Name:  종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 학습하세요 Cdk1 특이적 인산화 부위를 식별하는 시험관 내 키나아제 분석법으로 세포 주기 조절 메커니즘을 규명하는 방법을 배우세요. 정제된 단백질을 사용하여 다양한 모델 생물에 적용 가능한 이 기법은 암 생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 질량 분석 분석 및 유용한 의견에 대 한 박사 데이비드 킹, 하 워드 휴즈 의학 연구소, 캘리포니아 대학 버클리를 감사합니다. 우리는 박사 Xuelian 주, 상하이, 생물 과학을 위한 학회, 과학의 중국 아카데미, 상하이, 중국 전체 길이 CENP F 구조를 제공 하기 위한 감사 합니다. 마지막으로, 우리는 감사 박사 수잔 베인 박사 브라이언 칼라, 빙 엄 턴 대학에서 박사 Christof Grewer 장비에 대 한 액세스. 이 연구는 뉴욕의 주립 대학 및 대학의 뉴욕 주립 빙햄 턴 화학과 연구 재단에 의해 투자 되었다.

저자는 공개 없다.

우리의 생체 외에서 니 분석 결과 세포 주기의 마스터 컨트롤러 및 많은 중요 한 세포질 과정을 조절 키 Cdk1를 위한 분자 표적을 식별 하는 매우 강력한 방법입니다. 메서드는 순화 된 단백질 Cdk1에 대 한 기판 이며 수 인 산화 특정 사이트의 경우 결정 합니다. 이 Cdk1 통해 인 산화에 의해 세포 프로세스의 규칙을 위한 기계 연구를 촉진 한다.
질량 분석에 의해 인 산화 위치의 성공적인 식별에 대 한 가장 중요 한 요소 니 분석 결과의 인 산화 효율입니다. 개별 사이트의 인 산화 효율 이어야 한다, 높은 선호 100%. 이 Cdk1/ B의 양을 증가 하 고 16 h 배양 시간에 의해 얻을 수 있습니다. 때 Cdk1/ B, 단백질과 사이트를 고려해 야 하는 인 산화 수의 어 금 니 농도의 양을 계산 합니다. 이것이 여러 인 산화 위치는 대상 단백질에 존재 하는 경우에 특히 중요 합니다. 그것은 상업 Cdk1/ B의 활동 배치에서 배치, 다 수 고는 키...

Kinases는 기판에 ATP에서 인산 염 그룹을 전송 하 고 많은 세포질 과정을 조절 하는 효소. 이 인 산화 되돌릴 수, 빠르고, 두 부정적인 요금을 추가 및 저장 자유 에너지, 하 고 셀에서 사용 하는 가장 일반적인 posttranslational 수정 중 하나입니다. Cdk1, 일컬어 세포 주기 단백질 2 체 (cdc2)는 모든 진핵생물1,2,3,,45, 세포 주기 위해 마스터 컨트롤러가 고 phosphorylates는 프로테옴6,7의 예상된 8-13%.
최근 proteomic 연구는 단백질, 대부분의 경우에서에 많은 인 산화 사이트를 확인 하는 동안 키 이러한 수정에 대 한 책임을 알 수 있다. 인간 세포에서 특히 알려진된 Cdk1 목표의 수는 낮은7. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법을 설정 하는 기계 론 적인 연구를 하면 그것은 중요 하다. 세포 주기 규칙은 충실 한 염색체 분리 및 세포 분열에 대 한 중요 한 그리고 세포질 과정의 무수 한이 중요 한 생리 기능을 지원 하기 위해 발생 해야 합니다. 전사와 유사 분열, 세포의 구조와 핵, 염색체 응축, mitotic 스핀 들 어셈블리의 분해 등의 조직에 극적인 개편의 발병 이전 번역 중단 포함 됩니다. 규제 완화와 이러한 프로세스에서 오류가 발생할 암, 출생 결함, 또는 mitotic 세포 죽음. RO-3306 같은 Cdk1의 특정 억제제 개발된8, 기능성 연구를 위한 강력한 도구를 제공 하는 되었고 이러한 억제제 중 일부는 현재 암 치료에 대 한 임상 시험 (검토를 위해9 참조).
여기, 우리가 시험관에서 키 분석 결과 Cdk1 관련 인 산화 위치의 식별 수 있도록 설명 합니다. 이 분석 결과에서 상용 인간 Cdk1/ B는 순화 대상 단백질에서 생체 외에서phosphorylate 데 사용 됩니다. 기판의 인 산화의 질량을 증가 하 고 추가 두 음 전; 따라서, 성공적인 인 산화는 SDS 페이지에 단백질 젤 밴드의 상승 교대에 의해 확인 된다. 인 산화 Cdk1 특정 사이트 이후 체 외에 phosphorylated 단백질의 질량 분석 분석에 의해 식별 됩니다. 실험적인 디자인으로 돕기 위해 우리는 또한 계산 도구와 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측에 대 한 참조를 검토 합니다. 또한, 우리는 또한 매우 순수 하 고 균질 단백질 준비 니 분석 결과 대 한 적합 한 생성 하는 정화 프로토콜 설명 합니다. 마지막으로, 기능 연구에 의해 확인 된 인 산화 사이트를 확인 해야 합니다 그리고 여기에 설명 된 간단한 바인딩 분석 결과 그 목적을 위해. 결합, 이것은 매우 강력한 접근 Cdk1 세포 주기7,,1011를 제어 하는 방법으로 기계 론 적인 연구를 가능 하 게 Cdk1 관련 인 산화 사이트를 생성. 이 메서드는 순화 된 단백질에 의존, 이후 모든 모델 유기 체 및 수율 신뢰할 수 있는 결과에 적용할 수 있습니다. 그러나, 취득된 인 산화 사이트에는 생체 외에서 의 기능 확인은 권장, 셀 추가 규제 메커니즘 posttranslational 수정, 상호 파트너 또는 셀룰러 지역화 같은 장소에는 인 산화 사이트 액세스할 수 또는 Cdk1에 의해 인식에 대 한 액세스할 수 없게 렌더링 수 있습니다.
Cdk1 어디 X 어떤 잔류물 이며 떠들고 또는 트레오닌 인 산화의 사이트 (Ser/Thr-프로-X-리스/Arg), 구성 된 합의 인 산화 사이트를 인식 합니다. 특히 중요 한 인식에 대 한 + 1 위치에 프롤린의 존재가입니다. + 2 또는 3 위치에 기본적인 잔류물을 선호 하는 또한, 대부분 Cdk1 관련 인 산화 사이트는 + 3에서 리스 또는 Arg를 포함 위치6,12.
Cdk1의 활성화 긴밀 하 게 규제 하 고 유사 분열1,2,3,,45의 발병에 연결 됩니다.  종속 kinases의 활동 일반적으로 진동 세포 주기13전역 수준에서 표현 되는 뚜렷한 cyclins ( A, B, C, D, 그리고 E 인간에서), 그들의 연관에 따라 달라 집니다. Cdk1는 일정 한 세포 주기 고  A와 B5,13,,1415로  규제 소 단위와의 연결에 의존 하는 그것의 활동의 규제 뿐만 아니라 포스트 번역 상 수정. Cdk1/ B 복합체의 형성이 키 니 아 제 활성화5,14,15,,1617,18에 대 한 필요 합니다. G2 단계  B는 cytosol에서 번역 및 그것은 Cdk15,14,15,16,,1718; 바인딩 핵을 가져올 그러나, Cdk1/ B 인간 Cdk1 억제 kinases Myt1에 의해 Thr14와 Tyr15 잔류물에 인 산화 (멤브레인 관련 티로신, 트레오닌-특정 cdc2 억제 키)와 Wee1, 각각19, 사 개최 20,21. 늦은 G2 단계에서 세포 분열 주기 25 인산 가수분해 효소 (cdc25)에 의해 Thr14와 Tyr15의 dephosphorylation Cdk1/ B 복합의 키 니 아 제 활동을 활성화 하 고 유사 분열12,14, 의 개시를 유발 18 , 20 , 22 , 23. Thr161 인 산화는 Cdk1/ B 활성화에도 필요 하 고 Cdk7, Cdk 활성화 키 (케이크)18에 의해 중재입니다.  B anaphase에의 생긴다 Cdk1을, 유사 분열24,25에서 출구를 허용. Cdk1/ B의 활성화는 따라서 복잡 한 과정입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 상용 Cdk1/ b 수행 곤충 세포에서이 복합물의 재조합 식 동안 활성화 된 vivo에서 생 kinases14,20 이며 순화 된 상태에서 활성 상태로 유지 합니다. 결과 활성화, 재조합 인간 Cdk1/ B는 생체 외에서 키 니 아 제 분석 실험에 적합 합니다.
여기, 우리는 인간의 centromere 단백질 F (CENP F)10Cdk1 관련 인 산화 위치의 식별에 대 한 프로토콜을 설명합니다. CENP-F는 대부분 interphase (g 1과 S 상)의 중 핵에 있는 g 2 단계26,27,28 , Cdk1 종속 방식으로10에 cytosol에 수출 하는 kinetochore 단백질 11. 핵 지역화26이 분 cNLS 의해 수 여. cNLSs 핵 전송 요소 karyopherin α karyopherin β 및 RanGDP, 핵29에 cNLS 화물의 수입 촉진에 의해 인식 됩니다. G2 단계에서 핵 수출10알 수 없는 수출 통로 통해 촉진 된다. CENP-F는 cytosol에 있는, 일단 핵을 모집 하 고 차례 차례로 모터 단백질 복잡 한 다30,31신병. 이 통로 mitotic 항목의 정확한 타이밍에 대 한 및 두뇌에 있는 근본적인 과정에 대 한 중요 한 다 종속 방식 mitotic 스핀 들 어셈블리의 초기 단계는 centrosome 각각 핵 위치 하는 것이 중요 하다 개발30,,3132. G 2 단계에서 시작 해 서, CENP-F 또한 조립 되는 kinetochore에 충실 한 염색체 분리27,28,,3334,35에 대 한 중요 한 역할을가지고 . 이 통로의 주요 규제 단계는 Cdk110,11에 따라 g 2 단계에서 CENP-F의 핵 수출 이다. 여기 CENP F. cNLS에 Cdk1-관련 인 산화 위치의 식별 프로토콜 설명 이 사이트의 Phosphomimetic 돌연변이 CENP-f, B Cdk1/ 직접 CENP-F의 그것의 cNLS10의 인 산화에 의해 세포 지역화 조절 제안 핵 가져오기 천천히.
전반적으로,이 생체 외에서 니 분석 결과 수 있습니다 특정 기판의 식별을 키 Cdk1 정화 대상 단백질 phosphorylated 생체 외에서 상용 Cdk1/ B 복합물 및 인 산화 사이트에 대 한 이후 질량 분석에 의해 식별 됩니다. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법을 계시 하는 기계 론 적인 연구를 지원 합니다.

<table><tbody><tr><td>2800 mL 당황 Fernbach 플라스크</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>골드 생명 공학</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>벤자미딘 염산염</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>병탑 필터</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 / cyclin B 재조합, human 20,000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (대체 소스)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (대체 소스)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B + 10x PK 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (residues 2987 &ndash; 3065) pGEX6P1 플라스미드</td><td>요청 시 사용 가능.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기: Heraeus Multifuge X3R, 냉각, TX-1000 스윙아웃 로터 포함</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>원심 필터 장치: Amicon Ultra-15 원심 필터 장치, 3kDa 컷오프, Ultracel-PL 멤브레인</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L 메티오닌</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td></td><td></td>125650010</tr><tr><td>탈염 피펫 팁: 지퍼 팁</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>일회용 크로마토그래피 컬럼, Econo-Pac 1.5 x 12cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS 균주</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>전기 분무 이온화 푸리에 변환 이온</td><td>Bruker 아마존</td><td>에이펙스 III</td><td></td></tr><tr><td>사이클로트론 공명 질량 분석기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기 분무 이온화 이온 트랩 질량 분석기</td><td>Bruker 아마존</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>고정 각도 로터: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC 시스템: &Auml; kta Pure FPLC</td><td>GE 헬스케어</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>젤 여과 컬럼: Superdex 200 증가 10/300 GL</td><td>GE 헬스케어</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온 아가로스</td><td>피어스</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온, 감소</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이션 쉐이커: 멀티트론 쉐이커</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈라크토피라노시드</td><td>골드 바이오테크</td>놀러지 <td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>골드 바이오테크</td>놀러지 <td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>카료페린 &알파; PET-28a 프레스 플라스미드</td><td>요청 시 이용 가능.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge 5418R, 냉장</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (0.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel 친화성 겔: His-Select Nickel 친화성 겔</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 플라스미드</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드</td><td>골드 생명공학</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS 프로테아제: PreScission 프로테아제</td><td>GE 헬스케어</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>포스 태그 아크릴아미드</td><td>Wako Pure Chem.</td> 공업<td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>감소된 글루타티온</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50G</td><td></td></tr><tr><td>라운드바텀 원심분리기 튜브(Oakridge 튜브)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>현장 지시 돌연변이 유발 키트: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>현장 지시 돌연변이 유발 키트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소파화기: Branson S-250D 소닉 화기</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC 투석 멤브레인 (6-8 kDa 컷오프)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>스윙 아웃 로터 TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

 종속 키 1 (Cdk1)는 모든 진핵생물의 세포 주기 위한 마스터 컨트롤러와 프로테옴;의 약된 8-13% phosphorylates 그러나, Cdk1, 특히 인간의 세포에에서 대 한 확인된 대상 수 여전히 낮습니다. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 중요 하다, 그들은 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법에 대 한 기계적 통찰력을 제공. 세포 주기 규칙 충실 한 염색체 분리에 대 한 중요 하 고이 복잡 한 과정에 결함 염색체 착오 및 암으로 이어질.
여기, 우리가 시험관에서 키 분석 결과 Cdk1 관련 인 산화 위치를 식별 하는 데 사용 되는 설명 합니다. 이 분석 결과, 순화 된 단백질은 phosphorylated 생체 외에서 상용 인간 Cdk1/ B. 성공에 의해 인 산화 SDS 페이지에서 확인 및 인 산화 사이트 이후 질량 분석에 의해 식별 됩니다. 우리는 또한 정화 프로토콜 간의 상호 작용을 조사 확인 된 인 산화 위치의 기능 검증에 대 한 키 니 아 제 분석 실험 및 바인딩 분석 결과 대 한 적합 한 매우 순수 하 고 균질 단백질 준비 항복을 설명합니다 클래식 핵 지 방화 신호 (cNLS) 그리고 그것의 핵 수송 수용 체 karyopherin α. 실험 설계와 투입, 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측에 대 한 접근 방법을 검토 합니다. 함께 이러한 프로토콜 Cdk1 전용 인 산화 사이트를 생성 하 고 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법으로 기계 론 적인 연구는 매우 강력한 접근 방식을 제공 합니다. 때문에이 메서드는 순화 된 단백질에 의존, 그것은 적용할 수 있습니다 어떤 모델 유기 체 및 수율 신뢰할 수 있는 결과에, 세포 기능 연구와 결합 하는 경우에 특히.

최근 포함 cNLS10CENP-F 조각에서 Cdk1 관련 인 산화 사이트를 식별 하는 생체 외에서 니 분석 결과 (그림 1) 사용 했습니다. 이 신호는 대부분의 interphase 동안 CENP F의 핵 지역화를 수 여. G2 단계에서 CENP F Cdk1 종속 방식에서 cytosol에 핵에서 수출 된다. Cdk1 CENP-F의 셀룰러 지역화를 조절 하는 방법에 대 한 기계적 통찰력을 얻으려면, 우리는 iGPS 서버36,37을 사용 하 여 CENP-F Cdk1-관련 인 산화 위치를 예측 하기의 순서 분석. CENP F cNLS, 내 세 Cdk1 관련 인 산화 사이트 예측 했다 3,042, 잔류물에서 3045, 및 3,048 (표 1</stro...

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

이 시험관 내 키나아제 분석의 전반적인 목표는 키나아제 사이클린 의존성 키나아제 1에 특이적인 관심 단백질에서 인산화 부위를 식별하는 것입니다. CDK1 특이적 인산화 부위의 식별은 CDK1이 세포주기를 제어하는 방법에 대한 기계론적 통찰력을 제공하기 때문에 중요합니다. 세포주기 조절은 위상 가득 찬 염색체 분리에 매우 중요하며 결함은 염색체 이상과 암을 유발합니다.이 기술의 주요 장점은 정제된 단백질에 의존하므로 모든 모델 유기체에 적용할 수 있으며 특히 세포의 기능 연구와 결합할 때 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법은 CDK1이 단백질체의 약 8-13%를 인산화한다는 사실에도 불구하고 알려진 CDK1 표적의 수가 여전히 적기 때문에 중요합니다. 이 방법은 CDK1 특이적 인산화 부위를 식별하지만, 정제된 인산화효소를 사용할 수 있는 경우 다른 인산화효소에 대한 인산화 부위를 식별하도록 수정할 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 높은 인산화 효율을 얻기 위해 각 단백질 표적에 대해 kinase 분석 조건을 최적화해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 가급적이면 100% IGPS 3.0 소프트웨어를 사용하고 웹 서버를 방문하여 CENP-F 표적 단백질 서열에서 CDK1 특이적 인산화 부위를 예측합니다. CDK1 합의 염기서열에 대해 인산화 부위를 확인합니다.사전 배양을 준비하여 단백질 발현을 시작합니다. 제조업체의 지침에 따라, 1 마이크로 리터의 발현 플라스미드를 50 마이크로 리터의 E.coli 수용 세포로 변환합니다. 플라스미드를 첨가한 후 얼음 위에서 30분 동안 세포를 배양합니다.그런 다음 섭씨 42도에서 45초 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 세포를 얼음 위에 1분 동안 놓고 세포에 LB 400마이크로리터를 첨가한 다음 흔들면서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양물을 배양합니다. 그런 다음 LB 한천 플레이트에 배양액 200마이크로리터를 플레이트하고 구성에 따라 관심 있는 항생제를 보충합니다.다음으로 섭씨 37도에서 12-20시간 동안 흔들지 않고 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 LB 한천 플레이트에서 콜로니를 선택하고 원하는 항생제 조합이 보충된 50ml의 LB 배지를 콜로니에 접종합니다. 섭씨 37도에서 배양하면서 12-20시간 동안 분당 160-180회 회전으로 흔듭니다.LB 매체 1리터에 항생제와 멸균 여과 포도당 용액 10중량 기준 40밀리리터를 추가합니다. 이 배지에 조밀하게 자란 배양 전 20 밀리리터를 첨가하십시오. 그런 다음 섭씨 37도에서 분당 160-180회 회전으로 흔들면서 배양을 배양합니다.일정한 간격으로 600나노미터에서 배양물의 흡광도를 확인합니다. 흡광도가 0.5 - 0.6에 도달하면 0.2 millimolar IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 3시간 동안 흔들면서 배양물을 배양합니다.3 시간 후에 4, 100 시간 G에 원심 분리에 의하여 그네 밖으로 회전자를 사용하여 4 섭씨 온도에 15 분 동안, 세포를 추수하십시오. 원심분리 후 상층액을 배출합니다. 세포 펠릿을 CENP-F에 대한 GST 결합 완충액 20ml에 재현탁하고 배양 1리터당 카료페린 알파에 대한 6개의 결합 완충액에 재현탁합니다.그런 다음 셀을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. CENP-F를 정제하려면 먼저 CENP-F 구조체로 세포를 해동합니다. 그런 다음 GST 바인딩 버퍼를 사용하여 부피를 20밀리리터로 조정합니다.부피가 조정되면 모든 환원제와 프로테아제 억제제를 차례로 첨가하여 후속 용해를 위해 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 유리 비커에 옮기고 비커를 얼음물 수조에 담그십시오. 그런 다음 문화를 음파화하십시오.초음파 처리 후 250 마이크로 몰 PMSF를 용해물에 첨가 한 다음이 단계에서 투명해야하는 용해물을 검사하십시오. 다음 12, 000에서 40, 4 섭씨 온도에 25 분 동안 000 시간 G에 용해물을 원심 분리하십시오. 다음으로, 일회용 크로마토그래피 컬럼에 2ml의 글루타티온 아가로스 1:1 슬러리를 첨가하여 컬럼을 준비합니다.컬럼을 평형화하려면 먼저 25ml의 초순수로 세척한 다음 25ml의 GST 결합 완충액으로 세척합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 디캔팅한 다음 0.2마이크로미터 타설 크기를 통해 상층액을 여과합니다. 다음으로 결합 단계를 위해 막힌 컬럼에 용해물을 붓습니다.컬럼을 덮고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양하면서 부드럽게 너트를 끼우고 거품이 생기지 않도록 합니다. 30분 후 컬럼을 랙에 옮기고 수지를 가라앉힙니다. 그런 다음 흐름을 수집하고 25ml의 GST 결합 버퍼로 컬럼을 두 번 세척합니다.세탁이 완료되면 컬럼을 다시 꽂습니다. 그런 다음 400마이크로리터의 GST 결합 완충액과 250마이크로리터의 PS 프로테아제 스톡을 밀리그램당 1000단위의 활성으로 컬럼에 추가합니다. 다시 컬럼을 덮고 컬럼을 부드럽게 소용돌이쳐 버퍼에 레진을 다시 현탁시킨 다음 컬럼을 섭씨 4도에서 16-20시간 동안 배양합니다.배양 기간이 끝나면 4ml의 GST 결합 완충액을 첨가하여 단백질 분해 절단된 컬럼에서 CENP-F 단편을 용리시킵니다. GST 태그를 용리하려면 열을 다시 꽂습니다. 그런 다음 글루타치온이 함유된 GST 용출 완충액 4ml를 컬럼에 추가합니다.그런 다음 바인딩된 GST 태그를 용리하기 위해 10분 동안 컬럼을 배양합니다. 10분 후 용리액을 수집합니다. 그런 다음 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 PS 프로테아제 및 글루타티온 용출 분획을 분석합니다.다음으로 단백질 샘플을 농축하기 위해 PS 프로테아제 용출액을 3킬로달톤 분자량 컷오프로 원심 필터 장치의 상부 구획에 용출합니다. 그런 다음 스윙 아웃 로터에서 섭씨 4도에서 10-15분 단위로 4, 100배 G로 용리액을 원심분리하여 샘플을 농축합니다. 각 증분 후에는 농도 구배가 형성되지 않도록 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 농도 필터의 단백질 샘플을 혼합합니다.겔 여과를 통해 CENP-F를 정제하려면 겔 여과 컬럼을 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 부착합니다. 다음으로, 하나의 컬럼 부피의 겔 여과 버퍼로 컬럼을 평형화합니다. 다음으로 CENP-F 단편을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 20분 동안 21, 700배 G로 원심분리합니다.원심분리가 끝난 후 컬럼에 샘플을 주입한 다음 겔 여과 버퍼로 컬럼을 용리시키고 CENP-F 단편의 0.6ml 분획을 수집합니다. 다음으로 겔 여과 프로파일을 분석하고 피크 분획물의 SDS-PAGE를 실행합니다. 순수 CENP-F를 포함하는 풀 분획.그런 다음 정제된 CENP-F 단편을 밀리리터당 3.3mg으로 농축합니다. 단백질 농도를 측정하려면 CENP-F 단편을 초순수로 1:100 비율로 희석합니다. 다음으로 분광 광도계에서 220에서 300 나노 미터 파장의 스펙트럼을 기록하십시오.다음으로 0.5ml 마이크로튜브에 정제된 CENP-F 50마이크로리터의 부분 표본을 준비한 다음 튜브를 액체 질소에서 급속 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 키나아제 분석을 위해 CENP-F 단편을 ATP 및 CDK1 cyclin B와 함께 0.5ml 마이크로튜브에 다른 완충액과 혼합합니다. 그런 다음 CDK1 cyclin B가 없는 두 번째 샘플을 음성 대조군으로 준비합니다.그런 다음 섭씨 30도의 수조에서 1-16시간 동안 샘플을 배양합니다. 질량 분석법으로 인산화 부위를 성공적으로 식별하기 위해서는 인산화 효율이 가능한 한 높고, 바람직하게는 100%인산화 효율을 높이려면 더 많은 키나아제를 추가하고 배양 시간을 16시간으로 늘리는 것이 중요합니다. 그런 다음 동일한 부피의 6몰 구아니딘 염산염 용액을 나머지 키나아제 분석 반응 및 음성 대조군에 추가하고 질량 분석을 수행하여 인산화 부위를 식별합니다.고품질 질량 분석 데이터를 얻으려면 정제된 단백질 샘플이 매우 순수하고 균질해야 합니다. 먼저 SDS-PAGE 분석이 수행되어 CDK1이 없는 음성 대조군과 비교하여 인산화된 CENP-F에 대한 겔의 밴드가 명확하게 상향 이동하여 CENP-F의 cNLS가 CDK1 기질임을 나타냅니다. 다음으로 CENP-F 인산화 부위의 수와 효율을 분석하기 위해 질량 분석이 수행됩니다.온전한 체외 인산화된 CENP-F의 ESI 이온 트랩 질량 스펙트럼은 5개의 피크가 있음을 보여주며, 이는 4개의 인산화 부위를 나타내고 5번째 피크는 인산화되지 않은 단백질입니다. 다음으로, 이 크기 배제 용리 프로파일은 카료페린 알파 피크의 용출 부피가 야생형 CENP-F를 추가할 때 더 높은 질량으로 이동함을 보여주며, 이는 CENP-F 돌연변이를 추가할 때 관찰되지 않습니다. 이는 CENP-F의 인광 버전 S3048D가 CENP-F cNLS와 카료페린 알파의 상호 작용을 약화시킨다는 것을 나타냅니다.마지막으로, SDS-PAGE 분석이 수행된 결과 cNLS가 손상되지 않은 야생형 CENP-F 단편이 카료페린 알파와 공핵되어 강한 상호 작용을 나타내는 것으로 나타났습니다. 그러나 CENP-F와 카료페린 알파의 S3048D 돌연변이는 별도의 피크에서 용리됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 얻어진 인산화 부위를 CDK1 합의 인산화 서열에 대해 확인하고 식별된 기질이 CDK1과 동일한 세포 구획에 국한되어 있는지 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 확인된 인산화 부위가 생리학적 기능을 가지고 있는지 확인하기 위해 세포 또는 동물 모델에서 기능 검증을 수행해야 합니다. 기능 검증을 위해 특정 CDK1 억제제 및 인역학 돌연변이와 같은 다양한 도구를 사용할 수 있습니다. 단백질체에는 CDK1 기질이 많기 때문에 많은 인간 CDK1 기질이 발견되어야 하며, 체외 키나아제 분석은 이러한 부위를 식별, 매핑 및 검증하는 데 중요한 도구가 될 것입니다.이러한 인산화 부위를 식별하면 CDK1이 세포주기를 제어하는 방법에 대한 기계론적 연구가 가능합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 in vitro kinase assay를 통해 CDK1 특이적 인산화 부위와 표적 단백질을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본...

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

여기에서는 (세포주기) 키나아제의 미토콘드리아 국소화를 연구하는 방법과 미토콘드리아 아래 위치 및 잠재적인 미토콘드리아 기질/표적을 결정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 단백질을 미토콘드리아로 강제 발현하는 것은 관심 단백질의 미토콘드리아 국소화의 기능적 결과를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

모 세관 전자 초점 단백질과 매우 작은 생물 학적 샘플에서 그들의 isoforms의 상세한 특성을 사용 하는 항 체 기반, 磁, 높은 처리량 기법입니다. 다음 자동화 하 고 운반할 방식 검색 및 특정 단백질과 그들의 isoforms의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

단백질 및 모 세관 전자 초점 방법으로 그들의 Isoforms의 매우 민감하고 정량적 검출

이 프로토콜의 목적은 레이블, 풍부, 및 단백질 키 니 아 CK2 세포 lysate 또는 조직 homogenate 같은 복잡 한 생물학 견본에서의 기판 확인 하는 것 이다. 이 메서드는이 목적을 위해 CK2 생물학의 독특한 측면을 활용합니다.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

본 프로토콜은 뉴런 K-Cl 공동 수송체 KCC2의 기능 및 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다. 상기 프로토콜은 웨스턴 블로팅을 통한 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서의 KCC2 인산화의 조사를 기술한다. 또한 KCC2 활성을 확인하는 추가 방법이이 텍스트에서 간략하게 강조 표시됩니다.

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

학습하세요 Cdk1 특이적 인산화 부위를 식별하는 시험관 내 키나아제 분석법으로 세포 주기 조절 메커니즘을 규명하는 방법을 배우세요. 정제된 단백질을 사용하여 다양한 모델 생물에 적용 가능한 이 기법은 암 생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

더 많은 동영상 탐색