Name: 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 Activin A와 Id1 과발현을 이용하여 심장 전구세포와 심근세포를 생성하는 확장 가능한 방법을. 이 기술은 심장 질환 모델링 및 세포 기반 치료 연구에 활용됩니다.

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우리는 유용한 토론 Colas 실험실의 구성원 및 원고의 중요 한 리뷰 감사합니다. 이 연구는 NIH/NIEHS R44ES023521-02에 의해 지원 되었다 고 CIRM DISC2-10110 박사 Colas를 부여 합니다.

1. Id1 바이러스 준비 및 감염
<ol><li>공동 transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G, 및 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR Id1 overexpressing lentivirus 생성 (Addgene: 플라스 미드 #107735) HEK293T 세포로. 바이러스 성 입자를 수집 하 고, 여과 하 고, 상쾌한에서 정화 하 고 무라 외 에서-80 ° C에서 저장 (2003) 19. 또는 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR lentivirus 생산 공급 업체에 전송 하 여 Id1 lentivirus를 상업적으로 생산. 주의: lentiviral 안전 규정 및 표준 작동 프로토콜을 따르시기 바랍니다. 참고: 중요 한: 최적의 바이러스 titer 적어도 10 이어야 한다8 10에9 Transducing 단위/mL (TU/mL).</li>
	<li>이전에 감염, 코팅 시 약, 일반적으로 Engelbreth-Holm-떼 마우스 육 종 세포 ( 재료의 표참조)에 의해 분 비 젤라틴 단백질 혼합물의 50 µ l 96 잘 접시의 한 잘 코트.</li>
	<li>6 잘 플레이트에서 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 0.5 m EDTA의 1 mL을 추가 하 여 재배 하는 만능 줄기 세포의 한 잘 해리 참고: 3-10 분에서 분리 시간 변화 한다. 세포의 80% 이상이 접시의 바닥에서 분리 됩니다, 다음 단계로 진행.</li>
	<li>피펫으로 멸 균과 세포 현 탁 액 15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 수집 합니다.</li>
	<li>분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.</li>
	<li>다시 셀 줄기 세포 미디어의 1 ml에서를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>공급 업체 지침에 따라 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>당 접시 20000 가능한 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 50 µ L에서 잘 (96 잘 접시) 코팅 ( 표 1 및 2참조).</li>
	<li>24 시간 후에 셀 첨부 파일에 대 한 모니터링 및 2 µ M로 / 바위 통로 억제제와 6 ng/mL hexadimethrine 브 로마 이드 보충 100 µ l 줄기 세포 미디어 미디어 바꿉니다 ( 표 1 및 2참조), lentiviral 감염 전에 한 h. 참고: 셀 해야 단단히 장착할 접시의 바닥에.</li>
	<li>얼음에 Id1 lentivirus 녹여</li>
	<li>잘 당 정화 lentivirus의 3 µ L 추가 (바이러스 titer 10 사이 여야8 109 화/mL), 다음 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 20% O2)를 다시 접시를 전송.</li>
	<li>24 시간 후 바이러스 성 감염, 감염된 세포에 신선한 줄기 세포 미디어의 100 µ L를 추가.</li>
	<li>48 h 후 lentiviral 감염, 신선한 줄기 세포 미디어 1 µ g/mL puromycin 보충의 200 µ L 미디어를 포함 하는 대체 바이러스.</li>
	<li>줄기 세포 미디어 1 µ g/mL puromycin 보충의 200 µ L 매일 미디어를 새로 고침 합니다.</li>
	<li>문화 80 %confluency 도달, 해리 (96 잘 접시의 한 우물)에 대 한 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + + 0.5 m EDTA 없이 PBS의 200 µ L를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.</li>
	<li>다시 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 1 ml를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>모든 셀 (1 mL) 전송 12-잘 접시의 코팅.</li>
	<li>24 시간 후 셀 줄기 세포 미디어의 1 mL와 잘 및 바꾸기 미디어 첨부 파일에 대 한 모니터는 6 ng/mL hexadimethrine 브 로마 이드, 변환 전에 한 h 2 µ M로 / 바위 통로 억제제와 보충.</li>
	<li>얼음에 Id1 lentivirus 녹여</li>
	<li>잘 (12-잘 접시) 당 정화 바이러스의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>24 시간 후 lentiviral 감염, 신선한 줄기 세포 미디어 3 µ g/mL puromycin 보충의 1 mL와 함께 미디어를 포함 하는 대체 바이러스.</li>
	<li>48 h lentiviral 감염 게시, 신선한 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 1 mL와 함께 미디어를 포함 하는 바이러스를 대체.</li>
	<li>문화 80 %confluency 도달, 해리 (12-잘 접시의 한 우물)에 대 한 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 0.5 m EDTA의 500 µ L를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>절반을 전송 (250 µ L) 코팅 시 약의 한 잘에 세포 현 탁 액의 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 2 개 mL를 포함 하는 6 잘 플레이트 코팅.</li>
	<li>다른 절반을 사용 (250 µ L) RNA 추출 및 qRT-PCR lentiviral 중재 Id1 식 레벨, Colas 외 로 결정 하기 위해 샘플의 (2012 년) 4. 참고: 중요 한: Id1 mRNA 식 레벨 GAPDH 식 수준 (qRT-PCR 뇌관 표 3 참조)의 0.005 배 보다 낮은 경우, 반복 감염 과정 Id1 식 수준 초과 될 때까지 위에서 설명한 대로 임계값입니다.</li>
</ol>2입니다. hPSCsId1 유지 보수
<ol><li>코팅된 6 잘 플레이트에 hPSCsId1 문화와 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 당 3 mL에서 성장.</li>
	<li>HPSCsId1 80 %confluency 도달, 효소 없는 분리 시 약 공급 업체의 지침을 사용 하 여 집계 (1:6 분할 비율)로 셀을 통과 하 고 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 당 3 mL에 성장 한다.</li>
</ol>3. 차별화 hPSCsi d 1 의 준비
<ol><li>코트 코팅 시 약의 당 500 µ L와 12-잘 접시.</li>
	<li>Id1 도달 90% confluency hPSCs 1 mL의 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 잘 당 0.5 m m EDTA 추가 하 여 세포를 분리 하는 경우 5-10 분에 대 한 분리 과정 1 분 마다 확인 하 고 세포의 80%는 접시에서 해리는 한 번 다음 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.</li>
	<li>다시 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 2 개 mL를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>줄기 세포 미디어 조직 문화 인큐베이터에 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 및 6 µ g/mL puromycin, 전송 접시 보충의 1 mL에 잘 당 300000 플레이트 세포.</li>
	<li>줄기 세포 미디어 문화 90 %confluency 도달할 때까지 6 µ g/mL puromycin 보충의 2 mL와 함께 매일 미디어를 새로 고침 합니다. 이 시점에서 심장 차별화를 시작 (다음 단계).</li>
</ol>4. 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자 (FHF L CPs)에 hPSCsi d 1 의 차별화
<ol><li>12 잘 플레이트 형식에 대 한 유도 미디어 (표 1)의 1.5 mL와 함께 줄기 세포 미디어를 대체 하 여 시작 차별화 (0 일) 보충 Activin를 (100 ng/mL) (참조 표 2 에 대 한 권장 볼륨 및 Activin A에 대 한 농도 다른 플레이트 형식)입니다.</li>
	<li>하루에 1 (차별화 시작 후 24 h), 미디어를 (당 12-잘 접시의 우물) Activin A 없이 유도 미디어의 2 mL 바꿉니다.</li>
	<li>3 일에 2 mL (당 12-잘 접시의 우물) Activin A 없이 유도 미디어의 미디어를 바꿉니다.</li>
	<li>당일 5, FHF L CPs cryopreservation 수집 (다음 단계). 참고: 중요 한: Cryopreservation는 선호이 시점에서, 그것은 연결을 푸십시오 셀의 후속 cardiomyocyte 생산과 biobank 대규모 배치에서 심장 조상 세대 수 있습니다. 참고 또는 그 날 5 FHF L CPs 차별화 계속, 단계 5.1-5.5 passFHF L CPs 참조 하십시오 다음 단계 6.5 차별화 진행을 갓 코팅된 판에 전달 될 수 있습니다.</li>
</ol>5입니다. cryopreservation FHF L CPs의
<ol><li>5 일을 포함 하는 우물에서 모든 미디어를 발음 FHF L CPs 신속 하 게 따뜻한 (37 ° C) 1 x 분리 시 약 포함 하는 효소의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조). 조직 문화 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>1 분 후 접시를 인큐베이터에서 좌우로 흔들어.</li>
	<li>2 분 (전체 시간), 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 10 %FBS 미디어의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 피펫으로 세포를 위아래로 5 mL 피펫으로 접시에서 셀 분리를 촉진 하기 위하여와.</li>
	<li>3 분 x g 200에서 원심 분리 하 여 원심 분리기 튜브와 펠 릿 세포에 세포 현 탁 액을 수집</li>
	<li>다시 cryopreservation 시 약의 2 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>추가 cryopreservation 시 약 ( 재료의 표참조) 원하는 농도 (일반적으로 5-10 × 106 셀/mL)에서 세포를 cryopreserve에 충분 한 볼륨에.</li>
	<li>Cryopreservation 튜브 셀 전송 냉각 장치 (1 ° C/min)에 튜브를 배치 하 고 냉각 장치-80 ° C 냉장고에서 밤새 껏 두기 위하여.</li>
	<li>24 시간 후 장기 저장을 위한 액체 질소 냉동된 튜브 전송. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>6. 심 실 같은 Cardiomyocytes에 FHF L CP 차별화
<ol><li>드라이 아이스 용기에 액체 질소 저장에서 하루 5 FHF L CPs 냉동 튜브를 전송.</li>
	<li>세포 현 탁 액은 완전히 해 동 때까지 2 ~ 3 분 동안 37 ° C 물 목욕에 튜브를 배치 합니다. 참고: 중요 한: 녹고 과정은 시간에 민감한. 과도 한 양의 시간에 대 한 셀 cryopreservation 미디어 노출 (즉, 10 분) 세포 생존 능력을 감소 것입니다.</li>
	<li>15 또는 50 mL 원심 분리기 튜브, 해 동된 튜브의 수에 따라 셀 전송.</li>
	<li>Dropwise (5 방울 30 초 마다) 미리 데워 진된 (37 ° C) cardiogenic 미디어 (표 1) 셀 솔루션을 분배. 1:3 cryopreservation 미디어까지이 과정을 계속: cardiogenic 미디어 비율에 도달. 이 시점에서, 1시 10분까지 cardiogenic 미디어 추가 속도 증가 cryopreservation 미디어: cardiogenic 미디어 비율에 도달. 참고: 중요 한: 빠른 osmolarity 변경 과정에서 녹고; 세포 죽음을 증가할 것 이다 따라서, cardiogenic 미디어의 dropwise 또한 위에서 설명한 대로 좋습니다.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분)에 의해 세포 현 탁 액 및 펠 릿 세포를 원심.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 터치 하는 원심 분리기 튜브 셀 펠 릿을 꺼내.</li>
	<li>다시 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충 하는 cardiogenic 미디어와 셀을 일시 중단 합니다. 참고: 셀 생존 thaw 해 동에서 하 고, 일반적으로 다를 수 있습니다, 그리고 > 65% 생존 예측 좋은 도금 효율.</li>
	<li>도금에 대 한 원하는 셀 농도를 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충 하는 cardiogenic 미디어와 희석 집중 세포 현 탁 액 (다른 판 형식에 대 한 표 2 참조). 참고: 중요 한: 주의 심장 분화 효율 셀 너무 띄엄띄엄 시드 경우 거부할 수 있습니다.</li>
	<li>접시에 시드 셀입니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에 그것을 전송 하기 전에 20 분 동안 조직 문화 후드에서 플레이트를 유지.</li>
	<li>차별화의 날 6, 셀 첨부 파일을 모니터링 합니다. 참고: 심장 창시자는 차별화의 5 일에 cryopreserved는. 셀을 녹고 후 24 h는 차별화의 6 일에는 것입니다. 참고: 부동 (죽은) 세포의 존재를 일반적입니다.</li>
	<li>7 일에는 미디어의 50%를 발음 하 고 신선한 cardiogenic 미디어의 동일한 금액으로 바꿉니다. 참고: cardiogenic 미디어 로/바위 통로 억제제의 추가 필요 하지 않습니다이 시점 이후.</li>
	<li>매일 cardiogenic 미디어와 미디어의 50%를 교체 합니다.</li>
	<li>참고를 꺾고 자발적인 11 일과 13 일 사이 나타납니다.</li>
	<li>15 일에 DAPI (핵 얼룩) 및 ACTC1를 사용 하 여 면역 형광에 의해 심장 분화 효율을 계량 (팬 심장 마커).</li>
</ol>7. 합격 및 심 실 같은 Cardiomyocytes의 유지 보수
참고: 하루 14 ~ 16, 자발적으로 심 실 같은 cardiomyocytes 계약의 단층 해야 얻을 수 있습니다. 이 시점에서, 그것은 해리 하 고 다시 접시 cardiomyocytes 문화를 균질 하 고 셀 접시에서 분리 하는 것을 방지 하기 위해 좋습니다.
<ol><li>우물에서 모든 미디어를 발음 하 고 신속 하 게 미리 따뜻하게 (37 ° C) 1 분리 시 약 포함 하는 효소의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 포함 하는 효소 분리 시 볼륨 x 1 플레이트 형식에 따라 다르지만 완전히 잘 표면의 바닥을 커버 해야 합니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송 합니다.</li>
	<li>부드럽게 흔들 플레이트 좌우로 분리 프로세스를 가속 화 하기 위해 인큐베이터 안에 매 2 분.</li>
	<li>5-15 분 후 세포의 80% ~ 100%는 접시의 바닥에서 분리 때 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 10 %FBS 미디어의 동일한 볼륨을 추가 하 여 포함 하는 효소 분리 시 약 활동 x 1을 억제. 참고:이 프로세스에 대 한 1 x 효소 포함 된 분리 된 보육 시간 일괄 처리를 일괄 처리에서 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>피펫으로 및 count 셀 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 세포 현 탁 액을 혼합.</li>
	<li>원하는 셀 농도에 세포 현 탁 액 희석 (다른 판 형식에 대 한 표 2 참조) 유지 보수 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충.</li>
	<li>Cardiomyocytes 접시에 시드, 후 균등 하 게 셀 하 고 세포 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송 하기 전에 10-20 분에 대 한 연결을 허용 합니다.</li>
	<li>다시 도금 후 h 24 모니터링 셀 첨부 파일 및 복구 합니다. 참고: 부동 (죽은) 세포의 존재를 일반적입니다. 다시 도금 후 48-72 h, cardiomyocyte 자발적 수축을 재개 한다.</li>
	<li>Cardiomyocyte 문화를 유지 하려면 대체 미디어의 50% 유지 보수 미디어와 함께 매일 같은 심 실 cardiomyocytes의 사용까지 후속 실험에 대 한.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

성공적인 차별점에 대 한 밀접 하 게 지침에 따라 위에 나열 된 확인 합니다. 또한, 여기 우리가 강력 하 게 차별화 결과 영향을 주는 주요 매개 변수 강조 표시 합니다. 감 별 법을 시작 하기 전에 다음 세 개의 매개 변수 형태를 관찰 해야 합니다: hPSCsId1, 높은 세포 압축 및 높은 합류의 줄기 형태 (> 90%) 0에서 문화. 그런 측면에서 최적의 차별화 조건 단일 세포로 도금 해리 hPSCsi d 1 에 의해 만들어집니다 가장 하 고 형태를 밀접 하 게 그들을 수 있도록 클러스터 성장 monolayers ~ 90% 합류 2 ~ 3 일의 과정. 반대로, hPSCId1 문화 쇼 가난한 셀 및 식민지 형태학, 낮은 식민지 압축 및 문화 내에서 차별화의 큰 분야의 존재, 성공적인 FHF L CP 차별화 가능성이 되지 않습니다.
미디어 볼륨 및 Activin A 농도 FHF L CP 차별화 및 플레이트 형식 의존 (...

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 대규모 생산-파생된 심장 창시자 및 cardiomyocytes는 줄기 세포 기반 요법1,2,3 와의 빠른 특성을 모델링 하는 질병에 대 한 필수 새로운 통로 규제 심장 차별화4,,56 과 생리학7,8. 비록 연구9,10,11,12,,1314의 번호,15 는 앞에서 설명한 고효율 심장 차별화 프로토콜 hPSCs에서, 아무도 중요 한 분자 차이 왼쪽의 식별도 결과 cardiomyocytes의 심장 필드 근원 해결 (첫 번째 심장 분야) 및 오른쪽 (두 번째 심장 분야) 심 실 cardiomyocytes16 과 심장 분야 특정 선 천 성 심장 질환;의 존재 즉, hypoplastic 좌 심 혼 증후군17 또는 arrhythmogenic 오른쪽 심 실 발육 이상18. 따라서, 심장 창시자의 생성 및 hPSCs에서 정의 된 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 되고있다 치료로 그들의 관련성을 증가 하기 위하여 필요성 및 질병 모델링 도구.
이 프로토콜의 Id1, 최근 확인 된5 첫 번째 심장 필드 지정 큐 필요 하 고 충분 한 hPSCs에서 cardiogenesis를 시작 하는 Activin A와 함께에서 하는 제정 overexpression에 의존 합니다. 특히, 커닝 햄 외. (2017) 5 표시는 Id1 유도 창시자 구체적으로 표현 첫 심장 필드 (HCN4, TBX5) 하지만 하지 두 번째 심장 필드 마커 (SIX2, ISL1) 그들은 심장 차별화를 받 다. 또한, 저자는 또한 표시 유전자 변형 마우스 배아의 유전자 (i d 1-4), 전체 Id 가족 부족 첫 심장 필드 심장 창시자, 더 많은 중간과 뒷부분 심장 창시자 (동안 형성 없이 개발 두 번째 심장 필드) 아직도 그로 인하여 Id 단백질 필수적인 첫 번째 심장 필드 cardiogenesis에서 vivo에서시작 하는 제안, 형성할 수 있다. 편리 하 게, Id1 유도 창시자 cryopreserved 수 고 저절로 cardiomyocytes 표시 심 실 같은 특성을 포함 하 여 심 실 전용 마커 (IRX4, MYL2) 식으로 차별화 하 고 같은 심 실 활동 전위.
여기는 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes Id1 overexpressing hPSCs에서 생성 하는 간단 하 고 확장 가능한 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜의 중요 한 특징은 편리한 cryopreservation 단계를 사용 하 여 후속 cardiomyocyte 생산에서 심장 조상 세대 연결을 푸십시오 가능성. 요약 하자면,이 프로토콜 (1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs, (2) hPSCs에서 FHF L 심장 창시자를 생성, (3) cryopreserve 결과 창시자, 및 (4) 재개 FHF L 심장 조상 차별화에 필요한 단계를 자세히 설명 하 고 생성 매우 농축 (> 70-90%) 심 실 같은 cardiomyocytes 박동.

<table><tbody><tr><td>ACTC1 항체</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>Hu Recom Activin A</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement w/o - insulin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제 w/o - 비타민 A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587001</td><td></td></tr><tr><td>CDH5 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF938</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>줄기세포 기술</td><td>7930</td><td>냉동 보존 시약</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/ Ca & Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt 막 전위 키트&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td>광학 작용 전위 획득에 대해서는 McKeithan et al. 2017</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Coating reagent</td></tr><tr><td>mTeSR1 media kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca & Mg</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromycin&nbsp;</td><td>Acros</td><td>227422500</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>줄기세포 기술</td><td>5872</td><td>무효소 해리 시약</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TAGLN 항체</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72254</td><td>RHO/ROCK 경로 억제제</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605 -010</td><td>1X 효소 함유 해리 시약</td></tr><tr><td>Tyrodes 용액 혼합 패킷&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2145-10X1L</td><td>(광학 작용 전위 획득에 대해서는 McKeithan et al. 2017 참조)</td></tr></tbody></table>

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

많은 양의 기능 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 심장 창시자의 정의 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 세대 셀 기반 심장 치료 및 질병 모델링에 대 한 필수입니다. 우리는 최근 Id 유전자는 필요 하 고 척추 개발 하는 동안 첫 번째 심장 필드 창시자 지정 하려면 충분 한 나타났습니다. 이 분화 프로토콜 이러한 연구 결과 활용 하 고 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 창시자를 생산 하 강력한 지정 큐로 Activin A와 함께에서 Id1 overexpression를 사용 합니다. 중요 한 것은, 결과 창시자 효율적으로 심 실 같은 cardiomyocytes에 (~ 70-90%)를 구분합니다. 여기는 1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs 2) 차별화 cryopreservable FHF L 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes의 확장 가능한 수량을 상세한 방법에 설명 합니다.

HPSCs의 생성 I d 1 라인 hPSCs 중재 Id1 overexpression (그림 1A) lentivirus 감염 됩니다. HPSCId1 생성 됩니다 일단 transgene 식 qRT-PCR (그림 1B)에 의해 정량입니다. 그 GAPDH 0.005 배 보다 높은 레벨에서 Id1 mRNA 표현으로 하는 hPSCId1 선만 차별화 사용 되어야 한다.
hPSCs <...

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

이 간단한 기술의 주요 장점은 정의된 심장 필드 기원 및 아형의 심장 전구 세포와 심근 세포를 생성하는 것입니다. 결과적으로 생성된 세포는 기본 발달 생물학, 개념 증명 세포 기반 치료 및 심장 질환 모델링 연구를 포함한 광범위한 연구 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연할 사람은 제 연구실의 Sean Spiering과 Michael Yu입니다.먼저 후속 세포 파종 및 바이러스 감염 단계를 수용할 수 있도록 96웰 플레이트의 웰에 50마이크로리터의 코팅 시약을 충분히 코팅한 다음 6웰 플레이트의 웰에 1ml의 해리 시약을 추가하여 파종된 만능 줄기세포를 분리합니다. 그런 다음 멸균 피펫을 사용하여 15ml 플라스틱 원심분리기 튜브에 세포 현탁액을 옮깁니다. 튜브에 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS 5ml를 첨가하여 해리 시약을 중화합니다.그런 다음 200배 g에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 버리고 펠릿이 제거되도록 튜브를 부드럽게 튕깁니다. 그런 다음 세포 펠릿을 1ml의 줄기 세포 배지에 용해시킵니다.다음으로, 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산합니다. 계수가 완료되면 2마이크로몰 RHO/ROCK 경로 억제제가 보충된 50마이크로리터의 줄기세포 배지를 포함하는 96웰 플레이트의 각 웰에 20, 000개의 생존 가능한 세포를 파종합니다. 24시간 후, 세포 부착을 모니터링한 다음 렌티바이러스 감염 1시간 전에 배지를 100마이크로리터의 줄기세포 배지로 교체합니다.다음으로, Id1 렌티바이러스를 얼음에서 해동한 다음 웰당 3마이크로리터의 정제된 렌티바이러스를 추가합니다. 렌티바이러스를 첨가한 후 플레이트를 5% 이산화탄소로 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 바이러스 감염 후 24시간이 지나면 감염된 세포에 100마이크로리터의 신선한 줄기세포 배지를 추가합니다.48시간 후, 바이러스 함유 배지를 퓨로마이신 1밀리리터당 1마이크로그램이 보충된 200마이크로리터의 신선한 줄기세포 배지로 교체합니다. 매일 200마이크로리터의 신선한 줄기세포 배지에 1밀리리터당 1마이크로그램의 푸로마이신이 보충되어 배지를 계속 교체하십시오. 1.5ml의 유도 배지가 있는 줄기세포 배지를 12웰 플레이트에서 Activin A로 교체하여 0일차에 분화 과정을 시작합니다.분화가 시작된 지 24 시간 후, Activin A.On 없이 2 밀리리터의 유도 배지로 배지를 교체하십시

generation-first-heart-field-like-cardiac-progenitors-ventricular

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

이 방법의 목적은 전구 세포 사양 및 기능적 특성을 연구하기 위해 시험관 내에서 심장 필드 특이적 심장 전구 세포를 생성하고 심장 질환 모델링을 위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 것이다.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

여기서, 우리는 자기 조직에 의하여 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 발달적으로 관련있는 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 만드는 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 발달 단서의 순차적 활성화에 의존하고 매우 복잡하고 기능적으로 관련된 인간 심장 조직을 생성합니다.

다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

여기에 제시된 것은 고처리량, 다차원 형식으로 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 스페로이드(CS)의 생성 및 냉동 보존을 위한 일련의 프로토콜입니다. 이 3차원 모델은 질병 모델링, 고처리량 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼 역할을 하며 냉동 보존 후에도 기능을 유지합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

배우세요 인간 만능 줄기 세포에서 Activin A와 Id1 과발현을 이용하여 심장 전구세포와 심근세포를 생성하는 확장 가능한 방법을. 이 기술은 심장 질환 모델링 및 세포 기반 치료 연구에 활용됩니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

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