동 γ H2AX와 관심의 수리 단백질에 대 한 항 체와 세포를 품 어 (여기, RAD51에 대 한 1 차적인 항 체 사용) 3 %BSA 솔루션에서 제조업체의 사양에 따라 희석.</li>
		<li>96 잘 접시/coverslips 1 x PBS로 3 회 세척. 이차 항 체 3 %BSA 솔루션에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 희석 된 96 잘 접시/coverslips를 품 어. 확인 하는 보조 fluorophores 겹치는 구동 또는 없는 방출 스펙트럼.</li>
		<li>큰 핵 γ H2AX 포커스가 있는 셀을 식별 합니다. 만을 편견을 피하기 위해 이러한 셀의 사진을 찍을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
오랫동안 SceI의 분석 유도 포커스
	<ol>
<li>큰 γ-H2AX foci 및 관심사의 수리 단백질의 공동 화 된 foci 있는 셀 개수를 계산 하 여 오랫동안 포커스를 수동으로 분석.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

DNA의 분석 손상 수리 일반적 이며 이중 가닥 DNA 틈의 수리 구체적으로 연구의 활성 영역 그 결과 기본적인 생물학6,20tumorigenesis 범위 때문에. 이 원고 세부 사항 정확 하 게 dissects 시간 기대,이 방법을 통해 DSBs 해상도 RAD51 및 γ-H2AX 단백질의 기여 하는 방식 명료 DSBs14수리 단백질의 추가 기능을 사용할 수 있습니다. 복구 활동의 비교와, 기 절 하는 관심사의 단백질으로 수리 기계 제어 셀과 셀 간의 난-SceI 유도 DSBs의 채용 모집, 지역화에 그 단백질의 기여를 정의 하 고 해상도 DSBs 수리 요인입니다.
시각화 복구 활동 일반적으로 사용 되는 접근에 몇몇 이점이 있다. 자주, 수리는 어셈블리의 동적 과정과 수리 단지의 분리를 나타내는 수 단일 시간 지점에서 조사 이다. 전...

매일, 모든 세포는 인체에는 약된 10, 000으로 포 격 된다 DNA 장애1. 이 생존의 위협을 셀 뿐만 아니라 돌연변이, 발암에 대 한 위험에서 우리를 박 았 죽음. 게놈 충실도 보호 하기 위해 포유류 세포는 복잡 한 일련의 단백질 연결 및 수정 된 DNA 손상 응답 하 진화 했다. 이 응답은 여러 통로, DNA 손상 응답 (DDR)2,3로 총칭으로 구성 됩니다. DNA 병 변, 일시적으로 그리고 공간 조정에 DNA 수 선 단백질의 축적은 DDR에 의하여 이루어져 있다. DDR 자주 전파 또는 손상 된 DNA2,,45의 복제 하는 동안 발생할 수 있는 손상의 강화를 피하기 위해 세포 주기 검거를 유도 합니다. 차례 차례로, 그것은 또한 수리 완료 된 후 복구 단지를 분리 하 여 세포 주기 검거를 세포 생존에 필요한.
DNA 손상의 다양 한 종류 중에서 DSBs는 가장 해로운. DSBs 복구 실패 염색체 재배열 또는 전체 염색체 팔의 손실과 같은 대규모 삭제 될 수 있습니다. DSBs 수리 두 경로6,,78으로 분할 된다. 동종 재결합 (HR) 필요 자매 염색체 DNA 템플렛으로 사용 하 여 따라서 늦은 S와 G2/M 단계의 세포 주기9,10로 제한 됩니다. 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 이러한 제한에는 없습니다 하지만 DSBs11,12복구 때 작은 삭제를 발생할 수 있습니다.
DSB 특히 수리와 DDR 일반적 조사의 활성 영역이 있습니다. 편리 하 게 분리 된 경로에 조직 되 고에 불구 하 고 중복의 큰 거래가 이다. 실제로, 많은 단백질 (BRCA1, BRCA2, 그리고 예를 들어 복잡 한 RPA) 여러 경로13,14,,1516에서 포함 된다. 한 통로 의해 병 변의 수리는 다른 통로14에 의해 복구 해야 하는 중간 손상으로 이어질 수 있습니다. 필요한 시간의 정확한 금액에 대 한 올바른 위치에 올바른 단백질 보충의 그들의 복잡 한 작업을 함께 이러한 통로의 하나는 다중 계층 규제 프로세스를 필요 합니다.
최근 보고서는 수리 복잡 한 형성, 해상도 및 지역화 각각 별도로 수 장애인된17으로 DDR의 복잡 한을 강조 한다. 다음과 같은 프로토콜의 전반적인 목표는 DSB를 복구 하는 세포의 능력이 결정적으로 부. 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여, 손상의 사이트에서 수리 단백질의 축적 DSBs의 유도 따라 대표적인 시간 지점에서 구상 될 수 있다.
이 기술은 일반적으로 사용 되는 방법에 몇 가지 장점이 있습니다. 자주, 수리 한 번 포인트에서 조사 하 고 어셈블리의 동적 과정과 수리 단지의 분리를 나타내는 능력입니다. 전체 해상도로 초기 활성화에서 복구의 전체 범위를 관찰 하면 수리에서 지연 완전 한 금지로 오인 하지. 반대로, 그것은 했다 응답을 비활성화 수 있는 수리 응답의 감 응 작용 정상 또는 과도 한 정품 인증으로 오인 하지 보장 합니다.
그러나 지연된 단백질 복잡 한 형성 및 복구 단백질의 잘못 지역화, 수 없습니다 명확 하 게 구별 될이 방식으로. 확인 하려면 복구 단백질 대 잘못 지역화 된 그들의 지 방화에 지연, "오랫동안" DSB 세포질 DNA의 효소 분열을 통해 도입 수 있습니다. 결과 병 변 수리는, 뚜렷한 큰 핵 수리 초점 고 모집에서 시간 제한을 제거 때마다 recut 이다. 이 드문 절단 endonuclease (예를 들어, SceI) 오랫동안 DSB를 유발을 사용 하 여 기존 접근 방식을 수정 하 여 구현할 수 있습니다. DSBs의 장 수는 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 애매 수리 단백질의 시각화 수 있습니다. 또한 향상 된 풍부는 탐지 항 체 품질, 덜 공부 단백질 DNA 복구에 영향을 미치고로 식별 하는 경우 도움이 될 수 있는 기능에에서 제한에 의해 방해 된다 때 시각화를 향상 수 있습니다.
특히, 우리는 무료 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)에 대 한 명시적인 지침을 제공합니다. 이미지 분석, DNA 손상 복구를 심문을 열고 주요 금융 장벽을 제거 합니다.

<table><tbody><tr><td>12mm 커버슬립</td><td>VWR</td><td>89015-725</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(PFA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>82050-892</td><td></td></tr><tr><td>96웰 유리 바닥판</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H2AX Alexa488</td><td>EMD Millipore</td><td>05-636-AF488</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad51(D4B10)&nbsp;</td><td>세포 신호 기술</td><td>8875S</td><td></td></tr><tr><td>Bio-formats 플러그인 ImageJ</td><td>National Institute of Health (NIH)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html 소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>VWR</td><td>89510-194</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-래빗 IgG Alexa594</td><td>ThermoFisher 과학</td><td>&nbsp; A-11012&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>시그마-알드리치</td><td>216763-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>국립 보건원(NIH)&nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>SceI 발현 벡터</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td></td></tr><tr><td>매니큐어 - 인스타 드리</td><td>샐리 앤 한센</td><td>클리어리 퀵 (103)</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>바이오 베이직</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade 시약</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect 트랜스펙션 시약</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 dna 틈에 dna 복구 과정을 특성화

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

더블-좌초 틈 (DSBs) DNA의 복구는 매우 조정된 과정, 형성 및 다중 단백질 수리 단지의 해상도 필요로. 이 프로세스는 협회를 홍보 하는 단백질의 무수 한와이 병 변이 단백질의 분열에 의해 통제 된다. 단백질의 광대 한 도서관의 기능 화면 수행 하는 능력에 큰 부분에 감사 합니다, 이중 가닥 DNA 틈 수리에 필요한 유전자의 큰 감사 이다. 종종 녹아웃 또는 화학 억제 물 스크린 DSB 수리에 필요한 단백질에 대 한 표식으로 증가 독성을 사용 하 여 복구 프로세스에 관련 된 단백질을 식별 합니다. 하지만 게놈 충실도 유지에 관련 된 식별 소설 세포질 단백질에 대 한 유용한 기능 분석 관심사의 단백질 지역화, 형성, 또는 수리 복합물의 해결책을 촉진 하는 여부의 결정을 필요로 합니다.
수리 단백질의 축적 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 고유 핵 foci로 쉽게 감지 수 있습니다. 따라서, 협회 및 DNA 손상의 사이트에이 단백질의 분열 이중 가닥 DNA 틈의 유도 후 이러한 핵 foci 대표 간격으로 관찰 하 여 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 또한 수리 결함 수리에서 불완전 지연으로 동시에 발생 하지 않습니다 경우 잘못 지역화 된 복구 요소 단백질를 식별할 수 있습니다. 이 시나리오에서는 긴-지속 이중 가닥 DNA 휴식 했다 효소에 대 한 인식 사이트 세포 게놈으로 통합 되어 셀에 드문 절단 endonuclease (예를 들어, SceI)으로 표현 하 여 설계 수 있다. 결과 병 변 특히 충실 한 수리 효소의 인식 사이트, 분열의 또 다른 라운드를 메시지를 다시 것입니다 해결 하기 어렵다. 그 결과, 수리의 속도에 차이 제거 됩니다. 수리 단지 형성 하지는 경우 지역화 장애가 되어 있다. 이 프로토콜 수리 단백질 지 방화 뿐만 아니라 복구 속도 론 변경 내용을 식별 하는 데 필요한 방법론을 설명 합니다.

그림 1 은 맥시 마/foci 정량화 ImageJ를 사용 하 여에 대 한 올바른 잡음 차별의 선택을 묘사 한다. DAPI의 병합 된 이미지 및 복구 단백질의 왼쪽된 패널에 있습니다. 그림 1A 90의 잡음 차별 보여준다 고 foci의 정확한 수를 표시 합니다. 핵 가장자리 (분홍색 화살표 표시)와 포커스 (노란색 화살표가 그려져) 핵 외부에 정량화 하는 동안 포함 되지 않습니다. 그림 1B 50의 저 잡음 내성 묘사. 수많은 맥시 마 핵 외부와 핵 내에서 식별 됩니다. 그림 1 c 220의 높은 소음 허용 오차를 보여 줍니다. 오직 하나의 초점 (흰색 화살표) 검색 되었습니다. 독자 "긍정적인"와 "부정적인" 결과 제공, 우리는 또한 <strong class=...

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

이 방법은 DNA 복구 복합체 형성, 국소화 및 해상도가 어떻게 조절되는지와 같은 DNA 복구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 변경 사항을 명확하게 감지하고 복잡한 위치 파악 및 동역학을 수정할 수 있다는 것입니다. 제 연구실의 학부생 외에도 3명의 대학원생이 실험을 수행할 것입니다.Changkun Hu, Dalton Dacus, Stephen Walterhouse가 출연합니다. 먼저 10cm 조직 배양 플레이트에서 U2OS/DR-GFP 세포가 85-90% 융합될 때까지 성장시킵니다. 그런 다음 배지를 제거하고 3ml의 EDTA를 첨가한 다음 실온에서 3분 동안 세포를 배양합니다.EDTA를 1ml의 트립신으로 대체하고 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 5ml의 DMEM을 첨가하여 트립신을 중화합니다. 세포를 계수 한 후, 유리 바닥 96 웰 플레이트에 200 마이크로 리터의 배지에 웰 당 세 번째 세포를 10 번 6 번 파종합니다.또는 10cm 플레이트에 놓인 12mm 커버 슬립에 8밀리리터의 배지에 있는 6개의 웰에 10배의 4배를 파종한 다음 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소에서 밤새 세포를 성장시킵니다. 이중 가닥 파손 또는 DSB를 유도하려면 배지를 DMEM과 10% FBS로 25마이크로몰 농도로 희석된 과산화수소로 교체하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 1x PBS로 세포를 세 번 세척한 다음 새 DMEM을 추가합니다.세포를 배양 한 후 고정하려면 PBS를 사용하여 플레이트를 세 번 세척하십시오. 그런 다음 바늘과 집게를 사용하여 각 시점에 대해 10cm 플레이트에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 24웰 플레이트의 단일 웰에 넣습니다. 4%PFA를 추가하고 15분 동안 세포를 배양합니다.그런 다음 우리 PBS는 덮개를 세 번 씻습니다. 세포를 투과화하려면 0.5% 비이온 세제와 PBS를 첨가하십시오. 세포를 실온에서 15분 동안 배양합니다.그런 다음 PBS로 세포를 다시 세 번 씻습니다. 다음으로 PBS에 희석된 3%BSA와 0.1%비이온성 세제를 24웰 플레이트의 커버 슬립에 넣고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 관심 복구 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 추가하고 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.PBS로 세포를 3회 세척한 후 DAPI를 첨가하고 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 2차 항체로 배양합니다. 이전과 같이 셀을 세척한 후 장착 시약을 사용하여 커버 쪽이 슬라이드 위로 미끄러지도록 장착합니다.커버 슬립을 조심스럽게 누르고 물티슈를 사용하여 여분의 장착 시약을 흡수합니다. 속건성 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 슬라이드로 커버 슬립을 완전히 밀봉하십시오. DAPI 채널에 초점을 맞춰 컨포칼 현미경 이미지를 촬영합니다.면역형광 이미지에서 핵을 정의하려면 이미지 파일을 ImageJ 창으로 드래그하거나 ImageJ의 플러그인 도구 모음에서 bio-formats importer를 선택하여 컨포칼 이미지를 엽니다. 그런 다음 분할 채널을 선택합니다. color options(색상 옵션) 아래의 드롭다운 메뉴에서 colorized(색상)를 선택합니다.확인을 선택하여 DAPI 및 히스톤 H2AX 이미지를 별도의 창으로 열고 DAPI 이미지를 선택합니다. 그런 다음 adjust threshold(임계값 조정) 옵션에서 이미지 도구 모음을 선택하여 핵을 선택합니다. 그런 다음 임계값 창의 하단 막대를 완전히 오른쪽으로 밀어 이미지 임계값을 조정합니다.핵이 뚜렷한 윤곽선과 함께 완전히 빨간색으로 나타나고 배경이 검은색이 될 때까지 상단 막대를 조정합니다. 그런 다음 분석 도구 모음과 입자 분석 옵션을 선택합니다. 핵의 최소 크기를 입력합니다.표시 드롭다운 메뉴에서 개요를 선택한 다음 관리자에 추가 옵션을 선택합니다. 확인을 클릭하여 ROI 관리자 창을 엽니다. ROI 관리자 창에서 선택에 따라 핵에 숫자를 할당합니다.ImageJ를 사용하여 H2AX 병소 및 면역형광 현미경 이미지를 정량화하려면 H2AX 병소 창을 선택합니다. 그런 다음 process toolbar를 선택하고 find maxima를 선택하여 nuclei 내의 foci를 찾습니다. 출력 유형 드롭다운 메뉴에서 단일 포인트 옵션을 선택하고 미리보기 포인트 선택을 선택하여 최대 초점을 시각화합니다.그런 다음 이미지의 형광 강도에 따라 noise tolerance 값을 입력합니다. ROI manager 창에서 H2AX 병소를 정량화해야 하는 핵을 선택합니다. 선택한 핵 내의 최대 초점의 수를 측정하기 위해 측정을 선택합니다.원시 intensity 값을 복사하여 데이터 분석을 위해 소프트웨어에 붙여넣습니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 커버 슬립이 있는 96웰 플레이트에 세포를 안착시킨 후 지질 기반 transfectionary agent를 사용하여 I-SceI 발현 벡터로 세포를 transfection하여 이중 가닥 절단을 유도합니다. 앞서 보여준 바와 같이 vix 투과화 및 차단된 세포를 세척한 후 gamma H2AX에 대한 항체를 추가하고 관심 단백질을 복구한다고 상상해 보십시오.1x PBS 세척으로 96웰 플레이트 커버가 세 번 미끄러집니다. 그런 다음 96웰 플레이트 커버 슬립을 2차 항체로 배양합니다. 마지막으로, 핵 감마 H2AX 초점이 큰 세포를 식별한 후, 관심 복구 단백질과 공동 국소화를 보이는 세포를 수동으로 계산합니다.이 그림은 90의 잡음 변별을 보여주며 올바른 초점 수를 표시합니다. 가장자리의 핵과 핵 외부의 초점은 정량화 중에 계산되지 않습니다. 여기에 표시된 패널은 50의 낮은 노이즈 허용 오차를 나타냅니다.수많은 최대값이 핵 외부와 핵 내에서 확인됩니다. 이 셀에서 220의 높은 노이즈 허용 오차가 발견됩니다. 단일 초점만 검출되었습니다.감마 H2AX 초점과 관심 복구 단백질의 공동 국소화가 이 그림에 나와 있습니다. 여기에는 transfection되지 않은 세포가 표시되고, 비핵 감마 H2AX 초점이 있는 세포가 오른쪽 상단에 표시됩니다. 더 높은 배율에서는 실제 내부 초점과 비핵 또는 외부 초점에 대한 더 선명한 그림을 구별할 수 있습니다.마지막으로, 복구 단백질의 공동 국소화가 없는 핵 감마 H2AX 초점의 예가 여기에 나와 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 며칠 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 관심 있는 복구 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위해 co-mutor 침전과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 DNA에서 일시적인 이중 가닥 절단을 유도하여 DNA 복구 복합체의 형성 및 해상도를 관찰하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 오래 지속되는 병변을 유도하여 지연된 모집과 복구 인자의 잘못된 국소화를 명확하게 구별하는 방법을 배웁니다.

characterizing-dna-repair-processes-at-transient-long-lasting-double

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

이 비디오에서는 방사선 조사된 세포핵의 이중 가닥 DNA 절단 부위에서 DNA 복구 단백질 γH2AX 및 53BP1의 국소화를 시각화하기 위한 면역형광 방법에 대해 설명합니다.

DNA 복구 단백질 상호 작용의 면역형광 기반 시각화

이 비디오에서는 인간 단핵 세포의 DNA 이중 가닥 절단 부위에 국한된 특정 DNA 손상 반응 단백질을 검출하는 면역형광 현미경 검사 기술에 대해 설명합니다. 단백질은 특정 1차 항체에 의해 인식되며, 이 항체는 다시 현미경 시각화 중에 형광을 발하는 형광단 표지된 2차 항체에 결합하여 단백질을 세포핵 내에서 뚜렷한 형광 병소로 시각화할 수 있습니다.

DNA Double-Strand Break 분석을 위한 면역형광 현미경 검사

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 확립되지 않았다. 이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 면역 형광 염색에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 포시 (RIF)를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다.

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

본 프로토콜에서, 우리는 면역 형광 기지를 둔 방법을 사용하여 세포 주기의 S/G2 단계 도중 DNA 이중 가닥 말 절제술을 구상하는 방법을 보여줍니다.

세포 주기 차별 화상 진찰과 결합된 BrdU DNA 라벨링을 사용하여 글로벌 DNA 이중 가닥 끝 절제술의 평가

다음 프로토콜은 세포주기 동기화 후 RPA2 면역형광 염색을 사용하여 세포주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소를 검출하는 방법을 제시합니다.

세포 주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소 시각화

배우세요 면역형광현미경법을 이용한 DNA 이중가닥절단 복구 복합체 형성 및 해소 과정 분석 방법을. U2OS/DR-GFP 세포를 활용하여 유전체 안정성 연구에 필수적인 DNA 손상 응답 메커니즘을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

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