Name: 인쇄 Glycan 배열: 작은 동물에 반대로 탄수화물 항 체 순환의 레 퍼 토리의 분석에 대 한 민감한 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 학습하세요 인쇄 글리칸 어레이 기술을 활용하여 소동물 혈청의 순환 항-글리칸 항체 프로파일을 분석하는 방법을. 이 고감도 기법은 최소한의 시료로 수백 개의 글리칸 표적을 동시에 측정하여 면역학 연구에 활용됩니다.

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이 작품 "Fondo 드 Investigaciones Sanitarias"에 의해 지원 되었다 (FIS) 카를로스 3 세 건강 연구소, 보건의 스페인에서 PI13/01098 부여. DB-G 했다 유럽 연합 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년) 부여 계약 603049 (TRANSLINK) 아래에 의해 투자 하는 박사 후 연구 위치에서 혜택을. NK, NS, NB의 일 부여 #14-50-00131 러시아 과학 재단에 의해 지원 되었다. DB-G 마르타 Broto, J. 파블로 살바도르와 우수한 기술 지원, 애 나 Sanchis 및 알렉산더 Rakitko 통계 분석에 그의 감사를 표현 하 고 싶어. 지원으로는 "Pla 드 Doctorats 주 드 라 Secretaria d'Universitats 나 Recerca del Departament d'Empresa 나 Coneixement 드 라 Generalitat 드 Catalunya (부여 번호 2018 디 021). 우리는 검색 프로그램 감사 / Generalitat 드 Catalunya 제도적 지원에 대 한.

1. Glycochips 생산
<ol><li>
Microarray 준비
	<ol>
<li>Glycans (50mm)를 인쇄 및 6에서 버퍼링 된 식 염 수 (PBS, pH 8.5)를 사용 하 여 N-hydroxysuccinimide-derivatized 유리 슬라이드에 복제 300 m m 인산에서 류 (10 µ g/mL) 비-접촉 로봇 arrayer (볼륨 ~ 900 드롭 pL). 각 슬라이드는 6 번 반복 하위 배열 (그림 1A, 색상에서)의 4 다른 블록을 포함 합니다. 모든 단일 하위 배열 컨트롤 (8 행 × 14 열)를 포함 하 여 다른 glycan 112 관광 명소에 의해 형성 된다 (그림 1B). 참고: Glycan 관련 정보는 보충 표 1에 제공 됩니다. 인쇄 마이크로 칩에 사용 되는 glycan 라이브러리 IBCh 팀;의 장기 합성 노력의 결과 이다 관련된 출판물29,30,31,32,33,,3435,36에서에서 합성의 예 설명 ,,3738. Glycan 라이브러리 포함 혈액형 항 원 및 일부 포유류 N-및 O-연결 된 glycoproteins 및 glycolipids, 탄수화물 종양 관련 항 원, 핵심 모티프로 서 터미널 oligosaccharides, 자주 발생 하는 대부분의 고 병원 성 박테리아에서 다 당 류입니다.</li>
		<li>습기 상자 (상대 습도 ~ 70%)에서 슬라이드를 품 어 1 시간에 대 한 실 온 (25 ° C)에서</li>
		<li>Microarrays 차단: 실내 온도 (100 m m 붕, 25 mM 방법, 0.2% (v/v) 초순에 트윈-20)에서 블로킹 버퍼와 1.5 h에 대 한 슬라이드를 품 어.</li>
		<li>Glycochip 초순 물으로 세척 하 고 공기에 의해 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glycochip 품질 관리
	<ol>
<li>1 mg/mL 해결책의 복잡 한 면역 글로불린 준비 (CIP, IgG, IgM, IgA를 포함)를 사용 하 여 각 일괄 처리에서 두 microarrays 분석 10 µ g/mL 솔루션 biotinylated 염소 안티 인간 면역 글로불린의 이차 항 체 (IgM + IgG + IgA)으로 뒤에 1 µ g/mL 해당 형광 streptavidin 켤레의 솔루션 (아래에 설명 된 프로토콜을 통해 단계 2 참조).</li>
		<li>검사 하 고 분석 하는 glycochips (glycan 배열의 분석 3 단계 참조).</li>
		<li>Microarray 일괄 처리를 사용 하 여 내부 및 남북 chip 상관 관계와 함께 0.9 보다 더 높은.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Glycan 배열 기술
<ol><li>
다음 수성 해결책 (초순)을 준비 하 고 실 온 (25 ° C)에서 그들을 저장:
	<ul>
<li>버퍼-1: 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, 1% (v/v) 트윈-20 및 0.01% (w/v) 앤3 에
</li>
		<li>버퍼-2: 1% (w/v) BSA PBS에, 0.1% (v/v) 트윈-20 및 0.01% (w/v) 앤3</li>
		<li>버퍼-3: 0.1% (v/v) 트윈 20 PBS에.</li>
		<li>버퍼-4: 0.001% (v/v) 트윈 20 PBS에.</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Glycochip 및 샘플 준비
	<ol>
<li>실내 온도 (25 ° C) 도달할 때까지 테이블에 슬라이드와 저장 상자를 넣어. 참고: 사용 파우더 프리 라텍스 장갑. Glycochip는 바코드는 유리 슬라이드의 하단 부분에 의해 조작 해야 합니다. 바코드는 glycans 인쇄는 표면 접촉을 피하고 오른쪽을 식별 하는 데 도움이 됩니다.</li>
		<li>상자는 glycochip을 열고 이미 단련 필터 종이와 챔버 내부에 일정 한 습도 유지 하는 인큐베이션 챔버 (25 ° C)에 그것을 배치.</li>
		<li>한편, 1.5 mL 튜브에 버퍼-1 (1:20) 쥐 혈 청 희석. 혈 청 솔루션 균질 (5 s)와 동 믹서. 참고: 단일 glycochip 표면을 완전히 커버 하는 데 필요한 볼륨은 약 1 mL.</li>
		<li>균질, 후 희석된 혈 청 면역 글로불린 집계를 피하기 위해 물 욕조에 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 10000 x g와 25 ° C에서 3 분 동안 튜브 원심는 상쾌한을 수집 하 고 침전 된 자료 폐기.</li>
		<li>보육 실에는 glycochip를 신중 하 게 배치 합니다. 버퍼-3는 glycochip의 표면에 어떤 잔여 물자 제거의 1 mL와 25 ° C에서 15 분 동안 그것을 품 어.</li>
		<li>수직 위치에는 glycochip를 보유 하 고 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 버퍼 3의 몇 방울과 rewash. 필터 종이 사용 하 여 glycochip 표면에서 버퍼를 조심 스럽게 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
반응: 항 체 바인딩
	<ol>
<li>보육 실에는 glycochip를 배치 합니다. 희석된 혈 청 샘플은 micropipette를 사용 하 여 glycochip 표면에 걸쳐. 1.5 h. glycochip 표면의 모든 건조 영역은 피 펫의 끝을 사용 하 여 희석된 혈 청 샘플에 의해 포함 되는 확인에 대 한 37 ° C에서 궤도 동요 (30 rpm)와 함께 품 어.</li>
		<li>모든 초과 샘플을 제거 하 고 젖어 25 ° c.에 버퍼-3에서 5 분 glycochip 그런 다음 버퍼-4 (5 분) 컨테이너에는 glycochip를 이동 하 고 마지막으로 (5 분) glycochip 초순 물으로 씻어. 175 x g와 액체를 제거 하 25 ° C에서 1 분 동안 glycochip 원심</li>
	</ol>
</li>
	<li>
탐지: 이차 항 체
	<ol>
<li>보육 실에는 glycochip를 배치 합니다. Glycochip 표면 염소 반대로 마우스 (IgG + IgM) 버퍼 2에 biotin을 활용의 해결책 (5 µ g/mL)에 걸쳐. 1 시간에 대 한 37 ° C에서 궤도 동요 (30 rpm)와 함께 품 어.</li>
		<li>언바운드 분수를 제거 하 고 세척 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>원심 분리 후 알을 품는 glycochip 45 분 (30 rpm) 25 ° C에서 어둠 속에서 (버퍼-2)에 해당 형광 색소 표시 streptavidin 솔루션의 2 µ g/mL와 함께.</li>
		<li>어둠 속에서 언바운드 분수를 제거 하 고 세척 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>공기는 glycochip를 건조. 참고: Glycochip 최대한 빨리 검색할 수 합니다. 하지만 얼룩 후 즉시 스캔 할 수는 없습니다, 만약 glycochips 어둠 속에서 차가운 건조 한 장소에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. Glycan 배열의 분석
<ol><li>
배열 검색
	<ol>
<li>어둠 속에서 실 온에 도달할 때까지 테이블에는 glycochip를 남겨 주세요. 같은 시간에 켜고 슬라이드 스캐너와 레이저 (여기 파장 633 nm).</li>
		<li>잡고 있는 microarray 밀어는 glycochip 슬롯에 다시 감동까지.</li>
		<li>Glycochip ("실행된 쉬운 스캔"), 스캔 하 고 스캔으로 저장 한 ". 티파니"파일입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
배열 정량화
	<ol>
<li>ScanArray 분석 시스템을 사용 하 여 array를 계량. 오픈 이전 스캔 한 이미지를 "파일" 의"구성 및 파일 그룹" (그림 1B-D) 기본 창에서 클릭 하 여</li>
		<li>GAL 형식 (유리 슬라이드에 인쇄 된 glycans의 처리) 해당 배열 파일 템플릿을 로드할 (그림 1C).</li>
		<li>신중 하 게 이미지에 점이 배열 (격자)을 정렬 하 여 GAL 서식 파일을 조정 하 고 정량화 (그림 1D) 시작.</li>
		<li>정량화 매개 변수를 선택 합니다.<ul>
<li>정량화 형식: 실행 쉬운 양의.</li>
			<li>정량화 방법: 원 고정</li>
			<li>자동 장소를 찾을: 모든 옵션을 unclick</li>
			<li>정규화 방법: LOWESS (로컬가 중된 분산형 플롯 부드럽게).</li>
		</ul>
</li>
		<li>정량된 데이터를 저장 ". CSV"파일 (그림 1D). Microsoft Excel 또는 다른 응용 프로그램을 사용 하 여 일반적인 스프레드시트 파일에이 데이터를 전송.</li>
		<li>주요 통계 방법으로 사용 하는 interquartile 범위 (IQR): 각 리간드 및 interquartile 편차에 대 한 모든 신호 들의 중간값 (2 사분 위 수)의 계산 (25 그리고 75 백분위 또는 상위 및 하위 quartiles 3 분기와 1 분기, 각각).</li>
		<li>계층적 클러스터링 탐색기 응용 프로그램을 사용 하 여 데이터의 대화식 탐색을 수행 합니다.</li>
		<li>사용 매개 변수를 클러스터링: 유사성으로 유클리드 거리와 평균 연계 (UPGMA) 거리 측정. 계층적 클러스터링 정규화 없이 행 하 여 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Nailya Khasbiullina그리고 알렉세이 Nokel Semiotik LLC는,이 연구에 사용 된 glycochips의 공급 업체의 직원.

Glycan microarrays 단백질 glycan 상호 작용40공부에 대 한 필수적인 도구가 되고있다. 현재 일 PGA BALB/c 마우스 항 체 항 탄수화물의 순환의 레 퍼 토리를 연구 기술을 기반으로 하는 프로토콜을 설명 합니다. PGA 스크린 다 수 알 수 없는 생물학 glycans의 가능성을 제공 합니다, 이후 그것은 매우 편리한 검색 도구13,15,28. 제안된 된 방법 측정, 동일한 실험 설정 수백 glycan 구조 serological 샘플 (50 µ L)의 감소 금액을 사용 하 여 가능성을 제공 합니다. 이것은 특히 중요 한 작은 동물 (작은 순환 혈액 양), 경우 또는 그것은 여러 번 같은 실험 동물 로부터 혈액을 추출 하는 데 필요한 때 이다.
우리가...

항 체는 직접 보완 시스템4,5 를 활성화 하 여 바이러스1,2 , 박테리아2,3, 중화 하 여 병원 균 침입에 대 한 우리의 방어에 중심 역할을 담당 그리고 먹어서6의 향상입니다. 또한, 그들은 암 타겟팅 및 악성 세포7및 항상성 유지 보수8,9의 제거에 필수적인 요소입니다.
면역 시스템의 장애 자가 면역 및 염증 성 질환 및 암10 11발생할 수 있습니다. 이러한 병 적인 조건을 이상적으로 효율적인 치료에 대 한 신속한 진단 요구. 자가 면역 질환의 경우 대부분의 경우에는 신경의 혈 청 학적인 존재 면역10,12의 진단에 대 한 예측 이다. 이 항 체 세포 표면으로 반작용 하 고 extracellular autoantigens, 그들은 종종 면역 질환10,12의 프레 젠 테이 션을 하기 전에 몇 년 동안 존재. 면역 결핍증과 암은 또한으로 진단 혈액 검사도 항 체, 또는 그들의 기능 활동11같은 면역 요소의 수준을 측정.
순환 항 체 및 그들의 혈 청 학적인 레벨의 레 퍼 토리의 식별은 설정 하는 예 지 고 언급 한 병 적인 상황의 진행 평가 답해야 합니다. 우리는 이전 증명 하고있다 다른 동물 종13-16, 항 체 순환의 분석을 위한 PGA 기술의 잠재력 문제를 피하고 serological 샘플의 큰 볼륨의 사용을 최소화 연관 된 항 체 분17 및 수 있도록 높은 처리량 항 체15의 광범위 한 레 퍼 토리의 프로 파일링.
Glycan 기반 immunoassays는 주로 단련, 다른 요인 중 기원과 탄수화물, 선호도 및 ligands15,,1819,20 의 바인딩 결정 하는의 생산에 의해 21. Glycan 기반 immunoassays 정지 (스피어)15,,2122 또는 평면 활성화 표면15,,2122, 개발 될 수 있다 23,24. 마지막 (가장 평범한 이러한 메서드의) ELISA 등 PGA. 데이터는 동일한 실험 설정15,25,,2627에 이러한 방법론을 비교 하지 않습니다. 우리는 이전 효능과 선택도 이러한 immunoassays 개별 인간의 플라즈마 샘플15프로필 안티 glycan 항 체의 비교 했습니다. 그 대상으로 안티-A/B 혈액 그룹 등 일부 항 체에 대 한 모든 immunoassays 통계적 의미와 그들을 감지할 수 있는 그리고 그들은 적극적으로 서로 서로15,,1821. 한편, 안티-P1 항 체 주로 구별 고성능 PGA에 의해 발견 했다 하 고 다른 glycan 기반 immunoassays15,18, 에 의해 만들어진 결정에 상관 관계가 없었다 21. 방법 사이의 이러한 차이 주로 항 체/항 원 비율 및 glycan 방향15관련이 있었다. ELISA 및 서 스 펜 션 배열을 이러한 방법을15항 체에 항 원의 과잉 때문에 PGA 보다 불특정 바인딩을 더 따르게 됩니다. 또한, 미국 PGA에서 glycans의 방향을 ELISA와 서 스 펜 션 배열15보다 더 제한 됩니다. ELISA는 연구 glycans의 제한 된 패널을 포함 하는 경우에 편리 합니다. 서 스 펜 션 배열 함께 ELISA 분석 결과 재구성에 관한 광범위 한 유연성을 제공합니다. PGA는 발견 접근15,18,,2128매우 편리 합니다. 이러한 명확한 장점과 단점에도 불구 하 고 3 개의 언급된 immunoassays glycan 항 체 상호 작용의 다양 한 측면을 연구 사용 수 있습니다. 연구의 최종 목표는 하나 더 적합 한 방법론의 선택을 안내할 것입니다.
현재 작동 작은 동물 항 체 안티 glycan 순환의 레 퍼 토리의 분석을 위한 PGA 기술을 사용 하 여 확장 하는 것을 목표로 합니다. 대표 결과적으로 선물이 여기 PGA에 의해 성인 BALB/c 마우스에서 자연 안티 탄수화물 항 체의 레 퍼 토리를 평가 하기 위해 상세한 프로토콜.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotinylated goat anti-human Igs</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Ref. #: 31782</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 염소 anti-mouse IgM + IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: 31807</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5&nbsp;</td><td>Scienion AG, Berlin, Germany</td><td>http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/</td><td></td></tr> <tr><td>Stain Tray (slide incubation chamber)</td><td>Simport, Beloeil, QC, Canada</td><td>Ref. #: M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany&nbsp;</td><td>참조 #: 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>http://www.gilson.com/en/Pipette/</td><td></td></tr> <tr><td>슬라이드 스캐너&nbsp;</td><td>PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 월섬</td><td>ScanArray GX Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, UK</td><td>Ref. #: SI50</td><td></td></tr><tr><td>Biological samples</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c mice sera</td><td>This paper</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Complex Immunoglobulin Preparation (CIP)</td><td>Immuno-Gem, Moscow, Russia</td><td>http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531</td><td></td></tr><tr><td><강>화학물질, 시약 및 글리칸&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycan library</td><td>Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,&nbsp;</td><td>Ref. #: A9418</td><td></td></tr><tr><td>에탄올아민</td><td>시그마-알드리치</td><td>Ref. #: 411000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Chemicals & Life Science S.A., 마드리드, 스페인</td><td>Ref. #: 655204</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered Saline (PBS)</td><td>VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain</td><td>Ref. #: E404</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: S21381</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5 conjugate</td><td>GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK</td><td>Ref. #: PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H&nbsp;</td><td>Schott-Nexterion, 예나, 독일</td><td>Ref. #: 1070936</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 여과지&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: WHA10347509</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Ref. #: 0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Software and algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express 마이크로어레이 분석 시스템</td><td>PerkinElmer</td><td>http://www.per kinelmer.com/microarray</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hierarchical Clustering Explorer application</td> University <td>of Maryland, MD, USA</td><td>http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/</td><td></td></tr></tbody></table>

인쇄 glycan 배열: 작은 동물에 반대로 탄수화물 항 체 순환의 레 퍼 토리의 분석에 대 한 민감한 기술

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

주어진된 개인의 반대로 탄수화물 항 체 순환의 레 퍼 토리는 종종 면역 상태와 연결 됩니다. 뿐만 아니라 개별 면역 상태 결정 내부 및 외부 잠재적인 위협 신호를 퇴치에 성공 하지만 순환 안티 glycan 항 체 (및 그들의 혈 청 학적인 수준 변화)의 특정 패턴의 존재도 될 수는 발병과 병 적인 특정 조건의 진행의 중요 한 표식입니다. 여기, 우리는 매우 높은 감도; glycan 목표의 수백을 측정 하는 기회를 제공 하는 인쇄 Glycan 배열 PGA 기반 방법론 설명 샘플은 일반적인 제한 때 작은 동물의 최소 금액을 사용 하 여 (쥐, 쥐, 햄스터 등) 주소 측면 인간의 질병의 모델로 사용 됩니다. 이 방법의 대표적인 예를 들어, 우리는 자연 안티 glycan BALB/c 마우스에 항 체의 레 퍼 토리의 분석에서 얻은 결과 보여줍니다. 우리는 유전으로 동일 하 고 동일한 조건 하에서 유지 되 고에도 불구 하 고 연구에 참여 각 BALB/c 마우스 자연 안티 탄수화물 항 체의 특정 패턴을 개발 보여줍니다. 이 작품을 레 퍼 토리 (특이성) 조사 PGA 기술의 사용과 반대로 탄수화물 항 체, 건강에 어떤 병 적인 상태와 순환의 수준을 확장 하 주장 한다.

여기, 우리는 20 BALB/c 마우스의 인구에 있는 자연 안티 glycan 항 체의 레 퍼 토리의 정량화에서 얻은 대표적인 결과의 요약을 제시. 이 연구에 사용 된 glycochips 419 다른 glycan 구조 포함. 대부분 glycans 채널으로 종합 되었다2CH2CH2NH2 스페이서 무장 O-배당 체,-CH2CH2NH2 또는-NHCOCH2NH2 배당 체로 여러 경우에. 모든 glycan 구조 고해상도 특징 이었다 (700-800 mhz) NMR 분광학, 정화 및 HPLC, 테스트 나타내는 그들의 &gt; 95% 순도. 우리는 IgM 결정 동시에 + 마우스 혈 청의 제한으로 인해 안티 glycan 항 체 IgG. PGA에서 우리는 항 체 바인딩 (이 값은 최고 glycans...

이 작은 동물에 반대로 탄수화물 항 체 순환의 분석에 대 한 인쇄 glycan 배열 (PGA) 기술의 잠재력을 보여줍니다.

인쇄 Glycan 배열: 작은 동물에 반대로 탄수화물 항 체 순환의 레 퍼 토리의 분석에 대 한 민감한 기술

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 인쇄된 글리칸 어레이 기반 기술을 사용하여 작은 동물의 혈청에서 항글리칸 항체를 순환하는 프로파일을 연구하는 것입니다. 이 접근법은 글리칸 구조물에 대하여 항체가 중요한 역할을 하는 몇몇 병리학 조건에서 초기 진단 및 적당한 처리에 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소량의 시료를 사용하여 매우 높은 감도를 가진 수백 개의 글리칸 표적을 동일한 실험 환경에서 측정할 수 있다는 것입니다.마이크로 어레이를 준비하려면 비접촉 로봇 어레이를 사용합니다. 밀리머 글리칸 50개, 밀리리터 다당 10마이크로그램, 300밀리머 PBS, pH 8.5, n-하이드록시 6계 계피 파생 유리 슬라이드6복제. 각 슬라이드에는 6회 반복된 4개의 서로 다른 하위 배열 블록이 포함되어 있습니다.모든 단일 하위 어레이는 대조군을 포함한 112가지 글리칸 스팟에 의해 형성됩니다. 슬라이드를 실온의 수분 상자에 1시간 동안 배양합니다. 마이크로 어레이를 차단하려면 실온에서 버퍼를 차단하여 슬라이드를 1 1/2시간 동안 배양합니다.그런 다음 매우 순수한 물로 글리콜 칩을 씻고 공기로 건조시다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 버퍼 4를 통해 버퍼 를 준비합니다. 글리콜 칩과 샘플을 준비하려면 실온에 도달할 때까지 테이블에 슬라이드가 있는 저장 상자를 놓습니다.상자를 열고 글리콜 칩을 이미 젖은 필터 용지로 조절해야 하는 인큐베이션 챔버로 이송하여 실내의 습도를 일정하게 유지합니다. 한편, 1.5 밀리리터 튜브에 있는 완충1로 마우스 혈청을 희석시. 혈청 용액을 소용돌이 믹서로 5초 동안 균질화합니다.균질화 후, 면역 글로불린 응집을 피하기 위해 수조에서 10 분 동안 37섭씨에서 희석 된 혈청을 배양합니다. 그런 다음 10, 000 배 G 및 섭씨 25도에서 3 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 수집하고 침전 된 재료를 폐기하십시오.글리콜 칩을 인큐베이션 챔버에 조심스럽게 놓습니다. 글리콜 칩 표면에 잔류 물질을 제거하기 위해 버퍼 3의 1 밀리리터로 배양하십시오. 섭씨 25도에서 15분 동안.글리콜 칩을 수직 위치에 놓고 플라스틱 저스티드 파이펫을 사용하여 버퍼 3 방울로 다시 세척하십시오. 그런 다음 필터 용지를 사용하여 글리콜 칩 표면에서 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 글리콜 칩을 인큐베이션 챔버에 다시 넣습니다.마이크로 파이펫을 사용하여 희석된 혈청 샘플을 글리콜 칩 표면에 펴보시면 됩니다. 글리콜 칩 표면의 모든 건조한 부위가 파이펫 끝을 사용하여 희석된 혈청 샘플로 덮여 있는지 확인합니다. 1 1/2 시간 동안 섭씨 37도에서 궤도 동요로 배양하십시오.인큐베이션후, 여분의 시료를 제거하고 25°C에서 완충 3분 동안 글리콜 칩을 담그지. 글리콜 칩을 버퍼 4로 용기에 넣고 마지막으로 초순수물로 글리콜 칩을 씻습니다. 글리콜 칩을 175회 G와 섭씨 25도에서 1분간 원심분리하여 액체를 제거합니다.글리콜 칩을 인큐베이션 챔버에 다시 넣은 후, 글리콜 칩 표면 위에 비오틴에 공주된 염소 항마우스용액을 확산시다. 1시간 동안 섭씨 37도에서 궤도 동요로 배양합니다. 언바운드 분획을 제거하고 세척 단계를 반복합니다.원심분리에 따라, 완충 2에 해당 플루오로크롬 라벨 스트렙타비딘 용액의 밀리리터 당 2 마이크로그램으로 45분 동안 25도의 어둠 속에서 글리콜 칩을 배양한다. 어둠 속에서 작업한 후 언바운드 분획을 제거하고 세척 단계를 반복한 후 글리콜 칩을 공기로 건조시다. 어레이를 스캔하려면 글리콜 칩이 어둠 속에서 실온에 도달할 때까지 테이블에 둡니다.동시에 슬라이드 스캐너와 레이저를 켭니다. 마이크로 어레이를 잡고 글리콜 칩을 슬롯에 밀어 넣고 뒤쪽에 닿을 때까지 밀어 넣습니다. EasyScan을 실행하여 글리콜 칩을 스캔하고 스캔을 tif 파일로 저장합니다.ScanArray 분석 시스템을 사용하여 배열을 정량화합니다. 메인 창의 구성 및 파일 그룹에서 파일을 클릭하여 이전에 스캔한 이미지를 엽니다. 해당 어레이 파일 템플릿을 GAL 형식으로 로드하여 유리 슬라이드에 인쇄된 글리칸의 소착을 나타냅니다.배열을 이미지의 반점과 신중하게 정렬하여 GAL 템플릿을 조정하고 정량화를 시작합니다. 정량화 유형이 쉽게 정량화 및 정량화 방법 고정 원을 실행으로 정량화 둘레를 선택합니다. 자동 찾기 반점에 대한 모든 옵션을 클릭하고 정규화 방법에 대한 최저점을 선택합니다.정량화된 데이터를 csv 파일로 저장합니다. 이 데이터를 Microsoft Excel 또는 다른 적절한 응용 프로그램을 사용하여 일반적인 스프레드시트 파일로 전송합니다. 유전적으로 동일한 마우스는 천연 항탄수화물 항체의 다른 패턴을 개발했기 때문에 면역학적 등가물로 간주되어서는 안됩니다.여기에 나타난 바와 같이, 12글리칸 특이성만 보존되었다. 여기에 도시된, 플로리스트 스캐너를 사용하여 마이크로 칩 스캐닝에서 얻은 이미지의 대표적인 예입니다. 그런 다음 그리드는 모든 단일 하위 배열의 스팟에 정렬됩니다.각 스팟에 대해 플로리스트가 감지되고 결과는 공통 스프레드시트 파일로 전송됩니다. 마우스 세럼으로 인큐베이션을 받은 글리코 칩은 스캔 어레이 판독기를 사용하여 스캔했습니다. 데이터는 마이크로 어레이 분석 시스템으로 분석되었고 결과는 중앙값 절대 편차를 뺀 중간 값으로 RFU로 표현되었다.파란색과 흰색 색상은 4000 RFU 미만의 배경 바인딩 신호를 나타냅니다. 적색은 4000 RFU보다 크거나 같을 수 있는 양수 결합 신호를 나타냅니다. 글리콜 칩에 노출된 대부분의 글리칸 구조는 발프 C 마우스의 순환 항글리칸 항체의 레퍼토리에 의해 인식되지 않았다.이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 5 시간 45 분 안에 수행 할 수 있습니다. 이 비디오를 본 후에는 프린터 글리코 어레이 기술을 사용하여 혈청 샘플에서 레퍼토리 및 순환 항탄수화물 항체의 수준을 조사하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다. 이 절차를 시도하는 동안 글리코 칩은 안경 의 하단 부분에 의해 조작되어야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.바코드가 있는 위치입니다. 인쇄 된 글리칸과의 접촉을 피하기 위해. 또한, 글리코 칩의 모든 건조 영역이 파이펫의 끝을 사용하여 희석 된 혈청 샘플에 의해 덮여 있는지 확인합니다.글리코 칩의 단일 표면을 완전히 커버하는 데 필요한 부피는 약 1 밀리리터입니다. 이 절차에 이어, 마이크로스피어 베이스 서스펜션 어레이와 같은 다른 방법은 항글리칸 항체 프로파일의 유연한 멀티플렉스 검출과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다. 그것의 소개 후에 이 기술은 작은 동물의 집합에 있는 비 단백질 glycol 상호 작용을 탐구하기 위하여 생물막 분자 및 면역학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.

printed-glycan-array-sensitive-technique-for-analysis-repertoire

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

이 동영상은 마우스 혈청에서 순환하는 항글라이칸 항체를 분석하기 위한 인쇄된 글라이칸 어레이 기술을 보여줍니다. 혈청의 항체는 칩의 특정 글라이칸과 상호 작용하며, 이는 면역 염색 후 형광 스캔으로 확인됩니다.

Printed Glycan Array를 사용한 순환 항글라이칸 항체 검출

인쇄된 글라이칸 마이크로어레이 전략을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 열성 및 시알산 함유 수용체에 대한 특이성을 분석하기 위해 기존의 96웰 플레이트 분석을 소형화했습니다.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

여기에서는 인간과 생쥐의 혈청 IgG 및 IgM 자가항체를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 어레이를 통해 관심 항원 또는 항원결정기에 대한 항체를 고처리량 및 정량적으로 검출할 수 있습니다.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

Glycan microarray를 개발 하 고 광범위 하 게 항 체를 중화 하는 HIV의 프로 파일링에 대 한 사용 설명 되는 산화 알루미늄 코팅 유리에 첨부 파일에 대 한 N-glycans의 합성에 모듈 접근 (ACG 슬라이드) 슬라이드.

N-glycans 배열 개발 및 HIV 항 체의 항 암 치료 효소 합성 프로 파일링

시알로 글리 칸 마이크로 어레이 분석은 인체 혈청에서 항 -Neu5Gc 항체를 평가하는 데 사용될 수있어 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에 대한 잠재적 인 고효율 진단 분석법이됩니다.

Sialoglycan Microarray Assay를 사용하여 Human Sera에서 Anti-Neu5Gc IgG 프로파일 링

자동화된 미생물반응기의 수확된 세포 배양 유체(HCCF)로부터의 단일클론 항체의 정제 및 후속 분석을 위한 상세한 프로토콜이 기술되었다. 분석을 사용하여 중요한 품질 특성(CQA)을 결정하고 제한된 샘플 볼륨을 최대화하여 중요한 정보를 추출하는 것도 제공됩니다.

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

항체의 글리코실화 패턴은 그의 임상 성능을 결정하고, 따라서 글리코실화를 조절하기 위한 산업적 및 학문적 노력이 지속된다. 전형적인 글리코엔지니어링 캠페인은 시간과 노동 집약적이기 때문에, 일시적 침묵을 사용하여 글리코실화 유전자의 영향을 특성화하는 신속한 프로토콜의 생성은 유용할 것이다.

중국 햄스터 난소 세포의 신속한 항체 당공학

마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)은 생물학적 샘플에서 글라이칸의 조성 분석을 위한 고처리량 기술입니다.

고처리량 글라이칸 분석을 위한 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)

간단한 슬롯 얼룩 방법은 생물 정보학 분석을 통해 확인된 그들의 가장 보존 시퀀스를 대상으로 보편적인 항체를 사용하여 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 부량 위해 개발되었습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 모든 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 양적 결정에 유용한 대안을 제공할 수 있습니다.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

학습하세요 인쇄 글리칸 어레이 기술을 활용하여 소동물 혈청의 순환 항-글리칸 항체 프로파일을 분석하는 방법을. 이 고감도 기법은 최소한의 시료로 수백 개의 글리칸 표적을 동시에 측정하여 면역학 연구에 활용됩니다.

인쇄 Glycan 배열: 작은 동물에 반대로 탄수화물 항 체 순환의 레 퍼 토리의 분석에 대 한 민감한 기술

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