Name: 농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 피하 murine 종양에서 면역 및 비면역 미세환경을 분리하고 농축하는 방법을. 밀도 구백 분리 기법으로 종양 면역 상태를 정밀 분석하여 치료 유발 변화를 식별할 수 있습니다.

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JMN 국립 연구소의 종합 의료 과학 (T32GM088129)과 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (F31DE026682)에서 재정 지원의 건강의 국가 학회 둘 다 인정합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 이 프로젝트 또한 NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, 및 S10 RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 전문가 지원 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 베일 러 대학의과 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 종양 수확 및 소화
참고: 수확에 필요한 시간은 3-5 분/종양, 및 처리에 필요한 시간 1 ~ h + 2-3 분/종양.
<ol><li>이산화탄소 흡입 하 여 마우스를 안락사와 머리 오염을 방지 하기 위해 수확 하기 전에 70% 에탄올과 아래로 각 마우스 스프레이. 수술로 쥐에서 피하 종양을 제거 하 고 종양 어떤 오염 조직 (즉, 머리, 피부, 복 막, 등)의 무료 인지 확인. 각 종양 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 24-잘 접시에서 없이 기본 RPMI 1640 미디어의 1.8 mL에 놓습니다. 큰 수확에 대 한 계속 판 찬 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에. 참고: 불 임이 필요한 경우 모든 종양 ╂ biosafety 어떤 추가 단계 뿐 아니라 불 임 수술 도구 (즉, 가 위, 집게, 등), 캐비닛에서 필요 합니다. 0.5-1 ㎝ 사이 가장 긴 직경이 종양은 최적의 그리고 더 큰 또는 작은 종양 시 약의 스케일링 필요 합니다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 각 잘 내3 조각을 1 m m 미만으로 종양을 잘라.</li>
	<li>콜라를 용 해 하 여 소화 칵테일 x 10을 준비 10 mg/mL, 2500 U/mL, 그리고 DNase에서 콜라 4에서 나 기본 RPMI 1640 미디어 (FBS) 없이 200 U/mL에서 나. 참고: 소화 칵테일 사전에 하루를 준비 하 고 수-20 ° C에 저장 그러나, 효소 활동 한번 해산 시간이 지남에 잃게됩니다 장기간된 보관 권장 하지 않습니다.</li>
	<li>난, 콜라 4, 및 DNase 콜라를 포함 하는 분리 칵테일 x 10의 200 µ L을 추가 나 1 m m3 조각으로 각 잘 하.</li>
	<li>60-100 rpm 궤도 격판덮개 셰이 커를 사용 하 여 가볍게 흔들어 동안 37 ° C에서 1 시간에 대 한 소화 샘플 수 있습니다. 참고: 효소 소화 하는 동안 37 ° C에 온도를 상승 면역 세포 활성화를 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>1 시간 후 RPMI 1640 미디어 각 음을 5 %FBS 2 mM EDTA와 보충의 1 mL을 추가 하 여 반응 중화.</li>
	<li>50 mL 원심 분리기 튜브 위에 앉아 40 µ m 셀 스 트레이너로 종양 소화와 나머지 종양 조각 플라스틱. 참고: 종양 소화는 스 트레이너를 쉽게 전송에 대 한 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li>
	<li>10 mL 주사기 플런저를 사용 하 여 기계적으로 스 트레이너를 통해 종양 조각 세분화. 주기적으로 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL와 여과기를 헹 굴 (포함 하는 5 %FBS) 셀 스 트레이너는 종양의 명확한 때까지 반복. 참고: 전체 미디어의 약 4-10 mL 적절 하 게 종양의 여과기를 헹 구 게 충분 해야 한다. 참고:이 단계는 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 모든 샘플에 대 한 완료 될 때까지 얼음에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>각 50ml 원심 분리기 튜브 보충된 RPMI 1640 미디어를 사용 하 여 동일한 볼륨을 조정 합니다. 참고: 볼륨 조정은 원심 분리기 균형 중요 합니다. 이 단계를 건너뛰는 원심 분리기 손상 또는 상해 될 수 있습니다.</li>
	<li>셀 정지 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 원심 supernatants, 삭제 하 고, 다시 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 일시 중단. 참고: 셀 집계를 resuspend 어려운 원심 분리에 따라 형성 수 있습니다. 계속 하기 전에 헤어 5 mL 혈 청 학적인 피 펫과 혼합 빠르게 사용 합니다.</li>
</ol>2. 면역과 종양 세포 분수의 분리
참고:이 단계에 필요한 시간은 약 1 시간입니다.
<ol><li>15 mL 원심 분리기 튜브의 하단에 밀도 그라데이션 매체의 3 mL를 추가 합니다. 준비 하 고 각 종양에 대 한 충분 한 튜브 라벨.</li>
	<li>레이어 2 개의 층의 혼합을 방지 하기 위해 튜브의 측면 아래로 천천히 pipetting으로 밀도 그라데이션 매체 위에 종양 세포 현 탁 액 2 mL.</li>
	<li>조심 스럽게 원심 분리기에 스핀 805 x g, 20 ° C, 아니 브레이크에서 20 분에 대 한 계층화 된 튜브를 놓습니다. 참고: 그것은 매우 적절 한 균형을 확인 하 고 아무 브레이크 원심 분리 하는 동안 사용 되도록 하는 것이 중요입니다. 이 과정의 혼선 레이어 혼합 되며 전체 샘플 복구는 어려울 것 이다.</li>
	<li>조심 스럽게 (틸) 계층과 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브에 최고의 미디어 계층 백혈구 침투 종양 전송. 모든 나머지 밀도 그라데이션 매체를 삭제 하 고 보충된 RPMI-1640의 2 ml에서 튜브의 하단에 종양 펠 릿 resuspend. 참고: 원심 분리 후 있을 것입니다 아래로 각각 해당 하는 위에서 보이는 4 개의 층: 미디어, TILs, 밀도 그라데이션 매체, 및 종양 세포 펠 릿. 그림 2 다양 한 계층의 예를 참조 하십시오.</li>
	<li>모두 때까지 원심 종양 샘플 튜브 (5 분, 805 x g, 4 ° C)를 분리 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 200 µ L에 때까지 샘플 및 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 종양 펠 릿. 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에 계속.</li>
</ol>3. 도금 및 얼룩
참고: 도금에 필요한 시간은 30 s/종양; 표면 얼룩에 필요한 시간은 1 시간; 세포내 얼룩에 필요한 시간은 40 분; 필요한 흐름 cytometry 분석-1 시간 4 분/종양.
<ol><li>준비 하 고 얼룩 패널 및 셀에 대 한 추가 판 각 면역에 대 한 레이블 96 잘 U-하단 플레이트 계산. 참고: 일반적으로, 3 개의 접시 준비가 총에서: 림프 구 집중 패널 판, 골수성 집중 패널 플레이트, 그리고 셀 수 접시.</li>
	<li>Aliquot는 얼룩의 각 단일 셀 정지 패널 접시와 설정된 볼륨 수 접시에. 참고: 카운트 접시 정확한 세포 인구 수 수 있도록 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 총 수를 계산 하는 데 사용 됩니다. 96 잘 접시 샘플링 및 volumetric 분석 기능 교류 cytometer 각 샘플 µ L 당 세포 수를 제공 하 고 그러므로, 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 수를 계산 수 있습니다. 수 판 고정 FACs 버퍼와 rinsing 4 ° C에서 하룻밤 후 다음 날 취득 될 수 있다 (인산 2% 식 염 수 (PBS) 버퍼링 FBS), FACs 버퍼의 설정된 볼륨에서 resuspending 및.</li>
	<li>(5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 모든 무료 FBS를 제거 하려면 각 린스 사이 상쾌한 삭제 샘플 당 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 200 µ L로 두 번 셀 워시.</li>
	<li>Fc 블록의 50 µ L 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플 혼합 및 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 추가</li>
	<li>2 x의 50 µ L 집중 extracellular 대상 항 체와 고칠 수 생존 얼룩 혼합물, 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 혼합 하 고 RT 또는 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어 추가 참고: 정확한 착 조건 항 체에 대 한 제조업체의 지침에 따라 달라 집니다. 모든 얼룩 희석 DPBS, 고칠 수 생존 염료의 포화를 방지 하기 위해 아무 추가 FBS와 이어야 합니다. 이 원고에 사용 되는 착 색 패널의 최적의 희석에 대 한 테이블의 재료/장비 를 참조 하십시오. 항 체와 고칠 수 생존 솔루션 얼룩 얼룩 Fc 블록에 추가 될 때 전체 얼룩 볼륨 100 µ L에서 농도 x 최종 1을 2 배 농도에서 준비가 되어 있습니다.</li>
	<li>(5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 각 린스 사이 supernatants 삭제 FACs 버퍼와 두 번 샘플을 씻으십시오.</li>
	<li>고정/permeabilization 솔루션 x 1의 200 µ L에서 resuspend 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 밤새 품 어. 참고: 실험 일시 중지할 수 있습니다 하룻밤이 시점에서: 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 샘플을 계속.</li>
	<li>다음 날, 원심 판 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 그리고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>Permeabilization 버퍼, 원심 분리기 (5 분, 805 x g, 4 ° C), x 1의 200 µ L로 한 번 헹 구 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>1 x 집중된 세포내 항 체 얼룩 패널 1 x permeabilization 버퍼에 준비의 100 µ L을 추가 하 고 실시간 또는 (이 제조 업체에서 얼룩 권장 사항에 따라 달라 집니다) 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>1 x permeabilization와 버퍼 (5 분, 805 x g, 4 ° C), 상쾌한, 삭제 되 면 헹 구 고 린스 FACs 버퍼와 함께 두 번째 시간 (PBS 2 %FBS).</li>
	<li>FACs 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend (PBS 2 %FBS), 교류 cytometry 튜브 샘플 전송 및 흐름 cytometry 분석 수행.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

에 다양 하 고 복잡 한 세포 구성 성분과 분자의 구성 됩니다. 최근 기록은이 환경의 정확한 특성 치료 성공 또는 실패의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다 식별할 수 있습니다 심지어 치료 저항 메커니즘 제안. 예를 들어 intratumoral 수준 (즉, MDSCs, T 규정 하는 세포, 등) 다양 한 면역 세포의 증가 이펙터 면역 반응을 완화를 immunotherapeutic 효과 파기 됩니다. 다른 한편으로, 이펙터 면역 인구 (예를 들어, 종양 관련 CD8 + T 세포, 자연 킬러 세포, T 보조 세포)의 증가 intratumoral 존재 치료 성공의 강력한 predictors 수 있습니다. 종양 면역학 상태를 정확 하 게 나타내는 것을 계속 하는 또 다른 특성은 종양 세포 자체의 phenotypic 특징 이다. 이 포함 하는 다양 한 면역 ligands, 효소, 또는 겨냥 downregulating 이펙터 면역 반응 분자의 표현 (즉, PD-L1, PD-L...

진압 시간 최근 암의 각 인으로 인정을 받고 있다 그리고 immunotherapy1그들의 민감성을 완화 뿐만 아니라 개발, 진행, 그리고 고체 종양 암의 보호에 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 에 수많은 세포 하위 집합 및 고기, 종양의 면 역학적 상태에 중요 한 통찰력을 제공 하는 모두는 구성 됩니다. 이러한 면 역학적 하위 집합 추가 함께 타고 난 및 적응형 면역 반응2,3의 대다수를 구성 하는 림프 구 또는 골수성 근원의 세포로 층 화 될 수 있다. Immunotherapeutic 전략 (즉, 검사점 면역 억제제, 공상 항 원 수용 체 T-세포, 등) 튼튼한 암 유발 가능성이 있는 암 immunotherapy 분야의 최근 발전 증명 재발; 그러나, 그들은 상대적으로 단단한 종양 암4,5에서 효과 유지. 수많은 그룹 시간 치료 성공6,7을 재생할 수 및 따라서, 거기에 특별히 초점을 맞추고 전 임상 설정에서 새로운 immunotherapies 정확 하 게 평가할 필요가 남아 있다 중요 한 장애물이 나타났습니다 그들의 변조 또는8시간 극복 하는 능력.
일반적으로 시간을 특성화 하기 위해 현재 노력 중 현미경 활용 또는 항 체 면역 세포 하위 집합 및 그들의 기능9,10식별 하는 전략을 라벨 함께 cytometry 흐름. 이 두 가지 전략 현미경 세포 하위 집합의 공간 감사 있으며 cytometry 제공 높은 처리량 및 세포 변화의 광범위 한 정량화 고유 하 게 서로 다른 정보를 제공 합니다. 형광 성 다중 immunohistochemistry 지금 최대 7 매개 변수를 지원할 수, 스펙트럼 이미징 시스템 최적화에 최근 개선에도 불구 하 고 제한 된 패널 크기 어려운 광범위 한 레벨 프로 파일링 면역 이며 따라서이 기술을 자주 자세한 예약 집중 분석. 결과적으로, cytometry는 가장 널리 사용 되는 면역 프로 파일링 기법 중 하나 남아 있다. 시간 특성에 그것의 광범위 한 사용, 처리 및 얼룩을 위해 사용 되는 방법을 매우 변수는 있습니다. 가장 자주 프로토콜 활용 종양 효소 해리 (즉, collagenases, DNase, 등) 및 수동 분리 방법은 단일 셀 정지를 달성 하기 위해 다음 항 체 얼룩이 지 고 분석7. 각 방법의 장점에도 불구 하 고 수많은 그룹11이러한 기법 통해 유도 될 수 있는 광범위 한 다양성을 보여주었다. 이것은 종양 microenvironment 프로 파일링의 크로스-연구 비교 매우 어려운 동일한 murine 종양 모델을 평가 하는 경우에 합니다. 또한, 종양 세포를 평가 하기 위해 제한 된 잠재력을 제공 하는 이러한 메서드 및 종양 면역 침투 하지 구성 요소 독립적으로, 때문에 두 구성 요소는 소화 후 산재. 샘플 수량 다음 제한 멀티 패널 얼룩 및 분석, 희귀 면역학 하위 집합 특성 하려고 할 때 주요 문제 되는 (즉, 종양 관련 T-세포)12. 대량 cytometry cytometry (CyTOF), 비행 시간 등 최근 기술 42 독립적인 매개 변수13보다 큰 패널 디자인을 지 원하는 일부 시스템 셀룰러 하위 집합의 차원 높은 phenotypic 분석 허용. CyTOF 기술에 면역 프로 파일링의 엄청난 힘에도 불구 하 고 그것은 비용, 분석 전문 및 장비에 대 한 액세스 제한 된 남아 있습니다. 또한, 많은 CyTOF 프로토콜 추천14, 신호 대 잡음 비율 개선 하기 위해 면역 하위 집합의 정화 그리고 따라서 좋습니다 우리의 농축 메서드를 사용할 수는 업스트림 데이터 품질 향상을 위한 CyTOF 분석의.
여기 우리가 종양 microenvironment 소화 및 분석 분리를 침투 하는 종양 면역을 통합 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법의 목적은 종양 면역 침투 및 종양 microenvironment의 광범위 한 특성 분석을 위한 종양 세포 분수의 독립적인 높은 처리량 프로 파일링 수 있도록. 이 방법을 사용 하 여, 더 설명 전체 종양 분석의 중요성으로 피하 고체 종양 모델은 중요 한 공간 면역학이 발견 합니다. 전반적으로,이 방법은 더 정확 하 고 일관 되 게 비교할 수 샘플 사이의 종양 내에서 면역 세포 하위 집합에 대 한 풍요롭게 종양 세포와 종양의 면역 분수의 독립적인 프로 파일링을 허용 하기 때문에.

<table><tbody><tr><td>6주에서 12주 된 수컷 C57BL/6 마우스</td><td>Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>우리의 종양 연구에 사용된 N</td><td>/A</td> 쥐</tr><tr><td>MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line</td><td>협력자로부터 획득됨&nbsp;</td><td>N/A</td><td>E6/E7 HPV 항원이 쥐 편도선 상피암 세포주를 발현하고 있음&nbsp;</td></tr><tr><td>70% 이소프로필 알코올&nbsp;</td><td>EMD 밀리포어&nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>쥐 수술 도구 키트</td><td>세계 정밀 기기</td><td>MOUSEKIT</td><td>주로 가위, 핀셋, 메스만 필요합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>24웰 플레이트&nbsp;</td><td>덴빌 사이언티픽 Inc.</td><td>T1024</td><td>또는 24웰 플랫 바닥 플레이트.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 I&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Low Speed Orbital Shaker</td><td>BioExpress(공급업체: Genemate)&nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>또는 어떤 궤도 쉐이커.&nbsp;</td></tr><tr><td>온도 조절 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-255-27</td><td>또는 기타 온도 조절 인큐베이터</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 피펫 및 팁</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-032</td><td>또는 기타 피펫 및 팁</td></tr><tr><td>40 um Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원뿔형 튜브</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>10mL Luer-Lok 주사기(바늘 없음</td>) <td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>림포렙 밀도 그라디언트 매체</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>96웰 U-바닥 플레이트</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>D8573</td><td></td></tr><tr><td>FoxP3 전사 인자 염색 버퍼 세트&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td>고정/투과화 버퍼 및 투과화 버퍼</td></tr><tr><td>열조절 원심분리기</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT 플로우 사이토미터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>96-웰 세포 부피 계수용&nbsp;</td></tr><tr><td>정제 된 쥐 안티 마우스 CD16 / CD32 (마우스 BD fc 블록)&nbsp; 클론 2.4G2&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc Block</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue dead Cell Stain Kit, UV excitation용</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td><td>Fixable viability stain</td></tr><tr><td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-&알파; 항체 (KT15), PE</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53473&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD4 단클론 항체 (GK1.5), PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC Class II (I-A/I-E) 단클론 항체 (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11c 단클론 항체 (N418), PE-Cyanine5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 단클론 항체 (BM8), eFluor 450</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b 단클론 항체 (M1/70), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G (Gr-1) 단클론 항체 (RB6-8C5), PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) 단클론 항체 (MIH5), PE-Cyanine7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>CD273 (B7-DC) 단클론 항체 (122), PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 단클론 항체 (B56), BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

농축 및 설립된 피하 murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironments의 특성

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

종양 면역 microenvironment (시간) 최근 특히 immunotherapies에 대 한 단단한 종양에서 치료 응답의 중요 한 중재자로 인정 받고 있습니다. 최근 임상 발전 immunotherapy 정확 하 고 철저 하 게 종양 및 그 관련된 면역 침투 특성 재현 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 종양 효소 소화 및 흐름 cytometric 분석 허용 광범위 한 특성 수많은 면역 세포 하위 집합 및 고기; 그러나, 분석의 깊이 종종 fluorophore 제한 패널 설계 및 큰 종양 샘플을 확보 하는 필요의 희귀 면역 인구를 관찰에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 분리 및 농축 비 면역 종양 구성 요소에서 종양 면역 침투에 대 한 효과적이 고 높은 처리량 방법을 개발 했습니다. 설명된 종양 소화와 밀도 기반 원심 분리 기술은 종양 및 종양에 대 한 별도 특성 면역 침투 분수 및 세포 생존을 유지 있으며 따라서 종양의 광범위 한 특성을 제공 합니다 면 역학적 상태입니다. 이 방법은 하는 광범위 한 공간 면역이 단단한 종양에서 더 일관 된 전체 종양 면역학 프로 파일링 기법에 대 한 필요성을 보여주는 사용 되었다. 이 방법은 피하 고체 murine 종양; 면 역학적 특성에 대 한 효과적이 고 융통성 있는 기법을 제공 하는 전반적으로, 이 도구를 사용 하 수 있다 더 나은 종양 면역학 기능을 특성화 하는 등, 소설 immunotherapeutic 전략의 전 임상 평가.

우리의 결과 프로토콜에 설명 된 대로 비 면역 종양 구성 요소에서 분리 할 때의 중요 한 혜택을 보여 줍니다. 또한, 설립된 단단한 종양의 중요 한 면역학이 설명한 방법을 사용 하 여 설명 합니다.
많은 종양 분리 기술로 중요 한 문제는 가혹한 소화 조건 (즉, 높은 온도, 부적절 한 영양 공급, 등)의 결과로 수시로 샘플 생존 능력의 손실. 설명된 소화 방법의 사용 하거나 밀도 없이 그라데이션 중간 농축, cytometry (그림 1A)에 의해 평가 약 70-90% 총 세포 생존 능력을 제공 합니다. 유사한 viabilities에는 때까지 관찰 되었다 농축 하 고 종양이이 방법 (그림 1</str...

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

이 기술의 전반적인 목표는 고형 종양의 면역 미세환경에 기여하는 면역 세포 분획과 암세포 분획을 동시에 프로파일링할 수 있는 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 주어진 치료 후 종양 내에서 어떤 면역 및 비면역 연속 변화가 발생하는지와 같은 면역 종양학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 면역 및 비면역 성분의 효과적인 농축을 촉진하여 종양 면역 상태를 철저히 프로파일링할 수 있다는 것입니다.이 방법의 전반적인 목표는 종양 면역 미세환경을 효율적으로 프로파일링하고 치료로 유도된 변화를 식별하는 것입니다. 모발 오염을 방지하기 위해 마우스에 70% 에탄올을 분사한 후 종양에 오염된 조직이 없는지 주의하면서 피하 종양을 외과적으로 제거합니다. 그런 다음 각 종양을 소 태아 혈청이 없는 1.8ml의 기본 RPMI 1640 배지에 얼음 위 24웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.모든 종양이 채취되면 가위를 사용하여 샘플을 1입방밀리미터 미만으로 자르고 콜라겐분해효소-1, 콜라겐분해효소-4 및 DNase를 각각 1씩 포함하는 새로 준비된 10X 해리 칵테일 200마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 후 60-100RPM의 오비탈 플레이트 셰이커에서 5% FBS와 2밀리몰 EDTA가 보충된 1밀리리터의 RPMI 1640 배지로 반응을 중화하고 변형된 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 각 종양 슬러리 샘플을 개별 40마이크로미터 스트레이너가 있는 개별 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 10ml 주사기 플런저를 사용하여 거름망을 통해 종양 조각을 기계적으로 분해하고 거름망에 종양이 없어질 때까지 2ml의 RPMI 1640 배지와 5% FBS로 각 거름망을 주기적으로 헹굽니다.모든 종양이 해리되면 필요에 따라 각 튜브에 배지를 추가하여 모든 샘플을 동일한 부피로 만들고 원심분리로 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 5ml 혈청학 피펫을 사용하여 튜브당 2ml의 FBS 보충 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 면역 세포 분획과 종양 세포 분획을 분리하려면 샘플당 15ml 원추형 튜브 1개의 바닥에 3ml의 밀도 구배 매체를 추가하고 각 튜브의 측면 아래에 있는 2ml의 종양 세포 현탁액을 각 구배에 천천히 층을 이룹니다.종양 세포 현탁액이 층을 이루기 전에 잘 혼합되었는지, 세포 현탁액이 튜브 측면을 따라 천천히 피펫으로 이동했는지, 튜브가 층이 혼합되지 않도록 조심스럽게 다루었는지 확인하십시오. 밀도 구배 원심분리로 세포를 분리하고 백혈구 층을 상부 배지 및 종양 침윤 백혈구 층을 시료당 하나의 새로운 15ml 튜브로 조심스럽게 수집합니다. 남아 있는 밀도 구배 배지를 버리고 튜브당 2ml의 배지와 FBS에 종양 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 모든 샘플을 원심분리하고 종양 침투 백혈구를 200마이크로리터에 재현탁시키고 종양 세포를 얼음 위의 튜브당 2ml의 배지와 FBS에 재현탁합니다. 세포를 플레이트화하려면 각 면역 염색 패널에 대해 하나의 96웰 U-바닥 플레이트와 세포 수를 위한 추가 플레이트에 라벨을 붙이고 단일 세포 현탁액을 각 염색 패널 플레이트와 석회 플레이트에 분취합니다. 샘플당 200마이크로리터의 Dulbecco의 PBS로 셀을 두 번 세척하고 웰당 50마이크로리터의 FC 블록으로 셀을 섭씨 4도에서 20분 동안 차단합니다.차단 배양이 끝나면 50마이크로리터의 2X 농축 세포외 표적 표적 항체 및 고정 생존도 염색 혼합물을 각 웰에 추가하여 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다. 염색 배양이 끝나면 FACS 완충액으로 샘플을 두 번 세척하고 펠릿을 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 밤새 200마이크로리터의 고정 및 투과화 용액에 재현탁합니다. 다음 날, 원심분리를 통해 세포를 채취한 후 웰당 200마이크로리터의 투과화 완충액으로 세척합니다.투과화 완충액에 100마이크로리터의 세포 내 항체 염색 패널로 세포에 라벨을 부착하여 어둠 속에서 30분 동안 배양한 다음 또 다른 투과화 완충액 세척을 수행합니다. 그런 다음 FACS 완충액으로 세포를 다시 세척하고 유세포 분석을 위해 300마이크로리터의 새로운 FACS 완충액에 시료를 재현탁합니다. 밀도 구배 매체 농축 유무에 관계없이 종양 분해는 유세포 분석으로 평가된 바와 같이 약 70-90%의 생존 가능한 전체 종양 세포 집단을 생성합니다.밀도 구배 매체 농축은 비농축 종양 분해 및 면역 미세환경 연구에서 일반적으로 관찰되는 수많은 면역 세포 하위 집합과 비교하여 CD45 양성 종양 침윤 백혈구 분획의 2배 이상 증가를 촉진합니다. CD45 음성 종양 세포 분획은 또한 전반적인 종양 생존력 또는 세포사멸, 증식 용량 및 다양한 면역 억제 마커의 발현과 같은 수많은 종양 특징에 대해 프로파일링할 수 있습니다. 단일 고형 종양 전체에서 골수성 및 림프구 면역학적 하위 집합이 어떻게 변하는지 확인하기 위해 각 섹션이 거의 동일한 종양 내 영역과 동일한 피부 및 복막을 향하는 부분을 포함하는 방식으로 종양을 4개의 동일한 부분으로 나눌 수 있습니다.그런 다음 각 조각을 개별적으로 소화하고 입증된 대로 다양한 면역 세포 집단의 존재를 분석할 수 있습니다. 이 기법을 마스터하면 보유한 샘플 수에 따라 4시간에서 8시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포 생존력을 보존하기 위해 빠르고 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다.이 방법의 시각적 시연은 매우 중요한데, 해리 및 분리 단계에는 서면 텍스트만으로는 배우기 어려운 기술이 포함되기 때문입니다. 이 절차에 따라 유세포 분석을 수행하여 존재량 및 표현형 측면에서 종양 내에서 세포 집단이 어떻게 변화하는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 입증된 소화 및 밀도 구배 분리 기술을 사용하여 확립된 피하 쥐 종양의 면역 및 비면역 성분을 모두 분리하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 보고서에서는 종양에 침투 leukocytes의 고도 정화 인구를 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 복잡한 종양 조직에서 세포를 분리에 대한 수율과 순도를 향상시키기 위해 Miltenyi 생명 공학 프로토콜에서 적응하고 있습니다.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

이 비디오는 불완전하게 절제된 피하 종양이 있는 마우스 모델에서 보조 요법 또는 추가 요법을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 부분적으로 종양이 절제된 마우스는 T 조절 세포의 항세포독성 단백질을 표적으로 하는 항체로 치료되어 잠재적으로 종양 재성장을 줄이고 효과적인 보조 요법을 제안합니다.

불완전하게 절제된 피하 종양이 있는 마우스 모델의 보조 요법

이 프로토콜은 마우스 종양 모델에서 종양 미세환경 내의 백혈구 하위 집합을 자세히 평가하는 방법을 설명합니다. Chemerin-발현 B16 흑색종 세포를 syngeneic 마우스에 피하로 이식했습니다. 그런 다음 종양 미세환경의 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 상세한 백혈구 부분 집합 분석을 가능하게 했습니다.

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

여기 우리는 머리와 목 편평 상피 세포 암의 orthotopic murine 모델 개발에 대 한 재현 방법 제시. 종양 괴 사, 불 쌍 한 차별화, 꾸벅꾸벅 졸 기 전이 및 면역 침투를 포함 하 여 질병의 임상 관련 histopathological 기능을 보여 줍니다. 부전 실어증, 턱 변위, 및 체중 감소를 포함 한 임상 관련 증상을 개발 하는 종양 방위 쥐.

종양 면역 프로 파일링에 대 한 쥐 및 치료 반응 평가에 편평 세포 암 종 세포의 intramucosal 접종

이 프로토콜은 정형 외과 췌장 종양의 외과 생성 및 갓 단송된 뮤린 췌장 종양의 급속한 소화를 기술합니다. 소화 후, 실행 가능한 면역 세포 집단은 유세포 세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 검출을 위한 T 세포의 생체내 자극을 포함하는 추가하류 분석을 위해 사용될 수 있다.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

표준 프로토콜은 HNSCC의 동종 마우스 모델에서 IL-1α의 항종양 활성 및 관련 독성을 연구하기 위해 설명된다.

폴리안하이드라이드 IL-1α 나노입자의 생체 내 항종양 활성 평가

이 프로토콜은 Flt3L 발현 B16-F10 흑색종으로 세포 기반 종양 백신 접종을 사용하는 암 면역 요법 모델을 제시합니다. 이 프로토콜은 배양된 종양 세포의 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 성장 측정, 종양내 면역 세포의 분리 및 유세포 분석을 포함한 절차를 보여줍니다.

조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델

이 프로토콜은 면역 종양학 연구를 위한 인간 면역 체계(HIS) 마우스의 생성을 간략하게 설명합니다. 이 모델에 이식된 인간 종양에 대한 인간 면역치료제를 시험하기 위한 이 모델의 사용에 있어서의 지침 및 고려사항은 종양에 대한 인간 면역계의 반응을 특성화하는 것에 중점을 두고 제시된다.

인간 종양을 지닌 인간화 마우스 모델에서 암 면역 치료제 테스트

종양 내 면역치료에 대한 관심이 높아짐에 따라, 접근 가능하고 실용적인 종양 모델을 선택하는 것이 필수적입니다. 피하 종양은 쉽게 진단할 수 있지만, 시각화하고 조작하는 것은 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 가시성과 접근성을 높이는 피내종양을 생성하는 방법을 설명합니다.

생쥐암 종양 내 면역치료 연구의 강력한 모델로서의 피내종양 이식

배우세요 피하 murine 종양에서 면역 및 비면역 미세환경을 분리하고 농축하는 방법을. 밀도 구백 분리 기법으로 종양 면역 상태를 정밀 분석하여 치료 유발 변화를 식별할 수 있습니다.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

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