Name: 마우스 감염 모델에서 뇌 막 염에 구 이렇게 뵙 Biofilms의 조사 역할에 대 한 감염 intracranial Subarachnoidal 경로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 마우스 뇌내 피하감염 모델을 이용하여 Streptococcus suis 바이오필름이 세균성 수막염에서 면역 반응에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 이 기법은 중추신경계 침입을 모방하고 신약 효능 평가에 활용됩니다.

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이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 [2017YFD0500102];에서 교부 금에 의해 지원 되었다 [31572544]; 중국의 국가 자연과학 기초 수의 Etiological 생물학 [SKLVEB2016KFKT005]; 주 키 연구실 상하이 농업 기술 개발 프로그램, 중국 [G2016060201] 적용.

마우스 감염 실험 했다는 실험실 동물 모니터링 위원회의 장쑤 성, 중국에 의해 승인 및 실험 동물 센터의 난징 농업 대학교에서 수행 (허가 번호: SYXK (Su) 2017-0007).
1입니다. 박테리아의 준비
참고: S. 이렇게 뵙 serotype 2 악성 긴장 P1/7 수 막 염19병에 걸린 돼지 로부터 격리 했다. 스트레인 P1/7 토 드-휴이 트 국물에서 성장 했다 (THB, THB의 리터 당 수식: 심장 주입, 3.1 g, neopeptone, 20.0 g, 포도 당, 2.0 g, 염화 나트륨, 2.0 g; disodium 인산 염, 0.4 g, 나트륨 탄산염, 2.5 g)와 한 천 토 드-휴이 트 (THA, 리터 당 수식에 도금 그쪽으로: 심장 주입, 3.1 g; neopeptone, 20.0 g; 포도 당, 2.0 g; 염화 나트륨 2.0 g; disodium 인산 염, 0.4 g; 탄산 나트륨 2.5 g; 한 천, 15.0 g) 37 ° C, 5% CO2.
<ol><li>컬렉션의 스트레인 P1/7 planktonic 셀<ol>
<li>중간 로그 단계 문화에서 planktonic 셀의 5 mL을 수집 (OD600= 0.6), 8000 × g에서 3 분 동안 원심 및 다음 PBS로 3 회 세척.</li>
		<li>셀 5 튜브, aliquot THB에서 25% 글리세롤의 5 mL을 resuspend 하 고-80 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>컬렉션의 스트레인 P1/7 biofilm 상태 셀<ol>
<li>20 mL의 숙박 문화를가지고 고 신선한 THB;의 180 mL에 추가 10 라운드 배양 배지로 희석된 문화를 동등 하 게, 분한 다음 24 h에 대 한 5% CO2 에서 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 넣어.</li>
		<li>부 화, 후 접시 resuspend은 접시를 준수 하지 박테리아를 부드럽게 흔들어 고 다음는 상쾌한 포부에 의해 무시. 참고: 접시를 부드럽게 흔들어 하 고 resuspending는 앙금을 피하십시오.</li>
		<li>Biofilm 상태 셀을 수확, 퇴적 물을 완전히, resuspend 다음 새로운 튜브에 샘플을 전송 하는 PBS의 5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>다음 매개 변수는 마지막 단계에서 biofilm 상태 셀 sonicate: 60 W, 4 사이클 5 s 오프 및 10 s.</li>
		<li>8000 × g에서 3 분 centrifuge 고-80 ° c.에 상쾌한 저장 참고:는 상쾌한 biofilm 구성 요소를 포함할 수 있습니다 그리고 동물 실험 (3 단계)에 설명 된 대로 감염 전에 biofilm 박테리아 resuspend를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>THB에 10 mL 25% 글리세롤과 앙금을 resuspend 하 고-80 ° c.에 biofilm 상태 셀을 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 분석
<ol><li>수집 된 biofilm 상태 셀과 planktonic 셀 4 ° c.에 12-24 h에 대 한 4 %paraformaldehyde 사용 하 여 수정</li>
	<li>증류수와 신속 하 게 샘플을 헹 구 고 탈수 순차적으로 30 분 각 솔루션에 대 한 에탄올 (25%, 50%, 70%, 90%, 및 100%)의 증가 농도와 샘플.</li>
	<li>더블 양면 테이프와 홀더를 금속 금과 팔라듐으로 증발 기에서 마지막으로 코트 그들 말린된 샘플을 준수 합니다.</li>
	<li>다음 매개 변수를 사용 하 여 스캐닝 전자 현미경에 의해 샘플을 관찰: EHT (여분 고전압) = 10 kV; WD (작동 거리) = 7.0 또는 8.0 m m; 확대 = 5000 ×; A 신호 SE1 =.</li>
</ol>3. 동물 실험
<ol><li>SPF 6 주 오래 된을 사용 하 여이 연구에서 여성 BALB/c 마우스. 그 주사 부는 있는 3.5 m m는 bregma에서 rostral 감염의 intracranial subarachnoidal 경로 통해 모든 쥐를 감염. 사출 사이트의 stereotaxic 좌표 Chiavolini 외17에 의해 명확 하 게 설명 했다.<ol>
<li>Histopathological 분석, 대 한 감염 쥐 (그룹 당 5 쥐)의 2 개 그룹 planktonic 셀 또는 biofilm를 사용 하 여 상태 세포 3 × 107 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 복용량에 그리고 또 다른 5 마우스 컨트롤 PBS를 주입 했다.</li>
		<li>TLR2 및 두뇌에서 cytokines의 mRNA 표현의 검색 감염 쥐 (그룹 당 6 쥐)의 두 개의 추가 그룹에 대 한 3 × 107 CFU의 복용량에 상태 세포 planktonic 셀 또는 biofilm를 사용 하 여.</li>
		<li>그쪽으로에 직렬 희석을 도금 하 여 실행 가능한 박테리아의 수를 결정 합니다.</li>
		<li>추가 연구에 대 한 감염 된 후 12 h에서 모든 마우스 안락사 참고: 재고 매체에 글리세롤 감염 하기 전에 제거 되어야 합니다. Planktonic 전지와 biofilm 상태 셀-80 ° C에서 복구 PBS로 3 회를 씻어 있습니다. Planktonic 세포는 PBS를 가진 resuspended 그리고 감염;에 대 한 적절 한 복용량을 희석 biofilm 상태 셀 (1.2.5 단계)에서 저장 된 상쾌한와 함께 resuspended 고 감염에 대 한 적절 한 복용량을 희석. 감염에 대 한 볼륨 50 µ L 해서는 안됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>뇌 조직에서 TLR2 및 cytokines의 mRNA 표현 검색<ol>
<li>뇌 조직의 RNA 추출 키트를 사용 하 여에서 총 RNA를 추출 합니다.<ol>
<li>각 마우스에 대 한 전체 뇌 조직의 RNA를 추출 하기 위한 사용 합니다. 전체 뇌 조직을 5 튜브 나눕니다. 100mg 뇌 조직에 차지 하 고 키트에 의해 제공 lysing 매트릭스를 포함 하는 각 관에 세포 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>40 대 한 균질 화기에 튜브를 처리 6.0, 그리고 원심 분리기 튜브 12000 × g와 4 ° C에서 5 분에 대 한 설정에서 s.</li>
			<li>원심, 후 위 단계는 새로운 microcentrifuge 튜브 전송.</li>
			<li>실내 온도;에 5 분에 대 한 전송된 샘플을 품 어 클로 프롬, 10에 대 한 소용돌이의 300 µ L 추가 s, 다음 실 온에서 5 분 동안 품 어 고.</li>
			<li>12000 ×에서 튜브 원심 g 및 4 ° C 5 분에 대 한 새로운 튜브에 위 단계를 전송.</li>
			<li>5 시간 동안 그것을 반전 하기 전에 튜브를 감기 절대 에탄올의 500 µ L을 추가 하 고 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서 샘플을 저장.</li>
			<li>12000 ×에서 튜브 원심 g와 15 분 및 제거는 상쾌한 4 ° C. RNase 무료 H2o. 찬 75% 에탄올 500 µ L와 펠 릿을 세척</li>
			<li>제거는 에탄올, 공기 건조 실 온, RNase 무료 H2o.의 100 µ L에서 resuspend RNA에서 5 분 동안 펠 릿</li>
			<li>실 온에서 5 분 동안 RNA를 품 어 고 RNA bioanalyzer를 사용 하 여 RNA 농도 결정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>CDNA 합성을 한 thermocycler 반전 녹음 방송 (RT) 시 약 키트와 함께 사용 하 여 게놈 DNA (gDNA)의 제거를 포함 하 여 수행 합니다.<ol>
<li>RNA의 1 µ g는 튜브 포함 2 µ L 5 x gDNA 제거 버퍼의, 1 µ L gDNA 제거 효소, RNase 무료 H2O의 때까지 추가 볼륨 도달 10 µ L. Incubate 42 ° c.에서 2 분</li>
			<li>믹스 마스터의 10 µ L을 추가 (RT 효소의 1 µ L 믹스 나, RT 뇌관 믹스의 1 µ L, 버퍼 2, x 5의 4 µ L 및 RNase 무료 H2O 4 µ L) 마지막에서 반응 솔루션 단계 및 다음 부드럽게 섞는다. RT 반응으로 즉시 진행: 37 ° C 15 분 그리고 85 ° C 5에 대 한 s.</li>
			<li>SYBR 실시간 정량 Pcr 키트와 함께 실시간 PCR 기계를 사용 하 여 실시간 정량 PCR (RT-정량) 분석을 수행. 20 µ L의 총 볼륨까지 효소 x 2의 10 µ L, 앞으로 뇌관, 역방향 뇌관의 0.8 µ L, 0.4 µ L를 이용한 참조 염료 II x 50의,의 cDNA 템플릿과 RNase 무료 H2O 2 µ L의 0.8 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>다음 열 매개 변수를 사용 하 여 3 중에서 각 샘플을 실행: 30 94 ° c s 5의 40 주기 다음 95 ° c, s 및 34 s 15의 마지막 단계와 60 ° C에서 95 ° C, 60 ° C에서 1 분에 그리고 15 s 95 ° c.에 실시간 정량 Pcr를 위한 뇌관은 표 1에 나열 됩니다. 하우스키핑 유전자 B2m 및 18s rRNA 내부 제어로 사용 되었다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2-ΔΔCt 방법에 따라 상대 겹 변경을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조직학 단면도의 관찰
	<ol>
<li>24 시간 10% 포 르 말린으로 고정, 후 조직 조각 2-3 m m에서의 적절 한 크기로 고정된 뇌 조직을 재구성 합니다.</li>
		<li>조직 조각을 포함 카세트에 넣고 자동 진공 탈수로 탈수에 대 한 새로운 통 솔루션에 몰두.</li>
		<li>고정된 조직에 밖으로가 고 각 솔루션에서 30 분 (70%, 80%, 95%, 95%, 및 100%) 에탄올의 농도 증가에 순차적으로 탈수.</li>
		<li>15 분 동안 크 실 렌과 샘플을 transparentize 하 고 90 분 동안 60 ° C에 액체 파라핀에 찍어 후 포함 기계를 사용 하 여 포함.</li>
		<li>파라핀 블록 포함 조직 3 µ m 조각으로 잘라, 45 ° C에서 물에 조각 타일 그리고 공기에서 건조.</li>
		<li>60 ° C에서 3 h에 대 한 섹션을 품 어, haematoxylin 및 오신 (그)를 사용 하 여 메서드, 얼룩 그리고 중립 껌 함께 인감.</li>
		<li>광학 현미경으로는 뇌의 histopathological 변화를 관찰 합니다. 4-포인트 그레이 딩 시스템 조직학 변화를 평가 하기 위해 사용 되었다. 짝이 없는 t 테스트를 사용 하 여 통계 분석을 위해. 혼잡/출혈: 결 석, 점수 0; 초점 혼잡/출혈의 작은 영역 점수 1; 초점 혼잡/출혈의 넓은 지역 또는 초점 혼잡/출혈의 작은 지역의 여러 사이트 점수 2; 3 개 큰 초점 혼잡/출혈 사이트까지 점수 3; 혼잡/출혈 확산, 4 점수. 괴 사: 결 석, 점수 0; 초점 괴 사 점수 1; 1-10 회 저 성 세포의 발생을 확산, 점수 2; confluent 괴 사의 foci 점수 3; 광범위 한 confluent 괴 사, 4 점수. 선 동적인 세포 침투: 결 석, 점수 0; 몇 고 초점 침입, 점수 1; 다 초점 침투 또는 집계의 형성으로 침입 점수 2; 3 집계까지 점수 3; 그리고 더 이상의 집계 점수 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%3A+a+new+emerging+or+an+old+neglected+zoonotic+pathogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?</a> Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).</li>
<li>Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%2C+an+important+pig+pathogen+and+emerging+zoonotic+agent-an+update+on+the+worldwide+distribution+based+on+serotyping+and+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing.</a> Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45(2014).</li>
<li>Kerdsin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Streptococcus+suis+serotype+9+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).</li>
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<li>Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+involved+in+the+pathogenesis+of+the+infection+caused+by+the+swine+pathogen+and+zoonotic+agent+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis.</a> Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA%3A+a+major+proinflammatory+component+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).</li>
<li>Isiaku, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+is+associated+with+chronic+streptococcal+meningoencephalitis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish.</a> Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).</li>
<li>Oggioni, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+from+planktonic+to+sessile+life%3A+a+major+event+in+pneumococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis.</a> Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).</li>
<li>Xiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+small+RNA+rss04+contributes+to+the+induction+of+meningitis+by+regulating+capsule+synthesis+and+by+inducing+biofilm+formation+in+a+mouse+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model.</a> Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+serotype+2%2C+an+important+swine+and+human+pathogen%2C+induces+strong+systemic+and+cerebral+inflammatory+responses+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).</li>
<li>Seitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intranasal+mouse+model+for+mucosal+colonization+by+Streptococcus+suis+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2.</a> Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).</li>
<li>Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+of+pigs+against+Streptococcus+suis+serotype+2+infection+using+a+live+avirulent+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).</li>
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<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+cochlear+inflammation+and+vestibular+syndrome+in+an+experimental+model+of+Streptococcus+suis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기서 설명 하는 감염 intracranial subarachnoidal 경로 감염의 다른 경로 통한 확실 한 장점이 있습니다. 호스트-박테리아 상호 작용 및 중앙 신경 조직에 세균 입구를 모방 하는 뇌에 직접 호스트 면역 응답에 세균성 구성의 효과 연구 조사 수 있습니다. 따라서,이 감염 경로 조사 다른 박테리아에 의해 발생 하는 뇌 막 염의 메커니즘에 대 한 확장할 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 세균성 수 막 염에 대 한 약물의 효능을 테스트를 사용할 수 있습니다.
이 모델을 사용 하 여 좋은 결과 얻으려면 다음 중요 한 단계는 명시적. Biofilm 형성 실험 조건 하에서 시험 될 필요가 있다. 현재의 연구에서는 그것은 스캐닝 전자 현미경 분석을 사용 하 여 시험 되었다. 조직 문화 접시 방법 및 튜브 방법21와 같은 다른 방법 또한 biofilm 형성 검사를 사용할 수 있습니다. 감염, 전에 1 일 planktonic 셀과 b...

이렇게 뵙 구 (S. 이렇게 뵙)은 수 막 염, 폐 렴, septicaemia, 심장 내 막 염, 관절염1등 심각한 질병을 일으키는 돼지, 전세계의 주요 세균성 병원 체 이다. 그것은 또한 새로운 동물 매개 대리인입니다. 지금까지, 그것은 9 serotypes 인간, 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24, 그리고 31 serotypes2,,34를 포함 하 여 감염을 일으킬 수 보고 되었습니다. 인간과 돼지, 뇌 막 염에서는 S. 이렇게 뵙 감염의 주요 임상 증상 중 하나입니다. 베트남, 태국, S. 이렇게 뵙 는 어른5에 수 막 염의 주요 원인입니다. 미생물 biofilms는 미생물을 서로 게 고착 하 고 집중 인터페이스; 그들은 세균 독성, 다양 한 환경에 항생제 저항5생존에 필수적입니다. Biofilms는 일반적으로 일반적으로 포함 하는 다 당 류, 단백질과 DNA6세포 외 매트릭스 둘러싸여 있습니다. 후자는 호스트 염증 성 반응과 cytokine 생산7유도 수 있습니다. Biofilm 형성은 이전 연구에서 연쇄 구 균 수 막 염에서 포함 되기 위하여 알려졌다. Biofilms는 연쇄 상 구 균 agalactiae 염 tilapia 물고기 모델에 기여할 biofilm 형성 뇌 조직 내에서 공개 되었습니다 하 고 meningeal 주위 vivo에서 내부 복 부 접종8표면. 수 막 염, 중 연쇄 상 구 균 균 biofilm 같은 상태 이며 이러한 biofilm 상태에 박테리아 했다 마우스 감염 모델9에 수 막 염 유도에 더 효과적. 또한 우리의 이전 연구, 생존 분석10여 세균 독성에 기여 하는 S. 이렇게 뵙 마우스 뇌에서와 관련 된 biofilm 상태. 그러나, S. 이렇게 뵙 수 막 염에서 biofilm 참여에 대 한 직접 증거 조사 더 필요합니다.
S. 이렇게 뵙 감염의 동물 모델에서 마우스 복 (i.p.)11, intranasal (i.n.)12, 정 맥 (i.v.)13및 감염14, intracisternal (i.c.) 경로 사용 하 여 개발 되어 15 , 그러나 16., 감염의 i.p., i.n., 및 i.v. 노선 표면 구성 요소 S. 이렇게 뵙 는 뇌에 직접 뇌 막 염의 역할을 공부 하 고 적합 하지 않습니다. Biofilms에서 세포 외 기질 포함 됩니다. I.c. 접종 S. 이렇게 뵙 감염을 위해 사용 되었다, 비록 정확한 주사 부 하지 그 논문에서 설명 하고있다. 반면, stereotaxic 좌표 intracranial subarachnoidal 접종에 대 한 사출 사이트의 명확 하 게 이전 연구17에서 설명 하고있다. 이 접종 점과 더 단순한 실험 프로토콜의 쉽게 인식 허용. 또한, 감염 intracranial subarachnoidal 경로 sinuses 또는 중간 귀17, 그리고 중간 귀 및 S. 이렇게 뵙 로 인 한 수 막 염의 관계에서 중앙 신경 조직에 세균 입구를 모방 매드 슨 외18에 의해 증명 되었습니다. 또한, 마우스에서 감염 intracranial subarachnoidal 경로 적용 하 여 우리 시연 S. 이렇게 뵙 작은 RNA rss04 우리의 이전 연구10에 수 막 염에 기여 한다.
현재에서 연구, 감염 intracranial subarachnoidal 경로 S. 이렇게 뵙 수 막 염에 biofilms의 역할을 조사 하기 위해 쥐에 사용 되었다. 마우스 감염의이 경로 의해 planktonic 셀 또는 biofilm 상태 셀 S. 이렇게 뵙 의 감염 되었다. Histopathological 분석 및 TLR2 biofilm 상태 세포를 주입 하는 쥐의 뇌 조직에서 cytokines의 증가 mRNA 표현 명확 하 게 표시 S. 이렇게 뵙 biofilm 수 막 염에 기여.

<table><tbody><tr><td>Todd Hewitt Broth(THB)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>DF0492078</td><td>정제수 1L에 분말 30g을 용해시킵니다. 121&deg에 오토클레이브; 15 분 동안.</td></tr><tr><td>한천</td><td>DSBIO</td><td>16C0050</td><td>가루 15g을 THB 1L에 녹입니다. 121&deg에 오토클레이브; 15 분 동안.</td></tr><tr><td>Milli-Q Reference Water Purification System</td><td>Merck KGaA</td><td>Z00QSVCUS</td><td>Dnase/ Rnase</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>없이 Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>정제수 1L에 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.42g Na2HPO3, 0.27g KH2PO4를 용해합니다. 121&deg에 오토클레이브; 15 분 동안. KOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.</td></tr><tr><td>Na2HPO3</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009012-01-09</td><td>정제수 1L에 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.42g Na2HPO3, 0.27g KH2PO4를 용해합니다. 121&deg에 오토클레이브; 15 분 동안. KOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009017-01-09</td><td>정제수 1L에 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.42g Na2HPO3, 0.27g KH2PO4를 용해합니다. 121&deg에 오토클레이브; 15 분 동안. KOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009019-01-09</td><td>정제수 1L에 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.42g Na2HPO3, 0.27g KH2PO4를 용해합니다. 121&deg에 오토클레이브; 15 분 동안. KOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009014-01-09</td><td>정제수 1L에 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.42g Na2HPO3, 0.27g KH2PO4를 용해합니다. 121&deg에 오토클레이브; 15 분 동안. KOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sionpharm 화학 시약 10010618</td><td></td><td>정제수의 동일한 부피로 희석, 121°deg에서 오토클레이브, 15분 동안</td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Sionpharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>80096675</td><td></td></tr><tr><td>25% 글루타르알데히드</td><td>Sionpharm 화학 시약</td><td>30092436</td><td>고정을 위해 정제수로 10배 희석.</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sionpharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sionpharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Spctrophotometre</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11+</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세포 분쇄기</td><td>NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd</td><td>JY96-IIN</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Hitachi Koki Co., Ltd</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>냉장고</td><td>Aucma Co., Ltd</td><td>DW-86L500</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>Zeiss</td><td>EVO-LS10</td><td></td></tr><tr><td>FastRNA Pro Green Kit</td><td>MP Biomedicals</td><td>#6045-050</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 기기</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>PCR용 기기</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>1124310110</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485689</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT 시약 키트(gDNA 지우개</td> <td>포함)Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>완전 밀폐형 조직 처리기</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ASP200S</td><td></td></tr><tr><td>가열 파라핀 임베딩 모듈</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>반자동 로터리 마이크로톰</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 섹션용 수조</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer XL</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 감염 모델에서 뇌 막 염에 구 이렇게 뵙 biofilms의 조사 역할에 대 한 감염 intracranial subarachnoidal 경로

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

구 이렇게 뵙 는 전세계 돼지의 주요 세균성 병원 체 뿐만 아니라 신흥 동물 매개 대리인입니다. 인간과 돼지, 뇌 막 염에서는 S. 이렇게 뵙 감염의 주요 징후입니다. 적당 한 감염 모델 병원 균으로 인 한 질병의 메커니즘을 이해 하는 필수적인 도구입니다. 마우스 감염의 여러 노선 S. 이렇게 뵙 감염의 병 인 연구 개발 되었습니다. 그러나, 감염의 복, intranasal, 그리고 정 맥 노선 공부 biofilms에서 기질 등 뇌에 직접 뇌 막 염에 S. 이렇게 뵙 표면 구성 요소의 역할에 대 한 적합 하지 않습니다. Intracisternal 접종 S. 이렇게 뵙 감염에 대 한 사용 되었습니다, 하지만 정밀 사출 사이트 설명 하지 하고있다. 여기, 감염 intracranial subarachnoidal 경로 S. 이렇게 뵙 수 막 염에 biofilms의 역할을 조사 하기 위해 마우스 모델에서 설명 했다. S. 이렇게 뵙 planktonic 셀 또는 biofilm 상태 셀 직접 3.5 m m는 bregma에서 rostral 위치한 사출 사이트를 통해 쥐의 거미 막 밑 공간에 주입 했다. Histopathological 분석 및 증가 mRNA TLR2의 표현과 biofilm 상태 셀을 주사 하는 생쥐에서 뇌 조직의 cytokines 명확 하 게 표시 S. 이렇게 뵙 biofilm S. 이렇게 뵙 수 막 염에 확실 한 역할을 합니다. 이 감염 경로 감염, 호스트-박테리아 상호 작용의 연구를 수의 다른 경로 통한 확실 한 장점이 있습니다. 그것은 평가, 뇌에 직접 호스트 면역 반응에 세균성 구성의 효과 허용 하는 또한, 그리고 중앙 신경 조직에 세균 입구를 모방. 감염의이 경로 다른 박테리아에 의해 발생 하는 뇌 막 염의 메커니즘을 조사에 대 한 확장할 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 세균성 수 막 염에 대 한 약물의 효능을 테스트를 사용할 수 있습니다.

SEM 분석 실험 조건에서 biofilm 형성 검사를 수행 했습니다. 그림 1에서 보듯이 planktonic 세포 (그림 1A)와 biofilm 주 세포 (그림 1B) 사이의 biofilm 형성에 상당한 차이가 있다. SEM 분석 biofilm 박테리아 덩어리에 있던 여러 레이어와 그들은 쌌 다 했다 기질, 동안 planktonic 박테리아 훨씬 조밀 하 고 주로 분산 개별적으로 보여주었습니다.
Biofilms, DNA 등의 세포 외 매트릭스의 구성 요소 호스트 염증 성 반응과 사이토카인 생산을 유도 할 수 있습니다. TLR2 cytokines ...

여기, 우리 구 이렇게 뵙 수 막 염에 biofilms의 역할을 공부 하는 쥐에 감염 intracranial subarachnoidal 경로 설명 합니다. 이 감염 모델은 또한 다른 세균성 수 막 염의 병 인 세균성 수 막 염에 대 한 새로운 약물의 효능을 연구 하 고 적합 합니다.

마우스 감염 모델에서 뇌 막 염에 구 이렇게 뵙 Biofilms의 조사 역할에 대 한 감염 intracranial Subarachnoidal 경로

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

이 방법은 생물막의 세포외 기질과 같은 많은 부위에서 연쇄상구균 suis의 구성 요소의 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 면역 반응이 뇌에서 직접 영향을 미치고 박테리아가 중추 신경계로 들어가는 방식을 모방하는 박테리아 구성 요소를 조사할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Shouming Zhang 씨입니다.균주 P1/7 플랑크톤 세포를 수집하려면 먼저 mid-lock phase 배양에서 5ml의 세포를 수집합니다. PBS에서 세포를 세 번 세척하기 전에 8000배 G에서 3분 동안 원심분리기를 합니다. THB에 25% 글리세롤 5ml로 세포를 다시 현탁시키고 5개의 튜브로 분취합니다.또는 균주 P1/7 생물막 상태 세포를 수집하려면 하룻밤 배양물 20ml를 취하고 신선한 THB 180ml를 추가합니다. 희석된 배양물을 10개의 원형 배양 플레이트로 균등하게 나눈 다음 플레이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후 플레이트를 부드럽게 흔들어 플레이트에 부착되지 않은 박테리아를 다시 현탁시키고 침전물이 다시 현탁되지 않도록 합니다.그런 다음 흡인에 의해 상등액을 버립니다. PBS 5ml를 첨가하여 생물막 상태 세포를 수확합니다. 침전물을 완전히 재현탁시킨 다음 샘플을 새 튜브로 옮깁니다.텍스트 프로토콜에 나열된 대로 다시 부유된 생물막 상태 세포를 초음파 처리합니다. 다음으로, 초음파 처리 된 세포를 8000 회 G에서 3 분 동안 원심 분리하고 상층액을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 상등액에는 생물막 성분이 포함될 수 있으며 감염 전에 생물막 박테리아를 다시 현탁시키는 데 사용할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 주사 전자 현미경으로 샘플을 관찰하기 전에 THB에 10ml의 25% 글리세롤로 침전물을 다시 현탁시킵니다. 플랑크톤 세포 또는 생물막 상태 세포를 사용하여 모든 마우스를 감염시키고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 안락사를 수행합니다. 다음으로, RNA 추출 키트를 사용하여 뇌 조직에서 전체 RNA를 추출합니다.각 마우스에 대해 RNA를 추출하기 위해 전체 뇌 조직을 사용합니다. 전체 뇌 조직을 5개의 튜브로 나눕니다. 최대 100mg의 뇌 조직을 취하고 키트에서 제공하는 용해 매트릭스를 포함하는 각 튜브에 1ml의 용해 용액을 추가합니다.텍스트 프로토콜에 나열된 단계

intracranial-subarachnoidal-route-infection-for-investigating-roles

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 장, S. 외. 마우스 감염 모델에서 수막염에서 연쇄상구균 수체 바이오필름의 역할을 조사하기 위한 두개내 지주하 감염 경로. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 박테리아에 감염된 쥐 뇌에서 표적 유전자 발현을 탐지하는 과정을 보여줍니다. RNA를 추출하여 DNA 분해 효소로 처리한 후 역전사하여 cDNA로 전환합니다. cDNA는 유전자 특이적 프라이머를 이용한 열 사이클링을 통해 증폭되며, DNA 결합 염료가 증폭된 DNA에 결합하여 형광을 방출합니다. 형광 신호를 분석하여 표적 유전자의 존재를 확인합니다.

박테리아에 감염된 쥐 뇌에서 표적 유전자 발현 검출

출처: Lenhard, A. 외. 바이러스 공동 감염 시 폐 렴 구균이 집착자에서 병원체로 전환되는 마우스 모델은 연령에 따른 악화된 질병을 재현합니다. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 인플루엔자 바이러스가 폐 렴구 균을 정착자에서 병원체로 전환시키는 쥐 공동 감염 모델을 보여줍니다. 박테리아 정착, 바이러스 감염, 질병 진행에 관련된 단계를 개괄합니다.

바이러스 공동 감염 후 폐렴구 균 의 병원성 전이를 연구하기 위한 마우스 모델

이 비디오에서는 Neisseria meningitidis를 마우스 모델로 시추 내 전달하여 수막염 감염을 생성하는 방법을 보여줍니다.

수막구균성 수막염을 유발하기 위해 마우스 모델로 수막구균의 수막구균 내 전달(Intracisternal Delivery of meningococci into mouse models to induce meningococcal meningitis)

나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다.

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

동물 모델은 만성 염증의 발달에 기여하는 호스트와 병원체의 특정 메커니즘을 규정하는 매우 중요한 도구로 입증되었다. 여기서 우리는 로컬 및 전신성 염증 부위에서의 진행을 평가하기 위해 인간 병원체 Porphyromonas 진지 발리 및 세부 방법론 경구 감염 마우스 모델을 설명한다.

로컬 및 전신 사이트에서 병원체에 의한 만성 염증을위한 마우스 모델

여기에, 절차는 대장균 K1의 문화와 신생아 쥐에 전신 감염의 설립을 설명합니다. 이것은 비 침습성 절차 맥락총에서 위장관 식민 전신 순환에 병원균의 전위, 및 중추 신경계의 침입을 허용한다.

Neuropathogenic의 비 침습 모델 대장균 신생아 쥐에 감염

연쇄상구균 폐렴은 심장에 별개의 비화농성 현미경 병변을 형성합니다. 요약된 것은 심장 미세 병변 형성의 쥐 모델에 대한 프로토콜입니다. 현미경을 사용한 미세 병변 시각화, 초기 미세 병변과 후기 미세 병변 구별, 회복기 동물의 심장에서 심장 리모델링을 감지하는 방법에 대한 지침이 제공됩니다.

시각화<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

여기에서, 우리는 성인 마우스에 있는 감염의 내성인종 경로를 통해 수막구균 뇌막염을 유도하는 방법을 기술합니다. 우리는 접종의 준비에서 내질 감염에 수막 구균 감염의 단계 프로토콜에 의해 단계를 제시; 그런 다음 동물의 생존을 기록하고 뮤린 조직에서 세균 부하를 평가합니다.

인트스타스타스테어링 전달을 통해 마우스에서 수막구균 수막염 혈청계S C유도

이 논문은 바이러스 감염 동안 폐렴구균이 무증상 집락 상태에서 질병을 유발하는 병원체로 전환하기 위한 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 질병 진행의 여러 단계 동안 다양한 숙주에서 다미생물 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

본 프로토콜은 임플란트 관련 감염을 조사하기 위해 피하 등쪽 이식을 사용하는 마우스 모델을 설명하며, 이를 통해 병태생리학적 메커니즘을 포괄적으로 조사할 수 있고 표적 치료 전략으로 진단 기준 개발을 지원할 수 있습니다.

마우스의 임플란트 관련 감염에 대한 동물 모델

여기서는 Klebsiella pneumoniae 를 비강 주입하여 마우스 패혈증 면역억제 모델을 구축하는 프로토콜을 제시하고, 다양한 지표를 통해 모델을 검증하였습니다.

비강 주입을 통한 마우스 패혈증 유도 면역억제 모델 구축

배우세요 마우스 뇌내 피하감염 모델을 이용하여 Streptococcus suis 바이오필름이 세균성 수막염에서 면역 반응에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 이 기법은 중추신경계 침입을 모방하고 신약 효능 평가에 활용됩니다.

마우스 감염 모델에서 뇌 막 염에 구 이렇게 뵙 Biofilms의 조사 역할에 대 한 감염 intracranial Subarachnoidal 경로

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