체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화
August 8th, 2018
여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.
이 기술의 가장 큰 장점은 자동 광학 현미경에서 실시간으로 세포를 볼 수 있다는 것입니다. 이 치료법의 의미는 이주가 이러한 질병에서 중요한 역할을 하는 만성 상처 또는 암 치료로 확장됩니다. 먼저 HaCaT 세포의 융합 배양액을 5ml의 멸균 마그네슘 및 무칼슘 PBS로 두 번 세척합니다.
다음으로, 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5-8분 동안 1ml의 트립신으로 세포를 배양합니다. 광학 현미경으로 박리를 확인한 후 FBS가 보충된 9ml의 배양 배지로 효소 반응을 중지합니다. 그리고 세포를 7.5 곱하기 10 내지 250 마이크로리터당 4번째 세포로 희석하여 매체 플러스 FBS 농도를 첨가한다.
다음으로, 바닥이 둥근 48웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 250마이크로리터의 세포를 파딩하고 플레이트를 좌우로 부드럽게 밀어 세포가 웰 바닥에 고르게 분포되도록 합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 배양물이 90-95% 포화도에 도달하면 각 웰의 상층액을 밀리리터당 10마이크로그램의 미토마이신 C가 보충된 250마이크로리터의 새로 준비된 배지로 교체하고 플레이트를 다시 2시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
배양이 끝나면 250마이크로리터의 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 250마이크로리터의 새 PBS를 추가합니다. 그런 다음 200마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 각 셀 단층에 하나의 수직 스크래치를 만듭니다. 모든 단층이 긁히면 각 웰의 PBS를 관심 펩타이드 자극이 있는 250마이크로리터로 교체하고 뚜껑이 손상되지 않은 상태로 플레이트를 광학 카메라 시스템에 장착합니다.
광학 카메라를 설정하려면 획득 창을 열고 wound healing(상처 치유)을 선택합니다. 플레이트 유형을 선택하고 사용하지 않는 웰을 선택 취소합니다. 그런 다음 enable을 클릭하고 웰 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 세포의 위치에 맞게 초점을 조정합니다.
사진 간격에서 이미지의 기간을 설정하고 원하는 기간에 맞게 반복 횟수를 설정합니다. 그런 다음 적절한 분석 유형을 선택합니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 세포 이미징을 시작합니다.
상처가 생기면 피부 세포가 증식하기 시작하고 상처 부위를 가로질러 이동하여 상처를 봉합하는데, 이 과정을 광학 카메라를 통해 관찰할 수 있습니다. 48시간 배양 후 내피 성장 인자 치료는 상처의 거의 95% 봉합을 유도하는 반면, 처리되지 않은 대조군 우물에서는 38%, 락토페린 및 락토페리신 배양에서는 각각 33% 및 62% 봉합을 유도합니다. 초기 긁힘에서 갭 너비의 변화로 결정된 상처 봉합의 비율도 각 성장 자극에 대해 표시할 수 있습니다.
이 비디오는 건강한 세포의 단일층에서 만들어진 스크래치를 가로질러 각질 세포의 이동을 연구하기 위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 이 분석에 사용된 세포는 HaCaT 세포이지만, 마이크로타이터 플레이트의 바닥에 부착되어 있는 한 다른 세포주, 곰팡이 또는 박테리아에도 적용할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 자동화된 광학 카메라 현미경을 사용하여 세포 이동을 시험하는 절차를 설명합니다. 스크래치 분석법은 시간 경과에 따른 세포 이동을 관찰하는 신뢰할 수 있는 방법으로 강조됩니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 현미경 분석
- 시험관 내 기술
배경
- 스크래치 분석법은 세포 이동을 연구하는 데 널리 사용되는 기술입니다.
- 자동화된 광학 현미경은 세포를 실시간으로 관찰할 수 있게 합니다.
- 세포 이동을 이해하는 것은 만성 상처 및 암 치료에서 매우 중요합니다.
- 이 방법은 세포 이동을 감지하는 데 비용 효율적이고 신뢰할 수 있습니다.
연구 목적
- 세포 이동을 평가하는 신뢰할 수 있는 방법을 시연합니다.
- 만성 상처 치료 및 암 치료에서 세포 이동의 의미를 탐구합니다.
- 실시간 분석을 위해 자동화된 광학 현미경을 활용합니다.
사용된 방법
- PBS로 HaCaT 세포의 혼잡한 배양을 세척합니다.
- 세포를 트립신으로 배양하여 분리합니다.
- 배양 배지로 효소 반응을 중지합니다.
- 분석을 위해 세포를 특정 농도로 희석합니다.
주요 결과
- 세포 이동의 실시간 관찰이 이루어졌습니다.
- 이 방법은 스크래치 폐쇄 모니터링에 효과적인 것으로 입증되었습니다.
- 결과는 만성 상처 및 암에 대한 치료 전략에 정보를 제공할 수 있습니다.
- 자동화된 현미경은 이동 평가의 신뢰성을 향상시킵니다.
결론
- 자동화된 광학 현미경은 세포 이동을 연구하는 데 귀중한 도구입니다.
- 이 기술은 만성 상처 치료 및 암 치료 연구를 발전시킬 수 있습니다.
- 추가 연구는 다양한 생물학적 맥락에서 그 적용을 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Cell migration assays are critical for evaluating therapeutic candidates in wound healing and oncology, yet traditional scratch assays suffer from edge artifacts and manual analysis bottlenecks. This optimized protocol addresses reproducibility challenges by eliminating cation-mediated cell accumulation and integrating automated imaging, enabling consistent, quantitative migration readouts. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, real-time data on pro- and anti-migratory compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying migration changes in response to stimuli like lactoferrin or growth factors.
- Operational Value: Reduces variability from manual scratch analysis and temperature fluctuations through automated optical imaging.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative wound closure metrics from identical scratch sections over time.
- Operational Value: Eliminates labor-intensive image cycling and analysis, improving throughput for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant HaCaT keratinocytes to model epithelial migration, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures assay continuity from discovery to preclinical evaluation via reproducible, automated workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early discovery and enabling quantitative lead identification through measurable migration inhibition or stimulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating migration as a dependent variable in response to peptide or cytokine treatments.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., % wound closure) that allow comparison across compound libraries or protein variants.
- Analytics: Generates time-series migration data suitable for statistical comparison and dose-response modeling.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through use of human keratinocyte cells and wound-healing context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for migration assays across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in migration assays.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through automated imaging and consistent scratch preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative migration data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated migration effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and sterile technique for monolayer preparation.
- Dependent on automated optical camera systems with time-lapse and analysis capabilities.
- Necessitates standardization of scratch width and timing across wells for comparable data.
- Involves optimization of PBS washing steps to prevent edge artifacts in different cell lines.
- Limited to adherent cells compatible with microtiter plate bottom attachment.
