농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

이 기술의 전반적인 목표는 고형 종양의 면역 미세환경에 기여하는 면역 세포 분획과 암세포 분획을 동시에 프로파일링할 수 있는 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 주어진 치료 후 종양 내에서 어떤 면역 및 비면역 연속 변화가 발생하는지와 같은 면역 종양학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 면역 및 비면역 성분의 효과적인 농축을 촉진하여 종양 면역 상태를 철저히 프로파일링할 수 있다는 것입니다.

이 방법의 전반적인 목표는 종양 면역 미세환경을 효율적으로 프로파일링하고 치료로 유도된 변화를 식별하는 것입니다. 모발 오염을 방지하기 위해 마우스에 70% 에탄올을 분사한 후 종양에 오염된 조직이 없는지 주의하면서 피하 종양을 외과적으로 제거합니다. 그런 다음 각 종양을 소 태아 혈청이 없는 1.8ml의 기본 RPMI 1640 배지에 얼음 위 24웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.

모든 종양이 채취되면 가위를 사용하여 샘플을 1입방밀리미터 미만으로 자르고 콜라겐분해효소-1, 콜라겐분해효소-4 및 DNase를 각각 1씩 포함하는 새로 준비된 10X 해리 칵테일 200마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 후 60-100RPM의 오비탈 플레이트 셰이커에서 5% FBS와 2밀리몰 EDTA가 보충된 1밀리리터의 RPMI 1640 배지로 반응을 중화하고 변형된 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 각 종양 슬러리 샘플을 개별 40마이크로미터 스트레이너가 있는 개별 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 10ml 주사기 플런저를 사용하여 거름망을 통해 종양 조각을 기계적으로 분해하고 거름망에 종양이 없어질 때까지 2ml의 RPMI 1640 배지와 5% FBS로 각 거름망을 주기적으로 헹굽니다.

모든 종양이 해리되면 필요에 따라 각 튜브에 배지를 추가하여 모든 샘플을 동일한 부피로 만들고 원심분리로 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 5ml 혈청학 피펫을 사용하여 튜브당 2ml의 FBS 보충 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 면역 세포 분획과 종양 세포 분획을 분리하려면 샘플당 15ml 원추형 튜브 1개의 바닥에 3ml의 밀도 구배 매체를 추가하고 각 튜브의 측면 아래에 있는 2ml의 종양 세포 현탁액을 각 구배에 천천히 층을 이룹니다.

종양 세포 현탁액이 층을 이루기 전에 잘 혼합되었는지, 세포 현탁액이 튜브 측면을 따라 천천히 피펫으로 이동했는지, 튜브가 층이 혼합되지 않도록 조심스럽게 다루었는지 확인하십시오. 밀도 구배 원심분리로 세포를 분리하고 백혈구 층을 상부 배지 및 종양 침윤 백혈구 층을 시료당 하나의 새로운 15ml 튜브로 조심스럽게 수집합니다. 남아 있는 밀도 구배 배지를 버리고 튜브당 2ml의 배지와 FBS에 종양 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 모든 샘플을 원심분리하고 종양 침투 백혈구를 200마이크로리터에 재현탁시키고 종양 세포를 얼음 위의 튜브당 2ml의 배지와 FBS에 재현탁합니다. 세포를 플레이트화하려면 각 면역 염색 패널에 대해 하나의 96웰 U-바닥 플레이트와 세포 수를 위한 추가 플레이트에 라벨을 붙이고 단일 세포 현탁액을 각 염색 패널 플레이트와 석회 플레이트에 분취합니다. 샘플당 200마이크로리터의 Dulbecco의 PBS로 셀을 두 번 세척하고 웰당 50마이크로리터의 FC 블록으로 셀을 섭씨 4도에서 20분 동안 차단합니다.

차단 배양이 끝나면 50마이크로리터의 2X 농축 세포외 표적 표적 항체 및 고정 생존도 염색 혼합물을 각 웰에 추가하여 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다. 염색 배양이 끝나면 FACS 완충액으로 샘플을 두 번 세척하고 펠릿을 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 밤새 200마이크로리터의 고정 및 투과화 용액에 재현탁합니다. 다음 날, 원심분리를 통해 세포를 채취한 후 웰당 200마이크로리터의 투과화 완충액으로 세척합니다.

투과화 완충액에 100마이크로리터의 세포 내 항체 염색 패널로 세포에 라벨을 부착하여 어둠 속에서 30분 동안 배양한 다음 또 다른 투과화 완충액 세척을 수행합니다. 그런 다음 FACS 완충액으로 세포를 다시 세척하고 유세포 분석을 위해 300마이크로리터의 새로운 FACS 완충액에 시료를 재현탁합니다. 밀도 구배 매체 농축 유무에 관계없이 종양 분해는 유세포 분석으로 평가된 바와 같이 약 70-90%의 생존 가능한 전체 종양 세포 집단을 생성합니다.

밀도 구배 매체 농축은 비농축 종양 분해 및 면역 미세환경 연구에서 일반적으로 관찰되는 수많은 면역 세포 하위 집합과 비교하여 CD45 양성 종양 침윤 백혈구 분획의 2배 이상 증가를 촉진합니다. CD45 음성 종양 세포 분획은 또한 전반적인 종양 생존력 또는 세포사멸, 증식 용량 및 다양한 면역 억제 마커의 발현과 같은 수많은 종양 특징에 대해 프로파일링할 수 있습니다. 단일 고형 종양 전체에서 골수성 및 림프구 면역학적 하위 집합이 어떻게 변하는지 확인하기 위해 각 섹션이 거의 동일한 종양 내 영역과 동일한 피부 및 복막을 향하는 부분을 포함하는 방식으로 종양을 4개의 동일한 부분으로 나눌 수 있습니다.

그런 다음 각 조각을 개별적으로 소화하고 입증된 대로 다양한 면역 세포 집단의 존재를 분석할 수 있습니다. 이 기법을 마스터하면 보유한 샘플 수에 따라 4시간에서 8시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포 생존력을 보존하기 위해 빠르고 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다.

이 방법의 시각적 시연은 매우 중요한데, 해리 및 분리 단계에는 서면 텍스트만으로는 배우기 어려운 기술이 포함되기 때문입니다. 이 절차에 따라 유세포 분석을 수행하여 존재량 및 표현형 측면에서 종양 내에서 세포 집단이 어떻게 변화하는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 입증된 소화 및 밀도 구배 분리 기술을 사용하여 확립된 피하 쥐 종양의 면역 및 비면역 성분을 모두 분리하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.