Name: 생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 배우세요 인간 자궁내 막 기질 세포를 생체 외에서 고립하고 호르몬 처리로 인공 탈락화를 유도하는 방법을. siRNA 유전자 녹다운 기법을 활용하여 탈락화의 분자 메커니즘과 특정 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.

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저자는 공개 없다.

세인트 루이스, 산부인과 학과에서 워싱턴 대학에서이 연구를 위해 수집 하는 모든 인간의 endometrium biopsies 달성 했다 고 부인과 기관 검토 위원회 (IRB)를 사용 하 여 서 면된 동의서를 승인.
1입니다. 준비
<ol><li>100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스 미디어 포함 병 (HBSS + 매체 추가 참조)에 추가 하 여 1 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 500 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>Dulbecco의 수정이 글 중간의 500 mL를 준비: 페 놀 레드, L-글루타민와 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 1% 항생제 antimycotic 솔루션 (최종 농도 추가 하 여 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F12) 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 그리고 0.25 µ g/mL Fungizone) 병 (HESC 절연 매체로 참조 추가)를 포함 하는 미디어를.</li>
	<li>10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 x 나2HCO3및 1%를 추가 하 여 페 놀 레드, L-글루타민와 15 mM HEPES DMEM/F12의 500 mL를 준비 페니실린 (10000 U/mL)와 스 (10000 µ g/mL) (펜 Strep) 미디어 (추가 병 포함 HESC 미디어로 참조).</li>
	<li>2%의 감소 혈 청 L-글루타민, 2.4 g/L 나트륨 중 탄산염와 HEPES 500 mL를 준비 숯 박탈 태아 둔감 한 혈 청 (csFBS)와 1% 펜 Strep 병 (Decidualization 미디어 추가 참조)를 포함 하는 미디어.</li>
	<li>페 놀 레드 숯불 2%를 추가 하 여 무료 DMEM/F12 (더 변경 미디어 참조) 병을 포함 하는 미디어에 소 태아 혈 청 (csFBS) 박탈의 500 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>10 nM estradiol (e 2), 1 µ M medroxyprogesterone 아세테이트 (MPA), 및 15 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 튜브, 50 µ M 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 준비 하 고 이전 준비 decidualization 미디어 생체 외에서 의 잘 약 수 당 2 mL에 추가 decidualization 분석 결과 (EPC 미디어 추가 참조).</li>
	<li>50 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 튜브 (고정 미디어 추가 참조)에서 90 %FBS 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 미디어를 동결을 준비 합니다.</li>
	<li>전 콜라와 DNase의 5 mg 25 밀리 그램 무게 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에-20 ° c.에 게 나</li>
</ol>2. 인간의 Endometrium 생 검 획득
<ol><li>HBSS에 IRB 승인 클리닉에서 생리 주기의 증식 단계 (하루 9-12 일)에서 수집 된 인간의 endometrium 생 샘플을 가져옵니다.</li>
	<li>Prewarmed 37 ° C HBSS + 매체 1 mL와 함께 생 검 견본을 세척 하 고 부드럽게 흔들어 과잉 혈액을 제거 하 고 점액.</li>
</ol>3. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC)의 절연
참고:이 격리 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.
<ol><li>포함 된 10 mL 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 관으로 소독된 겸 자 생 검 전송 신선한 HBSS.</li>
	<li>90 x 500g에 실 온에서 생 검 원심 s.<ol>
<li>셀 펠 릿 파열 90 2000 x g에 생을 다시 회전 경우 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL를 피펫으로 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 37 ° C의 10 mL로 씻어 HESC 격리 미디어 500 x 90 g에서 원심 분리 뒤 prewarmed s.</li>
	<li>1 mL 피펫으로 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 적극적으로 생 검 꺼내 려 신선한 HESC 격리 미디어의 3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>HESC 격리 미디어의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 생 검을 가만히 따르다.</li>
	<li>약 20 분 동안 #5 집게와 좋은 스트레이트 스티치가 위를 사용 하 여 가능한 작은 조각으로로 생을 말하다.</li>
	<li>DNase 준비 나 하 고 미리 무게 DNase를 HESC 격리 미디어의 10 mL를 추가 하 여 콜라 효소 나 (0.5 mg/mL)와 콜라 (2.5 mg/mL). 피펫으로 믹스.</li>
	<li>피 펫 1 mL를 피펫으로 새로운 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브로 사용 하 여 조직 샘플을 잘라. HESC 격리 미디어의 7 mL로 세척 하 고 전체 샘플 얻으려고 폴 리 프로필 렌 튜브에 추가.</li>
	<li>2 분에 대 한 원심 분리기 샘플 800 x g에 실 온에서 부드럽게 피 펫은 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>어 0.2 µ m 필터를 통해 콜라 솔루션 10 mL 주사기 펠 릿에 직접에 연결 하는 DNase를 필터링 합니다.</li>
	<li>10 소용돌이 펠 릿 resuspend s.</li>
	<li>1.5 h에 대 한 37 ° C 물 목욕, vortexing 10에 대 한 다이제스트의 조직 소화 될 때까지 철저 하 게 모든 10 분.</li>
	<li>필터 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플 상피 세포와 조직 파편을 제거 하는 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 쌓입니다. 참고: Stromal 세포 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 2.5 분 800 x g에서 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 원심 부드럽게 1 mL 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>HESC 격리 미디어 10 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심. 상쾌한, 발음 하 고 혼합 HESC 미디어 정방향 및 역방향 피 펫의 6 mL에 셀 resuspend.</li>
	<li>천천히 밀도 그라데이션 미디어 레이어를 혼합 하지 않도록 주의 되 고 stromal 세포에서 남아 있는 혈액 세포를 분리 하는 resuspended 세포를 3 mL에 레이어.</li>
	<li>실 온에서 30 분 400 x g에서 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 원심</li>
	<li>새로운 50 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 상쾌한의 5 mL을 수집 하 고 셀을 resuspend 하는 추가 5 mL HESC 미디어 추가.</li>
	<li>실내 온도에, 뒤에 상쾌한의 제거 및 추가 6 mL HESC 미디어의 2.5 분 800 x g에서 원심. 소용돌이 10 s를 pipetting으로 혼합 샘플 앞으로 반전 5 번.</li>
	<li>Aliquot 10 µ L 셀 개수에 대 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 다시 일시 중단 된 세포의.</li>
	<li>0.4 %Trypan 푸른 얼룩 약 수를 셀을 피펫으로 믹스의 10 µ L를 추가 합니다. 약 수의 10 µ L을 로드 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>15 mL HESC 미디어에서 총 세포 수에 따라 적절 한 플라스 크에 세포 격판덮개<ol>
<li>셀의 총 수 1 백만 보다는 더 적은 인 경우에, 25 cm 플라스 크에 있는 모든 셀 HESC 미디어의 6 mL 접시. 경우 셀의 총 수는 1 백만 이상, 75 cm 플라스 크에 있는 모든 셀 HESC 미디어의 15 mL 접시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>문화는 5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 최소 6 h 적절 한 세포 접착을 보장 하는 HESC 미디어는 미디어 변경에 대 한 셀.</li>
	<li>37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 격리 HESC 세포 형성 단층 도금된 플라스 크에 80-90 %confluency 달성 될 때까지 3-5 일의 기간에 대 한 문화.</li>
	<li>HESC 미디어 매 2 일 변경.<ol>
<li>15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.</li>
		<li>플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).</li>
		<li>80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HESC 되 면 80-90% 합칠, 전송 셀 75 cm 플라스 크를 25 cm 또는 한 75 cm 플라스 크에서 세 75 cm 플라스 크. 참고: HESC 냉동 고 미래 실험을 위해이 이번에 최신 사용을 위해 저장 될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 중지 및 재개 HESCs
<ol><li>75 cm 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>세포는 플라스 크에서 빠질 때까지 37 ° C에서 2-3 분 5% CO2 배양 기에서 품 어.</li>
	<li>앞으로 역 HESC 미디어와 pipetting으로 잘 섞어 7 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>800 x g 2.5 분에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
	<li>레이블 셀 라인, 날짜, 및 통로 수 튜브를 동결.</li>
	<li>다시 미디어를 동결의 5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>-80 ° C 냉장고를 각 튜브 및 전송 관에 다시 중단된 HESC의 aliquot 1 mL.</li>
	<li>24 시간 이내에 액체 질소를 튜브를 전송 합니다. 참고: 즉시 미래에 있는 세포를 해 동 계획 저장 냉동된 셀-80 ° C에서 한 달 동안.</li>
	<li>녹고 있는 HESCs 대 한 HESC 미디어 20 분 예 열.</li>
	<li>25 cm 플라스 크를 데워 HESC 미디어의 8 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>액체 질소 탱크 또는-80 ° C에서 냉동 관을 검색 하 고 세포를 해 동 1-2 분 동안 37 ° C 물 목욕에서 튜브 잠수함.</li>
	<li>해 동된 HESC HESC 미디어 25 cm 플라스 크를 전송 하 고 37 ° c.에 하룻밤 5% CO2 배양 기에서 품 어</li>
	<li>다음 날, HESC 미디어를 변경 하 고 2-3 일 HESC confluent 되 고 아래에 설명된대로 프로토콜 5 75 cm 플라스 크에 세포를 전송 될 때까지 기다립니다.<ol>
<li>15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.</li>
		<li>플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).</li>
		<li>80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 경작
참고:이 Culturing 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.
<ol><li>20-30 분 물 목욕에서 37 ° C에서 사전 열 HESC 미디어.</li>
	<li>플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 0.25% Trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (1 개 mL를 추가 25 cm 플라스 크 또는 75 cm 플라스 크 2 mL).</li>
	<li>셀 꺼내 때까지는 5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 2-3 분 동안 품 어.</li>
	<li>부드럽게 플라스 크 벽 꺼내 나머지 셀을 누릅니다. 앞으로 역 HESC 미디어와 pipetting으로 잘 섞어 7 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>피펫으로 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 및 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심 분리기로 셀 혼합물.</li>
	<li>발음은 상쾌한 고 다시 셀 펠 릿 HESC 미디어에서 일시 중지.<ol>
<li>25 cm 플라스 크 또는 45 mL 플라스 크 75 cm (각 15 mL)에 대 한 15 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 25 cm 또는 75 cm 플라스 크에 각각 5 mL 또는 15 mL 셀 정지를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 격리 HESC 세포 형성 단층 도금된 플라스 크에 80-90 %confluency 달성 될 때까지 3-5 일의 기간에 대 한 문화.</li>
	<li>HESC 미디어 매 2 일 변경.<ol>
<li>15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.</li>
		<li>플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).</li>
		<li>80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 도금 및 siRNA Transfection
참고:이 transfection 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.
<ol><li>75 cm 플라스 크에서 HESC 미디어를 발음 하 고 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>셀을 꺼내 때까지 2-3 분 동안 37 ° C에서 5% CO2 인큐베이터에서 품 어.</li>
	<li>일단 세포는 플라스 크에서 빠질 HESC 미디어의 7 mL를 추가 하 고 앞으로 pipetting으로 부드럽게 혼합 역 5 번.</li>
	<li>피펫으로 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 및 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심 분리기로 셀 혼합물. 발음은 상쾌한 고 다시 HESC 미디어 10 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단. 참고: 둘 이상의 플라스 크에서 셀 도금, 경우 단순히 HESC 미디어 볼륨 증가.</li>
	<li>Hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.<ol>
<li>Aliquot 10 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 다시 일시 중단 된 세포의.</li>
		<li>0.4 %Trypan 파랑 셀 aliquot 얼룩 및 앞으로 pipetting으로 혼합 및 반전의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6 잘 플레이트에 잘 당 0.8 x 10 접시5 셀. 이틀 후, 셀 최적의 transfection에 대 한 60-70% 합칠 이어야 한다.</li>
	<li>각 siRNA transfection 샘플에 대 한 단지 transfection 시 약에 siRNA (60 nanomoles)를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>Transfection 시에 감소 된 혈 청 자유로운 미디어의 150 µ L의 5 µ L를 희석 하 고 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>감소 된 혈 청 자유로운 미디어의 100 µ L에 siRNA의 60 nanomoles 희석 하 고 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>5 분 후 희석된 transfection 시 솔루션 희석된 siRNA를 결합 하 고 앞으로 pipetting으로 부드럽게 혼합 5 번 역. 참고: 하나 이상의 siRNA에 여러 우물을 transfecting, 준비 10 mL에 마스터 믹스 폴리스 티 렌 튜브.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 siRNA transfection 시 약 단지를 품 어.</li>
	<li>이 부 화 하는 동안 각 잘을 변경 미디어의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>외피의 5 분 후 솔루션을 수집 하 여 siRNA transfection 시 약 단지의 250 µ L 각 잘 셀 및 미디어를 포함을 추가 2 분 동안 500 x g에서 튜브 원심.</li>
	<li>락을 부드럽게 혼합 하 고 37 ° c 5 h 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.</li>
	<li>5 h 후 HESC 미디어 미디어 변경 합니다.</li>
	<li>생체 외에서 decidualization 분석 결과 대 한 준비에 2 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.</li>
</ol>7. 생체 외에서 Decidualization 분석 결과
참고:이 분석 결과 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.
<ol><li>Camden 외 에 설명 된 대로 생체 외에서 decidualization 치료를 시작 하기 전에 EPC 미디어 준비 3 (1.6 참조).</li>
	<li>게시물 48 시간 단계 6.16에서에서 incubated HESC의 transfected 라인에서에서 미디어 발음</li>
	<li>각 우물에 EPC 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다. 참고:로 컨트롤을 두고 한 일련의 셀의 EPC 미디어와 치료. 대신, 컨트롤 우물에 HESC 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>6 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.<ol>
<li>EPC 미디어 48 시간 마다 변경 됩니다.<ol>
<li>따뜻한 고 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 EPC 미디어를 준비 합니다.</li>
			<li>우물에서 미디어를 발음 하 고 신선한 EPC 미디어를 추가 합니다.</li>
			<li>37 ° c.에 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 놓습니다</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>6 일 후 (아래와 같이) ELISA와 qRT-PCR을 통해 stromal 세포 decidualization의 정도 분석 합니다.</li>
</ol>8. 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사
참고: qRT-PCR Kommagani 외10에 앞에서 설명한 완료 됩니다.
<ol><li>상용 RNA 격리 키트에서 프로토콜을 활용 하는 HESC에서 총 RNA 격리 합니다.<ol>
<li>RNA의 양과 순도 (는260/A280) 가르시아-일 라이 어스 외15에 설명 된 대로 NanoDrop 또는 유사한 방법론을 사용 하 여 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상업적으로 이용 가능한 반전 녹음 방송 키트 프로토콜을 통해 총 RNA의 1 µ g에서 cDNA를 음성 합성.</li>
	<li>상용 qRT-PCR 키트 프로토콜에 설명 된 대로 qRT-PCR 반응을 실행 합니다.<ol>
<li>상업적으로 사용 가능한 실시간 PCR 주인 혼합을 사용 하 여 반응을 수행 하 고 내부 시스템 컨트롤 (18s, PRL및 IGFBP1) 함께 특정 유전자 프로브.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. ELISA를 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사
<ol><li>계량 상용 Prolactin ELISA 키트를 활용 하 여 조직 문화 매체에서 secreted Prolactin 수준.</li>
</ol>10. Phalloidin 얼룩을 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사.
<ol><li>12 잘 플레이트의 각 음에 살 균 coverslips를 삽입 합니다.</li>
	<li>6.1-6.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>12 잘 플레이트의 당 0.8 x 10 접시5 셀.</li>
	<li>2 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.</li>
	<li>미디어 발음</li>
	<li>7.3-7.4 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>30 분 동안 실내 온도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 셀을 수정.</li>
	<li>고정 솔루션을 발음 하 고 3 시간 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 씻어.</li>
	<li>침투성 증가 고정된 셀에 5 분에 대 한 PBS에 0.1% 비 이온 계면 활성 제 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octyl 페 닐 에테르를 추가 합니다.</li>
	<li>5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 3 번 세척.</li>
	<li>Phalloidin 솔루션 coverslip 당 100 µ L을 추가 하 고 90 분 동안 실 온에서 품 어.<ol>
<li>5 µ L 당 1 단위에서 phalloidin 재고 솔루션을 사용 하 여 PBS에 1: 100 희석을 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 3 번 세척.</li>
	<li>설치 매체를 포함 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)와 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	<li>Confocal 현미경을 이용 하 여 세포를 관찰 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Maruyama, T., Yoshimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+for+differentiation+and+regeneration+of+the+uterine+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium.</a> Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+Stromal+Decidualization+Responds+Reversibly+to+Hormone+Stimulation+and+Withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal.</a> Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).</li>
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</ol>

이 작품은 여에서 국립 보건원 (NIH) 자금 지원/아동 건강과 인간 발달 (NICHD) 그랜트 (R00 HD080742)와 워싱턴 대학의과 대학 시작의 국립 연구소 R.K.에 자금 우리는 워싱턴 대학 불 임 클리닉 자궁내 막 생 검 견본을 제공 하기 위한 감사 하 고 싶습니다.

여성 생식 생리 주기는 라운드, 상피 같은 분 비 세포3,8에 ESC의 decidualization를 유도 함으로써 상승 luteal 단계 내내 황 체 호르몬 수준에 의해 특징입니다. Decidualization의 개시는 종 의존. 인간에서는, decidualization 발생 합니다 자연 호르몬 농도의 증가 따라 쥐 해야 blastocyst 존재10,11. Decidualization에서의 이러한 불일치는 인간의 세포에 세포 분화의 변환 혜택을 예로 보여주. 1 차 세포 배양을 통해 생체 외 분석 실험 호르몬4,,610통해 decidualization의 ...

Menarche의 단계와 폐 경, 생식 연령의 여성 호르몬 규제 자궁내 막 증식, 차별화, 임신 생리1 이라는 프로세스에 대 한 준비에 후속 흘리기의 월별 주기 받아야 ,2. 인간의 endometrium의 실제 수정 등은 자 궁 벽1에 적절 한 배아 이식 필요 합니다. 난소 스테로이드 호르몬 에스트로겐과 황 체 호르몬 (P4)를 통해 생리 주기 변경 endometrium, 형태학 및 생화학 적인 적응을 포함 하 여의 중재는3,,45. 증식 (follicular) 단계 내 preovulatory 에스트로겐 수준의 증가, endometrium 두껍게 시작. 배 란, 다음 분 비 (또는 luteal) 단계 반올림, 상피 같은 decidual 셀 구와 같은 모습에서 자궁내 막 기질 세포 (ESC)의 형태학 상 변화를 유도 하는 P4 농도에 상당한 증가 촉진 decidualization4,6로 알려진 프로세스. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산4,,78에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 진단과 초기 임신 손실의 처리에 유리 하다.
현재, 자궁내 막 기질 세포에서 decidualization의 기본 효과 탐험 여러 방법론 활용 됩니다. Vivo에서, 마우스 궁 기계적 자극 (즉,긁 적)를 통해 decidualization에 대 한 인위적으로 유도 될 수 있다 또는 기름9hormonally 끝났다 자 궁 주입. 다른 인간,이 합성 자극 blastocyst 존재, 설치류10,11decidualization의 개시에 필요한 단계의 모양을 제공 하 여 자 궁 루멘의 분화를 촉진 합니다. 따라서, 동물 모델 및 인간에서 vivo에서 기반 연구를 둘러싼 윤리적 딜레마와 관련 된 변환 합병증으로 인해 decidualization 기반 모델은 가장 성공적으로 공부 생체 외에서.
이 연구에서 과목 두 지역 영어와 스페인어 신문에서 광고의 배치를 통해 채용 됩니다. 과목이이 연구에 대 한 적합 한 후보자로 식별 되는 가져온 연구 코디 네이 터, 잠재적인 위험의 전체 공개 토론 된다와 나. 관련 된 잠재적인 위험에 대 한 완전 한 이해의 확인, 과목의 동의 서 면과 구두 모양에서 달성 했다. 주제 동의 (1) 받을 미래 연구 목적을 위해 그들의 조직의 정 (2) 장기 저장 (3) 수집 된 조직 표본에서의 기본 문화 창조에 동의 하는 권한이 포함 됩니다. 동의 다음 과목 인종/민족성의 비공개에 대 한 권리는 허용 된 자가 식별에 완료 하는 폼을 받는다. 후속 방문 endometrium 생의 생리 주기에 따라 달성 예정 이다. 이 연구에 모집 하는 자원 봉사자로 2012 인구에 의해 문서화 세인트 루이스 수도권의 민족과 인종 인구를 반영 하 고 임산부, 태아, 태아를 포함 하 여 모든 취약 한 주민들의 참여를 포함 하지 않았다 나이, 또는 다른 취약 한 그룹의 18 세 미만 어린이. 생 검 샘플 컬렉션에 참여 하기 위한 자격 요건 포함 (1) 일반 생리 주기 (25-32 일) (3) 현재 임신 이나 호르몬 자궁내 장치 피임약의 사용 하는 데는 데 18-45 년 (2)의 나가 사이 되 고 현재 질 감염이 나 성병 (5) 없는 현재 항생제 치료와 (6) 등록 (4) 전 30 일에 대 한 없음 현재 비정상적인 경부 데.
이 연구에서 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 배양 하 (estradiol (e 2), medroxyprogesterone 아세테이트 (MPA), 및 순환 아데노신 호르몬의 보충을 통해 생체 외에서 decidualization을 인위적으로 유발 monophosphate (캠프)) 매체에. 이 방법에서는, decidualization의 정도 호르몬 치료의 일의 총 수에 따라 변경 됩니다. Cytoskeletal 재배치와 함께, 호르몬 보충 decidual 세포 분 비 같은 자질2,4를 경험 하는 생 화 확 적인 적응을 유도 합니다. Prolactin (PRL)와 인슐린 같은 성장 인자 의무적인 단백질 1 (IGFBP1), 같은 각 인 유전자의 표정은 확인 하 고 계량 HESC decidualization5,12, 의 정도를 이용 될 수 있다 13 , 14. 중요 한 것은,이 프로토콜을 유전자 특정 최저 생존도 시연 했다.

<table><tbody><tr><td>Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>탈이중화 매체용</td></tr><tr><td>DMEM / F12 (1:1) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>세포 계수용</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183018A</td><td>RNA 분리/정제용</td></tr><tr><td>TaqMan 2X Universal PCR 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td>4374967</td><td></td></tr><tr><td>진핵생물 18S rRNA 내인성 대조군</td><td>생명 기술</td><td>4319413E</td><td>qPCR 내부 대조군</td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 분석 Prolactin 프로브 qPCR</td><td>내부 대조</td><td></td>군 TaqMan 유전자 발현 4331182 <td>Applied Biosystems</td></tr><tr><td> 분석 IGFBP1 프로브</td><td>응용 바이오 시스템</td><td>4331182</td><td>qPCR 내부 제어</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488 시약 - CytoPainter</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>인간 프로락틴 ELISA 키트</td><td>Invitrogen</td><td>EHIAPRL</td><td></td></tr><tr><td>16 % 파라 포름 알데히드</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>고정</td></tr><tr><td>리포 펙타민 RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>숯 박탈 소 태아 혈청</td><td>시그마</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS 시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>45001749</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum의 콜라겐 분해</td><td>효소 시그마</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I</td><td>시그마</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Medroxyprogesterone 17-acetate</td><td>Sigma</td><td>M1629-1G</td><td>EPC 매체</td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Sigma</td><td>E1024-1G</td><td>EPC 미디어 용</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>시그마</td><td>A6885-100MG</td><td>EPC 미디어 용</td></tr><tr><td>미세 스트레이트 스티치 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 분석 NCOA2 프로브</td><td>응용 바이오 시스템</td><td>4351372</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 열 비활성화</td><td>Gibco</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>항생제 - 항진균</td><td>성 열 과학</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>행크' s 균형 잡힌 소금 솔루션&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-021-cv</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 폴리프로필렌 팔콘 튜브</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm 유리 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>40 미크론 셀 스트레이너</td><td>Midsci</td><td>229481</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS-215</td><td></td></tr><tr><td>LSE 원심분리기&nbsp;</td><td>코닝</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>인간 NCOA2 siRNA&nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>L-020159-00</td><td>유전자 특정 qPCR 프로브</td></tr><tr><td>Steri-cycle i160 CO2 인큐베이터&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030301</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>RNA 정량화</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50146771</td><td></td></tr><tr><td>75cm 경사형 목 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>6웰 비발열성 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>피펫 컨트롤러 울트라</td><td>코닝</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>19.0.1.334</td><td></td></tr><tr><td>25cm 경사형 목 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>7200876</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 폴리프로필렌 Falcon tube</td><td>Corning</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>1300 시리즈 A2 생물학적 안전 후드</td><td>Thermo Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>accuspin Micro17 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>13100675</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast 실시간 PCR 시스템</td><td>Applied Biosystems</td><td>3052632</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL 면역형광 현미경</td><td>Life Technologies</td><td>01414-155G-291</td><td></td></tr><tr><td>Leica Inverted Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Illrustrator</td><td>Adobe</td><td>22.0.1.253</td><td></td></tr><tr><td>Excel 스프레드시트</td><td>Microsoft</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser 18mm 커버 안경</td><td>NeuVitro</td><td>GG-18</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP176-100</td><td>RNA 용해 완충액</td></tr><tr><td>1.2mL 외부 나사식 폴리프로필렌 극저온 바이알</td><td>Corning</td><td>430658</td><td>HESC 세포 동결용&nbsp;</td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드 (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>냉동 매체 용</td></tr></tbody></table>

생체 외에서 decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 분 비 decidua에 구와 같은 모습에서의 분화는 어머니 자 궁의 자 궁 내벽에 배아 이식에 필요한 변환입니다. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 성공적인 출생의 속도 향상에 유리 하다. Vivo에서 기반 인공 decidualization의 연구는 종종 동물 모델에서 변환 합병증 뿐 아니라 인간의 연구와 관련 된 윤리적 딜레마 때문 제한 됩니다. 결과적으로, 기본 세포 배양을 통해 분석 실험 체 외에 호르몬을 통해 decidualization의 변조를 탐험 자주 활용 됩니다. 이 연구는 HESC 고립과 자란 보통 호르몬의 보충을 통해 후속 인공 decidualization에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한,이 연구 하면 잘 설계 된 최저에 관심사의 어떤 유전자 지질 기반 siRNA transfections를 활용 하 여 있습니다. 이 프로토콜 허용 기본 decidualization, 및의 후속 정량화 하는 분자 메커니즘을 이해 하는 신뢰할 수 있는 방법으로이 모델을 활용 하는 능력을 극대화 함으로써 제품의 수율 뿐 아니라 문화 순도의 최적화 decidualized 자궁내 막 기질 세포에 의해 분 비 대리인입니다.

HESC 문화 decidualization
절연, 다음 인간 자궁내 막 기질 세포 80-90 %confluency 단층 형성에 교양 있었다 및 10 nM E2, MPA, 1 개의 µ M, 50 µ M 캠프와 치료에 의해 생체 외에서 decidualization에 대 한 유발 (EPC). 생체 외에서 decidualization와 관련 된 형태학 변화 그림 1A에서 구상 했다. Decidualization, 시 HESCs 둥근된 epithelioid 세포에 길쭉한, fibroblastic 세포에서 cytoskeletal 재배열을 겪는 다. 따라서, phalloidin 얼룩 HESC decidualization 중 cytoskeletal 개편을 확인 하...

이 연구는 분리와 decidualization 분석 결과 생체 외에서 실시 하 인간의 자궁내 막 기질 세포의 문화에 대 한 검증 및 최적화 절차를 선물 한다. 또한,이 연구를 효율적으로 최저의 자세한 방법을 siRNAs를 사용 하 여 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 특정 유전자를 제공 한다.

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

이 방법은 탈이중화의 기본 분자 메커니즘에 관한 생식 의학 분야의 주요 질문에 답하고 자궁 내막 기질 세포 탈이중화에서 특정 유전자의 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구는 인간 자궁내막 기질 세포의 분리 및 배양 배지에 호르몬 보충에 의한 후속 인공 탈이중화에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로락틴 및 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 One과 같은 호르몬 변화의 발현은 탈이중화의 정도를 확인하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.중요한 것은 유전자 특이적 녹다운을 수행할 수 있는 이 프로토콜의 실행 가능성도 입증되었다는 것입니다. 멸균된 겸자로 생검을 10밀리리터의 새로운 HBSF가 들어 있는 50ml 튜브로 옮긴 다음 500x G에서 90초 동안 원심분리합니다. 1mL 피펫을 사용하여 배지를 제거하고 3mL의 예열된 hES 분리 배지를 추가합니다.5mL의 hES 분리 배지가 들어 있는 10cm 접시에 생검을 디케이트하고 Dumont 5 집게와 가는 직선 스티치 가위를 사용하여 약 20분 동안 다지기 시작합니다. 1mL 피펫을 사용하여 잘게 다진 생검을 새 50mL 튜브로 옮기고 접시에 7mL의 hES 분리 배지를 추가하여 나머지 조각을 50mL 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 800x G에서 2분 동안 샘플을 원심분리하고 1mL 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.다음으로, 10ml 주사기에 부착된 0.2미크론 필터를 통해 DNase-1 및 콜라겐분해효소 분해 혼합물을 펠릿에 직접 여과합니다. 그런 다음 튜브를 10초 동안 소용돌이쳐 펠릿을 다시 현탁시키고 수조에서 90분 동안 배양합니다. 10분마다 10초 동안 튜브를 소용돌이쳐 조직이 제대로 소화되었는지 확인합니다.배양 후 새로운 50ml 튜브 위에 쌓인 40미크론 세포 여과기를 통해 현탁액을 여과하여 기질 세포를 회수한 다음 수집된 세포를 800x G에서 2.5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 1ml 피펫을 사용하여 상층액을 부드럽게 제거하고 세포 펠릿을 방해하지 않도록 합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 10ml의 새로운 hES 분리 배지에 재현탁시킨 다음 800x G에서 2.5분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 상등액을 조심스럽게 흡인하고 6ml의 새로운 hES 배지에 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 혈액 세포를 제거하기 위해 3ml의 밀도 구배 매체에 재현탁 세포를 천천히 층을 이루고 400x G에서 30분 동안 샘플을 원심분리합

isolation-human-endometrial-stromal-cells-for-vitro

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포 배양 시스템을 구축하는 것은 이전의 연구 목표의 광대 한 배열을 추구하는 귀중한 생물 기술과 중요한 단계입니다. 여기서 우리는 인간의 환자의 수술 적 절제술 자궁 내막 조직에서 기질 문화를 설정하는 데 사용되는 두 가지 방법을 설명합니다.

자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

본 연구는 체외 탈락에서 공부하는 공 배양 시스템에서 사용할 수있는 기본 마우스 자궁 내막 기질과 상피 세포의 분리 및 문화에 대한 표준화 및 검증 방법을 제시한다.

마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한<em&gt; 체외</em&gt; 탈락

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할...

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

이 프로토콜은 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위한 마우스 자궁내막 상피 오가노이드를 확립하는 방법론을 설명합니다.

마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립

이 프로토콜은 3차원(3D) 프린팅 골격으로 두 종류의 부착 세포주의 생물학을 재현할 수 있는 새로운 체외 실험 모델을 보여줍니다. 이 모델의 구성과 세포 준비 및 세포 배양에서 분석 및 평가에 이르는 운영 절차에 대해 설명합니다.

두 가지 유형의 부착 세포주를 사용한 공동 배양 모델

인간 지방 유래 기질 세포 내의 전사 이질성은 세포 표면 마커와 골 형성 유전자를 사용하여 단일 세포 수준에서 정의할 수 있습니다.  우리는 골형성 잠재력이 증가된 세포 하위 집단의 분리를 위해 유세포 분석을 활용하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 두개안면 골격 재건을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

지방 유래 기질 세포는 환자 자신의 세포에서 새로운 조직을 엔지니어링하는 데 유용할 수 있습니다. 우리는 골형성 잠재력이 증가된 인간 지방 유래 기질 세포(ASC)의 하위 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시한 다음 in vivo calvarial healing assay에서 세포를 적용합니다.

BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

배우세요 인간 자궁내 막 기질 세포를 생체 외에서 고립하고 호르몬 처리로 인공 탈락화를 유도하는 방법을. siRNA 유전자 녹다운 기법을 활용하여 탈락화의 분자 메커니즘과 특정 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

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