 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

이 시험관 내 키나아제 분석의 전반적인 목표는 키나아제 사이클린 의존성 키나아제 1에 특이적인 관심 단백질에서 인산화 부위를 식별하는 것입니다. CDK1 특이적 인산화 부위의 식별은 CDK1이 세포주기를 제어하는 방법에 대한 기계론적 통찰력을 제공하기 때문에 중요합니다. 세포주기 조절은 위상 가득 찬 염색체 분리에 매우 중요하며 결함은 염색체 이상과 암을 유발합니다.

이 기술의 주요 장점은 정제된 단백질에 의존하므로 모든 모델 유기체에 적용할 수 있으며 특히 세포의 기능 연구와 결합할 때 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법은 CDK1이 단백질체의 약 8-13%를 인산화한다는 사실에도 불구하고 알려진 CDK1 표적의 수가 여전히 적기 때문에 중요합니다. 이 방법은 CDK1 특이적 인산화 부위를 식별하지만, 정제된 인산화효소를 사용할 수 있는 경우 다른 인산화효소에 대한 인산화 부위를 식별하도록 수정할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 높은 인산화 효율을 얻기 위해 각 단백질 표적에 대해 kinase 분석 조건을 최적화해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 가급적이면 100% IGPS 3.0 소프트웨어를 사용하고 웹 서버를 방문하여 CENP-F 표적 단백질 서열에서 CDK1 특이적 인산화 부위를 예측합니다. CDK1 합의 염기서열에 대해 인산화 부위를 확인합니다.

사전 배양을 준비하여 단백질 발현을 시작합니다. 제조업체의 지침에 따라, 1 마이크로 리터의 발현 플라스미드를 50 마이크로 리터의 E.coli 수용 세포로 변환합니다. 플라스미드를 첨가한 후 얼음 위에서 30분 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 섭씨 42도에서 45초 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 세포를 얼음 위에 1분 동안 놓고 세포에 LB 400마이크로리터를 첨가한 다음 흔들면서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양물을 배양합니다. 그런 다음 LB 한천 플레이트에 배양액 200마이크로리터를 플레이트하고 구성에 따라 관심 있는 항생제를 보충합니다.

다음으로 섭씨 37도에서 12-20시간 동안 흔들지 않고 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 LB 한천 플레이트에서 콜로니를 선택하고 원하는 항생제 조합이 보충된 50ml의 LB 배지를 콜로니에 접종합니다. 섭씨 37도에서 배양하면서 12-20시간 동안 분당 160-180회 회전으로 흔듭니다.

LB 매체 1리터에 항생제와 멸균 여과 포도당 용액 10중량 기준 40밀리리터를 추가합니다. 이 배지에 조밀하게 자란 배양 전 20 밀리리터를 첨가하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 분당 160-180회 회전으로 흔들면서 배양을 배양합니다.

일정한 간격으로 600나노미터에서 배양물의 흡광도를 확인합니다. 흡광도가 0.5 - 0.6에 도달하면 0.2 millimolar IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 3시간 동안 흔들면서 배양물을 배양합니다.

3 시간 후에 4, 100 시간 G에 원심 분리에 의하여 그네 밖으로 회전자를 사용하여 4 섭씨 온도에 15 분 동안, 세포를 추수하십시오. 원심분리 후 상층액을 배출합니다. 세포 펠릿을 CENP-F에 대한 GST 결합 완충액 20ml에 재현탁하고 배양 1리터당 카료페린 알파에 대한 6개의 결합 완충액

그런 다음 셀을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. CENP-F를 정제하려면 먼저 CENP-F 구조체로 세포를 해동합니다. 그런 다음 GST 바인딩 버퍼를 사용하여 부피를 20밀리리터로 조정합니다.

부피가 조정되면 모든 환원제와 프로테아제 억제제를 차례로 첨가하여 후속 용해를 위해 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 유리 비커에 옮기고 비커를 얼음물 수조에 담그십시오. 그런 다음 문화를 음파화하십시오.

초음파 처리 후 250 마이크로 몰 PMSF를 용해물에 첨가 한 다음이 단계에서 투명해야하는 용해물을 검사하십시오. 다음 12, 000에서 40, 4 섭씨 온도에 25 분 동안 000 시간 G에 용해물을 원심 분리하십시오. 다음으로, 일회용 크로마토그래피 컬럼에 2ml의 글루타티온 아가로스 1:1 슬러리를 첨가하여 컬럼을 준비합니다.

컬럼을 평형화하려면 먼저 25ml의 초순수로 세척한 다음 25ml의 GST 결합 완충액으로 세척합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 디캔팅한 다음 0.2마이크로미터 타설 크기를 통해 상층액을 여과합니다. 다음으로 결합 단계를 위해 막힌 컬럼에 용해물을 붓습니다.

컬럼을 덮고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양하면서 부드럽게 너트를 끼우고 거품이 생기지 않도록 합니다. 30분 후 컬럼을 랙에 옮기고 수지를 가라앉힙니다. 그런 다음 흐름을 수집하고 25ml의 GST 결합 버퍼로 컬럼을 두 번 세척합니다.

세탁이 완료되면 컬럼을 다시 꽂습니다. 그런 다음 400마이크로리터의 GST 결합 완충액과 250마이크로리터의 PS 프로테아제 스톡을 밀리그램당 1000단위의 활성으로 컬럼에 추가합니다. 다시 컬럼을 덮고 컬럼을 부드럽게 소용돌이쳐 버퍼에 레진을 다시 현탁시킨 다음 컬럼을 섭씨 4도에서 16-20시간 동안 배양합니다.

배양 기간이 끝나면 4ml의 GST 결합 완충액을 첨가하여 단백질 분해 절단된 컬럼에서 CENP-F 단편을 용리시킵니다. GST 태그를 용리하려면 열을 다시 꽂습니다. 그런 다음 글루타치온이 함유된 GST 용출 완충액 4ml를 컬럼에 추가합니다.

그런 다음 바인딩된 GST 태그를 용리하기 위해 10분 동안 컬럼을 배양합니다. 10분 후 용리액을 수집합니다. 그런 다음 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 PS 프로테아제 및 글루타티온 용출 분획을 분석합니다.

다음으로 단백질 샘플을 농축하기 위해 PS 프로테아제 용출액을 3킬로달톤 분자량 컷오프로 원심 필터 장치의 상부 구획에 용출합니다. 그런 다음 스윙 아웃 로터에서 섭씨 4도에서 10-15분 단위로 4, 100배 G로 용리액을 원심분리하여 샘플을 농축합니다. 각 증분 후에는 농도 구배가 형성되지 않도록 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 농도 필터의 단백질 샘플을 혼합합니다.

겔 여과를 통해 CENP-F를 정제하려면 겔 여과 컬럼을 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 부착합니다. 다음으로, 하나의 컬럼 부피의 겔 여과 버퍼로 컬럼을 평형화합니다. 다음으로 CENP-F 단편을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 20분 동안 21, 700배 G로 원심분리합니다.

원심분리가 끝난 후 컬럼에 샘플을 주입한 다음 겔 여과 버퍼로 컬럼을 용리시키고 CENP-F 단편의 0.6ml 분획을 수집합니다. 다음으로 겔 여과 프로파일을 분석하고 피크 분획물의 SDS-PAGE를 실행합니다. 순수 CENP-F를 포함하는 풀 분획.

그런 다음 정제된 CENP-F 단편을 밀리리터당 3.3mg으로 농축합니다. 단백질 농도를 측정하려면 CENP-F 단편을 초순수로 1:100 비율로 희석합니다. 다음으로 분광 광도계에서 220에서 300 나노 미터 파장의 스펙트럼을 기록하십시오.

다음으로 0.5ml 마이크로튜브에 정제된 CENP-F 50마이크로리터의 부분 표본을 준비한 다음 튜브를 액체 질소에서 급속 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 키나아제 분석을 위해 CENP-F 단편을 ATP 및 CDK1 cyclin B와 함께 0.5ml 마이크로튜브에 다른 완충액과 혼합합니다. 그런 다음 CDK1 cyclin B가 없는 두 번째 샘플을 음성 대조군으로 준비합니다.

그런 다음 섭씨 30도의 수조에서 1-16시간 동안 샘플을 배양합니다. 질량 분석법으로 인산화 부위를 성공적으로 식별하기 위해서는 인산화 효율이 가능한 한 높고, 바람직하게는 100%인산화 효율을 높이려면 더 많은 키나아제를 추가하고 배양 시간을 16시간으로 늘리는 것이 중요합니다. 그런 다음 동일한 부피의 6몰 구아니딘 염산염 용액을 나머지 키나아제 분석 반응 및 음성 대조군에 추가하고 질량 분석을 수행하여 인산화 부위를 식별합니다.

고품질 질량 분석 데이터를 얻으려면 정제된 단백질 샘플이 매우 순수하고 균질해야 합니다. 먼저 SDS-PAGE 분석이 수행되어 CDK1이 없는 음성 대조군과 비교하여 인산화된 CENP-F에 대한 겔의 밴드가 명확하게 상향 이동하여 CENP-F의 cNLS가 CDK1 기질임을 나타냅니다. 다음으로 CENP-F 인산화 부위의 수와 효율을 분석하기 위해 질량 분석이 수행됩니다.

온전한 체외 인산화된 CENP-F의 ESI 이온 트랩 질량 스펙트럼은 5개의 피크가 있음을 보여주며, 이는 4개의 인산화 부위를 나타내고 5번째 피크는 인산화되지 않은 단백질입니다. 다음으로, 이 크기 배제 용리 프로파일은 카료페린 알파 피크의 용출 부피가 야생형 CENP-F를 추가할 때 더 높은 질량으로 이동함을 보여주며, 이는 CENP-F 돌연변이를 추가할 때 관찰되지 않습니다. 이는 CENP-F의 인광 버전 S3048D가 CENP-F cNLS와 카료페린 알파의 상호 작용을 약화시킨다는 것을 나타냅니다.

마지막으로, SDS-PAGE 분석이 수행된 결과 cNLS가 손상되지 않은 야생형 CENP-F 단편이 카료페린 알파와 공핵되어 강한 상호 작용을 나타내는 것으로 나타났습니다. 그러나 CENP-F와 카료페린 알파의 S3048D 돌연변이는 별도의 피크에서 용리됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 얻어진 인산화 부위를 CDK1 합의 인산화 서열에 대해 확인하고 식별된 기질이 CDK1과 동일한 세포 구획에 국한되어 있는지 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 확인된 인산화 부위가 생리학적 기능을 가지고 있는지 확인하기 위해 세포 또는 동물 모델에서 기능 검증을 수행해야 합니다. 기능 검증을 위해 특정 CDK1 억제제 및 인역학 돌연변이와 같은 다양한 도구를 사용할 수 있습니다. 단백질체에는 CDK1 기질이 많기 때문에 많은 인간 CDK1 기질이 발견되어야 하며, 체외 키나아제 분석은 이러한 부위를 식별, 매핑 및 검증하는 데 중요한 도구가 될 것입니다.

이러한 인산화 부위를 식별하면 CDK1이 세포주기를 제어하는 방법에 대한 기계론적 연구가 가능합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 in vitro kinase assay를 통해 CDK1 특이적 인산화 부위와 표적 단백질을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.