체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화
2018년 8월 8일
여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.
이 기술의 가장 큰 장점은 자동 광학 현미경에서 실시간으로 세포를 볼 수 있다는 것입니다. 이 치료법의 의미는 이주가 이러한 질병에서 중요한 역할을 하는 만성 상처 또는 암 치료로 확장됩니다. 먼저 HaCaT 세포의 융합 배양액을 5ml의 멸균 마그네슘 및 무칼슘 PBS로 두 번 세척합니다.
다음으로, 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5-8분 동안 1ml의 트립신으로 세포를 배양합니다. 광학 현미경으로 박리를 확인한 후 FBS가 보충된 9ml의 배양 배지로 효소 반응을 중지합니다. 그리고 세포를 7.5 곱하기 10 내지 250 마이크로리터당 4번째 세포로 희석하여 매체 플러스 FBS 농도를 첨가한다.
다음으로, 바닥이 둥근 48웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 250마이크로리터의 세포를 파딩하고 플레이트를 좌우로 부드럽게 밀어 세포가 웰 바닥에 고르게 분포되도록 합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 배양물이 90-95% 포화도에 도달하면 각 웰의 상층액을 밀리리터당 10마이크로그램의 미토마이신 C가 보충된 250마이크로리터의 새로 준비된 배지로 교체하고 플레이트를 다시 2시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
배양이 끝나면 250마이크로리터의 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 250마이크로리터의 새 PBS를 추가합니다. 그런 다음 200마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 각 셀 단층에 하나의 수직 스크래치를 만듭니다. 모든 단층이 긁히면 각 웰의 PBS를 관심 펩타이드 자극이 있는 250마이크로리터로 교체하고 뚜껑이 손상되지 않은 상태로 플레이트를 광학 카메라 시스템에 장착합니다.
광학 카메라를 설정하려면 획득 창을 열고 wound healing(상처 치유)을 선택합니다. 플레이트 유형을 선택하고 사용하지 않는 웰을 선택 취소합니다. 그런 다음 enable을 클릭하고 웰 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 세포의 위치에 맞게 초점을 조정합니다.
사진 간격에서 이미지의 기간을 설정하고 원하는 기간에 맞게 반복 횟수를 설정합니다. 그런 다음 적절한 분석 유형을 선택합니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 세포 이미징을 시작합니다.
상처가 생기면 피부 세포가 증식하기 시작하고 상처 부위를 가로질러 이동하여 상처를 봉합하는데, 이 과정을 광학 카메라를 통해 관찰할 수 있습니다. 48시간 배양 후 내피 성장 인자 치료는 상처의 거의 95% 봉합을 유도하는 반면, 처리되지 않은 대조군 우물에서는 38%, 락토페린 및 락토페리신 배양에서는 각각 33% 및 62% 봉합을 유도합니다. 초기 긁힘에서 갭 너비의 변화로 결정된 상처 봉합의 비율도 각 성장 자극에 대해 표시할 수 있습니다.
이 비디오는 건강한 세포의 단일층에서 만들어진 스크래치를 가로질러 각질 세포의 이동을 연구하기 위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 이 분석에 사용된 세포는 HaCaT 세포이지만, 마이크로타이터 플레이트의 바닥에 부착되어 있는 한 다른 세포주, 곰팡이 또는 박테리아에도 적용할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 자동 광학 카메라 현미경을 사용하여 인비트로(in vitro) 세포 이동을 테스트하는 절차를 설명합니다. 스크래치 분석(scratch assay)은 시간에 따른 세포 이동을 관찰하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 강조됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 현미경 검사
- 인 비트로(In Vitro) 기술
배경
- 스크래치 분석(scratch assay)은 세포 이동을 연구하는 데 널리 사용되는 기술입니다.
- 자동 광학 현미경은 세포의 실시간 관찰을 가능하게 합니다.
- 세포 이동에 대한 이해는 만성 상처 및 암 치료법에서 매우 중요합니다.
- 이 방법은 세포 이동을 검출하는 데 있어 비용 효율적이며 신뢰할 수 있습니다.
연구 목적
- 세포 이동을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 입증합니다.
- 만성 상처 치료 및 암 치료에서 세포 이동의 의미를 탐구합니다.
- 실시간 분석을 위해 자동 광학 현미경을 활용합니다.
사용된 방법
- PBS로 HaCaT 세포의 합류 배양물을 세척합니다.
- 세포를 분리하기 위해 트립신과 함께 배양합니다.
- 배양액을 사용하여 효소 반응을 중단시킵니다.
- 분석을 위해 세포를 특정 농도로 희석합니다.
주요 결과
- 세포 이동의 실시간 관찰이 이루어졌습니다.
- 이 방법은 스크래치 폐쇄를 모니터링하는 데 효과적임이 입증되었습니다.
- 결과는 만성 상처 및 암의 치료 전략에 정보를 제공할 수 있습니다.
- 자동화된 현미경 분석은 이동성 평가의 신뢰도를 높여줍니다.
결론
- 자동 광학 현미경은 세포 이동을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
- 이 기술은 만성 상처 치유 및 암 치료 연구를 진전시킬 수 있습니다.
- 추후 연구를 통해 다양한 생물학적 맥락에서 응용 범위를 확장할 수 있을 것입니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
세포 이동 분석은 상처 치유 및 종양학 분야에서 치료 후보 물질을 평가하는 데 매우 중요하지만, 기존의 스크래치 분석은 가장자리 아티팩트와 수동 분석의 병목 현상이라는 문제점이 있습니다. 본 최적화된 프로토콜은 양이온 매개 세포 축적을 제거하고 자동화된 이미징을 통합함으로써 재현성 문제를 해결하며, 일관되고 정량적인 이동 측정값을 가능하게 합니다. 이러한 접근 방식은 전-이동 및 항-이동 화합물에 대한 신뢰할 수 있는 실시간 데이터를 제공하여 초기 단계의 타겟 검증과 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 락토페린이나 성장 인자와 같은 자극에 반응하여 나타나는 이동 변화를 정량화함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 자동화된 광학 이미징을 통해 수동 스크래치 분석 및 온도 변동으로 인한 가변성을 줄여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 시간에 따른 동일한 스크래치 영역에서 표준화된 정량적 상처 폐쇄 지표를 생성합니다.
- 운영적 가치: 노동 집약적인 이미지 순환 및 분석 과정을 제거하여 화합물 스크리닝의 처리량을 향상시킵니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 질병 관련 HaCaT 각질형성세포를 사용하여 상피 세포 이동을 모델링함으로써, 중개 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 운영적 가치: 재현 가능한 자동화 워크플로우를 통해 발견 단계부터 전임상 평가까지 분석의 연속성을 보장합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 발견 연속체(discovery continuum)의 범주에 부합하며, 초기 발견 단계에서의 가설 검증을 지원하고 측정 가능한 이동 억제 또는 촉진을 통해 정량적인 리드 화합물 식별을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 펩타이드 또는 사이토카인 처리 시 이동을 종속 변수로 격리함으로써 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 화합물 라이브러리나 단백질 변이체 간의 비교가 가능한 재현성 있는 정량적 결과(예: % 상처 폐쇄)를 제공합니다.
- 분석: 통계적 비교 및 용량-반응 모델링에 적합한 시계열 이동 데이터를 생성합니다.
- 중개 연구: 인간 각질 형성 세포와 상처 치유 맥락을 사용하여 전임상적 관련성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 여러 프로젝트와 세포 유형에 걸쳐 이동 분석을 위한 재사용 가능한 자동화 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 이동 분석(migration assays)의 기전적 모호성을 줄여 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 자동화된 이미징과 일관된 스크래치 준비를 통해 표준화 및 확장성을 강화합니다.
- 전략적 가치: 파이프라인 초기 단계에서 신뢰할 수 있는 정량적 이동 데이터를 제공하여 의사결정(go/no-go decisions)을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 검증된 이동 효과를 기반으로 화합물의 위험 조정 우선순위 결정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려 사항
- 단층 세포 준비를 위한 세포 배양 및 무균 조작 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 타임랩스 및 분석 기능이 포함된 자동 광학 카메라 시스템에 의존합니다.
- 비교 가능한 데이터를 얻기 위해 웰 간의 스크래치 너비와 타이밍의 표준화가 필수적입니다.
- 다양한 세포주에서 가장자리 아티팩트를 방지하기 위한 PBS 세척 단계의 최적화가 수반됩니다.
- 마이크로타이터 플레이트 바닥에 부착 가능한 부착성 세포로 제한됩니다.
