생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

이 방법은 탈이중화의 기본 분자 메커니즘에 관한 생식 의학 분야의 주요 질문에 답하고 자궁 내막 기질 세포 탈이중화에서 특정 유전자의 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구는 인간 자궁내막 기질 세포의 분리 및 배양 배지에 호르몬 보충에 의한 후속 인공 탈이중화에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로락틴 및 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 One과 같은 호르몬 변화의 발현은 탈이중화의 정도를 확인하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

중요한 것은 유전자 특이적 녹다운을 수행할 수 있는 이 프로토콜의 실행 가능성도 입증되었다는 것입니다. 멸균된 겸자로 생검을 10밀리리터의 새로운 HBSF가 들어 있는 50ml 튜브로 옮긴 다음 500x G에서 90초 동안 원심분리합니다. 1mL 피펫을 사용하여 배지를 제거하고 3mL의 예열된 hES 분리 배지를 추가합니다.

5mL의 hES 분리 배지가 들어 있는 10cm 접시에 생검을 디케이트하고 Dumont 5 집게와 가는 직선 스티치 가위를 사용하여 약 20분 동안 다지기 시작합니다. 1mL 피펫을 사용하여 잘게 다진 생검을 새 50mL 튜브로 옮기고 접시에 7mL의 hES 분리 배지를 추가하여 나머지 조각을 50mL 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 800x G에서 2분 동안 샘플을 원심분리하고 1mL 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.

다음으로, 10ml 주사기에 부착된 0.2미크론 필터를 통해 DNase-1 및 콜라겐분해효소 분해 혼합물을 펠릿에 직접 여과합니다. 그런 다음 튜브를 10초 동안 소용돌이쳐 펠릿을 다시 현탁시키고 수조에서 90분 동안 배양합니다. 10분마다 10초 동안 튜브를 소용돌이쳐 조직이 제대로 소화되었는지 확인합니다.

배양 후 새로운 50ml 튜브 위에 쌓인 40미크론 세포 여과기를 통해 현탁액을 여과하여 기질 세포를 회수한 다음 수집된 세포를 800x G에서 2.5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 1ml 피펫을 사용하여 상층액을 부드럽게 제거하고 세포 펠릿을 방해하지 않도록 합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 10ml의 새로운 hES 분리 배지에 재현탁시킨 다음 800x G에서 2.5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 상등액을 조심스럽게 흡인하고 6ml의 새로운 hES 배지에 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 혈액 세포를 제거하기 위해 3ml의 밀도 구배 매체에 재현탁 세포를 천천히 층을 이루고 400x G에서 30분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 밀도 구배 매체를 방해하지 않고 상층액을 수집합니다.

그런 다음 hES 배지를 추가하여 총 부피를 최대 10ml까지 만들고 800x G에서 2.5분 동안 샘플을 다시 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 6ml의 hES 배지에 세포를 재현탁합니다. 다음으로 플라스크에 6ml의 세포 재현탁액과 10ml의 hES 배지를 첨가하여 75cm 플라스크의 세포를 플레이트에 넣은 다음 플라스크를 흔들어 부드럽게 혼합합니다.

도금 후 현미경으로 세포 밀도를 확인한 다음 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 3-5일 동안 세포를 배양하고 2일마다 hES 배지를 교체해야 합니다. 48시간이 지나면 세포가 단층으로 성장해야 합니다. 일반적으로 5일 후에 세포는 75cm 플라스크에서 80-90%의 포화도를 달성합니다.

siRNA transfection의 경우, 각 조건에 대해 3회씩 6개의 well plate에 well당 800,000개의 세포를 도금하는 것으로 시작하고, 5%carbon dioxide incubator에서 세포를 2일 동안 배양하여 transfection을 준비합니다. 2일 후, 5mL 튜브에 150마이크로리터의 Opti-MEM 무혈청 배지를 첨가한 다음 5마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 추가합니다. 반전으로 잘 섞고 5분 동안 배양합니다.

다음으로 새로운 5mL 튜브에 100마이크로리터의 Opti-MEM 무혈청 배지를 추가한 다음 16나노몰의 SRC-2 siRNA를 추가합니다. 그런 다음 5mL 튜브에 100마이크로리터의 Opti-MEM 무혈청 배지를 추가한 다음 16나노몰 대조 siRNA를 추가합니다. 배양 후, 희석된 transfection 시약을 SRC-2 siRNA와 결합하고 정방향 및 역방향 피펫팅으로 잘 혼합합니다.

그런 다음 희석된 transfection 시약을 control siRNA와 결합하고 정방향 및 역방향 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 그런 다음 5분 동안 단지를 배양합니다. 이 배양 중에 hES 배지를 흡입하고 각 웰에 1ml의 변화 배지를 추가합니다.

5분 배양 후 500x G에서 2분 동안 복합체를 원심분리하여 용액을 수집합니다. 그런 다음 250마이크로리터의 siRNA transfection 시약 복합체를 세포와 배지가 포함된 각 웰에 첨가하고 완만한 흔들림으로 혼합한 다음 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5시간 동안 배양합니다. 5시간 후, 배지를 흡인하고 hES 배지로 변경하고 체외 탈이중화 분석을 준비하기 위해 2일 동안 배양을 계속합니다.

48시간 transfection 후 in vitro decidualization assay를 시작하기 전에 day zero control siRNA 및 SRC-2 siRNA transfection된 세포를 수집합니다. 먼저 배지를 흡입하고 웰당 1mL PBS로 세척합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 웰당 300마이크로리터의 RNA 용해 완충액을 추가하고 3분 동안 배양합니다.

3분 배양 후 RNA 용해 완충액의 세포를 1.5ml 튜브에 모아 추후 다운스트림 분석을 수행합니다. 그런 다음 적절한 부피의 데시듀탈화 매체를 분취하여 EPC 매체를 준비하고 50 밀리리터 튜브에 10 나노 몰 에스트라 에스트라 디트라 디올, 1 마이크로 몰 메드 록시 프로게스테론 아세테이트 및 50 마이크로 몰 고리 아데노신 일인산염을 첨가한다. 나머지 6일차 웰의 경우 각 웰에 2밀리리터의 EPC 배지를 추가하고 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 6일 동안 셀을 배양하고 48시간마다 EPC 배지를 교체합니다.

6일째 되는 날 이후, Real-Time PCR을 사용한 다운스트림 분석을 위해 RNA 용해 완충액에서 6일차 대조군 siRNA와 6일차 SRC-2 siRNA transfected cell pellet를 수집합니다. 에스트로겐 메드록시프로게스테론 아세테이트와 고리형 아데노신 일인산염에 의한 탈이중화의 유도는 길쭉한 섬유아세포 세포에서 둥근 상피 세포로 기질 세포의 세포골격 재배열을 초래합니다. 자궁내막 기질 세포의 팔로이딘 염색은 hES 탈이중화의 활성 섬유 세포골격 재조직 특성을 추가로 보여줍니다.

비히클 처리된 hES에서 세포는 외관상 섬유아세포를 유지하는 반면, EPC 처리된 세포에서는 hES가 상피와 같이 나타났습니다. 체외 탈이중화 분석의 효능을 확인하기 위해 6일 동안 탈이중화 마커 프로락틴 및 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-1의 mRNA 전사체 수준을 평가했습니다. 인간 자궁내막 기질 세포의 탈이중화(decidualization)에 따라 프로락틴(prolactin)과 IGFBP1 수치가 시간에 따라 증가했다.

분비된 프로락틴 수치의 시간에 따른 증가는 ELISA 방법을 통해 hES 조직 배양 배지를 검사하여 확인되었습니다. 인간 자궁내막 기질 세포 탈락의 세포 및 분자 변화에 대한 유전자 특이적 녹다운 효과는 대조군 또는 스테로이드 수용체 공동 활성제 2 siRNA를 사용하여 48시간 siRNA 형질 주입 후 배양 6일째에 평가되었습니다. 대조군 siRNA transfected hES는 조약돌 형태학적 변화와 탈이중화 마커 PRL 및 IGFBP1의 전사체 수준 증가를 포함하여 적절한 탈이중화와 일치하는 세포 및 분자 변화를 보여주었습니다.

SRC-2 siRNA knockdown에서 hES는 대조군 siRNA가 transfection된 hES에 비해 외관상 섬유아세포를 유지했으며 PRL 및 IGFBP1 전사체 수준이 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. SRC-2 전사체 수준은 대조군 siRNA와 비교할 때 SRC-2 siRNA transfection된 hES에서 크게 감소했으며, 이는 유전자 침묵을 위한 이 방법의 실행 가능성을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 체외 탈이중화(in-vitro decidualization)를 위해 자궁내막 생검에서 일차 기질 세포를 분리하고 siRNA transfection을 사용하여 특정 관심 유전자를 knockdown하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.