식물 감염 테스트: 스프레이 식물 병원 체 Magnaporthe Grisea 와 상처-중재 접종

이 비디오는 식물 병원균 Magnaporthe grisea에 대한 무료 및 원함 매개 접종과 같은 식물 감염 분야의 주요 방법을 교육하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분무, 상처 프로토콜이 곰팡이 분리물의 병원형을 빠르고 정확하며 대규모로 스크리닝하는 데 기여한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 대규모 식물 질병의 예방 및 통제에 매우 중요하기 때문에 식물 병원체와 싸우기위한 생리학 연구와 관련이 있습니다.

이 방법은 곰팡이의 보존 병원성 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 밥 보리와 같은 농업 식물의 주요 다양성에 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 멸균된 면봉으로 분생포자를 부드럽게 긁어내기가 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법의 시연은 잎을 관통하지 않고 긁힌 상처를 모으는 것이 중요한데, 이는 분리된 벼나 보리 잎의 주요 수단이 어렵기 때문입니다. 시작하려면 오트밀 30-50g의 무게를 잰다. 증류수 800ml에 오트밀을 넣고 전기 냄비에서 30분 동안 끓입니다.

다음으로 삶은 오트밀 혼합물을 거즈 조각을 통해 비커에 걸러냅니다. 그런 다음 비커에 토마토 주스 150ml와 한천 20g을 넣는다. 비커에 증류된 탈이온수를 최대 1000ml까지 추가합니다.

쌀 씨앗 약 50개를 증류수 탈이온수에 3일간 담근 후 촉촉한 거즈로 싸서 페트리 접시에 담가 촉촉한 여과지에 발아시킵니다. 다음으로 오토클레이브 화분용 흙이 있는 화분에 묘목을 심습니다. 물을 준 후 묘목을 질석 층으로 덮습니다.

1-2주 동안 섭씨 25도로 유지되는 유리 집에 묘목을 놓습니다. 그런 다음 멸균 수술 용 가위를 사용하여 3 층의 여과지를 8cm 원으로 자릅니다. 여과지 원을 100mm 멸균 플라스틱 플레이트에 놓습니다.

여과지가 적실 수 있을 만큼만 각 접시에 증류된 탈이온수를 추가합니다. 그런 다음 각 배양 접시에 2-3cm 간격으로 두 개의 멸균 이쑤시개를 놓습니다. 파종 2주 후 줄기의 아래쪽 부분을 잘라 벼 식물의 잎을 수집합니다.

온도 조절 인큐베이터 배양을 사용하여 M.grisea는 섭씨 25도의 OTA 플레이트에서 4일 동안 변형됩니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 각 플레이트에 2ml의 증류수 탈이온수를 추가합니다. 접종 루프를 사용하여 야생형과 돌연변이 균주의 균사체를 긁어내어 균사체 파편으로 넣습니다.

균사체 파편을 모아 새 OTA 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 깨끗한 벤치에서 균사체 찌꺼기를 말리십시오. 배양된 균사체 접시에 증류수 2ml를 넣고 멸균 면봉을 사용하여 분생포자를 부드럽게 긁어냅니다.

두 겹의 렌즈 종이를 통해 분생포자 현탁액을 필터링하고 현탁액을 새 50mm 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 5000 회 g으로 5 분 동안 원심 분리합니다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 펠릿을 Tween-20 용액으로 다시 현탁시켜 밀리리터당 20,000 분생포자 농도를 생성합니다.

현탁액을 휴대용 분무기에 붓고 약 10ml의 원추형 현탁액을 2주 된 벼 식물의 잎에 뿌립니다. 대조 식물의 잎에 Tween-20 용액을 뿌립니다. 그 후, 어둡고 습한 상자에서 잎을 24시간 동안 배양합니다.

그런 다음 잎을 형광등이 있는 축축한 챔버로 12시간 동안 옮깁니다. 해부학적 바늘을 사용하여 분리된 벼잎의 주요 정맥에 있는 2-3cm 길이의 상처 3개를 긁어냅니다. 긁어낸 잎을 이쑤시개에 놓고 Tween-20 용액을 뿌립니다.

다음으로, 각 M.grisea 균주를 포함하는 OTA 플레이트에서 반 x 반 센티미터의 균사체 플러그를 자릅니다. 상처 입은 잎에 플러그를 꽂고 섭씨 25도의 습한 방에서 3일에서 8일 동안 배양합니다. 잠복기가 끝나면 International Rice Research Institute에서 제공하는 채점 시스템에 따라 병변을 검사하고 평가합니다.

마지막으로 감염된 잎의 사진을 찍어 테스트된 균주의 감염성을 평가합니다. 이 프로토콜에서는 M.grisea 균주 P131 및 Com1을 사용한 식물 감염 분석을 감수성이 있는 벼 묘목에 대해 수행했습니다. P131을 접종한 야생형 잎은 벼 돌풍의 전형적인 견고한 병변을 나타냈습니다.

그러나 Com1을 접종한 잎은 명백한 감염 결함을 보였으며 완전한 감염을 유발하지 않았습니다. M.grisea가 상처를 통해 숙주 세포를 감염시킬 수 있는지 확인하기 위해 야생 식물의 마모된 잎에 균사체 플러그 또는 원추체 방울을 접종했습니다. 스프레이를 접종한 잎은 감염 결함을 나타내지 않았습니다.

대조적으로, 균사체 플러그를 통해 접종된 잎은 명백한 결함을 보였습니다. 이 절차를 시도하는 동안 분리된 벼잎의 주요 혈관에 있는 2-3cm 길이의 상처 3개를 긁어내는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 작물 질병 저항성을 식별하고 분석하기 위해 병원체 접종과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 식물 병원체 분야의 연구자들이 현대 유기체에서 벼 돌풍병을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. Magnapor로 작업하는 것은 위험 할 수 있으며 이러한 절차를 수행 할 때 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.