Name: Cytometry와 수생 Biofilms의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 수생 바이오필름의 특성 분석을 위한 유세포 분석법과 시각적 클러스터링 기법을 활용하는 방법을. 이 기술은 미세플라스틱과 같은 비생물성 입자를 식별하고 생태계 건강을 평가하는 데 효과적입니다.

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제시 작품 SNF Ambizione 친교 (PZ00P2_142533)와 Velux 연구 그랜트 (Amplebig)에 의해 지원 되었다. 우리는 실험적인 작품에 대 한 베티 바그너를 감사 하 고 싶습니다.

1. 생태계 선택 및 Biofilm 샘플링
<ol><li>관심의 수생 생태계를 선택 하 고 샘플링 사이트 biofilms 성장. 얕은 부분으로 스트림의 중간 물 흐름을 느리게 그리고 돌 streambed biofilm 첨부 파일에 대 한 적절 한17,18.</li>
	<li>옵션: 없으면 사이트 충분 한 표면에 biofilm 첨부 파일에 대 한 또는 사이트 내에서 biofilms 가변성을 감소, biofilm 첨부 파일 (예: 유리 슬라이드, 세라믹 타일)에 대 한 인공 기판에 배치 사이트 있는지 하는 동안 그들은 물의 흐름에 관하여와 비슷한 깊이 빛의 강도19에서 같은 방향으로 배치 됩니다.</li>
	<li>샘플링 사이트, 빛의 강도 측정을 사용 하 여 휴대용 기기에서 환경 조건을 확인 하려면 물 온도, 전도도, 산소와 pH 표면 biofilm 바로 위에 샘플링입니다. 샘플링의 과정을 통해 조치를 반복 (3-5) 평균값을 계산 하려면.</li>
	<li>선택 사항: 관련 확인 받아 물 샘플 물 화학 매개 변수 (녹은 유기 탄소 (DOC), K+Na+, 캘리포니아2 +, 마그네슘2 +, Cl-, F-, SO42-, PO42- , 아니32-, SiO44-).</li>
	<li>보호 장갑에 사용 하 여, 각 사이트 (또는 인공 기판)에서 유사한 돌 (크기, 모양, 및 형식)를 수집 합니다. 돌 비슷한 흐름을 조명 조건18노출 되어야 합니다.</li>
	<li>것 (예를 들어, 샘플 당 15 mL) 모든 수집 된 샘플에 대 한 준비 사이트에서 충분 한 스트림 물의 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>부드러운 칫 솔을 사용 하 여 필터링 된 스트림 물20의 15 mL로 플라스 크 (브러쉬 모든 biofilm 제거 될 때까지)에 biofilm 기판에서 제거.</li>
	<li>0.01 %paraformaldehyde 및 0.1% 글21에 샘플을 수정.</li>
</ol>2. 최적의 흐름-cytometric (FC) 매개 변수 결정
<ol><li>가벼운 현미경을 하위 전송 (40 / 0.75 X를 사용 하 여 목표; 필요한 100 × 1.3 오일 목표를 사용 하 여) 종 샘플22,23에 확인.</li>
	<li>주문 확인 적절 한 문화 컬렉션에서 단일 종 (예: 실험 조류학 및 Goettingen의 대학 [EPSAG]에 조류의 문화 컬렉션 또는 [CCAC] 쾰른 대학에서 문화 조류 컬렉션의 경우 모니터링 수행 됩니다 중앙 유럽 생태계에).</li>
	<li>Biofilm 샘플에서 찍은 환경에 단일 종 비슷한 환경 조건 (예: 빛, 온도, pH)에서 지속적으로 성장. 1 ° C와 0.5 내 환경 샘플에서 pH 포인트는 것이 좋습니다.</li>
	<li>분리/분산 셀, 원심 분리기 튜브 단일 종 샘플의 15 mL를 넣고 하 고 물 욕조의 센터에 튜브를 넣어 잠수함, 그 샘플의 액체 표면 목욕의 표면으로 동일한 수준. 45 kHz24,25에서 1 분 샘플 sonicate</li>
	<li>플레이트 리더를 사용 하 여 단일 종의 흡 광도 및 형광 스펙트럼을 기록 합니다. 지침에 대 한 선택의 플레이트 리더를 참조 하십시오. 이 예제에서는에서 96 잘 플랫 바닥 투명 polystyrol 접시 200 µ L 샘플 볼륨으로 로드 하 고 흡 광도 측정 했다. (사용 되는 설정: (a) 형광 스캔 모드; 방출 파장 단계 10 nm, 방출 스캔 번호 30, 대역폭 20 nm 크기, 100, 25 섬광, 20 미국 통합 시간 또는 흡 광도 (b) 스캔 모드; 25 섬광, 대역폭 9 nm).</li>
	<li>레이저, dichroic 스플리터와 필터를 조합에 다른 종 특정 속성을가지고 있는 모든 그 형광 범위를 커버 흐름 cytometer를 설정 합니다. 중앙 유럽 스트림에서 405 nm, 488 nm 및 638 nm 레이저 유용한 결과 얻을.</li>
	<li>Photomultipliers (모든 교류 cytometers은 적용 되지 않음)의 전압 설정 및 측정된 fluorescences의 범위는 샘플의 모든 이벤트의 99% 이상 포함 하도록 조정 합니다.</li>
	<li>또는, 종은 biofilms에 존재에 대 한 지식을 사용할 수 있는 경우 단계 2.2 시작. 형광 속성 알고 있는 단계 2.6 시작 합니다.</li>
</ol>3. 선택 사항: 흐름 cytometric 참조 데이터베이스 준비
참고: FC는 biofilm에 셀의 분류학 id를 허용 하지 않습니다. Biofilms로 유사한 조건에서 성장 된 biofilms에 존재 알려진 단일 종의 FC 측정 참조 데이터베이스는 데이터의 해석으로 도울 수 있다.
<ol><li>
참고: 단일 종
	<ol>
<li>2.5-7에 최적화 된 FC 매개 변수를 사용 하 여, 단일 종 (paraformaldehyde에도 고정 및 교류 cytometer에 대 한 적절 한 크기의 필터를 통해 필터링)의 광학 속성과 형광을 측정.</li>
		<li>같은 방식으로 데이터 (단계 6.1.2 참조) biofilms에서 단일 종에서 데이터를 정상화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
참조: 손상 되 고 부패 셀 Biofilm 건강의 가장 중요 한 지표 중 하나는 biofilm에 손상/죽어가는 세포의 일부분입니다. 이러한 셀을 계량, 부패 셀의 참조를 준비 수 있습니다.<ol>
<li>1 mL 희석된 biofilms의 샘플이 고 탁상 원심 분리기에서 10 분 동안 그들을 실 온에서 8000 x g 에서 원심. 1 mL 90% 에탄올에 결과 펠 릿을 일시 중단 하 고 4 ° c.에 하룻밤 정지를 저장 다음날에 반복 합니다.</li>
		<li>최적화 된 FC 설정을 사용 하 여, 손상 되 고 부패 셀 (고정 및 필터링)의 광학 속성과 형광 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
참고: microplastics 참고:: 는 biofilms에 microplastic 입자 모니터링에 관심이, 그들은 충분히 다른 지 여부를 확인 광학에 생물 입자 및 식별에 대 한 형광 속성에서.<ol>
<li>Microplastics 프로듀서의 지시에 따라 microplastic 입자를 일시 중단 하 고 (2.7에서 FC 매개 변수를 사용 하 여) 그들의 광학 및 형광 속성을 측정 한다.</li>
		<li>Biofilm 샘플을 microplastic 입자를 추가 하 고 위에 밤에 4 ° c.</li>
		<li>펜션과 같은 FC 매개 변수로 위의 측정값을 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 샘플 준비와 저장
<ol><li>FC 설정 이며 FC 참조 데이터베이스 준비, 일단 하나 1.1-7 단계에 따라 수집 된 신선한 biofilm 샘플의 평가 함께 진행할 수 있습니다. 분리/분산 된 biofilm, 원심 분리기 튜브 샘플의 15 mL 플라스 크 (단계 1.7 참조)에서 전송.</li>
	<li>물 목욕의 센터에 각 튜브를 넣고는 샘플의 액체 표면 목욕의 표면으로 동일한 수준에 잠수함. 1 분 45 khz 샘플 sonicate</li>
	<li>0.01 %paraformaldehyde 및 0.1% 글 (nanopure 물에 재고)에서 샘플을 수정. 분석에 대 한 준비까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>중요:-cytometry 분석에 대 한 샘플의 절반을 사용 하 고 절반 형광 활성화 된 세포 분류 또는 가벼운 현미경 검사 법 (제 6 항 참조) 선택적 유효성 검사에 대 한 스토리지 안전에 대 한 유지. :: 을 참고 냉장고에 저장, 고정된 biofilm 샘플 유지 한다 그들의 광학 및 형광 속성 3 주 최대.</li>
</ol>5. FC를 통해 샘플을 실행합니다.
<ol><li>샘플은 냉장고에 저장, 신속 하 게 그들을 sonicate 또는 여러 번 입자를 분리 하기 위하여 플라스틱. 측정 하기 전에 50 μ m 필터 (필터 크기는 FC 모 세관의 너비에 따라 달라 집니다)는 하위를 필터링 합니다.</li>
	<li>개별 샘플을 로드 (1-2 mL,이에 따라 달라 집니다 사용 교류 cytometer) 교류 cytometer로 각 입자의 광학 및 형광 특성을 측정 하 고. 각 생물 복제 (3 기술 복제) 당 3 회 측정을 반복 합니다.</li>
	<li>FC.csv 형식에서에서 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>6. 데이터 준비 및 상관 관계 분석
FC 각 측정된 광학 속성 및 형광 범위에 대 한 여러 매개 변수 (예를 들면, 신호 면적, 높이, 너비) 분석할 수 있습니다. 측정된 변수에 상관 관계 분석을 실행 하 고만 높은 상관 없습니다 그 측정을 유지. 이 보통 한 FC 매개 변수 (예를 들면, 신호 지역) 제외 하 고 모두 제거 하 고 상관 수 있다 또한 제거 높은 형광 측정 (일반적으로 동일한 레이저에서 형태소 및 필터 인접).
<ol><li>
Matlab에서 도구 상자 CYT 실행:
	<ol>
<li>CYT 소프트웨어16, 모든 기술 등 생물 학적으로 분석 하는 모든 샘플에서.csv 형식에서 가져오기 감소 FC 데이터 복제 합니다. (클릭 +, 파일 필터 *.csv 가져오기 파일을 선택).</li>
		<li>하이퍼볼릭 아크사인 변환을 사용 하 여 모든 샘플의 형광 채널 변환. 공동 인자 값; 선택할 필요가 150 일 가장 광합성 biofilms 및 교류 cytometers 하지만 최적화에 대 한 특정 실험 설정 및 이렇게 biofilms에 대 한 필요할 수 있습니다. (오른쪽-클릭/변환/입력 cofactor 150)</li>
		<li>품질 관리에 대 한 시각 비교 (CYT)에서 개별 샘플 및 확인 거기 아무 outliers 복제 기술 및 생물 학적 수준에서 개별 광과 형광 채널의 히스토그램. Outliers는 복제 사이 크게 이동한 형광/광학 배포판에서 매니 페스트 것입니다. (데이터, 선택 채널, 플롯을 선택)<ol>
<li>대안: 형광 배포판의 중간 값에 주성분 분석 (PCA)를 실행 하 고 기술 및 생물 복제 클러스터 함께 있는지 확인 하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>기술 각 생물 복제에 복제 병합 및 subsample 생물학 복제, 각각 입자 (셀, 셀 조각 및 abiotic 입자)의 동일한 수로 표시 되 고 입자의 총 수에 의해 분석 반 즈-헛 확률적 이웃 (bh-SNE) 포함 (최고의 시각화 결과26)에 대 한 약 150, 000 이다. (데이터, 마우스 오른쪽 단추로 클릭, 병합/Subsample 선택)</li>
		<li>샘플 사이의 비교에 대 한 그것은 비교 하는 샘플만을 선택 하는 것이 중요입니다. 샘플을 선택 하 고 bh SNE27실행. 알고리즘 완료, 새로운 채널은, 일단 명명 된 bh SNE1와 bh SNE2 나타납니다. 이들은 점도 (viSNE 지도)에서 데이터를 시각화 하는 데 사용할 수 있습니다 모든 분석 된 입자의 SNE 좌표. (데이터, 채널, 마우스 오른쪽 단추로 클릭, bh SNE, 정규화 된 데이터 예)</li>
		<li>ViSNE 지도에서 입자는 유사성에 따라 배치 하 고 시각적으로 분리 클러스터로 그룹화 합니다. CYT에서 사용할 수 있는 그리기 도구를 사용 하 여 다른 광/형광 속성 있고 잘 분리 되어 그의 클러스터와 마크와 이름 광/형광 속성 검사 합니다. (선택 채널 bh-SNE1, bh-SNE2)</li>
		<li>옵션: 하나의 미생물 종 (같은-cytometry 설정 측정 및 유사한 조건 하에서 성장!)의 참조 데이터베이스를 사용할 수 있으면 viSNE 지도 Matlab으로 내보내고 지도에 참조 데이터베이스 프로젝트. 이 방법에서는, 특정 클러스터 특정 종/분류학 그룹 (https://github.com/anzezupanic/FC_analysis에서 다운로드에 사용할 수 있는 스크립트)에 연결할 수 있습니다. (세션/저장)</li>
		<li>문제 해결: bh SNE 분석은 시각적으로 분리 클러스터, 하지만 하나의 큰 하나를 반환 하지 않으면, 너무 많은 입자에서에서 사용 되었다 bh SNE. 샘플 당 적은 입자와 다시를 시도 하십시오. 클러스터, 하지만 오히려 스파스 개별 포인트 경우 사용 하는 입자의 수를 늘립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선택 사항: bh-SNE는 클러스터링에 사용 하는 대신 다른 클러스터링 방법 (예를 들어계층 구조, 중심 기반 또는 밀도 기반 클러스터링) 정규화 된 데이터에 사용 하 고 수 다음 viSNE (https://github.com/에 겹쳐 anzezupanic/FC_analysis)입니다.</li>
	<li>클러스터 확인 한 후, 각 샘플에 각 생물 복제에 속한 각 클러스터에 있는 입자의 수를 계산 합니다. 적절 한 (예를 들어, 홈즈)와 ANOVA와 Tukey의 테스트를 사용 하 여 샘플 간의 차이 평가 여러 비교에 대 한 수정.</li>
</ol>7. 선택 사항: 유효성 검사 형광 활성화 된 세포 분류를 사용 하 여 클러스터 해석의
<ol><li>클러스터 확인 한 후, 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여는 FACS 구성이 비슷한 (또는 동일한) 레이저 및 형광 필터는 원하는 경우 샘플에서 그들을 정렬.</li>
	<li>식별 된 각 클러스터 CYT 광과 형광 게이츠를 클러스터를 정의 하는 제공 합니다. 이 게이트를 사용 하 여 각 클러스터는 FACS에 입자를 밖으로 정렬 한 다음 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 정렬된 셀을 식별.</li>
</ol>

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<li>van der Maaten, L. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v15/vandermaaten14a.html">Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms.</a> J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

위에서 설명한 프로토콜은 구현 하려면 상대적으로 간단 합니다. 그러나, 표시 기본 설정을 모든 광합성 biofilm 지금까지 테스트에 적합 하도록 표시 되었습니다, 하는 동안 최적화 (프로토콜에서 설명) 하는 대로 방법에서 얻은 정보를 최대화 하기 위해 필요 하다. 실제로, biofilms의 광과 형광 속성 환경 조건 (계절, 온도, 물의 화학 성분)1에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서,이 가변성 FC 분석을 설정할 때 고려해 야 할 중요 하다. 할 한 가지 방법은이 여 샘플링 사이트에서 biofilms의 대표 샘플을 복용 또는 단일 종의 다른 조건 및 측정에 그들을 성장 하는 것은 서로 다른 설정을 사용 하 여 그들. 단일 종의 성장도 FC 결과 해석 하는 데 사용할 수 있는 형광 속성의 데이터베이스를 만드는 데 유용 하다. 그러나,이 위해서는 단일 종 하는 biofilms 샘플링 수 하가 그 비슷한 조건에서 측정 된 중요 하다. 예를 들어 25 ° C에서 성장 하는 단일 종의 FC...

Biofilms는 미생물 및 생태계의 생물 다양성의 분포에 영향을 미치는 주요 생산, 영양소 사이클링, 및 물 정화에서 이르는 민물 생태계에서 중요 한 역할을 하는 미생물의 동적 컨소시엄 1. biofilms는 변화 하는 환경 조건 또는 화학 물질, 같은 스트레스에 노출 되 면 그들의 지역 사회 구조 신속 하 게 더 관대 종2,3쪽으로 이동. 그러나 그들의 높은 감도 현재 방법의 아무도 완벽 하 게 실제로 biofilm 커뮤니티의 동적을 추적 하는 빠르고 쉬운 방법에 적합 한 biofilms 환경 모니터링4, 매력적인 모델 시스템으로 변합니다.
기능과 구조 끝점의 측정 biofilms 하 방법의 일반적으로 사용 되 세트에 의하여 이루어져 있다. 전체 사회의 수준에서 광합성 및 호흡 활동 뿐만 아니라 세포 외 효소의 활동 정보를 제공 합니다 biofilm5,6,7,8의 기능 상태에 ,9. 바이오 매스 계산 전체 biofilm 성장 표시기로 사용 됩니다. 구조적인 변화는 현재 가벼운 현미경 검사 법 또는 뉴클레오티드 기반 기술 (예를 들어, 그라데이션 젤 전기 이동 법 (DGGE), 자동화 된 ribosomal intergenic 스페이서를 변성 시키기 전통적인 종 식별을 사용 하 여 측정 분석 (아리사) metagenomics)10,,1112. 이러한 방법 정보를 제공 하지만 수행, 또는 특정 지식이 필요로 수 있습니다 또는 아직 개발 중인. 마지막으로, 세포 외 고분자 물질 (EPS)13,14 와 biofilm 건축1을 민감한, 동안 평가 대 한 새로운 방법을 낮은 처리량 고 쪽으로 아직 개발 하지 않은 목적을 모니터링합니다.
민물 biofilms의 완전 한 특성, 그것은 biofilm 기능, 구성 및 아키텍처에 대 한 통찰력을 제공 하는 여러 가지 다른 방법을 결합 하는 데 필요한 것이 분명 하다. 환경 모니터링, 다른 한편으로는 biofilm에서 변화를 감지 하 여 설정 기능 및 구조적 수준에서 교대의 기본적인 생물 학적 해석 수 있는 신속 하 고 중요 한 방법이 필요 합니다.
우리 스트림 biofilms (periphyton), 목적, 모니터링을 위한 충분히 빠른 이며 동시에 biofilm 커뮤니티에 충분 한 정보를 제공 한다 광합성의 미생물 지역 사회 특성에 대 한 새로운 방법을 개발 했습니다. 생물 학적 해석15수 있도록 구조입니다. 그것은 단일 셀 cytometry (FC) biofilm 샘플에 기반 하 고 전산 시각화 함께 단일 셀 수준에 biofilm의 광과 형광 속성에 정보를 제공 합니다.
Biofilm 샘플링 후 워크플로 샘플 준비 쥡니다, 고정, cytometry에 의해 샘플을 평가 하 여 다음 샘플의 크기 기반 필터링의 형태로 이루어져 있다. 단일 측정에 여러 세포 특성에 정보를 제공 하는 인수 데이터: 입자 크기, 밀도, 안료 콘텐츠는 biofilm에서 비 생물 적인 콘텐츠 (예: microplastics). 데이터의이 세트는 보다 시각적 확률적 이웃 (viSNE)16, 데이터의 신속 하 고 쉽게 해석 가능 하 게 포함을 사용 하 여 계산 시각화를 통해 분석. 몇 주를 설정 하 고 메서드를 최적화 하는 데 필요한 있지만 한번 설정 하 고, 결과 해석 하는 biofilm 샘플 수집에서 단 몇 시간 걸리는.
다른 사람 제시 방법의 주요 장점은 속도 분석 및이 정보 콘텐츠는. 또한, 샘플의 그들의 광 손실 및 형광 속성 없이 컬렉션 후 몇 주 동안 저장할 수 있습니다. 샘플의 많은 수의 큰 샘플링 연구 등 biomonitoring 프로그램 필요 하지만 상당한 양의 작은 예비 연구에 정보를 제공할 수 있습니다 때이 매우 유용할 수 있습니다.
제시 프로토콜 스트림의 다른 위치에서 수집 된 광합성 biofilms (periphyton)의 흐름-cytometric 분석을 기반으로 합니다. 프로토콜, 예를 들면 목적, 모니터링에 대 한 적절 한 사이트의 선택의 많은 단계 연구의 목표에 따라 달라 집니다 그리고 그러므로 처방 될 수 없습니다. 다른 더 적은 자유를 허용 하 고 필요한 프로토콜은 밀접 하 게 뒤에, 상세한 프로토콜 아래에서 분명히 만든.
프로토콜은 biofilm 기반 환경 모니터링에 대 한 사이트의 선택과 시작합니다. 다음 단계는 set-up 교류 cytometer (FC)의 측정 사용 모니터링된 환경에서 biofilms에 살고 다른 광합성 유기 체 사이 차별. 이 사이트를 식별 하는 다른 종에 존재 하는 biofilm 고 교류 cytometer 레이저와 광학에 적절 한 측정을 사용할 수 있는 필터 설정의 형광 속성에서 biofilm 샘플을 수집 하 여 수행 됩니다. 파장입니다. Biofilms 수 FC 설정 후 사이트에서 주기적으로, cytometry에 의해 측정 하는 biofilm 및 시각적 클러스터링 분석 데이터에 단일 입자의 광학 및 형광 재산 수집. 결과의 더 나은 해석에 대 한 로컬 biofilm 살아있는 종의 FC 참조 데이터베이스 및 그들의 고기를 빌드하고 FC 데이터에서 다른 분류를 식별 하는 데이터베이스를 사용 가능 하다. 유효성 검사 FACS 및 현재 종의 분류학 식별 현미경-기반을 사용 하 여 단일 셀의 확인 된 클러스터의 정렬 형광 기반을 통해 가능 하다. 프로토콜의 회로도 그림 1에서 주어진 다.

<table><tbody><tr><td>멀티 미터</td><td>WTW</td><td>MultiLine 3620 IDS</td><td>온도, pH, 용존 산소</td></tr><tr><td>측정용 초음파 세척기</td><td>VWR International</td><td>97043-986</td><td>탱크 치수: 15*14*10 cm</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios</td><td>레이저: 405, 488 및 638 nm. 보충 표 11의 필터 밴드. Sgier 외, Nat Comm, 2016.&nbsp;</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td>은 보충 표 12에서 FC 세포 분류기 Beckman Coulter MoFlo Astrios 설정<td>의 적절한 설정을 선택하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>. Sgier 외, Nat Comm, 2016.&nbsp;</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td>Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 대물</td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수치</td><td>계산을 위한</td>Matlab <td>MathWorks</td><td>R2013a</td> 소프트웨어</tr><tr><td>CYT</td><td>Dana Pe'er Lab</td><td>버전 1.1</td><td>세포 분석 데이터 분석을 위한 무료 대화형 시각화 도구</td></tr></tbody></table>

cytometry와 수생 biofilms의 특성

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms는 민물 생태계에서 중요 한 역할을 하는 미생물의 동적 컨소시엄. 그들의 사회 구조를 바꾸어 서, biofilms 환경 변화에 신속 하 게 대응 하 고 따라서 수 질의 지표로 사용할 수 있습니다. 현재, biofilm 평가 주로 기반으로 통합 및 기능 끝점, 광합성 이나 호흡 활동, biofilm 커뮤니티 구조에 정보를 제공 하지 않습니다를 합니다. Cytometry 및 전산 시각화 커뮤니티 구성, 특히 민물 biofilms의 photoautotrophic 부분에 대 한 평가 대 한 대안, 민감한, 그리고 사용 하기 쉬운 메서드를 제공합니다. 전체 샘플 교류 cytometer 통해 실행 후 기본 샘플 준비를 필요 합니다. 단일 셀 광과 형광 정보 전산 시각화 및 생물 학적 해석에 사용 됩니다. 다른 방법에 비해 주요 장점을 분석 하 고이 정보 콘텐츠 자연의 속도. Cytometry 단일 측정에 여러 휴대 및 biofilm 특성에 정보를 제공 합니다: 입자 크기, 밀도, 안료 콘텐츠, biofilm, 및 거친 분류학 정보 abiotic 콘텐츠. 그러나, 그것은 종 수준에 biofilm 구성에 정보를 제공 하지 않습니다. 우리 수생 생태계의 환경 모니터링을 위한 방법의 사용에서 높은 잠재력을 하류 알리는 단계 초기 biofilm 평가로 보완 하 고 더 상세한 방법으로 조사를 상세한.

(그림 1)을 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 스위스에서 로컬 스트림의 여러 사이트에서 샘플 분석 했다. 각 사이트에서 3 개의 비슷한 크기의 돌 (10-12 cm) 찍은, 그리고 biofilms 돌 닦 했다. 샘플 다음 sonicated, 고정, 필터링 되었고 나중 cytometry에 의해 분석. 교류 cytometer와 사용 하는 참조 데이터베이스의 설치 이전 종이15에 설명 된 대로 동일한 했다: 3 레이저 사용 되었다 (405, 488, 638 nm), 7 dichroic 스플리터와 커버에 425에서 형광 방출 10 필터 &gt; 755 nm 참조 데이터베이스 포함 &gt; 취재 남조류, 녹 조류, 규조류 및 스위스 스트림에 biofilms에서 발견 된 붉은 해 조류 30 종. ViSNE 맵 생성에 사용 되는 입자의 총 수는 약 150000 (<strong cla...

시각적 클러스터링 함께에서 cytometry 수생 biofilms 공부는 쉬운--사용 하 고 빠른 방법을 제공 합니다. 그것은 biofilm 특성, biofilm 커뮤니티 구조에 변화의 탐지 및는 biofilm에 포함 하는 비 생물 적인 입자의 탐지에 사용할 수 있습니다.

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

이 방법은 화학 오염이나 기후 변화가 수생 생태계에 미치는 영향과 같은 환경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 개별 단계를 간단하고 빠르게 수행할 수 있다는 것입니다. 이 절차의 초점은 독립영양 생물막을 특성화하는 것이지만, 종속영양 생물막을 특성화하고 미세 플라스틱과 같은 입자 오염 물질을 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다.시작하려면 생물막이 자라는 수생 샘플링 사이트를 선택하며, 이는 일반적으로 물의 흐름이 느리거나 중간 정도의 흐름과 돌이 많은 하천 바닥이 있는 하천의 얕은 부분입니다. 현장에 생물막을 부착할 수 있는 표면이 충분하지 않은 경우 생물막이 자랄 수 있는 인공 기판을 사용할 수 있습니다. 휴대용 기기를 사용하여 샘플링 현장의 환경 조건을 측정하여 샘플링할 생물막 표면 바로 위의 전도도, pH, 수온 및 광 강도를 측정합니다.보호 장갑을 사용하여 각 사이트에서 크기, 모양 및 유형이 비슷한 돌을 수집합니다. 돌은 유사한 흐름과 빛 조건에 노출되는 지역에서 수집해야 합니다. 생물막 시료 채취 및 현장의 성장 조건 측정 외에도 물 화학적 매개변수를 측정하기 위해 물 샘플을 확보하십시오.생물막 샘플을 처리하려면 먼저 0.22마이크로미터 필터를 통해 현장에서 15밀리리터의 하천수를 여과합니다. 그런 다음 부드러운 칫솔을 사용하여 플라스크에 완전히 매달려 있을 때까지 기질에서 생물막을 제거합니다. 0.01%파라포름알데히드와 0.1%글루타르알데히드를 사용하여 생물막 샘플을 수정합니다.생물막의 하위 샘플을 광학 현미경으로 전송합니다. 샘플에 적합한 배율로 전환하고 생물막 샘플에 존재하는 종을 식별합니다. 개별 종에 대한 배양을 준비합니다.생물막 샘플이 채취된 환경과 유사한 환경 조건을 사용하여 지속적으로 성장시킵니다. 일단 성장하면 45 킬로 헤르츠에서 5-10 초 동안 초음파 처리하여 세포를 분산시킵니다. 분산된 세포를 96웰 플레이트에 넣습니다.일단 분산되면 플레이트 리더를 사용하여 단일 종의 흡광도 및 형광 스펙트럼을 기록합니다. 다음으로, 이색성 스플리터와 필터로 유세포 분석기를 설정하여 다양한 종이 특정 특성을 가지고 있는 것으로 밝혀진 형광 범위를 커버합니다. 단일 종 참조를 준비하려면 최적화된 유세포 분석 매개변수를 사용하여 단일 종의 광학 및 형광 특성을 측정하십시오.다음으로, 묽게 된 생물막의 1 밀리리터 이하 샘플을 채취하여 8, 000g에서 10 분 동안 원심 분리 한 다음 펠릿을 90 % 에탄올 1 밀리리터로 다시 현탁시켜 손상되고 부패하는 세포를 준비합니다. 현탁액을 섭씨 4도에서 밤새 보관하고 다음날 이 과정을 다시 반복합니다. 동일한 최적화된 유세포 분석 설정을 사용하여 손상되고 붕괴된 세포의 광학 및 형광 특성을 측정합니다.유세포 분석기 매개변수를 설정하고 참조 데이터베이스를 구축한 후에는 모니터링 캠페인을 위한 샘플 수집을 시작할 때입니다. 샘플은 이전 단계에서 보여진대로 수집 및 처리해야하며, 초음파 처리는 45 킬로 헤르츠에서 1 분이 소요되어야한다는 점을 제외하고는 예외입니다. 분석할 준비가 되면 저장소에서 샘플을 채취합니다.유세포 분석기가 막히지 않도록 50 마이크로 미터 공극 필터를 통해 하위 샘플을 필터링 한 다음 개별 샘플의 1-2 밀리리터를 유세포 분석기에 로드하고 각 입자의 광학 및 형광 특성을 측정합니다. 각 샘플에 대해 측정을 세 번 반복합니다. MATLAB을 열고 CYT를 툴박스로 실행합니다.그런 다음 감소된 유세포 분석 데이터를 csv 파일로 CYT 소프트웨어에 가져옵니다. 다음으로, 쌍곡선 아크사인 변환을 사용하여 모든 샘플의 형광 채널을 변환합니다. 보조 인자의 값으로 150을 입력합니다.이 값은 대부분의 광영양 생물막 및 유세포 분석기에 적용되지만 최적화가 필요할 수 있습니다. 품질 관리를 위해 개별 샘플과 개별 광학 및 형광 채널의 히스토그램을 플롯하고 시각적으로 비교하여 복제의 기술적 및 생물학적 수준에서 이상치가 없는지 확인합니다. 이상치는 복제물 사이의 크게 이동된 형광 광학 분포에서 나타납니다.다음으로, 각 생물학적 복제물에서 기술적 복제물을 병합하고 생물학적 복제물을 하위 샘플링하여 각각이 동일한 수의 입자로 표시되도록 합니다. Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding에서 분석한 이상적인 입자 수는 약 150,000개입니다. 샘플 간의 비교를 위해 비교할 샘플만 선택하고 Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding을 실행합니다.알고리즘이 완료되면 bh-SNE1 및 bh-SNE2라는 새 채널이 나타납니다. 결과 채널의 데이터를 산점도로 시각화하여 분석된 모든 입자를 포함하는 모든 Stochastic Neighbor Embedding 좌표를 표시합니다. 클러스터를 시각적으로 분리할 수 없는 경우 해석에 입자가 너무 많거나 충분하지 않은 것일 수 있습니다.입자 수를 조정하고 분석을 반복합니다. viSNE 맵에서 입자는 유사성에 따라 배치되고 시각적으로 분리 가능한 클러스터로 그룹화됩니다. 클러스터의 광학 형광 특성을 검사하고 그리기 도구를 사용하여 잘 분리되어 있고 다른 속성을 가진 클러스터를 표시하고 이름을 지정합니다.후속 통계 분석을 위해 viSNE 클러스터를 MATLAB으로 내보내십시오. 여기에 제시된 절차를 사용하여 스위스의 지역 하천의 여러 현장에서 채취한 샘플을 분석했습니다. viSNE 맵을 사용하면 서로 다른 환경 생물막을 구별 할 수 있습니다.여기서 6 개의 다른 샘플은 viSNE 맵의 여러 부분에서 서로 다른 밀도를 특징으로합니다. 여기에 표시된 viSNE 맵은 입자의 생물적/비생물적 기원과 생물 입자가 속한 분류학적 그룹에 대한 단서를 제공하는 다양한 광학 및 형광 특성을 가진 입자로 채워져 있습니다. 또한 viSNE 맵에 참조 데이터베이스를 투영하면 맵의 어느 부분이 어떤 분류군 및/또는 비생물 입자로 채워지는지 해석하는 데 도움이 될 수 있습니다.또한 표본 간에 어떤 하위 모집단이 다른지 확인할 수 있습니다. 여기서, 각 하위 모집단에 대한 입자 수는 서로 다른 생물학적 복제물 각각에 대해 표시됩니다. 이 기법을 완전히 익히면 시료 채취부터 분석 완료까지 2시간 만에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라 형광 활성화 세포 분류와 같은 다른 방법을 사용하여 시각적 클러스터링의 예측을 검증할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 유세포 분석 및 시각적 클러스터링을 사용하여 수생 생물막을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

미생물 biofilms은 일반적으로 전문의 세포 독특한 subpopulations에 의해 형성된다. 이러한 subpopulations의 단일 세포 분석은 형광 기자의 사용을 필요로합니다. 여기 몇 가지 subpopulationswithin을 시각화하고 모니터하는 프로토콜을...

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

출처: Chapman, I. J., et al., 유세포 분석을 사용하여 광합성 유기체(Microcystis aeruginosa)의 세포 사망률을 결정하기 위한 분자 프로브 최적화. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 형광 프로브 표지와 피코시아닌 자가형광 및 프로브 신호의 유세포 분석을 결합하여 살아있는 세포와 죽은 녹농미세낭 충 세포를 구별하는 방법을 보여줍니다.

유세포 분석을 이용한 Microcystis aeruginosa 의 생존율 분석

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

여기에서는 외딴 해양 환경에서 유기 및 무기 영양소 가용성과 미생물 및 바이러스 군집의 풍부함 및 구조를 평가하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

생물막은 주변 환경과 복잡한 상호 작용을 합니다. 생물막-환경 상호 작용을 종합적으로 조사하기 위해 여기서는 생물막 개발을 위한 이질적인 화학적 환경을 조성하고, 국소 유속을 정량화하고, 생물막 군집 내부 및 주변의 질량 수송을 분석하는 일련의 방법을 제시합니다.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

미생물 인구는 전체 동작을 지시 할 수있는 실질적인 세포 이질성가 포함되어 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 분자 프로브 분석 그러나 그것의 응용 프로그램이 종 사이에서 변화, 세포의 생리 학적 상태를 확인할 수 있습니다. 이 연구는 과소 평가하거나 거짓 긍정적 인 결과를 기록하지 않고, 정확하게 cyanobacterium 인구 내에서 세포 사망을 결정하는 프로토콜을 제공합니다.

분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법<em&gt; Microcystis aeruginosa의</em&gt;) 유동 세포 계측법을 사용하여

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

흐름 cytometric 분석은 순수 문화 조사 및 미생물 지역 사회 역학을 모니터링 귀중 한 입증 했다. 우리는 순수한 문화 및 도전 행렬에서 명확한 매체 뿐만 아니라 복잡 한 사회에 대 한 데이터 분석, 샘플링에서 세 개의 포괄적인 워크플로 각각 제시.

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

어셈블리, 동작, 설명 그리고 흐름에서 실시간으로에서 이미지 균 biofilm 형성 하도록 설계 흐름 기구의 청소. 우리는 또한 제공 하 고 인수 이미지에 사용할 수 양적 알고리즘 토론.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

이 프로토콜은 이미징 유세포 분석을 사용하여 미생물 자가응집을 측정하기 위한 정량적 접근 방식을 설명합니다.

미생물 자가응집(microbial autoaggregation)을 연구하기 위한 이미징 유세포분석(Imaging flow cytometry)

배우세요 수생 바이오필름의 특성 분석을 위한 유세포 분석법과 시각적 클러스터링 기법을 활용하는 방법을. 이 기술은 미세플라스틱과 같은 비생물성 입자를 식별하고 생태계 건강을 평가하는 데 효과적입니다.

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

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