면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

이 방법은 DNA 복구 복합체 형성, 국소화 및 해상도가 어떻게 조절되는지와 같은 DNA 복구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 변경 사항을 명확하게 감지하고 복잡한 위치 파악 및 동역학을 수정할 수 있다는 것입니다. 제 연구실의 학부생 외에도 3명의 대학원생이 실험을 수행할 것입니다.

Changkun Hu, Dalton Dacus, Stephen Walterhouse가 출연합니다. 먼저 10cm 조직 배양 플레이트에서 U2OS/DR-GFP 세포가 85-90% 융합될 때까지 성장시킵니다. 그런 다음 배지를 제거하고 3ml의 EDTA를 첨가한 다음 실온에서 3분 동안 세포를 배양합니다.

EDTA를 1ml의 트립신으로 대체하고 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 5ml의 DMEM을 첨가하여 트립신을 중화합니다. 세포를 계수 한 후, 유리 바닥 96 웰 플레이트에 200 마이크로 리터의 배지에 웰 당 세 번째 세포를 10 번 6 번 파종합니다.

또는 10cm 플레이트에 놓인 12mm 커버 슬립에 8밀리리터의 배지에 있는 6개의 웰에 10배의 4배를 파종한 다음 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소에서 밤새 세포를 성장시킵니다. 이중 가닥 파손 또는 DSB를 유도하려면 배지를 DMEM과 10% FBS로 25마이크로몰 농도로 희석된 과산화수소로 교체하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 1x PBS로 세포를 세 번 세척한 다음 새 DMEM을 추가합니다.

세포를 배양 한 후 고정하려면 PBS를 사용하여 플레이트를 세 번 세척하십시오. 그런 다음 바늘과 집게를 사용하여 각 시점에 대해 10cm 플레이트에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 24웰 플레이트의 단일 웰에 넣습니다. 4%PFA를 추가하고 15분 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 우리 PBS는 덮개를 세 번 씻습니다. 세포를 투과화하려면 0.5% 비이온 세제와 PBS를 첨가하십시오. 세포를 실온에서 15분 동안 배양합니다.

그런 다음 PBS로 세포를 다시 세 번 씻습니다. 다음으로 PBS에 희석된 3%BSA와 0.1%비이온성 세제를 24웰 플레이트의 커버 슬립에 넣고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 관심 복구 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 추가하고 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.

PBS로 세포를 3회 세척한 후 DAPI를 첨가하고 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 2차 항체로 배양합니다. 이전과 같이 셀을 세척한 후 장착 시약을 사용하여 커버 쪽이 슬라이드 위로 미끄러지도록 장착합니다.

커버 슬립을 조심스럽게 누르고 물티슈를 사용하여 여분의 장착 시약을 흡수합니다. 속건성 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 슬라이드로 커버 슬립을 완전히 밀봉하십시오. DAPI 채널에 초점을 맞춰 컨포칼 현미경 이미지를 촬영합니다.

면역형광 이미지에서 핵을 정의하려면 이미지 파일을 ImageJ 창으로 드래그하거나 ImageJ의 플러그인 도구 모음에서 bio-formats importer를 선택하여 컨포칼 이미지를 엽니다. 그런 다음 분할 채널을 선택합니다. color options(색상 옵션) 아래의 드롭다운 메뉴에서 colorized(색상)를 선택합니다.

확인을 선택하여 DAPI 및 히스톤 H2AX 이미지를 별도의 창으로 열고 DAPI 이미지를 선택합니다. 그런 다음 adjust threshold(임계값 조정) 옵션에서 이미지 도구 모음을 선택하여 핵을 선택합니다. 그런 다음 임계값 창의 하단 막대를 완전히 오른쪽으로 밀어 이미지 임계값을 조정합니다.

핵이 뚜렷한 윤곽선과 함께 완전히 빨간색으로 나타나고 배경이 검은색이 될 때까지 상단 막대를 조정합니다. 그런 다음 분석 도구 모음과 입자 분석 옵션을 선택합니다. 핵의 최소 크기를 입력합니다.

표시 드롭다운 메뉴에서 개요를 선택한 다음 관리자에 추가 옵션을 선택합니다. 확인을 클릭하여 ROI 관리자 창을 엽니다. ROI 관리자 창에서 선택에 따라 핵에 숫자를 할당합니다.

ImageJ를 사용하여 H2AX 병소 및 면역형광 현미경 이미지를 정량화하려면 H2AX 병소 창을 선택합니다. 그런 다음 process toolbar를 선택하고 find maxima를 선택하여 nuclei 내의 foci를 찾습니다. 출력 유형 드롭다운 메뉴에서 단일 포인트 옵션을 선택하고 미리보기 포인트 선택을 선택하여 최대 초점을 시각화합니다.

그런 다음 이미지의 형광 강도에 따라 noise tolerance 값을 입력합니다. ROI manager 창에서 H2AX 병소를 정량화해야 하는 핵을 선택합니다. 선택한 핵 내의 최대 초점의 수를 측정하기 위해 측정을 선택합니다.

원시 intensity 값을 복사하여 데이터 분석을 위해 소프트웨어에 붙여넣습니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 커버 슬립이 있는 96웰 플레이트에 세포를 안착시킨 후 지질 기반 transfectionary agent를 사용하여 I-SceI 발현 벡터로 세포를 transfection하여 이중 가닥 절단을 유도합니다. 앞서 보여준 바와 같이 vix 투과화 및 차단된 세포를 세척한 후 gamma H2AX에 대한 항체를 추가하고 관심 단백질을 복구한다고 상상해 보십시오.

1x PBS 세척으로 96웰 플레이트 커버가 세 번 미끄러집니다. 그런 다음 96웰 플레이트 커버 슬립을 2차 항체로 배양합니다. 마지막으로, 핵 감마 H2AX 초점이 큰 세포를 식별한 후, 관심 복구 단백질과 공동 국소화를 보이는 세포를 수동으로 계산합니다.

이 그림은 90의 잡음 변별을 보여주며 올바른 초점 수를 표시합니다. 가장자리의 핵과 핵 외부의 초점은 정량화 중에 계산되지 않습니다. 여기에 표시된 패널은 50의 낮은 노이즈 허용 오차를 나타냅니다.

수많은 최대값이 핵 외부와 핵 내에서 확인됩니다. 이 셀에서 220의 높은 노이즈 허용 오차가 발견됩니다. 단일 초점만 검출되었습니다.

감마 H2AX 초점과 관심 복구 단백질의 공동 국소화가 이 그림에 나와 있습니다. 여기에는 transfection되지 않은 세포가 표시되고, 비핵 감마 H2AX 초점이 있는 세포가 오른쪽 상단에 표시됩니다. 더 높은 배율에서는 실제 내부 초점과 비핵 또는 외부 초점에 대한 더 선명한 그림을 구별할 수 있습니다.

마지막으로, 복구 단백질의 공동 국소화가 없는 핵 감마 H2AX 초점의 예가 여기에 나와 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 며칠 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 관심 있는 복구 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위해 co-mutor 침전과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 DNA에서 일시적인 이중 가닥 절단을 유도하여 DNA 복구 복합체의 형성 및 해상도를 관찰하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 오래 지속되는 병변을 유도하여 지연된 모집과 복구 인자의 잘못된 국소화를 명확하게 구별하는 방법을 배웁니다.