열 Nanoimprinting 기술과 인간의 내 피 식민지 형성 세포의 응답의 심사에 의해 그라데이션 Nanopattern의 제조

이 기술의 주요 장점은 재현성이 높은 구배 패턴을 생성할 수 있고 기생충 관찰 구조에 대한 세포 반응을 스크리닝할 수 있다는 것입니다. 물리적 자극에 대한 관찰 반응은 아직 완전히 발견되지 않았습니다. 우리는 우리의 방법이 이러한 알려지지 않은 메커니즘을 밝히는 데 필수적인 도구가 될 것이라고 믿습니다.

시작하려면 전해 연마 용액이 들어 있는 이중 재킷 비커를 순환기에 연결하고 온도를 섭씨 7도로 설정합니다. 온도가 섭씨 7도까지 떨어질 때까지 용액을 최소 30분 동안 저어줍니다. 초순수 알루미늄 판과 탄소 상대 전극을 악어 클립과 구리선을 사용하여 전해 연마 용액에 담그십시오.

탄소 카운터 전극에서 알루미늄 플레이트의 위치를 서로 마주 보도록 조정합니다. 알루미늄 플레이트를 양극 단자에 연결하고 탄소 카운터 전극을 직류 전원 공급 장치의 음극 단자에 연결합니다. 20볼트의 전압을 가한 후 알루미늄 판은 거친 광택이 없는 표면에서 거울과 같은 은색 표면으로 바뀝니다.

1차 아노다이징을 수행하려면 1리터의 전해질을 2리터 더블 재킷 비커에 붓습니다. 광택 처리된 알루미늄 판과 탄소 카운터 전극을 구리선의 악어 클립으로 용액에 담궈냈습니다. U자형 받침대에 수직 샤프트를 설치하십시오.

금속 클램프를 사용하여 오버헤드 교반기와 임펠러를 부착합니다. 임펠러의 프로펠러를 두 전극의 하단 근처에 배치합니다. 오버헤드 교반의 회전 속도를 200rpm에서 300rpm 사이로 설정하고 195시간 동안 교반 시 16볼트의 전압을 적용합니다.

1차 아노다이징 후 알루미늄 판의 색상이 은색에서 회색으로 변합니다. 알루미나 가려움증을 수행하려면 양극 산화 처리된 알루미늄 판을 에칭 용액에 담그십시오. 비커 상단을 알루미늄 호일로 밀봉하고 최소 10시간 동안 저어줍니다.

에칭 단계에서 알루미늄 판의 색상이 회색에서 흰색으로 변합니다. 2차 아노다이징의 경우 1차 아노다이징과 동일한 실험 조건을 설정하고 다시 195볼트의 전압을 6시간 동안 적용합니다. 2차 아노다이징 후 알루미늄 판의 색상이 흰색에서 회색으로 다시 바뀝니다.

그라디언트 기공 확장을 수행하려면 먼저 인산 용액이 들어 있는 이중 재킷 비커를 순환기에 연결하고 온도를 섭씨 30도로 설정합니다. 비커 옆에 선형 이동 스테이지를 수직으로 놓고 선형 스테이지의 이동 부분에 브래킷을 부착합니다. 선형 스테이지의 움직이는 부분을 홈 위치로 설정합니다.

브래킷의 클립을 부착하고 양극 산화 처리된 알루미늄 플레이트를 로드합니다. 알루미늄 판이 용액 표면 바로 위에 오도록 알루미늄 판의 위치를 수동으로 조작합니다. 알루미늄 플레이트를 120분 동안 초당 4점 86미크론의 속도로 용액에 점차적으로 담그어 120나노미터에서 200나노미터의 크기 구배를 가진 35mm AAO 금형을 만듭니다.

알루미늄 플레이트가 용액 표면에 닿는 순간 스톱워치를 시작합니다. 100분이 지나면 AAO 금형의 절반이 용액에 있어야 합니다. GP 200-280 및 GP 280-360 금형을 만들기 위해 GP 120-200 금형의 전체 영역을 각각 2-4 시간 동안 기공 확장 용액에 담근다.

AAO 몰드와 피라냐 용액을 비금속 핀셋을 사용하여 30초 동안 담급니다. AAO 금형을 탈이온수로 여러 번 헹굽니다. 곰팡이를 탈이온수에 30분 동안 담그고 메틸 알코올을 30분 더 넣습니다.

AAO 금형을 진공 상태에서 3 시간 동안 완전히 건조시켰습니다. 자체 조립 단층 증착의 경우 AAO 금형을 57ml의 여과 및 헥산과 100ml 비커에 담그십시오. 그런 다음 N 헥산에 3ml의 HDFS 원액을 추가하여 2.9밀리몰의 HDFS 용액을 만들고 반응이 진행될 때까지 10분 동안 기다립니다.

AAO 금형을 신선하고 헥산으로 옮긴 후 AAO 금형을 60 밀리리터의 메톡시-노나플루오로부탄에 담갔다. 비이커에서 AAO 금형을 1회에 10초 동안 초음파로 세척하여 물리적으로 흡착된 HDFS 분자를 제거합니다. AAO 금형을 24시간 동안 진공 상태에서 건조하기 전에 세척 절차를 10회 반복합니다.

인쇄 회로 기판 절단기를 사용하여 1 점 1 밀리미터 두께의 폴리스티렌 시트를 2 점 9 밀리미터 너비 x 3 점 7 밀리미터 크기로 자릅니다. 클린 룸에서 작업하면서 니퍼를 사용하여 AAO 금형을 바닥에서 35mm 자릅니다. 뒷면에 샘플 이름과 데이터 제조업체를 표시합니다.

소량의 에틸 알코올로 8 포인트 0 인치 웨이퍼를 청소 한 다음 폴리스티렌 시트를 웨이퍼에 놓고 AAO 몰드를 장착합니다. 다음으로, 열전사 프린터의 서랍에 하단 필름을 넣고 상단 필름을 개스킷에 부착한 다음 하단 필름에 웨이퍼를 놓고 웨이퍼에 개스킷을 놓습니다. 웨이퍼에 먼지가 없는지 확인하십시오.

열전사 및 프린터의 서랍을 닫은 후 100초부터 섭씨 165도의 열과 620포인트 5/2킬로파스칼의 압력을 가합니다. 그런 다음 샘플을 실온으로 식힙니다. 냉각되면 챔버를 환기시키면 압력이 0 킬로 파스칼로 내려갑니다.

폴리스티렌 시트를 부드럽게 비틀어 AAO 금형을 분리합니다. 헤파린 억제제 튜브를 사용하여 50ml의 인간 혈액을 수집합니다. 15ml 튜브에 6ml의 친수성 다당류 용액을 넣고 친수성 다당류 용액에 8ml의 혈액을 추가합니다.

혈액을 즉시 채취하여 친수성 다당류 용액 위에 천천히 첨가해야 합니다. 1020 times G에서 20분 동안 튜브를 원심분리하여 세포를 펠릿화한 후 불투명한 세포층을 채취하여 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다. 10%FBS를 함유한 PBS 10밀리리터에서 원심분리를 통해 1020배 G에서 튜브를 10분 동안 가열하여 세포를 펠릿화합니다.

상층액을 제거하고 적혈구 용해 완충액을 추가합니다. 10%FBS를 함유한 PBS에서 얼음 위에서 5분 동안 배양한 후 1020배 G로 튜브를 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 10%FBS가 보충된 1ml의 내피 세포 확장 배지를 추가합니다.

각 콜라겐 코드 접시에 대해 우물당 8개 포인트 000만 개의 세포를 씨를 뿌립니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 인간 및 에테리얼 콜로니 형성 세포를 유도하고 추가 실험을 위해 세포를 7계대까지 성장시킵니다. 다음으로, PBS에 1ml의 영점 1% 단백질 코팅 용액을 실온에서 10분 동안 코팅합니다.

트립신(trypsin)을 사용한 표준 세포 분할 방법으로 배양 접시에서 인간 ECFC를 현탁액으로 만듭니다. 원하는 합류점을 얻기 위해 세포 현탁액을 희석한 후, 인간 ECFC를 편평한 대조군에서 그래디언트 나노 패턴 플레이트에 중단시킵니다. 인큐베이터에서 2일 동안 평면 또는 구배 나노 패턴 플레이트에서 세포를 배양합니다.

이 이미지는 세 가지 다른 타설 확장 조건에서 제작된 AAO 금형을 보여줍니다. 인산 에칭 용액에 담근 시간이 가장 짧은 한쪽은 기공 크기가 가장 작은 반면, 에칭 용액에 가장 오랜 시간을 담근 다른 쪽은 기공 크기가 가장 큽니다. 나노 패턴을 열 각인 방법을 통해 폴리스티렌으로 전달했기 때문에 폴리스티렌 표면에 나노 기둥 구조가 생성되고 나노 패턴 플레이트에서 AAO 몰드의 크기 구배가 유지됩니다.

융합된 인간 ECFC는 형태학적으로 군체를 알려주는 전형적인 조약돌을 보여주었으며, 이는 위상차 현미경으로 쉽게 구별할 수 있습니다. 구배 나노 패턴 플레이트의 평면에서 인간 ECFC를 2일 동안 배양한 후, GP 120 - 200에서 배양된 세포에서 상당한 필로포디아 성장이 관찰되었습니다. 반대로, 플랫 대조군과 비교하여 GP 200에서 280 또는 GP 280에서 360에서는 현저한 변화가 관찰되지 않았습니다.

이 결과는 표면 나노 구조체의 크기에 따라 세포의 반응이 다르다는 것을 나타냅니다. 나노 패턴 플레이트를 제작하는 데는 여러 단계가 있습니다. 따라서 처음에는 복잡할 수 있지만 일단 마스터하면 어려움 없이 원하는 크기 그라데이션으로 패턴을 얻을 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 나노 패턴 플레이트에서 그라디언트 나노 패턴 플레이트를 생산하는 방법과 인간 배양 및 더 어리석은 집락 형성 시리즈를 이해하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 이 방법은 다양한 유형의 시리즈에서 사용할 수 있습니다. 이 방법은 세포 주입과 표면 나노 지형을 이해하는 데 도움이 되는 재료 공학과 생명 공학 사이에 다리를 제공할 수 있습니다.